Artykuł metodologiczny

Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69531

⸱

6 stycznia 2026

 ,  ,  , 
1London Centre for Nanotechnology, University College London, 2Department of Chemistry, University College London

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten określa procedurę wykonywania głębokiej, całkomórkowej mikroskopii lokalizacyjnej pojedyncząsteczkowej (SMLM) za pomocą obrotowego mikroskopu konfokalnego z optycznym przesunięciem fotonów, co umożliwia obrazowanie DNA-PAINT bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy złożonego oświetlenia.

Streszczenie

Mikroskopia lokalizacyjna pojedynczątkowa (SMLM) umożliwia obrazowanie struktur komórkowych na nanoskalę, ale zazwyczaj ogranicza się do obrazowania w pobliżu pokrywy ze względu na ograniczenia całkowitej fluorescencji odbicia wewnętrznego (TIRF) oraz oświetlenia wysoko nachylonego i optycznego (HILO). Przedstawiono tutaj protokół wykorzystujący obrotowy dyskowy mikroskop konfokalny wyposażony w optyczną realokację fotonu (SDC-OPR) do przeprowadzania SMLM w całych komórkach. Metoda ta umożliwia wysokoprecyzyjne obrazowanie pojedynczych cząsteczek w całej objętości komórki, wykorzystując akumulację punktów DNA do obrazowania w topografii nanoskalowej (DNA-PAINT) bez potrzeby stosowania niestandardowej optyki czy skomplikowanych schematów oświetlenia. Protokół zawiera krok po kroku przewodnik po konfiguracji komercyjnie dostępnego obrotowego mikroskopu dyskowego (np. CSU-W1 SoRA) do obrazowania SMLM, w tym parametry akwizycji zoptymalizowane pod kątem obrazowania głębokiego. Opisano kroki przygotowania próbek do oznaczania celów wewnątrzkomórkowych sondami sprzężonymi z DNA do wykonania obrazowania DNA-PAINT, w tym strategie wielokolorowego obrazowania kilku celów. Po akwizycji obrazu następuje lokalizacja i rekonstrukcja pojedynczych cząsteczek przy użyciu standardowych pakietów oprogramowania. Omawiane są również kluczowe kwestie minimalizujące tło, optymalizację rozdzielczości bocznej oraz zapewnienie jakości obrazowania na całej głębokości komórki. Ten dostępny protokół pozwala badaczom na wykonywanie głębokiego, całokomórkowego SMLM przy użyciu standardowego sprzętu konfokalnego, rozszerzając zakres pytań biologicznych możliwych do rozwiązywania obrazowania pojedynczątkowym poza obszary bliskie błonie.

Wprowadzenie

Mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek (SMLM)1 to rodzina technik superrozdzielczości, które osiągają rozdzielczość na skali nanoskali poprzez rozdzielanie emisji pojedynczych fluoroforów w czasie i lokalizację ich z dużą precyzją. Udane SMLM wymaga wysokiego stosunku sygnału do szumu (SNR) do wykrywania zdarzeń pojedynczych cząsteczek, co tradycyjnie ograniczało jego zastosowanie do układów optycznych zapewniających intensywną, lokalną wzbudzę. Najczęściej spotykane konfiguracje to mikroskopia całkowitej fluorescencji wewnętrznej (TIRF)2 oraz oświetlenie optyczne z dużym nachyleniem laminowanej folii optycznej (HILO)3. TIRF redukuje fluorescencję tła poprzez tworzenie pola unikającego, które selektywnie pobudza fluorofory w odległości kilku nanometrów od pokrywy, tłumiąc tym samym nieostre oświetlenie. Jednak to ograniczenie sprawia, że TIRF nie nadaje się do obrazowania głębszych struktur biologicznych, takich jak organelle sięgające do domeny zewnątrzkomórkowej. Mikroskopia HILO zapewnia większą głębokość penetracji, umożliwiając obrazowanie kilkuset nanometrów powyżej szkła podłoża. Odbywa się to kosztem zmniejszonego pola widzenia (FOV)4 oraz nierównego oświetlenia przy coraz wyższych płaszczyznach, co ogranicza zastosowanie w większych strukturach komórkowych. W ostatnich latach techniki mikroskopii świetlnej (LSM), takie jak lattice light sheet 5,6,7 oraz jednoobiektywowa mikroskopia oświetleniowa jednopłaszczyznowa (soSPIM)8, rozszerzyły SMLM o obrazowanie wolumetryczne i tkankowe. Poprzez kształtowanie wiązki wzbudzającej w cienkie, ustrukturyzowane arkusze światła, LSM osiąga optyczne przekroje przy zmniejszonym tle i fototoksyczności. SoSPIM rejestruje płaszczyzny ogniskowe prostopadłe do osi detekcji w jednej ekspozycji, umożliwiając szybkie obrazowanie objętościowe z niemal izotropową rozdzielczością. Aplikacja soSPIM wykazała 3D SMLM w całych komórkach i małych organellach (głębokość >20 μm) z izotropową rozdzielczością do 40 nm orazminimalnym tłem poza ostrością 9. Pomimo swoich mocnych stron, metody te zazwyczaj wymagają przezroczystych próbek, specjalistycznej optyki i złożonego wyrównania, a także pozostają wrażliwe na aberracje optyczne i rozpraszanie w grubszych próbkach.

Mikroskopia konfokalna oferuje alternatywę poprzez odrzucanie światła nieostrego za pomocą otworu przed detektorem, połączonego z lustrzami ultrazkumawiającymi10. Ta możliwość optycznego przecinkowania umożliwia obrazowanie głębokie objętościowe z wysokim SNR. W szczególności mikroskopia obrotowa dyskowa konfokalna (SDC) łączy szybkość i szerokokątne wykrywanie konwencjonalnego obrazowania z możliwością sekcjonowania systemów punktowego. W konwencjonalnym SDC osiąga się to poprzez zastosowanie obracającego się dysku z równoległymi otworkami, często połączonego z wyrównaną matrycą mikrosoczewek. Mikrosoczewki zbierają znaczną część emitowanej fluorescencji i skupiają ją przez otworki, co zmniejsza sygnał tła. Ta konfiguracja zapewnia szybkie przekrojowanie optyczne bez potrzeby specjalistycznej optyki czy dodatkowego przygotowania do montażu próbki, co czyni ją solidnym wyborem, który można łatwo zaimplementować i zoptymalizować do głębokiego przechwytu obrazu SMLM11.

W tym badaniu zastosowano konfokalny skaner CSU-W1 z obrotowym dyskiem wyposażonym w optyczną realokację fotonu (SDC-OPR). W przeciwieństwie do standardowego SDC, SDC-OPR wprowadza drugą matrycę mikrosoczewek, która projektuje emitowane fotony na komplementarny wzór dziurki12, aby ograniczyć rozpraszanie i odzyskać fotony, które w innym przypadku zostałyby odrzucone. To przesunięcie fotonu skutecznie wyostrza funkcję rozpraszania punktu (PSF), zwiększając rozdzielczość boczną ponad konwencjonalne SDC, jednocześnie odrzucając światło nieostre13. Konkretnie, matryca mikrosoczewek SDC-OPR przekierowuje fotony poza osią do ich najbliższych punktów początkowych, skutecznie zwiększając wykrytą jasność fluorescencji w porównaniu ze standardowym SDC. Ponadto korzyści z rozdzielczości SDC-OPR można wzmocnić poprzez dekonwolucję obrazu. Iteracyjne algorytmy dekonwolucyjne doprecyzownie udoskonalają PSF, redukują tło i poprawiają stosunek sygnału do tła bez konieczności zmiany konfiguracji optycznej. To połączone podejście daje znaczącą przewagę w zakresie precyzji lokalizacji w porównaniu ze standardowym SDC dla eksperymentów lokalizacji pojedynczych cząsteczek14.

Przedstawiono tutaj solidny i powtarzalny protokół mikroskopii lokalizacji pojedyncząsteczki z użyciem obrotowego mikroskopu dyskowego konfokalnego wyposażonego w optyczną realokację fotonu (SDC-OPR). To podejście łączy precyzję DNA-PAINT na skalę nanoskalową z prędkością, kątem pola widzenia i głębokością penetracji obrazowania dysku obrotowego. DNA-PAINT, adaptacja akumulacji punktów do obrazowania topografii nanoskalowej (PAINT)15, opiera się na tymczasowej hybrydyzacji fluorescencyjnie oznakowanych "nici" obrazujących się z komplementarnymi "dokującymi" nici zakotwiczonymi w celach molekularnych. Te odwracalne zdarzenia wiązania generują stochastyczne sygnały fluorescencji, które można precyzyjnie zlokalizować, umożliwiając wysokorozdzielczą rekonstrukcję ultrastruktury komórkowej. DNA-PAINT umożliwia użycie wysoce fotostabilnych fluoroforów, zapewnia kinetykę regulowania wiązania do precyzyjnej kontroli warunków obrazowania oraz łagodzi fotobielenie poprzez ciągłe uzupełnianie nici fluorescencyjnychobrazujących 16.

Aby zapewnić powtarzalność i swoistość, podejście opiera się na niestandardowych sprzężeniach DNA-przeciwciała, które łączą nici dokujące z przeciwciałami wtórnymi. Przedstawiono szczegółowe kroki przygotowania próbki, w tym koniugację przeciwciał z DNA, aby wspierać solidne wyniki eksperymentalne. Protokół jest weryfikowany na dobrze scharakteryzowanych strukturach komórkowych, takich jak jądrowe kompleksy porowe (NPC)17 oraz mikrotubule w próbkach stałych, co stanowi punkt odniesienia do oceny dokładności rekonstrukcji. Zmiany rozdzielczości, określane za pomocą precyzji lokalizacji jako pośredniego, są dodatkowo oceniane w zależności od FOV i głębokości obrazowania.

Ponadto efektywność tego procesu dla obrazowania multipleksowanego jest demonstrowana za pomocą Exchange-PAINT18, strategii umożliwiającej sekwencyjną wizualizację wielu celów z tym samym barwnikiem i jednym źródłem laserowym opartym na DNA-PAINT. Workflow Exchange-PAINT jest stosowany do wielokolorowego obrazowania mitochondriów, mikrotubul i NPC w tej samej próbce.

