Modułowy workflow do analizy ilościowej, strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira

Summary

Protokół ten zapewnia modułowy workflow BSL-2, łączący testy biomasy kryształowo-fioletowej, kinetykę kontrastu fazowego poklatkowego, konfokalne mapowanie 3D/matrycowe macierzy, ultrastrukturę SEM oraz moduł in vivo dla infekcji chomików, aby kultywować, ilościować, charakteryzować i badać funkcjonalną rolę biofilmu Leptospira , umożliwiając standaryzowaną ocenę mutantów i interwencji antybiofilmowych w różnych laboratoriach.

Abstract

Przedstawiamy tutaj zintegrowany zestaw protokołów do hodowli, monitorowania ilościowego, charakteryzacji strukturalnej i funkcjonalnej biofilmów Leptospira spp. w czasie. Ten workflow łączy mikromiatrowe testy kryształowego fioletu do pomiaru biomasy biofilmu w wielu punktach czasowych, z podejściem frakcjonowania czasowo, które rozróżnia populacje bakterii przyłączonych (biofilm) i nieprzyłączonych (faza ciekłą), obrazowanie poklatkowe fazowe do nieniszczącej obserwacji kinetycznej, konfokalną mikroskopię laserową do generowania pełnych rekonstrukcji 3D z odczytami sond matrycowych oraz mikroskopię skaningową wspieraną przez membranę do analizy ultrastrukturalnej. Równolegle szczegółowo przedstawiamy ustandaryzowaną procedurę pozyskiwania nienaruszonych agregatów biofilmu i przygotowania ich do iniekcji wewnątrzotrzewnowej do modelu wrażliwego złotego chomika syryjskiego, umożliwiając bezpośrednią ocenę zjadliwości związanej z biofilmem in vivo obok dopasowanych kontrol planktonu.

Zoptymalizowany pod patogenny szczep Leptospira interrogans Manilae L495, każdy moduł jest łatwo przenoszony do innych gatunków i bibliotek mutantów Leptospira w celu porównania zdolności do tworzenia biofilmu. Razem te skoordynowane moduły stanowią solidne podstawy do analizy strategii antybiofilmowych, badania determinantów genetycznych oraz wyjaśniania wkładu biofilmów w trwałość i patogenezę Leptospiry .

Introduction

Biofilmy to ustrukturyzowane społeczności mikrobiologiczne, w których komórki są osadzone w matrycy samowydzielającej się zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej (EPS) złożonej z polisacharydów, białek, kwasów nukleinowych i lipidów¹. Ta matryca zapewnia stabilność mechaniczną, pośredniczy w adhezji do powierzchni i zwiększa przeżywalność mikroorganizmów, zapewniając odporność na stresy środowiskowe, takie jak wysychanie, stres oksydacyjny i środki przeciwdrobnoustrojowe ^2,3. W bakteriach patogennych biofilmy ułatwiają trwałość, unikanie odporności oraz przewlekłe infekcje ^4,5.

W porównaniu z komórkami planktonicznymi, które są swobodnie pływające i metabolicznie bardziej jednorodne, komórki związane z biofilmem wykazują zmienioną ekspresję genów, tempo wzrostu i aktywność metaboliczną⁶. Te różnice zapewniają zwiększoną tolerancję na wyzwania środowiskowe, antybiotyki i mechanizmy obronne gospodarza, jednocześnie umożliwiając skoordynowane zachowania, takie jak wykrywanie kworum, zatrzymywanie składników odżywczych i organizacja przestrzenna ^7,8.

Formowanie biofilmu zostało szeroko scharakteryzowane u organizmów modelowych takich jak Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Vibrio cholerae, które wspólnie ukształtowały nasze rozumienie genetycznych, strukturalnych i fizjologicznych podstaw stylu życia opartego na biofilmie. Badania nad Pseudomonasem wykazały, że egzopolisacharydy i detekcja kworum współdziałają, kształtując złożone trójwymiarowe architektury biofilmu ^9,10. Badania nad gronkowcem podkreślają rolę białek powierzchniowych i DNA zewnątrzkomórkowego w poprawie kohezji biofilmu i tolerancji na antybiotyki ^11,12. Badania gatunków Vibrio dodatkowo uwypukliły niezwykłą różnorodność morfologii biofilmów oraz ich znaczenie ekologiczne w środowiskach wodnych¹³. Łącznie systemy te zapewniły solidne ramy koncepcyjne i metodologiczne dla badań nad biofilmem, wzmocnione przez standaryzowane protokoły¹⁴ oraz krytyczne oceny istniejących technik^15,16, które razem podkreślają potrzebę zharmonizowanych podejść przy badaniu powstawania biofilmu u mniej zbadanych bakterii, takich jak Leptospira.

Członkowie rodzaju Leptospira z rodziny przełomkowatych, będących czynnikami powodującymi leptospirozę, byli przez długi czas uznawani za przeważnie planktoniczne. Najnowsze badania wykazały eksperymentalnie solidne tworzenie biofilmu u wielu gatunków¹⁷. Podczas gdy niektóre badania sugerują powstawanie biofilmu w środowiskowych¹⁸ i powiązanych z gospodarzem kontekstach¹⁹, inne eksperymentalnie wykazały zdolność leptospirów do tworzenia biofilmu w kanalikach nerkowych Rattus norvegicus²⁰ oraz w skórze szklistej koni²¹, a także wykrywanie gatunków leptospiralnych w biofilmach środowiskowych^22,23. Rozszyfrowanie warunków i mechanizmów rządzących biofilmami Leptospira jest zatem kluczowe dla zrozumienia transmisji środowiskowej, trwałości rezerwuarów oraz patogenezy chorób ^24,25.

Istniejące testy biofilmu Leptospira są fragmentaryczne, obejmujące jakościowe obserwacje mikroskopowe^17,26 po kolorymetryczne lub kryształowe barwienia fioletowe^27,28. Chociaż badania te dostarczyły cennych informacji na temat powstawania biofilmu, często brakuje im zarówno rozdzielczości kinetycznej potrzebnej do monitorowania dojrzewania i rozprzestrzeniania biofilmu w czasie rzeczywistym, jak i ultrastrukturalnego kontekstu zapewnianego przez mikroskopię konfokalną lub elektronową. Ciągły monitoring i analiza strukturalna 3D są uważane za niezbędne do uchwycenia dynamicznego charakteru powstawania i rozprzestrzeniania biofilmu^14,15. Te ograniczenia utrudniają porównywalność między badaniami i ograniczają systematyczną ocenę czynników lub interwencji wpływających na powstawanie i rozprzestrzenianie biofilmu, co podkreśla potrzebę ustandaryzowanego, wieloodczytowego workflow, który w sposób powtarzalny i kompleksowy obejmuje zarówno dynamikę strukturalną, jak i funkcjonalną biofilmu Leptospira biofilm.

Aby wypełnić te luki, opracowaliśmy zintegrowany, modułowy workflow, który łączy sześć uzupełniających się odczytów pochodzących z tej samej serii kultur. Po pierwsze, wysokoprzepustowy test mikromiarek CV ilościowo określa przyłączoną biomasę w wielu punktach czasowych. Po drugie, przeprowadzono test frakcjonacyjny o rozdzieleniu czasowym w 96-dołkowych płytach podziałowych całkowitych, w fazie ciekłej (nieprzyłączonej lub częściowo odłączonej) oraz (biofilm) populacji według OD₄₀₅, aby śledzić ich ewolucję podczas formowania się i rozpraszania. Termin faza ciecza używany jest tutaj zarówno do komórek planktonicznych, jak i odłączonych, uznając dynamiczny kontinuum między fenotypami wolno żyjącymi a powierzchniowymi^29,30. Po trzecie, obrazowanie fazowe z kontrastem poklatkowym zapewnia nieniszczycielską kinetykę adhezji, ruchliwości agregatu i koalescencji. Po czwarte, konfokalna mikroskopia laserowo-skaningowa (CLSM) pozwala na pełne rekonstrukcje 3D z odczytami żywymi/martwymi oraz sondami matrycowymi, umożliwiając żywotność zależną od głębokości i mapowanie macierzy. Po piąte, skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) wspierana przez membranę lub pokrywę umożliwia rozdzielczość architektury zewnątrzkomórkowej oraz polaryzacji podstawowo-wierzchołkowej w wysokiej rozdzielczości. Ponadto włączono moduł in vivo do oceny zjadliwości za pomocą intraperitonealnego wstrzyknięcia agregatów biofilmu do modelu wrażliwego złotego chomika syryjskiego, wrażliwego i dobrze ugruntowanego modelu leptospirozy 31,32,33. To podejście łączy fenotypy biofilmu z potencjałem patogennym, dostarczając kontekstu funkcjonalnego, który uzupełnia analizy in vitro.