Razem protokół ten dostarcza kompleksowych wskazówek i kluczowych notatek dotyczących adaptacji dotyczących konjugacji przeciwciał i DNA, przygotowania próbki, warunków obrazowania oraz analizy danych, umożliwiając badaczom wykonywanie powtarzalnego obrazowania DNA-PAINT na SDC-OPR. Poprzez rozszerzenie obrazowania o wysokiej rozdzielczości poza ograniczenia głębokości i widzenia charakterystyczne dla podejść opartych na TIRF, metoda ta poszerza zastosowanie SMLM na szeroki zakres kontekstów biologicznych.

Protokół

Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie buforów

  1. Przygotowanie bufora cytoszkieletu (CB):
    1. Przygotuj 10 mM MES (pH 6,1) z 150 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5 mM D-glukozy i 5 mM MgCl2 w 1x przefiltrowanym roztworze buforu fosforanowym (PBS).
    2. Przechowuj w temperaturze 4 °C i filtruj przed użyciem.
  2. 40x przygotowanie bulionu z kwasem protokatechuowym (PCA):
    1. Rozpuścić 154 mg PCA w 10 ml destylowanej, przefiltrowanej wody.
    2. Ustawij pH do 9,0 z NaOH.
    3. Zachowaj w temperaturze -20°C maksymalnie przez 6 miesięcy.
      UWAGA: Jeśli jakaś aliquot wydaje się brązowa, wyrzuć ją, ponieważ wskazuje to na utlenianie.
  3. 100x protokatechuat-3,4-dioksygenaza (PCD) przygotowanie zapasów:
    1. Przygotuj roztwór glicerolu 50% z 50 mM KCl, 1 mM EDTA i 100 mM buforu Tris.
    2. Rozpuszcz 2,2 mg PCD w 3,4 ml roztworu glicerolu.
    3. Zachowaj w temperaturze -20 °C maksymalnie przez 6 miesięcy.
  4. 100x przygotowanie bulionu Trolox:
    1. Rozpuszcz 50 mg Troloksu (6-hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy) w 215 μl metanolu, aż roztwór stanie się zielony w chemicznym okapu, używając odpowiedniego sprzętu ochronnego (PPE).
    2. Dodaj 1,6 mL wody destylowanej, przefiltrowanej. Pozwól, by roztwór zbielał i zaczął się zastygać.
    3. Dodaj 175 μL 1M NaOH 1M. Pozwól, by roztwór znów zaczął się zmieniać w ciek.
    4. W objętościach 10 μL kontynuuj dodawanie 1 M NaOH, aż roztwór całkowicie się przeklarzy (około 40 μL).
    5. Zachowaj w temperaturze -20 °C maksymalnie przez 6 miesięcy. Ostateczne rozwiązanie wydaje się żółtawe.
      UWAGA: Ostateczny roztwór 100x ma pH 11, ale rozcieńczenie do 1x daje pH 7-8.
  5. Bufor C+
    1. Przygotuj 1 mM EDTA, 500 mM NaCl i 0,02% Tween-20 w 1x PBS.
    2. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą HCl i/lub NaOH, jeśli jest to wymagane.
    3. Opcjonalny suplement Trolox: Dodaj wymagane ilości zapasów PCA (40x), PCD (100x) i Trolox (100x), aby uzyskać 1x rozcieńczenie, pozostawić roztwór do wyrównania przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (23 °C) przed użyciem.
      UWAGA: Przygotowuj świeżo co tydzień. Jeśli używasz Troloxu, użyj go w ciągu 4 godzin od miksowania.
  6. Bufory immunobarwiające (paraformaldehyd PFA, glicyna i tryton):
    1. Dla przygotowania 4% PFA z ampułki 10 ml 16% PFA:
      1. W okapie chemicznym ostrożnie otwórz ampułkę.
      2. Przelej 10 mL 16% PFA do stożkowej rurki odśrodkowej o pojemności 50 mL.
      3. Wykonaj rozcieńczenie 1:4 w 1x PBS, aby uzyskać 4% PFA, ostrożnie dodając ~30 mL 1x przefiltrowanego PBS do przelewanego 16% PFA, aby końcowa objętość wynosiła ~40 mL.
      4. Umieść w rurkach mikrowirówek o pojemności 1 mL i przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu potrzeby.
    2. Dla 60 mM glicyny w przygotowaniu PBS:
      1. Waż 225 mg glicyny w stożkowej rurce odśrodkowej o pojemności 50 mL.
      2. Dodaj 50 mL 1x filtrowanego PBS.
      3. Wiruj aż do pełnego wymieszania i przefiltruj.
      4. Przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu potrzeby.
    3. Dla przygotowania Triton X-100 0,1%:
      1. Najpierw przygotuj roboczy zapas 10% Triton X-100, rozcieńczając 1 mL 100% Triton X-100 do 9 ml 1x przefiltrowanego PBS (ostateczna objętość = 10 mL), pipetuj i powoli mieszaj, aby zapobiec nadmiernemu bąbelkowaniu. Przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu potrzeby.
      2. Z 10% gotowych zapasów dodaj 0,1 mL 10% Triton X-100 do 9,9 mL 1x filtrowanego PBS dla końcowego zapasu 0,1%, ponownie mieszaj powoli. Przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu potrzeby.

2. Koniugacja przeciwciał z DNA

  1. Skoncentruj przeciwciało za pomocą odśrodkowego filtra ultrafiltracyjnego o mocy 100 kDa:
    1. Płucz jednostkę odśrodkową ultrafiltracji o mocy 100 kDa 100 μL 1 x filtrowanego PBS przez 30 minut przy 14 000 x g, 4 °C.
    2. Dodaj 100 μL przeciwciała z 200 μL 1x filtrowanego PBS do wcześniej umytej jednostki odśrodkowej ultrafiltracji o mocy 100 kDa, obróć przez 30 minut przy 14 000 x g, 4°C. Upewnij się, że stężenie przeciwciał przekracza 1,5 mg/mL po stężeniu za pomocą filtra odśrodkowego ultrafiltracyjnego. W tej metodzie filtr odśrodkowy ultrafiltracyjny zwykle koncentruje przeciwciało ~3x.
    3. Odwróć odśrodkową jednostkę filtra ultrafiltracyjnego o mocy 100 kDa do czystej rurki, obróć przez 6 minut przy 1000 x g, 4 °C. To jest skoncentrowane przeciwciało w PBS.
    4. Zmierz objętość skoncentrowanego przeciwciała (1 lub 2 μL) w celu obliczenia nowego stężenia i wykonaj spektrum absorpcji UV-Vis za pomocą spektrofotometru UV-Vis mikroobjętościowego. Ustaw tło na 1x PBS i zapisz widma.
  2. Redukuj nić dokującą tiolowane DNA:
    1. Rozpuszcz 7,7 mg wcześniej zważonego DTT w 100 μL przefiltrowanej wody i przelej do świeżej rurki.
    2. Dodaj 100 μL 3 mM EDTA w 1x PBS do oryginalnej rurki DTT, wiru i przenieś do tej samej rurki co krok 2.2.1, co daje 200 μL 250 mM DTT w 1,5 mM EDTA w 1x PBS.
    3. Rozpuszcz tiolowaną nić DNA w 1x filtrowanym PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. Zapisz widma UV-Vis roztworu dokującego nici DNA (rozcieńczony do 10 μM w 1x PBS) i zapisz je za pomocą spektrofotometru UV-Vis mikroobjętościowego.
    4. Wymieszaj 13 μL tiolowanego DNA (1 mM) z 30 μL DTT (250 mM), wstrząśnij przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (23 °C).
      UWAGA: Przechowywać pozostałe niewykorzystane nici dokujące DNA w alikwotach 13 μL w temperaturze -20 °C na potrzeby przyszłych reakcji.
  3. Koniugacja przeciwciał z sieciatorem:
    1. Rozpuszczać maleimid-PEG2-sukcynimidylowy ester w DMSO do 10 mg/mL (23,5 mM). Przechowuj w alikwotach 10 μL w temperaturze -20 °C do czasu zapotrzebowania.
    2. Wymieszaj skoncentrowane przeciwciało z etapu 2.1 z 20x nadmiarem molowym crosslinkera. Inkubuj przez 90 minut, potrząsając się, w temperaturze 4 °C.
  4. Oczyszczaj filtrowanie przeciwciał i crosslinkera za pomocą kolumny odsolniającej spin o mocy 7,0 KDa zawierającej żywicę wykluczającą rozmiar (7 kDa odcięcie masy cząsteczkowej):
    1. Zdejmij dolne zamknięcie kolumny odsalania 7,0 kDa i poluzuj pokrywkę. Włóż go do mikrowirówki z białkiem o niskim wiązaniu. Wirówka przez 1 minutę w 1500 x g, 4 °C.
      UWAGA: Po pierwszym obrocie zaznacz nachylenie żywicy. We wszystkich kolejnych zastosowaniach kolumny umieść pochylenie skierowane bezpośrednio na zewnątrz na wirówkę. Nakładaj próbki i washe na środek i unikaj kontaktu z żywicznym łóżkiem.
    2. Dodaj 300 μL 1 x przefiltrowanego PBS do kolumny odsalania o mocy 7,0 kDa, poluzuj pokrywkę, wiruj przez 1 minutę przy 1500 x g, 4 °C. Powtórz jeszcze dwa razy.
      UWAGA: Pozostawić kolumnę odsolniającą spin o mocy 7,0 KDa z 300 μL 1x PBS do czasu przygotowania reakcji przeciwciało-krzyżowodlak; Nie pozwól, by kolumna wyschła.
    3. Usuń ostatnie 300 μL płukania PBS, wirując ponownie przez 1 minutę w 1500 x g, 4 °C.
    4. Roztwór przeciwciało-crosslinker należy nałożyć na środek warstwy żywicy kroplą. Włóż kolumnę odsolniającą o mocy 7,0 kDa do czystej rurki mikrowirówki, wiruj przez 2 minuty w temperaturze 1500 x g, 4 °C. Produkt przeciwciało-crosslinker znajduje się obecnie w rurce mikrowirówki; trzymaj się 4 °C lub trzymaj na lodzie.
  5. Oczyść mieszaninę DNA-DTT za pomocą kolumn spinowych odsolających za pomocą Sephadex G-25 (żywica wykluczająca rozmiar do oczyszczania DNA):
    1. Vortex odsolania kolumn spinowych (oczyszczanie DNA), aby żywica była równomiernie rozłożona. Zdejmij dolny zamek, poluzuj nakrętkę i włóż ją do czystej rurki mikrowirówki.
    2. Wirówka odsalnia kolumny wirowe (oczyszczanie DNA) w ilości 735 x g przez 1 minutę, aby usunąć bufor magazynowy.
    3. Umieść kolumny spinowe do odsolania (oczyszczanie DNA) do świeżej rurki mikrowirówki i powoli dodawaj mieszaninę DNA/DTT do środka żywicy. Wiruj w 735 x g przez 2 minuty. Oczyszczone, zredukowane DNA będzie teraz w rurce mikrowirówki.
  6. Łącz DNA i produkty z przeciwciałami:
    1. Dodaj zredukowane DNA do produktu przeciwciało-crosslinker przy 10-krotnym nadmiarze DNA:przeciwciało. Natychmiast po oczyszczeniu zmieszaj oczyszczone DNA z produktem przeciwciało-crosslinker. To zapobiega ponownemu wiązaniu DNA.
    2. Inkubować przez noc, drżąc, w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Wymieszaj DNA i przeciwciała późnym popołudniem i natychmiast oczyszcz je następnego ranka. Długotrwała inkubacja DNA i przeciwciał może skutkować wysokim stosunkiem DNA:przeciwciała.
  7. Usuń nadmiar DNA za pomocą odśrodkowego filtra ultrafiltracyjnego 100 kDa następnego ranka:
    1. Przemyj jednostkę odśrodkową ultrafiltracji 100 kDa 300 μL 1x filtrowanego PBS przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g, 4 °C.
    2. Dodaj mieszaninę DNA i przeciwciał z 300 μL 1x filtrowanego PBS do odśrodkowej jednostki odśrodkowej ultrafiltracji o mocy 100 kDa i wiruj przez 30 minut w temperaturze 14 000 x g, 4 °C.
    3. Odwróć jednostkę filtra odśrodkowego do czystej rurki, obróć przez 6 minut przy 1000 x g, 4 °C. To jest produkt skoncentrowany w PBS.
    4. Rozcieńcz produkt do 100 μL w 1x przefiltrowanym PBS.
    5. Zapisz widma UV-Vis produktu (1 lub 2 μL) za pomocą spektrofotometru UV-Vis mikroobjętościowego, z tłem 1x PBS, i zapisz widma.
    6. Zmierz końcowe stężenie i stosunek DNA do przeciwciał na podstawie widm. Obserwuj przesunięcie szczytu absorpcji przeciwciała z 280 nm do 260 nm, spowodowane dodatkową absorbencją DNA. Użyj kroku 2.8, aby określić stężenie i stosunek DNA:przeciwciała.
    7. Przechowywać produkt w pierwotnych warunkach przechowywania użytego przeciwciała. Jeśli zamarzasz, unikaj cykli zamrożenia i rozmrażania.
  8. Oblicz stosunek DNA:przeciwciała na podstawie widm UV-Vis:
    1. Z widm czystego DNA (10 μM w 1x PBS) zmierz wartości absorpcji przy 260 nm (Równanie 1) i 280 nm (Równanie 2). Podziel je przez stężenie DNA (10 μM), aby znaleźć molowe współczynniki absorpcji DNA (Równanie 3 i Równanie 4).
    2. Powtarzaj, aby przeciwciało znalazło Równanie 5 i , Równanie 6pamiętając o dzieleniu przez stężenie przeciwciał użytych do widm.
    3. Z widm produktów wynika, że absorpcja na 260 nm i 280 nm zależy zarówno od absorpcji DNA, jak i przeciwciała:
      Równanie 7
      Równanie 8
      Gdzie cDNA i cAb to odpowiednio stężenia DNA i przeciwciał w produkcie końcowym. Rozwiązuj te równania jednocześnie, aby znaleźć stężenie molowe zarówno DNA, jak i przeciwciał w produkcie. Oblicz stosunek DNA:przeciwciało na podstawie tych stężeń.
      UWAGA: Stężenie przeciwciała dla pierwszych widm można obliczyć, mierząc objętość przeciwciał pozostałych po filtracji za pomocą ultrafiltracji odśrodkowej jednostki filtracyjnej 100 kDa i porównując ją z pierwotną objętością (o znanym stężeniu) użytego przeciwciała.

3. Hodowla komórkowa

  1. Komórki HeLa Kyoto mEGFP-Nup107.
    1. Przygotuj zapas pożywki hodowlanej komórek, Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM), uzupełnionej o 10% surowicę płodową bydła (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny (P/S), i przechowuj ją w temperaturze 4 °C. Podgrzej podłoże 30 minut przed użyciem w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. W zależności od warunków pracy zaleca się stosowanie aliquotów i filtrowania odpowiedniej ilości, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
    2. Komórki nasienne w ilości 2 x 105 komórek /mL w 7 mL podgrzanego, uzupełnionego podłoża DMEM w kolbach T25. Umieść kolby w odpowiednim inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 .
    3. Zapewnij przejazd co 48-72 godziny, aby zapobiec przeładowaniu.
      1. Weź kolbkę T25 zawierającą konfluentną kulturę i aspiruj medium z piersiówki.
      2. Pipett 1 mL trypsyny EDTA (TE), zapewniając pełne pokrycie poprzez delikatne przechylenie piersiówki. Inkubuj w 37 °C przez 7 minut, aby umożliwić odłączenie komórek od kolby.
      3. Dodaj 2 mL suplementowanego medium DMEM i trituratuj.
      4. Przełóż zawiesinę ogniwa do stożkowej rurki odśrodkowej o pojemności 15 mL z dodatkowymi 7 ml podłoża DMEM.
      5. Wiruj w 400 x g przez 5 minut. Dokładnie sprawdź, czy na dnie rurki nie powstają granulki, nie naruszając jej.
      6. Aspiruj podłoże i ponownie zawiesij granulki komórkowe w podłożu uzupełnionym DMEM.
      7. Rozsiewaj 2 x 10komórek/ mL w nowej kolbie T25 zawierającej 7 mL podgrzanego media. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
        UWAGA: Jeśli nie jesteśmy pewni gęstości komórek, można użyć hemocytometru, aby określić liczbę komórek. Zaleca się rozpoczęcie od 1 ml zawieszenia granulatów przed liczeniem.
  2. Ogniwa U2OS CRISPR mEGFP-Nup96
    1. Przygotuj 10% FBS i 1% P/S uzupełnione materiały 5A McCoya, zgodnie z krokiem 3.1.1.
    2. Komórki nasienne w ilości 2 x 105 komórek /mL w 7 mL uzupełnionego podłoża McCoy's 5A w kolbkach T25. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
    3. Przejście co 48 godzin, aby utrzymać wzrost kultury poniżej 80% zbiegu:
      1. Aspiruj podłoże z kolby i delikatnie myj przylegającą hodowlę 2 mL filtrowanego, wcześniej podgrzanego (37 °C) 1x PBS.
      2. Aspiruj PBS i dodaj 2 ml Accutazy, powoli przechylając kolbę, aby zapewnić pełne pokrycie, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 7 minut.
      3. Dodaj 2 mL uzupełnionego medium McCoy's 5A i potrójnie zrób.
      4. Dodaj 7 mL medium do zawiesiny ogniwowej i przelej je do stożkowej rurki odśrodkowej o pojemności 15 mL lub 50 mL do wirowania. Wiruj w 400 x g przez 5 minut i sprawdź tworzenie granulek na dnie rurki.
      5. Ponownie zawiesij granulki komórkowe w uzupełnionym medium 5A McCoya.
      6. Nasiać w 2 x 105 komórek /mL w nowej kolbie T25 z 7 mL podgrzewanym podłożem. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5%CO2.
        UWAGA: Podgrzej wszystkie roztwory dodane do komórek do 37 °C w kąpieli wodnej lub koralikowej. W przypadku Accutase podgrzewaj tylko 2 mL aliquotów nie dłużej niż 5 minut, aby uniknąć degradacji.