W porównaniu z podejściami jednomodalnymi, platforma ta oferuje kilka zalet: (i) zsynchronizowane odczyty ilościowe (CV i frakcjonowane OD) oraz strukturalne (CLSM/SEM); (ii) nieniszczącym monitorowaniem kinetycznym wczesnej adhezji, wzrostu, dojrzewania i rozprzestrzeniania się; (iii) żywotność 3D i charakterystyka macierzy z użyciem sond ukierunkowanych; (iv) ultrastrukturalną wizualizację architektury macierzy zewnątrzkomórkowej; oraz (v) bezpośrednią ocenę funkcjonalną zjadliwości związanej z biofilmem w porównaniu z planktonową w modelu chomika podatnego, co jest możliwe do osiągnięcia przy standardowej infrastrukturze BSL-2. Wykorzystując formaty wielostudniowe oraz wymienne podłoża szklane lub poliwęglanowe, workflow umożliwia replikację przesiew zmiennych środowiskowych, związków przeciwdrobnoustrojowych lub bibliotek mutantów, jednocześnie utrzymując bezpłodność, przepustowość i walidację krzyżową między modułami.

Laboratoria skupione na ekologii, trwałości, interakcjach gospodarz-patogen lub odkrywaniu antybiofilmu mogą przyjmować pojedyncze moduły lub cały pipeline. Wymagane zasoby ograniczają się do czytnika płyt, mikroskopu odwróconego z kontrolą środowiskową dla poklatkowego pomiaru czasu, dostępu do mikroskopu konfokalnego i urządzenia SEM oraz standardowych obiektów zwierzęcych dla modelu chomika, co umożliwia szerokie wdrożenie i powtarzalne porównania w różnych badaniach.

Protocol

Oświadczenie etyczne:
Badania te zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytutu Pasteura Nowej Kaledonii i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytutu Pasteura w Paryżu oraz Europejskim Zaleceniem 2007/526/WE. Numer rejestracyjny eksperymentów na zwierzętach: IPNC-2018-ARE-001

UWAGA: Wszystkie procedury z udziałem żywych hodowli Leptospiry muszą być przeprowadzane w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2), zgodnie z wytycznymi instytucjonalnego dotyczącego bezpieczeństwa biologicznego. Wszystkie manipulacje hodowlami muszą być wykonywane pod szafą bezpieczeństwa biologicznego, aby zapewnić bezpieczeństwo operatora i zapobiec zanieczyszczeniu środowiska.

Szczep L495 Leptospira interrogans serovar Manilae L495 użyty w tym badaniu został pierwotnie pozyskany z kolekcji Instytutu Pasteura (Paryż, Francja) i jest przechowywany w Instytucie Pasteura w Nowej Kaledonii. Aby zachować zjadliwość, szczep jest okresowo ponownie izolowany od zakażonych chomików. We wszystkich eksperymentach in vitro hodowle nie były utrzymywane poza sześcioma subkulturami po odzyskaniu od zwierzęcego gospodarza.

Wszystkie procedury na zwierzętach muszą być wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez odpowiednie Komitety ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt. Eksperymenty powinny być zgodne z europejskimi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt (Dyrektywa UE 2010/63) oraz zaleceniami Służby Zdrowia Publicznego, zapewniając, że wykorzystywanie zwierząt jest zarówno uzasadnione, jak i etycznie regulowane.

1. Przygotowanie szczepionki bakteryjnej

1. Hodować komórki Leptospira spp. w temperaturze 30 °C w podłożu^{EMJH 34} w warunkach aerobowych i bez potrząsania w szklanych tubkach z płaskim dnem i śrubką, aż hodowla osiągnie fazę środkową w stanie log (log phase). W tych warunkach szczep L. interrogans serovar Manilae L495, szczep o niskim przejściu regularnie utrzymywany in vivo przez chomiki, zazwyczaj osiąga odpowiednią gęstość komórek w ciągu 3-5 dni. Upewnij się, że hodowle osiągają przedawkowanie 0,2-0,4 przy 405 nm (2 do 5 x 10^{8 komórek} /mL) przed rozcieńczeniem w świeżym ośrodku EMJH oraz zweryfikować ruchliwość i brak zlepiania się mikroskopem ciemnopolowym przy 20-krotnym powiększeniu.
   UWAGA: EMJH ma wewnętrzną absorpcję. Wyczyść spektrofotometr ze sterylnym EMJH i odejmij tę wartość od wszystkich odczytów. Inokulum można standaryzować poprzez pomiar gęstości optycznej lub bezpośrednie liczenie komórek za pomocą komory Petroffa-Haussera. Rozcieńczenie 1:100 zweryfikowanej hodowli średniej logariatusu zazwyczaj daje OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10^{6 komórek} /mL). Delikatnie mieszaj przez inwersję; Nie wiruj.
2. Zbadaj aliquot o pojemności 10 μL pod mikroskopią ciemnopolową przy powiększeniu 20x. Upewnij się, że ≥ 90% komórek jest bardzo ruchomych i nie ma widocznych grudek. Rozcieńcz zweryfikowaną hodowlę średnią 1:100 w świeżym EMJH, aby uzyskać OD₄₀₅ = 0,02 (≈ 1 x 10⁶ komórek/mL). Delikatnie mieszaj przez inwersję; Nie wiruj.
   UWAGA: Jedno działające inokulum obsługuje wszystkie dalsze testy opisane w tym protokole (Rysunek 1). Przygotuj 36 mL do zasiewania płyty z 24 dołkami (1 mL/dołek) lub 20 mL do zasiewania płyty 96-dołkowej (200 μL/dołek). Dostosuj objętości do liczby wymaganych płyt.

Rysunek 1. Globalny przepływ pracy analizy biofilmu Leptospira . Hodowle Leptospira z rosnącym wzrostem są najpierw oceniane pod kątem wzrostu i standaryzowane według gęstości optycznej. Hodowle są następnie rozdzielane na płytki zawierające szkło lub membranę, mikroskopowe mikromiszki lub płytki z 96 dołkami. Workflow obejmuje siedem modułów: (1) przygotowanie inokulum; (2) barwienie fioletowe kryształowe do ilościowego określenia biomasy; (3) obrazowanie ultrastrukturalne wykonane przez SEM; (4) dynamiczne monitorowanie biofilmu za pomocą mikroskopii poklatkowej fazowo-kontrastowej; (5) wizualizację 3D za pomocą CLSM z barwieniem żywym/martwym; (6) ilościowa ilościowa rozdzielczość czasowo frakcji przyłączonych i nieprzyłączonych podczas tworzenia biofilmu za pomocą gęstości optycznej; oraz (7) badanie funkcjonalnej roli biofilmu podczas infekcji u chomików syryjskich. To zintegrowane podejście umożliwia wielomodalną analizę rozwoju, struktury i patogenności biofilmu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