4. Immunobarwienie Nup96, mitochondriów i mikrotubul

  1. Przygotowanie komórek U2OS mEGFP-Nup96
    1. Zgodnie z krokami opisanymi w kroku 3.2, zasysaj medium z kolby T25 i delikatnie umyj przyklejone komórki 2 ml 1 razy przefiltrowanego PBS.
    2. Aspiruj PBS i dodaj 2 mL Accutazy, powoli przechylaj kolbę w górę i w dół, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez 7 minut, aby wspomóc odłączenie komórek.
    3. Dodaj 2 mL uzupełnionego medium McCoy's 5A i potrójnie zrób.
    4. Zawiesina ogniwa górnego z 7 mL uzupełnionego medium McCoy's 5A i przelać je do stożkowej rurki odśrodkowej o pojemności 15 mL lub 50 mL przed wirowaniem w dawce 400 x g przez 5 minut. Ponownie sprawdź, czy na dnie rurki nie powstają granulki.
    5. Ponownie zawiesij granulki komórkowe w uzupełnionym medium 5A McCoya.
    6. Komórki nasienne o wielkości 1 x 105 komórek /mL w mikroslajdach z 8 dołkami i inkubują w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5%CO2) przez noc.
      UWAGA: Komórki nasienne 24 godziny przed zabiegiem fiksacji i immunobarwienia, aby umożliwić przyleganie.
  2. Immunobarwienie komórek U2OS mEGFP-Nup96 do obrazowania Nup96
    1. Po inkubacji nocnej zastąpić medium McCoy's 5A w mikroslajdach z 8 dołkami na 1x filtrowany PBS. W szybkim tempie wciągaj PBS i dodaj podgrzany (37 °C) 4% roztwór utrwalający PFA do chemicznego okapu spalinowego.
    2. Pozwól ogniwom utrwalić się przez 30 minut w temperaturze pokojowej (23 °C), najlepiej w okapie chemicznym, zanim PFA zostanie umyte i odpady zostaną wyrzucone. Wszystkie kroki można teraz wykonywać w temperaturze pokojowej, chyba że zaznaczono inaczej.
    3. Usuń 4% roztwór utrwalający PFA i umyj szkiełko 3x 3 minuty 1x PBS.
      UWAGA: Używaj PFA w okapie chemicznym podczas używania odpowiedniego sprzętu ochronnego.
    4. Po utrwaleniu przepuszcza błonę komórkową, dodając 0,1% Triton X-100 w 1x roztworze PBS. Pozwól odstać 5 minut, potem myj 3 x 3 minuty 60 mM glicyny w 1x PBS, aby stłumić autofluorescencję pozostałości PFA.
      UWAGA: Roztwór permeabilizacji trytonów jest niezwykle czasowo wrażliwy i może wpłynąć na integralność struktury komórki, jeśli pozostanie zbyt długo.
    5. Dodaj 5% BSA do 1x PBS przez 1 godzinę w ciemności, aby zablokować komórki przed immunobarwieniem.
    6. Przygotuj 20 nM DNA-sprzężonego nanononiku anty-GFP w roztworze blokującym (5% BSA w 1x PBS), aby zapobiec niespecyficznemu blokowaniu wiązania. Inkubuj preparat z mieszanką nanonoioidów przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (23 °C), a następnie myj niezwiązane nici DNA 3 x 3 minuty 1x filtrowanym PBS.
      UWAGA: Punkt zatrzymania: Po utrwaleniu, zablokowaniu i dodaniu przeciwciał próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Ten punkt przerwy jest uwzględniony głównie ze względu na czas potrzebny na przygotowanie próbki, a nie jest to ścisła konieczność protokołu. Obrazowanie może być przeprowadzone natychmiast po tych etapach, jeśli jest to preferowane.
  3. Immunobarwienie komórek U2OS mEGFP-Nup96 do obrazowania mitochondriów i mikrotubul
    1. Po inkubacji nocnej zastąpić jednocześnie ośrodek DMEM w mikroslajdach 8-dołkowych 200 μL 0,3% glutaraldehydu i 0,25% Triton X-100 w buforze cytoszkieletu (CB) i pozostawić na 2 minuty na prefiksację.
    2. Zamień roztwór prefiksacyjny buforem cytoszkieletu (CB) wzbogaconym o 2% glutaraldehyd. Pozwól mu odczekać 10 minut, aby utrwalić komórki, następnie umyj szkiełko 3 x 3 minuty 60 mM glicyny w PBS, jak w kroku 4.2.4.
      UWAGA: Stosuj glutaraldehyd w chemicznym okapu wyparowującym podczas noszenia odpowiedniego sprzętu ochronnego.
    3. Dodaj ścinane DNA łososia w 3% BSA w 1x PBS przez 1 godzinę w ciemności, aby zablokować komórki przed immunobarwią.
    4. Dodaj 5 μg/mL antytubuliny sprzężonej z DNA (sprzężonej jak opisano powyżej) do obrazowania mikrotubul i/lub przeciwciało 1:200 TOM20 do obrazowania mitochondriów, w 2% BSA przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (23 °C). Pierz 3 x 3 minuty z 1 razem PBS.
    5. Dodaj 25 nM sdAb antykróliczego IgG slegowanego z DNA i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (23 °C). Pierz 3 x 3 minuty z 1 razem PBS.
      UWAGA: Punkt zatrzymania: Po utrwaleniu, zablokowaniu i dodaniu przeciwciał próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Ten punkt przerwy jest uwzględniony głównie ze względu na czas potrzebny na przygotowanie próbki, a nie jest to ścisła konieczność protokołu. Obrazowanie może być przeprowadzone natychmiast po tych etapach, jeśli jest to preferowane.
  4. Przygotowanie komórek HeLa Kyoto mEGFP-Nup107
    1. Aspiruj medium z kolby T25 z ogniw HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 i delikatnie przemyj kolbę 2 mL 1x przefiltrowanego PBS.
    2. Aspiruj PBS i dodaj 2 mL trypsyny EDTA (TE), powoli przechylaj kolbę w górę i w dół, inkubuj w temperaturze 37 °C przez 7 minut.
    3. Dodaj 2 mL suplementowanego medium DMEM i trituratuj.
    4. Dodaj roztwór komórki do stożkowej rurki odśrodkowej o pojemności 15 mL wraz z dodatkowymi 7 ml uzupełnionego medium DMEM i wiruj w dawce 400 x g przez 5 minut. Sprawdź tworzenie pelletów na dnie rurki.
    5. Ponownie zawiesij osad komórkowy w podłożu uzupełnionym DMEM.
    6. Komórki nasienne o wielkości 1 x 105 komórek /mL w mikroslajdach z 8 dołkami.
      UWAGA: Komórki nasienne 24 godziny przed obrazowaniem.
  5. Immunobarwienie HeLa Kyoto mEGFP-Nup107 dla mikrotubul
    1. Po inkubacji nocnej zastąpić jednocześnie ośrodek DMEM w mikroslajdach 8-dołkowych 200 μL 0,3% glutaraldehydu i 0,25% Triton X-100 w buforze cytoszkieletu (CB) i pozostawić na 2 minuty na prefiksację.
    2. Zamień roztwór prefiksacji na 2% glutaraldehyd w CB i pozostawij na 10 minut na utrwalenie komórek. Pierz 3 x 3 minuty z 60 mM glicyny w 1x PBS.
      UWAGA: Stosuj glutaraldehyd w chemicznym okapie do parowania podczas noszenia odpowiedniego sprzętu ochronnego.
    3. Dodaj 5% BSA do 1x PBS przez 1 godzinę w ciemności, aby zablokować komórki przed immunobarwieniem.
    4. Dodaj 5 μg/mL DNA-sprzężonej antytubuliny (sprzężonej jak opisano powyżej), aby obrazować mikrotubule w stężeniu 5% BSA w 1x PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (23 °C). Pierz 3 x 3 minuty z 1 razem PBS.
      UWAGA: Punkt zatrzymania: Po utrwaleniu, zablokowaniu i dodaniu przeciwciał próbki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc. Ten punkt przerwy jest uwzględniony głównie ze względu na czas potrzebny na przygotowanie próbki, a nie jest to ścisła konieczność protokołu. Obrazowanie może być przeprowadzone natychmiast po tych etapach, jeśli jest to preferowane.
    5. UWAGA: Pracując z alternatywnymi przeciwciałami lub liniami komórkowymi, dostosowuj czynniki rozcieńczające dla przeciwciał sprzężonych z DNA lub nanoniku, zgodnie z zaleceniami producenta.
  6. Przygotowanie obrazowe
    UWAGA: Ten krok jest wspólny dla wszystkich protokołów immunodostainingu.
    1. Dodaj 90 nm nanocząsteczki złota rozcieńczone w 1:2 w wodzie dejonizowanej bezpośrednio do każdego odwiertu, wykorzystując pełną objętość studni. Inkubuj przez 5 minut, aby umożliwić przyszłą korektę dryfu podczas obrazowania. Płucz studnie 3 razy z 1 PBS.
    2. Do obrazowania Nup96 dodaj pożądaną nić obrazującą o częstotliwości 1 nM w buforze C+, uzupełnioną o 1x Trolox, 1x PCA i 1x PCD.
    3. Dla Exchange-PAINT mitochondriów i/lub mikrotubul dodaj pierwszą pożądaną nić obrazującą tylko w buforze C+ o średnicy 1 nM. Po pierwszym przejściu obrazowania należy dokładnie przemyć próbkę, ale ostrożnie, aby usunąć wszystkie pozostałe nici obrazujące bez przesuwania próbki. Zazwyczaj wystarczy 5 prań i 30 sekund oczekiwania między nimi. Następnie dodaj drugi nić obrazowania o wartości 1 nM w buforze C+ tylko dla drugiej rundy obrazowania.

5. Konfiguracja obrazowania i parametry: Mikroskopia lokalizacyjna pojedynczych cząsteczek

UWAGA: Obrazy pokazane w tym protokole zostały wykonane w ośrodku mikroskopii superrozdzielczej LMCB na University College London w Wielkiej Brytanii, za pomocą komercyjnie dostępnego obrotowego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w kamerę sCMOS i obsługiwanego za pomocą oprogramowania NIS-Elements.