2. Crystal Violet – ilościowa ilościowość biofilmów na pokrywkach lub membranach

1. Wewnątrz okapu BSL2 z zakresu bezpieczeństwa biologicznego użyj sterylnych kleszczy, aby położyć jedną sterylną szklaną pokrywę o średnicy 12 mm lub jedną 0,1 μm sterylną membranę hydrofilową poliwęglanową płasko na dnie każdego dołku w sterylnej 24-dołkowej płytce z pokrywką. Namocz membranę/szklaną pokrywę przez 2 godziny w temperaturze 30 °C z 1 mL sterylnego EMJH.
   UWAGA: Chociaż nie jest to niezbędne, wstępne moczenie podłoża w EMJH poprawia zwilżanie i nieznacznie zwiększa przyczepność bakterii.
2. Usuń roztwór moczeniowy i dodaj 1,5 mL rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10^{6 komórek} /mL) do każdego dołku. Upewnij się, że pokrywa lub membrana pozostaje dobrze umieszczona na dole.
3. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C w warunkach statycznych w wilgotnej atmosferze, utrzymywanej przez umieszczenie tacy wypełnionej wodą wewnątrz inkubatora, aby zapobiec parowaniu podłoża hodowlanego. W przypadku wolno rosnących szczepów zaleca się 3-tygodniową inkubację, aby umożliwić powstanie dojrzałego, przylegającego biofilmu.
4. W wyznaczonym momencie ostrożnie usuń jak najwięcej medium hodowlanego z każdego odwiertu, nie naruszając przy tym biofilmu. Delikatnie przepłucz każdy dołek 1 mL sterylnej soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), aby usunąć pozostałe komórki nieprzylegające, utrzymując pokrywę płasko przy dnie studni, aby nie odklejać delikatnych komórek biofilmowych. W tych warunkach wzrost biofilmu zachodzi głównie na górnej powierzchni pokrywy, z minimalnym wzrostem po stronie spodu, więc płukanie bez podnoszenia wystarcza, aby wzbogacić ją dla komórek przymocowanych do powierzchni do analiz dalszych.
   UWAGA: Biofilmy są na tym etapie niezwykle delikatne i łatwo mogą zostać pomyłkowo zasysane. Pipetowanie powinno być wykonywane powoli i precyzyjnie wzdłuż ściany studni, aby nie zakłócać biofilmu.
5. Utrwal próbki biofilmu, dodając 1 ml 4% paradehydu (PFA) do PBS w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Usuń utrwalacz i ostrożnie spłuknij dwa razy 1 mL PBS.
   UWAGA: Do utrwalania przygotowywano świeżo 4% roztwór formacji formaldehydu (16% materiał bez metanolu rozcieńczony 1:4 w PBS) i wyrzucano po użyciu, ponieważ polimeryzacja do paraformaldehydu zmniejsza aktywność sieciowania.
6. Dodaj 1 ml roztworu Crystal Violet (CV) o wartości 0,1% (w/v) do każdego dołku i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut, zapewniając pełne przykrycie membrany lub pokrywy.
7. Wyrzuć barwnik i przepłucz dwa razy 1 mL PBS.
   UWAGA: Kryształowy fiolet i paradehyd (PFA) są toksyczne i mogą podrażniać skórę oraz oczy. Zawsze noś rękawiczki i obchodz się z obiema chemikaliami ostrożnie, najlepiej w okapie przeciwparowym. Utylizacja odpadów w wyznaczonych pojemnikach na niebezpieczne barwniki lub odpady chemiczne zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego.
8. Przechyl płytę i odpuszcz resztki cieczy. Susz studnie na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż podłoże będzie wyglądać na całkowicie suche (≥ 4 godziny, najlepiej przez noc).
   UWAGA: Na tym etapie na powierzchni pokrywy lub membrany mogą być widoczne struktury kropkowe lub siatkowate (rysunek 2A).
9. Do każdego odwiertu dodaj 500 μL buforu elucijnego (50% etanolu, 50% kwasu octowego lodowcowego (vol/vol)) do każdego odwiertu. Inkubuj talerz przez 15 minut. Pipetować w górę i w dół, aby całkowicie rozpuścić kryształ fioletowy związany z biofilmem.
10. Przelej 200 μl każdej próbki do optycznie przezroczystej mikropłyty z 96 dołkami i zmierz absorpcję na 570 nm. Odjąć blank tylko z podłoża, przygotowany przez obróbkę nienaoszczepionego pokrywka lub membrany poprzez utrwalenie, barwienie CV, płukania i elution, aby usunąć wewnętrzne wiązania/tło. Zanotuj średnią ± odchylenia standardowego dla co najmniej trzech powtórzeń technicznych. Rozcieńczaj próbki buforem elucijnym, jeśli absorpcja przekracza liniowy zakres spektrofotometru.

3. Wizualizacja biofilmu za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

1. Wewnątrz okapu BSL2 z zakresu bezpieczeństwa biologicznego użyj sterylnych kleszczy, aby położyć jedną sterylną szklaną pokrywę o średnicy 12 mm lub jedną 0,1 μm sterylną membranę hydrofilową poliwęglanową płasko na dnie każdego dołku w sterylnej 24-dołkowej płytce z pokrywką. Namocz membranę/szklaną pokrywę przez 2 godziny w temperaturze 30 °C z 1 mL sterylnego EMJH.
2. Usuń roztwór do moczenia i dodaj 1,5 mL rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10^{6 komórek} /mL) do każdego dołku. Upewnij się, że pokrywa lub membrana pozostaje dobrze umieszczona na dole.
3. Inkubuj płytkę w temperaturze 30 °C w warunkach statycznych w inkubatorze do kontroli wilgotności, aby zapobiec parowaniu podłoża hodowlanego. W przypadku wolno rosnących szczepów zaleca się 3-tygodniową inkubację, aby umożliwić powstanie dojrzałego, przylegającego biofilmu
4. W wyznaczonym momencie ostrożnie usuń jak najwięcej medium hodowlanego z każdego odwiertu, nie naruszając przy tym biofilmu.
5. Następnie delikatnie płucze każdą jamkę 1 mL sterylnego PBS, aby usunąć pozostałe, nieprzylegające komórki, utrzymując pokrywkę płasko przy dnie dołka, aby zapobiec odłączaniu delikatnych komórek biofilmowych. W tych warunkach wzrost biofilmu zachodzi głównie na górnej powierzchni pokrywy, z minimalnym wzrostem po stronie spodu, więc płukanie bez podnoszenia wystarcza, aby wzbogacić ją dla komórek przymocowanych do powierzchni do analiz dalszych.
   UWAGA: Biofilmy są na tym etapie niezwykle delikatne i łatwo mogą zostać pomyłkowo zasysane. Pipetowanie powinno być wykonywane powoli i precyzyjnie wzdłuż ściany studni, aby nie zakłócać biofilmu.
6. Bezpośrednio do studni dodaj roztwór 4% paradehydu (PFA) i 1% glutaraldehydu w buforze kakodylatowym sodu (0,2 M, pH 7,4), aby utrwalić biofilm.
7. Inkubuj przez 30 minut w 37 °C, następnie usuń utrwalacz i dwukrotnie spłuknij pokrywę lub membranę PBS. Takie podejście zachowuje biofilm przyczepiony do powierzchni, minimalizując odwarstwienie, ponieważ większość wzrostu biofilmu odbywa się na górnej powierzchni pokrywy w naszych warunkach.
   UWAGA: Do utrwalania przygotowywano świeżo roztwór 4% dehydu formaldehydu i 1% glutaraldehydu (16% materiał bez metanolu rozcieńczony 1:4 w buforze kakodylatianu sodu) i wyrzucano po użyciu, ponieważ polimeryzacja do paraformaldehydu zmniejsza aktywność sieciowania.
8. Zanurz podłoże w 1% czterotlenku osmu (OsO₄) rozcieńczonym w PBS na 1 godzinę, aby zwiększyć kontrast SEM. Spłukaj dwa razy PBS.
9. Próbki odwodniaj poprzez zanurzanie ich sekwencyjnie w serii ethanolu o rosnącym stężeniu: 25%, 50%, 70%, 90% i 100% (v/v), każda przez 10 minut.
10. Dodaj 500 μL heksamitylodisilazany i inkubuj przez 5 minut, następnie zamień na świeży HMDS i inkubuj kolejne 5 minut. Usuń nadmiar HMDS i pozwól próbce całkowicie wyschnąć pod okapem oparowym.
    UWAGA: Glutaraldehyd, PFA, kakodylan sodu, czterotlenek osmu i heksasametylodisilazana są toksyczne i muszą być obsługiwane pod chemicznym okapem z odpowiednim środkiem ochronnym.
11. Zamontuj wysuszone próbki na odcinkach SEM, używając dwustronnej przewodzącej taśmy węglowej. Powłoka sputter-owadowa na próbkach cienką warstwą (~10 nm) złota lub platyny, zapewniając odpowiedni kontrast elektronowy do obrazowania SEM. Pozwala to na wysoką rozdzielczość wizualizacji architektury biofilmu, w tym kontaktów między komórkami, morfologii, gęstości i heterogeniczności macierzy zewnątrzkomórkowej, bez potrzeby stosowania dodatkowych barwników czy barwników.
12. Załaduj wycinki do SEM-a za pomocą odpowiedniego uchwytu na próbkę. Ewakuuj komorę na noc, jeśli to możliwe, aby poprawić jakość obrazowania, a następnie wykonaj wtórne obrazy elektronów z napięciem 5 - 15 kV i odpowiednie powiększenia, aby odsłonić ultrastrukturę biofilmu (Rysunek 2).

4. Obrazowanie fazowe z kontrastem poklatkowym rosnącego biofilmu

1. Pipeta 500 μL działającego inokulum (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10⁶ komórek/mL; patrz Sekcja 1) do sterylnej szklanej płytki Hi-Q4 o średnicy 35 mm wyposażonej w pokrywę równoległą do płaszczyzny, aby wyeliminować zniekształcenia łąkotki. Unikaj wprowadzania bąbelków i natychmiast zamykaj naczynie.
   UWAGA: Naczynie Hi-Q4 o szklanym dnie 35 mm zawiera 4 odrębne obszary hodowlane, które mogą być używane do jednoczesnego obrazowania 4 różnych warunków. Przydziel jeden przedział na sterylne medium EMJH jako kontrolę negatywną, a trzy pozostałe na replikacje techniczne lub inne szczepy/mutanty.
2. Umieść antenę na scenie środowiskowej mikroskopu odwróconego wyposażonego w optykę z kontrastem fazowym, napędem ostrości (Biostation IMQ) oraz nawilżoną obudową ustawioną na 30 °C i wilgotność względną 95%. Te warunki pomagają zminimalizować parowanie podczas długotrwałego obrazowania (do 8 dni).
3. Uruchom aplikację BioStation IMQ i w głównym interfejsie otwórz okno Nowe Ustawienia Time-lapse , aby uzyskać dostęp do panelu konfiguracyjnego. Przed rozpoczęciem eksperymentu sprawdź parametry środowiskowe na wyświetlaczu statusu, upewniając się, że zarówno wskaźniki temperatury komory, jak i wody są stabilne, aby zapobiec dryfowi ramki podczas akwizycji.
4. Na nowym ekranie ustawień time-lapse wybierz zakładkę Live i skonfiguruj parametry obrazowania w panelu Warunki obserwacji , wybierając Phase Contrast (Ph) jako filtr i ustawiając powiększenie na 20X.
5. W trybie manualnym dostosuj natężenie światła i czas naświetlania , aby zoptymalizować kontrast i uniknąć nasycenia. Sprawdź to za pomocą przycisku Sprawdzenie Saturation . Zdefiniuj cztery punkty zdobywania odpowiadające środkom czterech przedziałów.
6. Ustawij stopień kolejno nad każdą przedziałką, używając pokrętła Jog Dial lub klikając bezpośrednio na wyświetlaczu obrazu obserwacji na żywo .
7. Doprecyzuj ostrość za pomocą przycisków ostrości i zapisuj każdą pozycję, klikając przycisk rejestracji punktów eksperymentu poklatkowego . Zarejestrowane punkty pojawiają się jako ponumerowane niebieskie ramki na wyświetlaczu Verification Point Observation i są potwierdzane w zakładce Points.
8. Zaprogramuj harmonogram pozyskiwania, otwierając zakładkę Czas i klikając Nowy , aby uzyskać dostęp do okna dialogowego Timelapse , gdzie cykl pozyskiwania jest ustawiony na 30 minut , a całkowity czas na 7 dni.
9. Po kliknięciu Apply oprogramowanie automatycznie oblicza liczbę rund zdobywania. Aktywuj autofokus, klikając prawym przyciskiem myszy na pasek tytułu, wybierając Preferencje i włączając tryb AF, aby zapewnić ponowne ustawienie ostrości na każdym etapie. Sprawdź spójność ustawień ekspozycji, wzmocnienia i intensywności światła we wszystkich punktach, a następnie zapisz całą konfigurację za pomocą przycisku Zapisz.
10. Rozpocznij akwizycję, klikając Start Time-lapse. Oprogramowanie automatycznie przełącza się na obrazy poklatkowe, umożliwiając ciągłe monitorowanie postępu akwizycji i stabilności komory przez cały 7-dniowy eksperyment. Wszystkie obrazy są automatycznie zapisywane w formacie TIFF w folderze eksperymentu utworzonym przez oprogramowanie.
11. Przetwarzaj i ilościowo przekonuj serię obrazów, importując stosy obrazów do FIJI (Rysunek 3A, B, C).
12. Otwórz stosy obrazów odpowiadające każdej pozycji za pomocą File > Import > Image Sequence, upewniając się, że klatki są ładowane w porządku chronologicznym.
13. Przekonwertowanie wyrównanych stosów na 8-bitową skalę szarości za pomocą Image > Type > 8-bit, aby ustandaryzować intensywność pikseli.
14. Zastosuj progowanie za pomocą Image > Adjust > Threshold , aby izolować obszary biofilmu bakterii. Zastosuj spójne ustawienia progowe we wszystkich klatkach, wybierając Apply, a następnie zapisz wynik jako maskę binarną za pomocą Process > Binary > Make Binary.
15. Wykonaj ilościową analizę za pomocą Analizuj > Analizuj Cząstki, rejestrując parametry takie jak powierzchnia, procent powierzchni i średnia intensywność.
16. Eksportuj wyniki z każdej klatki automatycznie do arkusza kalkulacyjnego przez okno Wyniki (File > Zapisz jako > .csv) do analizy kinetycznej. Wszystkie pomiary wyrażamy jako proporcję powierzchni pola pokrytej biofilmem (pokrycie powierzchniowe).

5. Wizualizacja biofilmu za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej skaningowej (CLSM)

1. Zaszczepić 1,5 mL roboczego inokulum (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10^{6 komórek} /mL; patrz Sekcja 1) do sterylnej misy o szklanym dnie o średnicy 35 mm. Inkubować statycznie w nawilżonym pudełku zawierającym zbiornik wodny w inkubatorze w temperaturze 30 °C, aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju (do 21 dni).
2. W wybranym momencie ostrożnie zasysaj medium powoli wzdłuż ściany naczynia, nie zakłócając biofilmu. Przepłucz raz 2 mL sterylnego PBS, aby usunąć komórki planktonowe, z dużą ostrożnością, aby nie odłączyć się ani nie zakłócić biofilmu.
3. Przygotuj roztwory barwiące wymagające inkubacji z nieutrwalonymi (żywymi) biofilmami (wykonaj przed utrwaleniem).
   1. Do barwienia żywego/martwego dodaj 3 μL zielonego fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego SYTO9 (1,67 mM) oraz 3 μL jodku propidiu (18,3 mM) do 10 mL PBS, aby uzyskać roztwór barwiący. Dodaj 200 μL roztworu barwiącego bezpośrednio na bakterie tworzące biofilm, następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności i raz spłukuj w PBS.
   2. Żywy śladownik komórek może być również używany do barwienia komórek przed utrwaleniem. Inkubuj żywe komórki za pomocą 10 μM CFDA/SE tracera przez 30 minut. Alternatywnie można również oznaczyć membrany FM4-64 w stężeniu 5 μg/mL. Przepłucz raz w PBS.
4. Utrwal biofilm, dodając 2 mL 4% roztworu paraformaldehydu w PBS i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Usuń utrwalacz i dwukrotnie przepłucz PBS.
5. Dodaj kroplę środka mocującego antyfade, aby zakryć biofilm i uniknąć powstawania bąbelków.
6. Zbierz stosy Z na odwróconym mikroskopie konfokalnym wyposażonym w regulowany laser białego światła (WLL) oraz obiektyw HC PL APO CS2 63×/1.4 NA do zanurzenia olejowego. Dla CFDA/SE ustaw wzbudzenie na 488 nm i zbieraj emisję między 500-550 nm, używając otworu o średnicy 1 jednostki Airy'ego (AU). Dla FM4-64 ustaw wzbudzenie na 561 nm i wykryj emisję między 630-700 nm, również z otworkiem 1 AU.
7. Zbieraj stosy Z w odstępach 0,5-1,0 μm na całej grubości biofilmu. Dostosuj moc lasera i wzmocnienie detektora, aby zmaksymalizować zakres dynamiczny, unikając nasycenia (<1% pikseli nasyconych).
8. Stosuj uśrednianie linii (2-4×), aby poprawić stosunek sygnału do szumu i utrzymać wszystkie parametry obrazowania (moc lasera, szerokość pasma detektora, rozmiar otworu, prędkość skanowania) na stałym poziomie dla próbek.
9. Zapisz stosy obrazów jako pliki 12-bitowe i eksportuj je w formacie .lif do analizy ilościowej w FIJI (ImageJ).
   UWAGA: Przed obrazowaniem upewnij się, że ustawienia mikroskopu (np. moc lasera, wzmocnienie detektora, rozmiar otworu) są standaryzowane przy użyciu próbek kontrolnych barwionych tymi samymi barwnikami. Ten etap kalibracji jest niezbędny, aby zminimalizować zmienność między akwizycjami i umożliwić wiarygodne porównanie między eksperymentami.
10. Przetwarzaj i ilościowo obliczaj stosy obrazów konfokalnych za pomocą FIJI wyposażonej w wtyczkę COMSTAT (lub równoważne oprogramowanie do analizy 3D)¹⁰. Mierz objętość biologiczną, średnią i maksymalną grubość, pokrycie powierzchni oraz stosunki żywych i martwych (lub inne zdefiniowane metryki). Eksportuj reprezentatywne widoki ortogonalne i projekcje maksymalnej intensywności dla celów ilustracyjnych (Rysunek 3D, E).