  1. Użyj wirującego dysku konfokalnego systemu z wzbudzeniem wieloogniskowym oraz kamery sCMOS.
  2. Rozpocznij system 30 minut przed obrazowaniem: włącz mikroskop, aparat i lasery, a następnie uruchom komputer. Poczekaj, aż oprogramowanie NIS-Elements w pełni się załaduje.
  3. Wybierz odpowiedni tryb obrazowania w NIS-Elements: standardowy konfokalny dysk obrotowy lub superrozdzielczość SDC-OPR SoRA przed ustawieniem parametrów akwizycji.
  4. Wybierz obiektyw 60× Apo NA 1.49 do fotografowania SDC lub SDC-OPR, aby zmaksymalizować wykrywanie zdarzeń pojedynczych cząsteczek i usprawnić postprocessing.
  5. Wybierz odpowiednie powiększenie (1×, 2,8× lub 4×) na podstawie obiektywu, ustawień aparatu oraz badanej próbki. Dostosuj binning kamery odpowiednio: 1× binning dla 1× powiększenia, 2× binning dla 2,8× oraz 4× binning dla 4×. W tym układzie odpowiada to efektywnym rozmiarom pikseli 108 nm dla 1× (bez binningu) lub 4× (4× binningu) oraz 78 nm dla 2,8× (2× binningu). Binning jest wymagany, aby uzyskać rozmiary pikseli odpowiednie dla SMLM, odpowiadające odchyleniu standardowemu PSF (zazwyczaj 100-150 nm)19,20.
    UWAGA: Wyższe powiększenia (2,8× lub 4×) zwiększają gęstość mocy lasera, poprawiając jednolitość oświetlenia. Zmniejsza to pole widzenia, więc binowanie musi być regulowane proporcjonalnie (np. 2× binowanie dla 2,8× powiększenia; 4× binowanie dla 4× powiększenia), aby zachować rozmiar piksela.
  6. Ustaw czas naświetlania do akwizycji DNA-PAINT i zsynchronizuj go z prędkością obrotowej dysku (regulowaną z pada CSU-W1). Upewnij się, że prędkość obrotu jest wielokrotnością czasu naświetlania lub naciśnij przycisk Sync, aby automatycznie dopasować najbliższe kompatybilne obroty. Sprawdź ekran pod kątem artefaktów pasków, co wskazuje na niesynchronizowane ustawienia. Do przedstawionych tu eksperymentów zastosowano czas naświetlania wynoszący 300 ms.
    UWAGA: Prędkość obrotu dysku SoRa z mikrosoczewkami jednostki SDC oraz synchronizacji wpływa na profil wzbudzenia wiązki, wpływając na średni rozkład gęstości mocy na oświetlonym obszarze. Z tego powodu mogą być potrzebne dłuższe czasy naświetlania niż w konfiguracjach TIRF.
  7. Konfiguruj długość fali, moc i koło filtrów lasera (NIS-Elements zasugeruje odpowiedni filtr). Długość fali lasera będzie określana przez widmo barwnika obrazującego.
    UWAGA: W tej pracy użyto Cy3B, który jest optymalnie wzbudzony laserem 561 nm. Cy3B zapewnia najlepszy stosunek sygnału do tła dla DNA-PAINT, co czyni go preferowanym wyborem do tego zastosowania.
  8. Reguluj moc lasera za pomocą pada laserowego (0%-100%). Do obrazowania DNA-PAINT ustaw laser na maksymalną moc (100%). W tym systemie odpowiada to 1,75 mW (≈ 65 W/cm2) mierzone po obiektywie dla powiększenia 4×, 3 mW (≈ 50 W/cm2) dla 2× oraz 5 mW (≈ 15 W/cm2) dla 1×.
    1. Aby zarejestrować moc po obiektywie, użyj skalibrowanego miernika mocy lasera i umieść czujnik na stopniu mikroskopu jak najbliżej miejsca, gdzie powinna znajdować się powierzchnia próbki. Uważaj, by unikać kontaktu z obiektywem. Zapisz moc dla każdej użytej konfiguracji.
  9. Nałóż kroplę oleju immersyjnego na czysty obiektyw olejowy 60× Apo NA 1.49.
  10. Przymocuj przygotowaną próbkę (od kroków 4.2-4.5) do sceny za pomocą adaptera scenowego. Jest to ważne, aby zminimalizować dryf podczas akwizycji obrazu oraz zapobiec ruchowi podczas wymiany buforów, szczególnie w eksperymentach wielokolorowych.
  11. Przełącz się na tryb jasnego pola w wybranej metodzie obrazowania i skup się na płaszczyźnie szkła, używając nanocząstek jako odniesienia. Aktywuj System Perfect Focus (PFS). PFS lub podobny system utrzymujący ostrość przez cały czas akwizycji jest kluczowy, ponieważ dryf w kierunku osiowym nie może zostać skorygowany przez postprocessing.
    UWAGA: Nikon PFS utrzymuje próbkę w ostrości poprzez ciągłe monitorowanie i regulowanie odległości między stałą płaszczyzną odniesienia a płaszczyzną ogniskową próbki za pomocą obiektywu przesuniętego i detektora linii CCD. Działając niezależnie od akwizycji obrazu, system koryguje dryf ostrości w czasie rzeczywistym (~milisekundy).
  12. Gdy PFS jest aktywny, wybierz interesującą Cię płaszczyznę obrazowania. Dla komórek mEGFP-Nup96 U2OS lub komórek mEGFP-Nup107 HeLa Kyoto użyj sygnału 488 GFP z NPC oznaczonych GFP, aby zidentyfikować najbardziej płaską komórkę i określić optymalną płaszczyznę ogniskową. W tym etapie używaj niskiej mocy lasera (~10% maksymalnej mocy lasera), aby uniknąć fotobielenia.
  13. Zdefiniuj nazwę i ścieżkę zapisu eksperymentu. Zaznacz pole Czas , aby ustawić interwał, czas trwania i liczbę pętli. Aby uzyskać akwizję ciągłą, ustaw przedział na No Delay i wprowadź tylko liczbę pętli, która odpowiada łącznej liczbie klatek.
    UWAGA: Upewnij się, że na dole jest zaznaczone pole PFS, a następnie naciśnij Run. Oprogramowanie automatycznie poda szacowany czas trwania eksperymentu i zapisze dane po jego zakończeniu. Aby zatrzymać eksperyment przed jego zakończeniem, naciśnij Zakończ, aby zapisać aktualny postęp, lub Przerwać, aby zakończyć eksperyment bez zapisu.
  14. Dla pierwszego białka należy uzyskać 17 000-20 000 klatek z czasem integracji 300 ms.
    UWAGA: Stężenie nici obrazującej należy zoptymalizować na tym etapie, aby zapewnić, że sygnały pojedynczych cząsteczek się nie nakładają, jednocześnie zapewniając wystarczające lokalizacje do rekonstrukcji. Proces ten jest podobny do typowego pozyskiwania SMLM, gdzie koncentracja obrazowców jest dostosowywana, aby uzyskać wystarczającą liczbę zdarzeń do rekonstrukcji, minimalizując nakładanie się. Optymalna koncentracja zależy od budowli, którą obrazujemy. Na przykład silnie oznakowane struktury, takie jak mikrotubule, zazwyczaj wymagają niższych stężeń w obrazowniku (mniej niż 1 nM).
  15. Delikatnie usuń bufor obrazujący dla następnego białka pipetą, uważając, aby nie zakłócić próbki. Podczas monitorowania próbki przez kamerę mikroskopową ostrożnie dodaj 200 μL buforu C+ bez używania obrazownika, aby przemyć pierwszy barwnik.
  16. Powtarzaj ten krok, aż nie wykryje się sygnału fluorescencyjnego z pierwszego roztworu DNA-imagera (zazwyczaj 5 płukań).
  17. Dodaj drugi roztwór obrazujący i sprawdź, czy zdarzenia pojedynczych cząsteczek są wykrywane ponownie.
  18. Uzyskaj 17 000-20 000 klatek z czasem integracji 300 ms dla drugiego białka.
  19. Powtórz kroki 5.14-5.18 dla każdego dodatkowego białka do obrazowania.
  20. Do obrazowania 3D uzyskaj stosy z odstępem 0,5-1 μm na całej wysokości komórki. Zostało to wykonane za pomocą specjalnego protokołu JOB21 zaprojektowanego dla oprogramowania akwizycji (elementy NIS), który nagrywa wideo z określoną liczbą klatek na określonych pozycjach z , utrzymując PSF przez cały czas akwizycji.
    UWAGA: Pakiet oprogramowania wraz ze szczegółowymi instrukcjami użytkownika jest dostępny w protokole JOB21. Zawiera również pełny opis PRACY. Oprogramowanie o nazwie "MultiZ_DNAPaint.bin" można pobrać z zakładki Materiały w publikacji. Aby uruchomić JOB, pobierz ten plik i zaimportuj go do Eksploratora JOBS NIS-Elements, zgodnie z instrukcjami krok po kroku.

6. Przetwarzanie i analiza obrazów

UWAGA: Obrazy najpierw były przetwarzane przez dekonwolucję przy użyciu kompatybilnego oprogramowania, a następnie analizę lokalizacji pojedynczych cząsteczek za pomocą oprogramowania Picasso opracowanego przez laboratorium Jungmanna16.