6. Ilościowa rozdzielczość czasowa frakcji przyłączonych i nieprzyłączonych podczas tworzenia biofilmu w mikromiarekach 96-dołkowych

1. Zaszczepić 200 μL działającego inokulum (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10^{6 komórek} /mL; patrz sekcja 1) do dołków płyty 96-dołkowej. Inkubuj statycznie w temperaturze 30 °C aż do pożądanego punktu czasowego (dni 3, 5, 7, 10, 12, 14, 17 lub 21).
   UWAGA: Efekty graniczne i parowanie są częste przy użyciu płytek z 96 dołkami, zwłaszcza jeśli inkubator nie ma kontroli wilgotności. Aby zminimalizować te skutki, należy dodać 200 μL sterylnej wody destylowanej do wszystkich studni peryferyjnych. Dodatkowo talerze umieszczano w nawilżonym pudełku zawierającym zbiornik wodny, który następnie umieszczano w inkubatorze, aby jeszcze bardziej ograniczyć parowanie i utrzymać stałą wilgotność w różnych studniach.
2. W każdym momencie przygotuj trzy typy próbek:
   1. Całkowita zawiesina – Ujednolic całą zawartość jednego odwiertu zawierającego biofilm poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół kilka razy, unikając powstawania pęcherzyków. Ta frakcja reprezentuje całą populację bakterii, obejmującą zarówno leptospiry nieprzywiązane, jak i te znajdujące się w półprzylegającym biofilmie. Ten etap homogenizacji pomaga rozpraszać agregaty komórkowe, które mogą zakłócać kolejne pomiary absorpcji.
   2. Faza ciekła – z drugiego otworu ostrożnie usuń 180 μL supernatantu, nie naruszając warstwy biofilmu. Przelej do pustego otworu i dodaj 20 μL świeżego medium EMJH. Delikatnie pipetuj w górę i w dół kilka razy, aby rozproszyć agregaty komórkowe. Ta frakcja reprezentuje nieprzywiązane komórki obecne w fazie ciekłej, która może obejmować zarówno swobodnie zawieszone leptospiry, jak i odłączone agregaty biofilmu.
   3. Biofilm – W tym samym studni używanym w kroku 2.2 ponownie zawiesijcie pozostałą biofilm, dodając 180 μL świeżego medium EMJH i delikatnie pipetując w górę i w dół kilka razy. Ta frakcja odpowiada leptospirom w biofilmie.
3. Zmierz absorpcję każdej zawiesziny na 405 nm za pomocą spektrofotometru, po upewnieniu się, że każdy odwór został dokładnie ujednolicony, i wykreśl wartości, aby wygenerować reprezentatywny wykres (rysunek 4A).

7. Badanie funkcjonalnej roli biofilmu podczas infekcji gospodarza

1. Zaszczep 200 μL działającego inokulum (OD₄₀₅ = 0,02 ≈ 1 x 10^{6 komórek} /mL; patrz Sekcja 1) do dołków płyty 96-dołowej. Inkubuj statycznie w temperaturze 30 °C aż do osiągnięcia pożądanego etapu rozwoju (do 21 dni).
2. Aby określić stężenie inokulum, należy wyznaczyć specjalne studnie "kontroli biofilmu", które będą używane wyłącznie do monitorowania wzrostu, a nie do iniekcji zwierzęcej. Gdy biofilm będzie widoczny makroskopowo, delikatnie usuń 180 μL supernatantu z jednego odwiertu kontrolnego, nie naruszając biofilmu. Zastąpić go 180 μL świeżym medium EMJH, ostrożnie zawiesić agregaty biofilmu bez powstawania pęcherzyków i zmierzyć OD₄₀₅ , aby oszacować stężenie bakterii.
   UWAGA: W zasadzie mycie studni przed ilościową identyfikacją może pomóc usunąć komórki nieprzylegające. Jednak ponieważ biofilmy Leptospira wykazują słabą przyczepność w płytkach 96-dołkow, płukanie prowadziłoby do niekontrolowanej utraty materiału biofilmowego. Z tego powodu etap ponownego zawieszenia przeprowadzono bez wcześniejszego płukania, aby zapewnić powtarzalność między dołkami i stałe stężenia bakterii.
   Studnie kontrolne biofilmu zazwyczaj zawierają ~2 x 10⁸ leptospirów, które zostały wybrane jako standardowe inokulum do eksperymentów z infekcją chomika. To stężenie definiuje również docelową liczbę leptospirów planktonowych stosowanych jako kontroli. W przypadku uwzględnienia planktonu kontrolne przygotowuje się poprzez świeżą subkulturę Leptospiry w podłożu EMJH w warunkach wstrząsania w temperaturze 30 °C przez maksymalnie 5 dni, co odpowiada fazie wzrostu średniej do późnej wykładniczej, która daje podobną gęstość komórek.
3. Do szczepienia zwierząt używaj oddzielnych dołków do biofilmu (nie tych kontrolnych). Ostrożnie usuń 180 μL supernatantu z odwiertów, aby wyeliminować większość leptospirów w fazie ciekłej.
4. Zbieraj pozostałe 20 μL agregatów biofilmu za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μL, aby nie zakłócać struktury.
   UWAGA: Biofilm jest delikatny. Upewnij się, że agregaty są widoczne przed i po odbiorze. Przygotuj dodatkowe studnie na wypadek, gdyby wymagało powtórzenia.
5. Przełóż kruszywa do strzykawki z 300 μL świeżego medium EMJH. Pozwól kruszywom osiadać pod wpływem grawitacji.
6. Podłącz igłę 21 G i delikatnie usuń nadmiar EMJH, aż osiągniesz ostateczną objętość 200 μL. Upewnij się, że nie pozostaną pęcherzyki powietrza i że skupiska biofilmu pozostaną widoczne.
   UWAGA: Czekanie na ustabilizowanie się agregatów minimalizuje straty podczas korekty wolumenu. Przed użyciem in vivo sprawdź, czy kruszywa pozostają nienaruszone po przejściu przez igłę o masie 21 G (Rysunek 4C, D).
7. Wykonaj iniekcję wewnątrzotrzewnowną 2 leptospirów o pojemności 10⁸ w medium EMJH o pojemności 200 μL.
   UWAGA: Używaj 7-8 tygodniowych złotych chomików syryjskich (obu płci), utrzymywanych w standardowych warunkach mieszkaniowych. W przypadku kontroli negatywnej należy wstrzyknąć 200 μL medium EMJH tylko (jedno zwierzę na replikę).
8. Monitorowanie zwierząt dwa razy dziennie przez okres do 21 dni pod kątem klinicznych objawów leptospirozy (potargane futro, pokłon i zmniejszona reakcja na stymulację). Natychmiast uśpij przez wdychanie dwutlenkiem węgla, jeśli zaobserwuje się cierpienie, i zapisz czas eutanazji jako czas śmierci.
9. W dniu 21 uśpij wszystkie ocalałe zwierzęta.
   UWAGA: Wykonaj trzy niezależne biologiczne replikacje z hodowlami przygotowanymi w różne daty. Każda replika obejmuje dwa zwierzęta na każde schorzenie oraz jedno zwierzę z negatywną kontrolą.

Results

Gdy inokulum jest prawidłowo przygotowane, hodowle wchodzą w fazę środkową logariażu w ciągu 3-5 dni i wykazują wartości OD₄₀₅ ~ 0,2-0,4 przy jasnych, bardzo ruchomych polach pod mikroskopią ciemnego pola (≥ 90% komórek ruchomych) i bez widocznych grudek. Preparaty nieoptymalne objawiają się ospałymi bakteriami i niejednorodną ruchliwością w całym polu; Takie kultury często dają słabe biofilmy i powinny być wyrzucane. W praktyce potwierdzenie ruchliwości i przedawkowania obok siebie tuż przed siewem minimalizuje liczbę nieudanych występów. Ustanowienie tych bram kontroli jakości na etapie inokulum jest najlepszym wskaźnikiem sukcesu we wszystkich dalszych zastosowaniach. Chociaż metodologia została zoptymalizowana dla L. interrogans serovar Manilae L495, te same procedury zastosowano także do szczepu Leptospira biflexa Patoc, aby wykazać zastosowanie międzygatunkowe. L. biflexa zazwyczaj tworzy mniej spójne i cieńsze biofilmy w porównaniu do L. interrogans, jednak charakterystyczne cechy sekwencji rozwojowej i strukturalne pozostają wykrywalne przy odpowiednich korektach parametrów. Włączenie obu gatunków podkreśla zatem zdolność procesu do patogennych i saprofitycznych Leptospira .

Po 21 dniach statycznej inkubacji w temperaturze 30 °C w nawilżonej komorze (lub odpowiednim czasie dla stosowanego gatunku Leptospira ), biofilmy stają się widoczne gołym okiem zarówno na szklanych pokrywkach, jak i hydrofilowych membranach poliwęglanowych. Udany wzrost po 2-3 tygodniach prowadzi do charakterystycznych wzorców CV, takich jak kropkowate, rozgałęzione lub siatkowate ślady przymocowane do powierzchni (Rysunek 2A).

W typowym biegu dzikie typy L. interrogan Manilae L495 osiągają ~ 50% pokrycia powierzchni do 3. tygodnia, podczas gdy u mutantów o niskiej zawartości biofilmu zatrzymują się na poziomie blisko ~ 20%, a fenotypy o wysokiej zawartości biofilmu zbliżają się do ~70-80%, co ustanawia praktyczny zakres dynamiczny do przesiewu. Zakres tworzenia biofilmu może się również różnić w zależności od gatunku i szczepu Leptospira ; na przykład szczep L. biflexa Patoc szybciej wytwarza widoczne biofilmy, a wcześniejsze badania uznawały struktury już 120 godzin po inokulacji za dojrzałe biofilmy³⁵.

Barwienie kryształowego fioletu stanowi niezawodną i powtarzalną metodę ilościowego określania biomasy biofilmu. W dobrze rozwiniętych biofilmach barwienie powoduje głębokie fioletowe ubarwienie lokalizowane na powierzchni pokrywy lub błonie, co wskazuje na wysoki poziom przyłączonej biomasy (Rysunek 2A). Wskazówki wizualne podczas fazy barwienia i rozpuszczania również stanowią użyteczne wskaźniki sukcesu protokołu. Na przykład nierównomierne rozmieszczenie CV lub blade barwienia mogą być spowodowane niedosiewem, parowaniem lub agresywnym płukaniem powodującym odłączanie wczesnych biofilmów.

Odczyty absorpcji przy 570 nm odzwierciedlają ilość zatrzymanej barwnicy, a tym samym względną gęstość biofilmu (Rysunek 2B). W eksperymentach reprezentatywnych hodowle L. interrogans, hodowane w optymalnych warunkach, wykazują spójne i powtarzalne odczyty OD₅₇₀ w powtórkach, co odzwierciedla stabilną formację biofilmu. Natomiast duże różnice między replikami często obserwuje się, gdy próbki poddawane są nadmiernemu pipetowaniu podczas zmian medium, co wskazuje na słabą przyczepność lub częściowe odwarstwienie biofilmu. Taka zmienność powinna być traktowana jako oznaka problemów technicznych, a dotknięte próbki powinny być wyłączone lub procedura dokładnie przeanalizowana. Warto zauważyć, że L. biflexa Patoc tworzy bardziej rozbudowane biofilmy zarówno na szklanych pokrywkach, jak i membranach poliwęglanowych w podobnych warunkach, co odzwierciedla wyższe wartości absorpcji CV, co pokazuje, że protokół jest adaptowalny i skuteczny we wszystkich gatunkach Leptospira .

Udane przygotowanie SEM pozwala ujawnić osady macierzy zewnątrzkomórkowej już w trzecim dniu, po czym następuje uderzająco spolaryzowana architektura w dojrzałych biofilmach: szorstka, kanałowana powierzchnia podstawowa (często z kanałami > 5 μm), która kotwiczy porowatą strukturę wewnętrzną, oraz gładsza wierzchołkowa ściana, gdzie przełetki leżą splecione w gęstej matrycy (Rysunek 2C, D, E, F). Pola o dużym powiększeniu często rejestrują rozgałęzione włókna zewnątrzkomórkowe oraz okazjonalne grzybowate wypustki; cechy odpowiadające dynamice koalescencji obserwowanej przez timelapse (Wideo uzupełniające 1). W nieoptymalnych przygotowaniach można zaobserwować zwinięte macierze, naładowanie i niewyraźne kontury komórek, zwykle świadczące o niewystarczającym postfiksacji, niewystarczającej warstwie przewodzącej lub słabym schnięciu. Gdy widoczna jest polaryzacja bazalno-wierzchołkowa oraz wszechobecne kanały, odczyty SEM są ściśle zgodne z konfokalnymi szacunkami grubości i porowatości, potwierdzając pomyślne wykonanie zarówno przygotowania, jak i obrazowania.

W efektywnych seriach poklatkowych izolowane punkty pojawiają się w ciągu 24-72 godzin i stopniowo łączą się w większe agregaty, które przesuwają się po powierzchni, zanim ograniczenia przestrzeni spowolnią ich ruch (Rysunek 3A, B, C). Segmentacja ilościowa powoduje monotoniczny wzrost całkowitego obszaru objętości, podczas gdy suma rośnie, szczytuje, a następnie maleje, gdy kolizje i połączenia dominują między ~12 a 216 godzinami. Kinetyka ta (powierzchnia w górę, liczba agregatów w dół) wskazuje na aktywną akrecję, a nie na prostą sedymentację. Nieudane lub graniczne przejazdy nie mają wczesnych punktów punktowych, pokazują płaskie krzywe powierzchniowe w czasie lub cierpią na dryf ostrości związany z niestabilną temperaturą/wilgotnością. Utrzymanie stabilnego środowiska o temperaturze 30 °C przy wilgotności 95% oraz stosowanie autofokusa w każdym momencie zazwyczaj przywraca wyraźne trajektorie odpowiednie do porównywania mutantów lub zabiegów.

Reprezentatywne stosy Z z dojrzałych biofilmów wykazują pianowate, wielowarstwową architekturę zwykle przekraczającą 50 μm grubości, z większością komórek barwiących się żywo (SYTO 9-dodatnie) oraz sporadycznymi centralnymi pustkami wskazującymi na zbiorowe przemianowania podczas wzrostu (Rysunek 3D). Sondy matrycowe mogą być wykorzystywane do badania składu matrycy: WGA podkreśla epitopy polisacharydów, BOBO-3 oznacza obfitość DNA zewnątrzkomórkowego, a barwienia selektywne na białko dostarczają niewielki sygnał związany z komórką zewnętrzną (Rysunek 3E). Wyniki suboptymalne obejmują cienkie lub nieciągłe stosy zdominowane przez jodek propidiu, silne fotoblajchowanie lub niespójne ustawienia wzmocnienia, z których każdy podważa porównywalność ilościową. Interpretacja grubości, objętości biologicznej oraz stosunków żywych do martwych (przy jednoczesnym utrzymaniu stałej mocy lasera, wzmocnienia detektora i dziurki w różnych warunkach) potwierdza status dojrzewania i wspiera bezpośrednie porównania z ultrastrukturą SEM i biomasą CV.