  1. Otwórz stosy obrazów ND2 w oprogramowaniu NIS-Elements AR.
  2. Dla obrazów 2D wybierz 2D Deconvolution. Dla obrazów 3D powtórz ten proces dla każdego pojedynczego stosu z.
  3. Wybierz ślepą dekonwolucję, efektywny otwórek 0,01, i ustaw poziom szumu na Szum. Następnie wprowadzamy wzbudzenie lasera i szybkość emisji, odpowiednio 560 nm i 571 nm. Inne parametry są automatycznie pozyskiwane z metadanych ND2, aby uzyskać przybliżone oszacowanie funkcji rozrzutu punktu źródłowego obrazu (PSF).
  4. Określ liczbę iteracji (tutaj 12), wybierz Utwórz nowy dokument i naciśnij Deconvolve. Zapisz powstały plik po przetworzeniu.
    UWAGA: Algorytm iteracyjnie poprawia jakość obrazu poprzez wykonywanie operacji splotowych, które dopracowują PSF aż do osiągnięcia zbieżności lub określonej liczby iteracji. Zaleca się wizualną inspekcję obrazu zdekonvolującego. Konieczna jest regulacja liczby iteracji w zależności od ograniczeń obliczeniowych i jakości obrazu.
  5. Załaduj rozłączony stos obrazów do modułu Picasso Localize.
  6. W pasku menu wybierz Analizuj → Parametry i wprowadź parametry specyficzne dla kamery zgodnie ze specyfikacją producenta. Dla kamery sCMOS użytej w tym badaniu (Hamamatsu ORCA-Fusion BT): wzmocnienie elektromagnetyczne: 1, wartość wyjściowa: 100, czułość: 0,23 (współczynnik konwersji, elektrony/liczby), sprawność kwantowa: 0,95 (w zależności od zastosowanej długości fali wzbudzenia).
    UWAGA: Efektywność kwantowa nie jest używana od wersji Picasso 0.6.0 i zachowana wyłącznie ze względu na kompatybilność wsteczną.
  7. Ustaw długość boku pudełka na 7. Długość pudełka jest określana za pomocą wzoru [6 × σPSF + 1], gdzie σPSF to odchylenie standardowe PSF. Ta optymalizacja zwiększa precyzję lokalizacji, poprawiając rozdzielczość zrekonstruowanego obrazu.
  8. Wybierz odpowiedni rozmiar piksela dla konfiguracji obrazowania, zgodnie z krokiem sekcji 5.5.
  9. Następnie wybierz odpowiedni minimalny gradient netto (np. ~1000, w zależności od próbki) i włącz Podgląd, aby wizualizować wykryte lokalizacje. Sprawdź wyniki i dostosuj próg gradientu w razie potrzeby, aby zminimalizować wykrywanie w tle i zapewnić dokładną lokalizację.
  10. Z paska menu wybierz Analizuj → Lokalizuj (Identyfikacja i dopasowanie), aby rozpocząć identyfikację punktu i dopasowanie wszystkich klatek filmu. Po zakończeniu konkursu proces ten automatycznie zapisuje pliki .hdf5 i .yaml.
    UWAGA: plik .hdf5 przechowuje pozycję lokalizacji każdego dopasowania gaussa oraz więcej parametrów. .yaml zapisuje informacje o wideo i procedurze analizy i może być przeglądany za pomocą edytora tekstu.
  11. Załaduj plik .hdf5 w module Picasso Render, aby zwizualizować zrekonstruowaną mapę lokalizacji i wykonać korekcję dryfu.
  12. W Picasso Render wybierz Postprocess → Undrift by RCC. Wprowadź wartość segmentacji, zaczynając od 1000. Po zakończeniu pojawi się obliczony wykres dryfu xy. Powtarzaj proces kolejno z niższymi wartościami segmentacji (np. 500, potem 250), obserwując stopniowe poprawy dryfu czasowego.
    UWAGA: Korekcja dryfu może być również wykonywana z użyciem nanocząstek jako markerów fiducjalnych; Jednak podczas obrazowania podniesionych powierzchni sygnał nanocząsteczek może nie być widoczny. W takich przypadkach stosuje się jedynie redundantną korekcję dryfu korelacji krzyżowej (RCC).
  13. Upewnij się, że zapisz plik z korektą dryfu, wybierając File → Save Localizations przed zamknięciem okna renderowania Picasso.
  14. Załaduj plik skorygowany dryfem od kroku 6.13 do modułu filtrów Picasso dla dodatkowych kroków postprocessingu, nakładając progi na metryki jakości lokalizacji pojedynczej cząsteczki, takie jak: (i) Precyzja lokalizacji (lpx, lpy); (ii) szerokości PSF (sx, sy); (iii) Liczba fotonów; oraz (iv) wszelkie dodatkowe kryteria usuwające szum, wartości odstające lub słabo rozróżnione miejsca.
    UWAGA: lpx i lpy (precyzja lokalizacji w x i y) szacują niepewność w zlokalizowanej pozycji plamy wzdłuż osi x i y i są obliczane na podstawie dolnego ograniczenia Craméra-Rao (CRLB).
  15. Aby przefiltrować jedną właściwość, wybierz odpowiednią kolumnę w nagłówku tabeli i wybierz Plot → Histogram z menu.
    UWAGA: Wybranie dwóch kolumn generuje histogram 2D.
  16. Aby filtrować według określonego zakresu właściwości, kliknij i przeciągnij przez wybrany obszar w histogramie 1D lub 2D. Wybrany region będzie zacieniony na zielono, a wszelkie zdarzenia lokalizacyjne z wartościami spoza tego zakresu zostaną natychmiast wykluczone z listy lokalizacji.
  17. Filtruj dane według fotonów, sx, sy, lpx i lpy, zachowując jedynie centralny zakres części rozkładu każdego parametru, aby zapewnić zachowanie najbardziej wiarygodnych lokalizacji.
    UWAGA: Centralna część rozkładu szerokości PSF to zazwyczaj rozmiar od 0,4 do 1,2 × piksela. Wyłącz rozkłady wtórne często spowodowane nakładającymi się sygnałami lub słabo rozróżnionymi plamami.
  18. Zapisz filtrowane dane, wybierając File → Save z menu.
  19. Powtórz ten proces od kroków 6.1-6.18 dla wszystkich nagrań wideo dla każdego rozwiązania obrazu.
  20. Otwórz filtrowany plik w module Picasso Render. Intensywność tego obrazu superrozdzielczego odzwierciedla liczbę lokalizacji. Kontrast można zmienić, wybierając View → Display Settings i zmieniając wartość maksymalnej gęstości.
  21. Aby zapisać obraz superrozdzielczości pojedynczego kanału, wybierz "Indywidualna precyzja lokalizacji" w sekcji Rozmycie. Można również dodać pasek skali z sekcji Skala.
  22. Aby zapisać obraz superrozdzielczości wszystkich kanałów, otwórz wszystkie przetworzone pliki .hdf5. Kolor każdego kanału można zmienić, wybierając View → Files w menu.
  23. Wyrównaj wszystkie kanały wybierające post-processing → Kanały Align.
  24. Wybierz File → Export Complete Image , aby zapisać obraz .png lub File → Export Current View dla konkretnego powiększenia obrazu.
    UWAGA: Stosuj spójne zasady nazewnictwa plików i dokumentacji dla powtarzalności. Oprogramowanie Picasso automatycznie dodaje sufiks do każdego zapisanego pliku. Metryki Cramer Rao Lower Bound oraz analizy opartej na najbliższym sąsiadzie (NeNA)22 można wyodrębnić, wybierając View → Show information z menu. NeNA ilościowo określa przestrzenny rozkład lokalnych fluoroforów, oceniając euklidesową odległość między sąsiednimi lokalizacjami. Podczas gdy CRLB stanowi teoretyczne dolne ograniczenie precyzji lokalizacji oparte na statystykach fotonów i szumie tła, NeNA oferuje eksperymentalne oszacowanie precyzji lokalizacji uzyskane bezpośrednio z samego zbioru danych. Z tego powodu NeNA jest szeroko stosowany w SMLM jako miara uzupełniająca CRLB, ponieważ obejmuje nie tylko teoretyczne granice, ale także praktyczne wpływy, takie jak korekcja dryfu, błędy dopasowania i zmienność eksperymentalna. Metryka NeNA jest wyodrębniana z modułu Picasso Render. CRLB dopasowania pojedynczej cząsteczki służy do określenia wartości precyzji lokalizacji (σSMLM). Zgłoszona wartość to średnia międzyσ x a σy dla wszystkich lokalizacji, które są wartością trybu rozkładu precyzji lokalizacji odpowiednio w x i y.

Wyniki

Aby zademonstrować możliwości obrazowania superrozdzielczości systemu SDC-OPR (rysunek 1A), jego rozdzielczość w płaszczyźnie oceniono poprzez eksperymenty obrazowania DNA-PAINT (rysunek 1B) na jądrowych kompleksach porowych (NPC), które stanowią biologiczną strukturę referencyjną17. Rysunek 1C przedstawia reprezentatywny obraz DNA-PAINT SDC-OPR nukleoporiny 96 (Nup96), oznaczonej monomerycznie wzmocnionym zielonym fluorescencyjnym białkiem (mEGFP) i oznakowanej DNA-sprzężonymi nanociałkami anty-GFP, w komórkach U2OS. Powiększone panele ujawniają podstrukturę NUP, a Rysunek 1D pokazuje pary białek Nup96 (oznaczone strzałkami) zgodne z oczekiwaną 8-krotną symetrią porów jądrowych. Na Rysunku 1E odległość euklidesową między parami Nup96 została zmierzona przez ich wyrównanie i narysowanie histogramu przekroju poprzecznego sumowanego obrazu (n = 16 par). Analiza wykazała separację szczyt-pik o długości (13 ± 2) nm (rysunek 1E), co zgadza się z wynikami modeli EM oraz obrazowania HILO i TIR23. Każde dopasowanie szczytu wykazywało odchylenie standardowe 4 nm, potwierdzając wysoką precyzję lokalizacji (σSMLM = 3,3 nm, NeNA = 4,4 nm) osiągniętą przy użyciu DNA-PAINT na SDC-OPR. Co istotne, ta precyzja była utrzymywana na całym obszarze 53 × 53 μm², co jest wyjątkowe dla systemów opartych na konfokalach.

Aby zademonstrować zdolność do obrazowania wielokolorowego, Nup96, mitochondria i mikrotubule w komórkach U2OS zostały oznaczone DNA do pozyskiwania za pomocą Exchange-PAINT18. Technika ta wykorzystuje ortogonalne nici DNA sprzężone z jednym fluoroforem, co pozwala na wzbudzanie wszystkich celów tym samym źródłem laserowym (rysunek 2A). Zamiast jednocześnie pobierać sygnały, rozdziela je na kolejne rundy obrazowania, co ułatwia prostą integrację z dowolnym komercyjnym systemem SDC-OPR. Rysunek 2B przedstawia Nup96 na niebiesko oznaczony nanociałem anty-GFP, mitochondria na czerwono z wtórnym przeciwciałem przeciw-TOM20 oraz mikrotubule na zielono z pierwotnym przeciwciałem przeciw α-tubulinie. Warto zauważyć, że znakomita precyzja lokalizacji pojedynczych cząsteczek uzyskana dla obrazowania jednokolorowego Nup96 została zachowana na wszystkich celach w eksperymencie wielocelowym, co dało wartości precyzji lokalizacji 3,9 nm dla NPC, 4,0 nm dla α-tubuliny oraz 3,3 nm dla mitochondriów (Rysunki 2B , panele 1, 2 i 3).

Do obrazowania o dużym polu widzenia mikrotubule w komórkach HeLa były obrazowane przy użyciu różnych powiększeń dostępnych w systemie SDC-OPR, połączonych z różnymi ustawieniami binningu kamery, aby utrzymać rozmiary pikseli w zakresie od 78 nm do 108 nm (Rysunek 3). Rysunek 3A przedstawia cytoszkielet mikrotubuli 10 komórek HeLa, z kolorami symbolizującymi precyzję lokalizacji. Przy powiększeniu 1× średnia precyzja lokalizacji jest zauważalnie gorsza w porównaniu do większych powiększeń (Rysunek 3B-D), a zaobserwowana jest większa zmienność. Wynika to z mniejszej gęstości mocy lasera w porównaniu z większym polem widzenia, gdzie widoczny staje się profil oświetlenia Gaussa, prowadzący do obniżonej precyzji w kierunku krawędzi pola widzenia. Niemniej jednak, osiągnięcie średniej precyzji lokalizacji 9,5 nm na rozległym polu widzenia 211 × 211 μm² jest imponujące dla systemów opartych na konfokalach i umożliwia badania heterogeniczności biologicznej o wysokiej rozdzielczości.

Wreszcie, możliwość obrazowania całych komórek jest demonstrowana poprzez uzyskanie obrazów DNA-PAINT sieci mikrotubul w stałych komórkach HeLa o objętości konfokalnej ~500 nm grubości i 1 μm kroku z, przy użyciu największego powiększenia systemu (4×, 53 × 53 μm² FOV). Rysunek 4A przedstawia obrazy rekonstrukcji pojedynczych cząsteczek dla każdej płaszczyzny z, wraz z odpowiednią precyzją lokalizacji i wartościami NeNA. Dodatkowo, na rysunku 4C przedstawiono trójwymiarową wizualizację kolorową sieci mikrotubul w komórce HeLa. Wraz ze wzrostem głębokości liczba wykrytych fotonów maleje z powodu rozpraszania i aberracji optycznych, co skutkuje obniżeniem precyzji lokalizacji zarówno dla precyzji lokalizacji wyprowadzonej z dolnej granicy Cramér-Rao (CRLB) (rysunek 4A, po prawej), jak i tych obliczonych za pomocą metryki NeNA. Mimo to wysoki poziom zbierania fotonów możliwy przez system SDC-OPR umożliwia σSMLM ≤ 10 nm dla głębokości obrazowania do 9 μm przy wąskim rozkładzie. Rzeczywiście, dwuściankowe struktury mikrotubul włóknistych były wyraźnie rozróżnione na różnych głębokościach: w pobliżu granicy pokrywy z komórką, w pośrednich pozycjach osiowych oraz na górze komórki, z odległością szczyt-pik między 30 nm a 40 nm (rysunek 4C), co jest zgodne z podanymi wartościami24. Wyniki te podkreślają zdolność SDC-OPR do dostarczania obrazów o wysokiej rozdzielczości na dużych obszarach widzenia i na całej wysokości komórek.