Proces tworzenia biofilmu u Leptospira zazwyczaj przebiega według wyraźnych faz, choć dokładne czasy i wartości mogą się różnić w zależności od gatunku lub szczepu. Korzystając ze szczepu L. interrogans Manilae L495 jako odniesienia, przewidywana progresja przez 21 dni obejmuje początkową fazę (dni 0-3), podczas której bakterie pozostają głównie planktoniczne, z minimalnym biofilmem (Rysunek 4A). Następnie następuje wykładnicza faza wzrostu (dni 3-7), podczas której zarówno bakterie planktonowe, jak i związane z biofilmem zwiększają wzrost, osiągając około 9 x 10⁸ komórek/mL, a towarzyszy im tworzenie i rozszerzanie agregatów biofilmu. Między dniem 7 a 12 bakterie planktoniczne znacząco spadają na spadek, podczas gdy komórki związane z biofilmem osiągają szczyt, stanowiąc około 80% populacji. Wreszcie, w fazie dojrzewania (dni 12-21) liczba bakterii biofilmowych maleje bez wzrostu liczby komórek planktonowych, a jednak rozmiar i złożoność biofilmu nadal rosną. Obserwowanie tej sekwencji zmian wskazuje, że protokół skutecznie rejestruje dynamiczny rozwój i dojrzewanie biofilmów Leptospira .

Jeśli jest prawidłowo przeprowadzany, protokół infekcji wykorzystuje inokule zawierające ~2 x 10⁸ leptospiry w 200 μL EMJH, przygotowane z dobrze zdefiniowanych hodowli planktonu (5-dniowe) lub biofilmowego (21-dniowe). Chociaż te dwa typy hodowli reprezentują odrębne stany fizjologiczne, różnica ta jest celowa, ponieważ eksperyment ma na celu ustalenie, czy biofilmy Leptospira — charakteryzujące się obniżoną aktywnością metaboliczną i zróżnicowaniem strukturalnym — zachowują zdolność do inicjowania infekcji. Ten kontrast potwierdzają badania transkryptomiczne pokazujące istotne zmiany w ekspresji genów między planktoniczną a biofilmem Leptospira ^35,36. Agregaty biofilmowe są starannie pozyskiwane, aby zachować ich strukturę i pozostać nienaruszone po przejściu przez igłę 21 G, co potwierdzono przed wstrzyknięciem (Rysunek 4C, D). Po wstrzyknięciu dootrzewnewkowym, złote chomiki syryjskie zazwyczaj wykazują kliniczne objawy leptospirozy w ciągu 3 do 5 dni (np. ospałość, potargane futro, pokłon). Negatywne kontrole, które podawano wyłącznie podłoże EMJH, nie wykazują oznak choroby. Przebieg i nasilenie objawów klinicznych, a także czas do eutanazji, różnią się w zależności od inokulum: bakterie planktoniczne często wywołują wcześniejsze i bardziej ostre objawy, podczas gdy agregaty pochodzące z biofilmu mogą powodować opóźnione, lecz utrzymujące się zakażenie (Rysunek 4B). Monitorowanie dwa razy dziennie przez okres do 21 dni pozwala uchwycić pełny przebieg choroby.

Rysunek 2. Barwienie fioletowe, ilościowe i ultrastrukturalne obrazowanie biofilmów Leptospira. (A) Barwienie kryształowym fioletem (CV) biofilmów uprawianych na różnych podłożach. Barwienie CV pozwala na wizualizację architektury biofilmu oraz początkowych wzorców przyczepienia dla różnych gatunków i podłoży. i. L. interrogan na filtrze poliwęglanowym; ii. L. biflexa na filtrze poliwęglanowym; iii. L. interrogansa na szklanej pokrywce; iv. L. biflexa na szklanej pokrywce. (B) Przykład ilościowego powstawania biofilmu ocenianego przez absorpcję CV (OD570 nm) w czasie dla L. interrogans i L. biflexa. Ten odczyt kinetyczny rejestruje zarówno wczesną adhezję, jak i dynamikę akumulacji biomasy, podkreślając różnice w wzroście biofilmu między gatunkami patogenicznymi a saprofitycznymi. Ilustracja ta została zmodyfikowana na podstawie²⁷. (C-E) skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) biofilmów L. interrogans: (c) 3-dniowy biofilm pokazujący wczesne powstawanie mikrokolonii i początkowe osadzanie macierzy zewnątrzkomórkowej; (d) 14-dniowy biofilm prezentujący dojrzałą architekturę z rozległą organizacją matrycową i trójwymiarową; (e-f) 3-tygodniowy biofilm ilustrujący konsolidację strukturalną i dojrzewanie macierzy podczas długotrwałej hodowli. To połączenie barwienia CV, ilościowych pomiarów przedawkowania oraz obrazowania SEM zapewnia kompleksowy przegląd rozwoju biofilmu, od wczesnego przyłączenia po dojrzałą organizację ultrastrukturalną, umożliwiając bezpośrednie porównania między gatunkami i okresami trwania hodowli. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3. Wizualizacja powstawania biofilmu Leptospira .Obrazy z kontrastem fazowym uzyskane za pomocą BioStation pokazują wywoływanie biofilmu w (A) 48 h, (B) 96 h i (C) 144 h. (D) rekonstrukcja CLSM biofilmu Leptospira pokazująca całkowitą objętość biofilmu z ortogonalnymi fragmentami do wizualizacji 3D. (E) Konfokalne barwienie dojrzałego biofilmu DAPI (zielony) i WGA (czerwony), podkreślające komórki bakteryjne i składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta liczba została zmieniona z³⁷. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4. Ilościowa definicja w czasie frakcji planktonu i biofilmu oraz funkcjonalna ocena biofilmów Leptospira .(A) Kinetyka powstawania biofilmu mierzona przez absorpcję przy 405 nm. Dla każdego punktu czasowego pobierano odczyty z całkowitej studni, ułamku biofilmu oraz supernatantu zawierającego leptospiry planktonowe, co pozwalało rozróżnić bakterie przyczepione i swobodnie pływające. (B) Przykładowe krzywe przeżycia chomików wstrzykniętych agregatami biofilmu, leptospirów planktonowych lub kontroli EMJH. Zwierzęta poddane biofilmowi wykazują zmniejszoną zjadliwość, niektóre przeżywają aż 21 dni, podczas gdy leptospiry planktonowe powodują szybką śmiertelność. (C-D) Wstępna walidacja integralności biofilmu: kruszywa są widoczne w strzykawce przed wstrzyknięciem (C) i pozostają nienaruszone po przejściu przez igłę 21 G (D, białe strzałki), co potwierdza, że struktura biofilmu jest zachowana podczas manipulacji. Ta liczba została zmieniona z³⁶. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Discussion

Protokół ten przedstawia modułowy i integracyjny sposób badania biofilmów Leptospira, integrując ilościową biomasę (fiolet kryształowy)^9,27, dynamikę (kontrast fazowy poklatkowy), skład trójwymiarowy (konfokalna mikroskopia laserowa z celowanymi sondami)³⁸, ultrastrukturę (skaningową mikroskopię elektronową) oraz ocenę funkcjonalną (infekcja chomika). Stosując tę samą serię hodowli w modułach, minimalizowane są efekty wsadowe, a w ramach eksperymentu umożliwiana jest walidacja krzyżowa, co jest szczególnie ważne dla wolno rosnących, delikatnych spirochetów. Każdy moduł uzupełnia pozostałe: CV ilościowo określa "ile", time-lapse pokazuje "jak szybko", CLSM ujawnia "co jest w środku", SEM rozstrzyga "jak jest zbudowany", a testy in vivo dostarczają "dowodu funkcji". Wprowadzenie L. biflexa pokazuje elastyczność w różnych gatunkach, podkreślając szybsze i gęstsze tworzenie biofilmu oraz podkreślając elastyczność metodologiczną³⁵.

Sukces każdego modułu zależy od jakości inokulum i stanu fizjologicznego. Kultury planktoniczne w połowie logu (3-5 dni), bardzo ruchome i wolne od kruszyw, dają powtarzalną adhezję i rozwój biofilmu. Należy stosować jedynie izolaty o niskim przepuszczeniu, aby zapewnić solidne tworzenie i powtarzalność biofilmu.

Analiza CV opiera się na procesie pracy dzięki szybkości, skalowalności i przepustowości ^9,27. Umożliwia szybkie badanie mutantów, mediów lub związków antybiofilmowych. Jednak ponieważ biofilmy Leptospira są delikatne i niejednorodne, delikatna manipulacja i weryfikacja replik są niezbędne. CV nie potrafi rozróżnić architektur kompaktowych od porowatych ani wykryć składania macierzy — stąd jego rola jako bramki przesiewowej dla głębszych analiz strukturalnych.

Obrazowanie poklatkowe niweluje tę lukę, ujawniając kinetykę biofilmu w czasie rzeczywistym. Rejestruje on proces wyłaniania się, zlewania i unieruchamiania agregatów ruchomych, ujawniając zjawiska przejściowe, których testy końcowe pomijają. Stabilność środowiskowa (temperatura, wilgotność, autofokus) jest kluczowa. Te nagrania wykazały, że nawet gdy biomasa CV wydaje się stabilna, dynamika może się rozbieżać — wskazując na przekształcenia strukturalne lub utratę żywotności w głębszych warstwach.

CLSM dostarcza wglądu w objętość i chemię bez artefaktów odwodnienia³⁹. Barwienie żywe/martwe ujawnia gradienty żywotności komórek w biofilmie, co jest zgodne z doniesieniami o ograniczonej dyfuzji tlenu i stratyfikacji metabolycznej ^6,40. Lektyny i barwniki kwasów nukleinowych ujawniają obfitość DNA zewnątrzkomórkowego oraz specyficznych motywów glikanowych, co pozwala na ilościową identyfikację i charakteryzację składników matrycy^41,42. Dane CLSM często ujawniają wewnętrzne pustki, co odzwierciedla zbiorowe przearanżowania widoczne w time-lapse³⁸. Ograniczenia obejmują jednak specyficzność sondy, fotobielenie oraz rozdzielczość osiową ograniczoną dyfrakcją; Dlatego ustawienia mikroskopu i wydajność barwnika powinny być standaryzowane i testowane wcześniej, aby zapewnić wiarygodne, porównywalne wyniki w różnych eksperymentach.

SEM oferuje komplementarną rozdzielczość ultrastrukturalną⁴³. Na wczesnych etapach rozwiązuje się początkujące agregaty; W dojrzałości (≈ 15-21 dni) ujawnia spolaryzowaną architekturę: szorstką, kanałowaną warstwę podstawową do kotwiczenia i wymiany oraz gładką, wierzchołkową powierzchnię bogatą w matrycę³⁷. Ostrożna fiksacja, suszenie HMDS oraz korelacja z danymi konfokalnymi łagodzą artefakty spowodowane odwodnieniem lub zapadaniem^{się 44}.

Razem te cztery moduły umożliwiają wewnętrzną walidację krzyżową: gdy CV, CLSM i SEM się zbiegają, wnioski są solidne; Gdy się rozchodzą, same rozbieżności są pouczające – ujawniając na przykład zwiększoną biomasę przy zmniejszonej żywotności lub niezmienioną biomasę ze zmienionym składem matrycy.

Pozostało kilka wewnętrznych ograniczeń. Biofilmy Leptospiry są niejednorodne i delikatne, co czyni je wrażliwymi na dotykanie i odwodnienie. CV integruje całkowitą biomasę, ale nie żywotność¹⁶; CLSM nie może przekraczać limitów optycznych³⁸; SEM ryzykuje artefakty przygotowawcze. Śmiertelność w głębszych warstwach jest spodziewana ze względu na gradienty tlenu⁶, ale to ukierunkowanie jest systematyczne i porównywalne w różnych warunkach. Dojrzewanie biofilmu osiąga plateau około 15-21 dni, związane z transkrypcyjnymi sygnaturami ograniczenia składników odżywczych³⁶. Późniejsze etapy pozostają słabo scharakteryzowane.

Testy in vivo dostarczają kontekstu funkcjonalnego. Wstrzykiwanie agregatów wewnątrzotrzewnowkowo sprawdza, czy komórki pochodzące z biofilmu różnią się pod względem zjadliwości czy trwałości w porównaniu z odpowiednikami planktonicznymi. Chociaż inokulacja wewnątrzotrzewnowkowa nie jest naturalną drogą, oferuje kontrolowany model porównawczy³⁶. Heterogeniczność agregatu wprowadza pewną zmienność, ale konsekwentne traktowanie i dopasowany rozmiar inokulum łagodzą ten problem. Co istotne, cechy trwałości biofilmu (np. tolerancja na stres wywołana przez ECM) niekoniecznie przekładają się na zwiększoną ostrą zjadliwość, co podkreśla ekologiczną, a nie patogeniczną rolę powstawania biofilmu²⁴.

Modułowa konstrukcja umożliwia skalowalne użytkowanie. Do szybkiego testu wystarczy CV i time-lapse. Dla wglądu mechanistycznego CLSM i SEM dodają rozdzielczość kompozycyjną i architektoniczną. Moduły mogą integrować zaburzenia enzymatyczne lub chemiczne (DNaza, glikozydaza), alternatywne sondy glikany lub kwasy nukleinowe, a także systemy mikrofluidyczne do testowania odpowiedzi przepływu. To samo inokulum może zasilać analizy transkryptomiczne lub proteomiczne, bezpośrednio łącząc fenotyp biofilmu z regulacją (np. sygnalizacja c-di-GMP, reakcja głodowa). Ramy te umożliwiają również badania przesiewowe mutantów, testy perturbacji środowiskowych oraz ocenę związków antybiofilmowych lub przeciwwirusowych.

Ten zintegrowany przepływ pracy przekształca izolowane obserwacje w spójne, wielowymiarowe zrozumienie biofilmów Leptospira. Łącząc przepustowość (CV), dynamikę (time-lapse), chemię i głębię (CLSM) oraz ultrastrukturę (SEM), podejście to wiernie oddaje mobilną, porowatą i spolaryzowaną naturę społeczności Leptospira. Rozszerzając wcześniejsze badania 17,35,36, pokazuje, że skoordynowana, modułowa eksperymentacja ujawnia zjawiska niewidoczne dla badań jednometodowych — takie jak rosnąca biomasa mimo spadku żywotności czy rozbieżna kinetyka między gatunkami. Ostatecznie to podejście wspiera analizy porównawcze, powtarzalne i funkcjonalnie istotne dla gatunków, mutantów i schorzeń, stanowiąc podstawę dla mikrobiologii mechanicznej, odporności ekologicznej oraz projektowania strategii antybiofilmowych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 & mikro; M Sterylna Hydrofilowa Membrana Poliwęglanowa	it4IP	1000M25/861N101/13
Sterylna szklana pokrywa 12 mm	SPL	330164
16% paradehydu (PFA)	Thermo Scientific	28908
Igła 21G	BD Medical	304432
Mikropłytka 24-dołkowa	NUNC	143982
Naczynie o szklanym dnie 35 mm	Ibidi	81218-200
Szklane dno 35 mm Hi-Q4	Ibidi	81156
Mikropłytka 96-dołkowa	NEST	701001
Mocowanie antyfade medium	Biorad	29410
Powłoka węglowa	Leica Microsystem	Em ACE600
Śladnik CFDA/SE	Biolegenda	423801
Przewodzący klej węglowy	Nauka o mikroskopii elektronowej	77816
Kryształowy fiolet (CV)	Sigma	C3886
Mikroskop ciemnego pola	Leica Microsystem	11888846	Leica DM4000 B wyposażona w kondensator dark fiel (katalizator n&stupień; 11505142)
Etanol	VWR Chemicals	83813.36
FM4-64	Invitrogen	T3166
Kwas octowy lodowcowy	Supelco	1.00063
Roztwór glutaraldehydu	Sigma-Aldrich	G5882
Heksametyldisilazana	Acros Organics	120581000
Inkubator	Memmert	IN30
Odwrócony mikroskop konfokalny	Leica Microsystem	Leica DMI6000 TCS SP8 X	Mikroskop konfokalny SP8
Odwrócony mikroskop wyposażony w optykę fazową z kontrastem	Nikon	CELL-S2	BioStation IM-Q
Leptospira Medium Base EMJH	Becton Dickinson	BD  279410	Medium EMJH dla Leptospiry
Czterotlenek osmu (OsO4)	Sigma	BCCG9181
Propidium jodek & nbsp;	Biot	40017
Skaningowy mikroskop elektronowy	JEOL	JSM-IT300
Bufor kakodylatan sodu	Chemikalia termonaukowe	15453149
Spektrofotometr Varioskan Lux	Thermo Scientific	VLBL00GD0
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym	Biosolve	0016232301BS
Strzykawka (1 mL)	Chirana	CH03002L
SYTO9 zielone fluorescencyjne barwienie kwasem nukleinowym	Invitrogen	S34854