Rysunek 1
Rysunek 1: Mikroskopia lokalizacyjna w płaszczyźnie różnych próbek komórek oraz wielokolorowe obrazowanie superrozdzielcze. (A) Schemat systemu konfokalnego Wirującego Dysku z optycznym przydziałem fotonów (SDC-OPR), z matrycą mikrosoczewek zaprojektowaną w celu maksymalizacji zbierania fotonów. (B) Schemat DNA-PAINT: Fluorescencyjne znakowane nici DNA, zwane niciami obrazującymi, tymczasowo hybrydydują z komplementarnymi sekwencjami DNA (nici dokujące ), które są zakotwiczone w przeciwciało/nanoniku, który celuje w interesujące białko. Te krótkotrwałe zdarzenia wiązania generują sygnały fluorescencyjne, które pojawiają się jak stochastyczne miganie. (C) Reprezentatywny obraz DNA-PAINT w systemie SDC-OPR z wykorzystaniem 4× powiększenia NPC komórek U2OS. Możliwość wysokiej rozdzielczości jest widoczna w wkładzie, gdzie poszczególne postacie NPC są wyraźnie rozstrzygnięte. (D) DNA-PAINT wzmocniony SDC-OPR umożliwia wizualizację pojedynczych NPC, gdzie białe strzałki podkreślają charakterystyczne pary białek Nup96 w architekturze porów. (E) Rozkład pomiarów odległości między dimery Nup96 (n=16 par) w ramach pojedynczych jednostek symetrii NPC. Ta liczba została zmodyfikowana na podstawie Zaza i in.14. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2
Rysunek 2: Zamiana PAINT na obrazowanie wielokolorowe za pomocą mikroskopu SDC-OPR. (A) Schemat Exchange-PAINT trzech celów obrazowanych kolejno. Trzy cele białkowe zostały oznaczone jako przeciwciała funkcjonalizowane przez DNA, fragmenty Fab lub nanociała. Nici obrazowania Cy3B były obrazowane sekwencyjnie według typu nici z krokami płukania między rundami obrazowania. (B) Trójkolorowe obrazowanie Exchange-PAINT komórek U2OS za pomocą mikroskopii SDC-OPR z użyciem powiększenia 4×, pokazujące mikrotubule (czerwone; oznaczone DNA-sprzężoną anty-α-tubuliną), mitochondria (zielone; nanociałka ukierunkowane na TOM20 DNA), oraz NPC (niebieski; Nup96 oznaczony tagiem mEGFP z nanociałami DNA anty-GFP). Pasek skali: 5 μm. Region przybliżony podkreśla zwiększoną rozdzielczość uzyskaną w systemie SDC-OPR, koncentrując się na (1) mitochondriach, (2) mikrotubulach oraz (3) NUP. Paski skalowe = 1 μm. Ta liczba została zmodyfikowana na podstawie Zaza i in.14. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3
Rysunek 3: Obrazowanie DNA-PAINT w dużych FOV na mikroskopie SDC-OPR. Obrazy DNA-PAINT mikrotubul (oznakowanie anty-α-tubulinowe) uzyskane przy wielu powiększeniach: (A) 1× powiększeniu i 1 binningu (FOV 211 × 211 μm²), (B) 2,8× i 2 binningach (FOV 76 × 76 μm²), (C) 4× powiększeniu i 4 binningach (FOV 53 × 53 μm²). Kolor reprezentuje precyzję lokalizacji od 0 do 16 nm w przypadku powiększenia 1x i 0-4 nm w pozostałych. (D) Precyzja lokalizacji mierzona w różnych odległościach (w μm) od środka pola pola dla powiększeń 1× (czerwony), 2,8× (żółty) i 4× (zielony). Ta liczba została zmodyfikowana na podstawie Zaza i in.14. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4
Rysunek 4: Obrazowanie DNA-PAINT całej komórki. (A) Po lewej. Obrazowanie mikrotubul objętościowych w komórkach HeLa za pomocą DNA-PAINT wykonane za pomocą SDC-OPR przy powiększeniu 4×, pokazując przekroje osiowe od z = 0 do 9 μm (kroki 1 μm). Każda płaszczyzna pokazuje pozycję z , precyzję lokalizacji oraz metrykę NeNA. Pręty skalowe: 5 μm (xy). Racja. Precyzja lokalizacji kontra głębokość penetracji dla wszystkich płaszczyzn. (B) 3D renderowania sieci mikrotubul na tej samej komórce HeLa co w (A). Kolor oznacza głębokość penetracji od 0 do 9 μm. (C) Powiększone zdjęcia podświetlonych małych obszarów z każdej głębokości penetracji zaznaczone w (A). Ta liczba została zmodyfikowana na podstawie Zaza i in.14. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Mikroskopia fluorescencyjna o superrozdzielczości przełamała barierę dyfrakcyjną, znacząco poprawiając rozdzielczość przestrzenną. Jednak jego powszechne zastosowanie w badaniach biologicznych napotyka ciągłe wyzwania. Co istotne, kompromisy między FOV, rozdzielczością i głębokością penetracji utrudniają optymalizację wszystkich trzech czynników jednocześnie. Wyzwania te zostały rozwiązane poprzez wykorzystanie połączonych możliwości SMLM oraz obrotowej mikroskopii dyskowej konfokalnej, wzmocnionej przez optyczną realokację fotonu (SDC-OPR). Integrując matryce mikrosoczewek ze standardową konfiguracją SDC, co umożliwił komercyjny system SDC-OPR, zwiększono zbieranie fotonów, a efektywny rozmiar otworka zmniejszono, co doprowadziło do znacznej poprawy rozdzielczości. W porównaniu ze standardowym SDC, system SDC-OPR wykazał wyraźną poprawę mocy rozdzielczości, skutecznie rozróżniając cechy oddzielone o 10 nm14 w płaszczyźnie ogniskowej, podczas gdy standardowy SDC mógł rozróżnić tylko odległości większe niż 20 nm11. Ta zwiększona zdolność rozdzielczości podkreśla korzyści z przeniesienia fotonu do osiągania separacji na skalę molekularną. Konkretnie, precyzja lokalizacji bocznej poniżej 2 nm została osiągnięta w płaszczyźnie ogniskowej (z = 0 μm), przy czym precyzja boczna pozostawała poniżej 10 nm na głębokościach do 9 μm, w połączeniu z wysoce adaptacyjnym kątem widzenia 53 × 53 μm² lub 76 × 76 μm². Nawet przy dużym polu widzenia 211 × 211 μm² system zapewniał imponującą średnią precyzję lokalizacji w płaszczyźnie wynoszącą 9,5 nm. Wyniki te podkreślają zdolność systemu do obrazowania o wysokiej rozdzielczości w całych komórkach.

Jeśli chodzi o reakcje sprzężenia dla różnych stosowanych przeciwciał, protokół musi być ściśle przestrzegany, aby zapewnić optymalny stosunek przeciwciał do DNA. Przekroczenie tego stosunku może obniżyć precyzję lokalizacji i negatywnie wpłynąć na pomiary ilościowe, takie jak te wykonywane w qPAINT25. Dlatego kluczowe jest zweryfikowanie stosunku za pomocą mikroobjętościowego spektrofotometru UV-Vis, co zapewnia ostateczny stosunek 1:1 między DNA a przeciwciałem.

Kluczowym krokiem w uzyskaniu wysokiej jakości obrazów mikrotubul o wysokiej rozdzielczości jest właściwa fiksacja. Konwencjonalne metody fiksacji, oparte wyłącznie na wysokim stężeniu PFA, często zakłócają struktury mikrotubul. Zamiast tego, stosowanie glutaraldehydu (GA) samodzielnie lub w połączeniu z PFA znacząco poprawia zachowanie strukturalne26,27.

Dla optymalnego obrazowania niezbędny jest obiektyw o wysokiej aperturze numerycznej (NA), aby zmaksymalizować zbieranie fotonów na jedno zdarzenie pojedynczej cząsteczki. W komercyjnym systemie SDC-OPR moc lasera jest celowo niższa niż w konwencjonalnych mikroskopach TIRF używanych w SMLM, aby zminimalizować fotobielenie próbek. Chociaż DNA-PAINT eliminuje problemy z fotobieleniem i teoretycznie może stosować wyższą moc lasera, obecne systemy komercyjne nakładają ograniczenia, wymagając dłuższego czasu naświetlania w porównaniu do oświetlenia TIRF. Ponadto, ponieważ oświetlenie w SDC-OPR jest konfokalne, cząsteczki nie są ciągle wzbudzane podczas ekspozycji. W rezultacie konieczne są dłuższe czasy naświetlania względem ciągłego oświetlenia TIRF; W tym badaniu zastosowano czas ekspozycji wynoszący 300 ms. Jednak w zależności od wymagań rozdzielczości danego eksperymentu, można zastosować krótsze czasy całkowania (np. 150-200 ms) przy minimalnej utracie rozdzielczości28.

Optymalizacja stężenia nici obrazującego jest kluczowym krokiem, aby zapewnić, że sygnały pojedynczych cząsteczek pozostają dobrze rozdzielone, jednocześnie generując wystarczającą liczbę lokalizacji do dokładnej rekonstrukcji. Ta regulacja jest analogiczna do standardowych akwizycji SMLM, gdzie równowaga między gęstością zdarzeń a nakładaniem się sygnałów jest starannie kontrolowana. Optymalna koncentracja obrazowania powinna być dostosowana do każdego konkretnego celu. Na przykład dla mikrotubul zaleca się początkowe stężenie nici obrazującej poniżej 1 nM, z dostosowaniem w razie potrzeby.

Utrzymanie stabilnej ostrości podczas długotrwałych akwizycji jest kluczowe, ponieważ dryf osiowy (z) nie może być skorygowany w postprocessingu. Dryf boczny (xy) można skompensować za pomocą markerów RCC lub fiducjalnych. W tym układzie system Perfect Focus (PFS) mikroskopu zapewnia stabilność ostrości przez wiele godzin obrazowania.

Podsumowując, integracja SMLM z SDC-OPR zapewnia potężną platformę do obrazowania o wysokiej rozdzielczości głęboko wewnątrz całych komórek, pokonując tradycyjne kompromisy między rozdzielczością, głębokością i FOV. Jednak aby w pełni wykorzystać możliwości systemu, niezbędna jest skrupulatna uwaga na warunki eksperymentalne, od koniugacji i utrwalania przeciwciał po ustawienia akwizycji i przetwarzanie danych. Każdy krok, od przygotowania próbki po korektę dryfu, odgrywa kluczową rolę w uzyskaniu wiarygodnych i precyzyjnych danych. Dzięki starannej optymalizacji protokołów to podejście oferuje solidne i wszechstronne rozwiązanie do obrazowania ilościowego, nanoskalowego w złożonych próbkach biologicznych. Protokół ten ma pomóc społeczności w wdrażaniu mikroskopii lokalizacyjnej pojedynczej cząsteczki oraz w uzyskaniu superrozdzielczych obrazów z planów próbek, do których trudno uzyskać dostęp przy użyciu konwencjonalnego oświetlenia TIRF lub HILO. Oba cele są realizowane za pomocą komercyjnie dostępnych mikroskopów, które zwykle znajdują się w mikroskopach na całym świecie.

W kontekście innych i przyszłych zastosowań metoda ta ma zastosowanie zarówno do próbek całych komórek, jak i do bardziej złożonych próbek tkanek na większych głębokościach obrazowania, co wykazano w poprzednich badaniach14. W przeciwieństwie do metod wymagających fizycznego sekcjonowania, technika ta umożliwia obrazowanie wolumetryczne nienaruszonych tkanek, zachowując rodzimą architekturę i minimalizując artefakty wprowadzane przez fizyczne sekcjonowanie. Zastosowanie mniejszych sond powinowactwa, takich jak nanociała, dodatkowo zwiększa penetrację tkanek w porównaniu z przeciwciałami pełnej długości, umożliwiając bardziej jednolite oznakowanie w gęstych próbkach. Takie podejście otwiera drzwi do badania organizacji komórkowej i rozkładu cząsteczek in situ z wyższą dokładnością. Poza tymi zastosowaniami strategia umożliwia także wysokoprzepustowe przesiewanie nanostruktur i zespołów biomolekularnych, umożliwiając systematyczne badania heterogeniczności i funkcji strukturalnej. Ponadto najnowsze osiągnięcia w DNA-PAINT doprowadziły do samogaszenia sond obrazujących, opartych na interakcjach barwnik-gasnik lub barwnik-barwnik 29,30,31, które skutecznie obniżają sygnały tła, zwiększają intensywność fluorescencji i zwiększają rozdzielczość przestrzenną, umożliwiając szybsze tempo pozyskiwania. Integracja tych sond fluorogenicznych z ramami SDC-OPR ma potencjał dalszego zwiększenia zarówno szybkości, jak i rozdzielczości obrazowania. Połączenie tych osiągnięć z mocnymi stronami systemu SDC-OPR mogłoby rozszerzyć jego zastosowanie na bardziej złożone próbki biologiczne, ustanawiając platformę jako elastyczne narzędzie do szczegółowego mapowania struktur komórkowych i molekularnych w szerokiej gamie tkanek.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do oświadczenia.

Podziękowania

Badania te zostały sfinansowane przez Human Frontier Science Program Organization (HFSP) poprzez interdyscyplinarne stypendium podoktorskie dla CZ (LT0025/2023-C) oraz Engineering and Physical Sciences Research Council wspierających M.T. (EP/R513143/1 i EP/W524335/1) oraz O.P.L.D (EP/R513143/1 i EP/T517793/1). S.S również uznaje Royal Society poprzez stypendium Dorothy Hodgkin (DHF\R1\191019 oraz DHF\R\251006). Prace te były również wspierane przez granty Inicjatywy Chana Zuckerberga (2023-321188) oraz BBSCR (BB/Y513064/1) dla S.S.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(±)-6-Hydroksy-2,5,7,8-tetrametylochroman-2-karboksylowy kwasMerck 238813-5GTroloks
3,4-dihydroksybenzoowy kwas  Merck 37580-25G-FPCA
60 razy; Obiektyw Apo NA 1.49Nikon
7.0 KDA kolumna odsalania spinowego zawierająca żywicę wykluczającą rozmiar  Fisher Scientific Ltd89882Kolumny odsolania Zeba Spin dla kroku 2.4
Akcutaza – Enzym Cell Detachment MediumKomórka PromocyjnaC-41310
Alpaka sdAb (1H1) anty-GFP w połączeniu z niestandardowym DNA (sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')Masywna fotonikaProdukt niestandardowyAnty-GFP nanobody dla Drosophili
Alpaka sdAb (1H1) anty-GFP w połączeniu z DNAMasywna fotonikaMASSIVE-TAG-Q-FAST anty-GFP - F3Anty-GFP nanobody dla NUP
Antyalfa tubulina (YL1/2)Thermo Fisher ScientificMA1-80017
Anti-rabbit IgGMasywna fotonikaMassive-sdAB-FAST 2-Plex, Secondary sdAB F2
Anty-TCRζ (6B10.2)BioLegend644102
Albumina surowicy bydłaMerck A4503-10GBSA
Stożkowa rurka odśrodkowa 15 mLFisher Scientific Ltd17705004
Stożkowa rurka odśrodkowa 50 mLVWR International734-0448
CSU-W1 SoRaNikonMikroskop SDC-OPR
Odsalanie kolumn spinowych Sephadex G-25 (żywica wykluczająca rozmiar do oczyszczania DNA)  Fisher Scientific Ltd11743309Marka: Cytiva. Kolumny G-25 dla kroku 2.5
D-glukozaMerck G8270-1KG
Nośniki DMEMThermo Fisher Scientific11965092
DMSO, bezwodnyThermo Fisher ScientificD12345
DTT  (Dithiothreitol)Thermo Fisher Scientific15976082
EDTAThermo Fisher Scientific15575020
EGTAMarck324626
Serum bydlęce płodoweThermo Fisher ScientificA5256701
GlutaraldehydServa2311402
GlicerolMerck G5516-500ML 
GlycineMP Biomedicals219482580
Maleimid-PEG2-sukcinimidyl  Merck 746223-50MG
Media 5A McCoyaFisher Scientific Ltd16600082
MES (2-(N-morfolino)etansulfonowy kwas)MerckM3671-50G
MetanolFisher Scientific Ltd32213-25L
MgCl2Fisher Scientific Ltd10418464
Rurki mikrowirówkowe 0,5 mLFisher Scientific Ltd11508232
Rurki mikrowirówki 1,5 mLEppendorf10509691 
Spektrofotometr UV-Vis mikroobjętościowyThermo Fisher ScientificND-JEDEN-WNanodrop
NaCl2Sigma-AldrichS6546-1L 
Nanocząstki 90 nm -ZłotoCytodiagnostykaG-90-100
Kamera CMOS Orca Fusion-BTHamamatsu
Penicylina-StreptomycynaThermo Fisher Scientific15070063P/S
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (1x roztwór)Fisher Scientific Ltd11530546PBS
Pierce 16% formaldehydu (z metanolem), bez metanoluFisher Scientific Ltd11586711PFA
Chlorek potasu  Merck   P9541-500G
Protokatechuat 3,4-Dioksydenaza  Merck P8279-25UN PCD
Sód   WodorotlenekFisher Scientific Ltd12963614
Przeciwciało TOM20AbcamAb186735
Bufor TrisVWR InternationalA4577.1000
Triton   X-100   VWR International1086031000
Tween-20Merck P9416-50ML
Jednostka filtra odśrodkowego ultrafiltracyjnego, 100 kDa MWCOMerck UFC510024Producent: Amicon Ultra
μ-Zjeżdżalnia 8 studni Wysokie szklane dnoIbidiIB-80807
μ-Suwak VI 0,5 Szklane dnoIbidiIB-80607

Bibliografia

  1. Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).
  2. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  3. Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells. Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).
  4. Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms. Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).
  5. Kim, J., et al. Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals. Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).
  6. Ghosh, A., et al. Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy. Science. 387 (6730), eadq4510(2025).
  7. Wäldchen, F., et al. Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM. Nat Commun. 11 (1), 887(2020).
  8. Zagato, E., et al. Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM). Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).
  9. Galland, R., et al. 3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM. Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).
  10. Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. 236, Springer Science & Business Media. (2006).
  11. Schueder, F., et al. Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT. Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).
  12. Azuma, T., Kei, T. Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment. Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).
  13. York, A. G., et al. Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing. Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).
  14. Zaza, C., et al. Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment. Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).
  15. Jungmann, R., et al. Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami. Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).
  16. Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. Super-resolution microscopy with DNA-PAINT. Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).
  17. Thevathasan, J. V., et al. Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy. Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).
  18. Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
  19. Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
  20. Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. Localization accuracy in single-molecule microscopy. Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).
  21. Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes. , (2025).
  22. Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment. Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).
  23. Schlichthaerle, T., et al. Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT. Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).
  24. Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification. Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).
  25. Jungmann, R., et al. Quantitative super-resolution imaging with qPAINT. Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).
  26. Whelan, D. R., Bell, T. D. M. Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).
  27. Xie, Z., et al. Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy. Cytoskeleton. , (2025).
  28. Steen, P. R., et al. The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes. Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).
  29. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy. J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).
  30. Kessler, L. F., et al. Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy. Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).
  31. Chung, K. K. H., et al. Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging. Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie DNA PAINTlokalizacja pojedynczych cz steczekobrazowanie ca ych kom rekobrazowanie wielokoloroweznakowanie wewn trzkom rkoweobrazowanie g bokie kom rekrekonstrukcja obrazu
Obrazowanie całokomórkowe superrozdzielczości za pomocą DNA-PAINT na obracającym się dysku konfokalnym z optycznym przekształceniem fotonów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.