Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Opracowanie i standaryzacja mikrometody ex vivo do ilościowej identyfikacji winkrystyny wewnątrzkomórkowej w komórkach pierwotnych ALL przez LC-MS/MS

463 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69535

⸱

23 stycznia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Mass Spectrometry Laboratory, Boldrini Children's Center, 3Boldrini Children's Center

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten miał na celu ustanowienie i optymalizację metody LC-MS/MS do względnej ilościowej ilościowej akumulacji winkrystyny w pierwotnych komórkach WSZYSTKICH dzieci u dzieci.

Streszczenie

Ilościowe określenie winkrystyny wewnątrzkomórkowej (VCR) w pierwotnych pediatrycznych ostrych komórkach białaczki limfoblastycznej (ALL) jest niezbędne dla zrozumienia różnic specyficznych dla próbek w przyjmowaniu leków oraz do wsparcia badań eksperymentalnych z wykorzystaniem niedostępnych materiałów pacjentów. Przedstawiamy tutaj uprościoną mikrometodę LC-MS/MS, zoptymalizowaną specjalnie pod komórki pierwotne ALL uzyskane za pomocą ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX), odpowiadając na kluczowe wyzwania, takie jak ograniczona dostępność komórek, rozmiar małych komórek oraz potrzeba powtarzalnej regeneracji po wielu etapach mycia. Testy czasowe o długości od 1 do 5 godzin wykazały, że okres inkubacji 3 godzin daje najwyższe i najbardziej spójne poziomy wewnątrzkomórkowego magnetowidu, z mniejszą zmiennością między replikacjami. Optymalizacja metod wykazała również, że stosowanie 2,5 × 106 komórek na warunki poprawia odporność analityczną w porównaniu do 1 × 106 komórek, które wykazały większą dyspersję w powtarzanych eksperymentach. Dodatkowe istotne udoskonalenia obejmowały użycie zimnego metanolu w celu zwiększenia efektywności wytrącania białek oraz wprowadzenie wewnętrznego standardu monitorującego i minimalizującego zmienność proceduralną. Metoda umożliwia czułe i precyzyjne ilościowe określenie magnetowida wewnątrzkomórkowego w odpowiednich zakresach stężeń, chociaż najniższa testowana dawka (0,01 μM) nie była mierzalna po 3-godzinnej inkubacji. Ogólnie rzecz biorąc, ta mikrometoda zapewnia praktyczne, powtarzalne i skalowalne podejście do pomiaru magnetowidu wewnątrzkomórkowego w pierwotnych próbkach ALL. Jego projekt wspiera analizy porównawcze, walidację modeli ex vivo oraz przyszłe zastosowania metodologiczne mające na celu integrację wewnątrzkomórkowej ilościowej analizy leków w szerszych ocenach farmakologicznych.

Wprowadzenie

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) odpowiada za około 25% wszystkich nowotworów dziecięcych i pozostaje najczęstszym nowotworem u dzieci 1,2. Chociaż postępy w terapii znacznie poprawiły wskaźniki przeżywalności, przekraczające obecnie 90% – biologiczna złożoność ALL nadal napędza wysiłki na rzecz opracowania narzędzi lepiej charakteryzujących chorobę na poziomie komórkowym3.

Alkaloidy vinca, szczególnie magnetowidy, są kluczowymi elementami WSZYSTKICH protokołów leczenia4. Ponieważ VCR wywiera swoje cytotoksyczne efekty wewnątrzkomórkowe, zrozumienie jego pobierania i gromadzenia w komórkach białaczkowych jest kluczowe dla badań dotyczących odpowiedzi na leki, farmakodynamiki i zachowań komórkowych w systemach ex vivo. Jednak większość dostępnych podejść do oceny poziomu leków wewnątrzkomórkowych opiera się na pomiarach pośrednich lub metodach półilościowych, co ogranicza powtarzalność i czułość 5,6,7.

Równolegle wiele badań nadal opiera się w dużej mierze na liniach komórkowych białaczki, które nie mają biologicznej heterogeniczności i klinicznego znaczenia komórek pierwotnych pochodzących od pacjentów. Próbki pierwotne często stanowią wyzwania, takie jak ograniczona liczba komórek, zmienna jakość próbek oraz konieczność stosowania wysoce czułych technik analitycznych zdolnych do wykrywaniazwiązków wewnątrzkomórkowych o niskiej ilości.

Chromatografia cieczowa – tandemomowa spektrometria mas (LC-MS/MS) zapewnia specyficzność i czułość niezbędne do precyzyjnego ilościowego określenia środków chemioterapeutycznych, jednak standaryzowane protokoły pomiaru wewnątrzkomórkowego magnetowidu bezpośrednio w komórkach białaczki pierwotnej pozostają rzadkie. Ustanowienie solidnych mikrometod zgodnych z ograniczonym materiałem pacjenta może ułatwić szeroki zakres zastosowań, w tym profilowanie farmakologiczne, ocenę interakcji lek-komórki oraz badania porównawcze między podtypami chorób lub stanami terapeutycznymi.

W tym protokole opisujemy rozwój i optymalizację mikrometody ilościowej ex vivo intrakomórkowej magnetowidy w komórkach pierwotnej białaczki z użyciem LC-MS/MS. Aby uzyskać wystarczający materiał do opracowania metody, próbki pacjentów zostały przeszczepione do niedoborczych myszy NSG w celu opracowania modeli PDX9. Po rozszerzeniu in vivo izolowano ludzkie komórki białaczki i kriokonserwowano10. Następnie zostały rozmrozzone, inkubowane w magnetowidzie, przemyte, zanalizowane i przeanalizowane przez LC-MS/MS w celu określenia poziomu leków wewnątrzkomórkowych.

Metoda ta oferuje kilka zalet: wymaga niewielkiej liczby komórek (2,5 miliona), jest czuła i szybka oraz kompatybilna z klinicznie istotnymi próbkami pierwotnymi. Ponieważ bezpośrednio mierzy zawartość leków wewnątrzkomórkowych, stanowi wiarygodne narzędzie ilościowe dla badaczy badających przyjmowanie leków, odpowiedzi komórkowe na chemiopeutyki lub inne kwestie farmakologiczne w nowotworach hematologicznych.

Ogólnie protokół ten rozszerza dostępny zestaw narzędzi analitycznych do badania ALL u dzieci i może być łatwo dostosowany do innych leków lub typów próbek, wspierając przyszłe badania nad biologią białaczki, zachowaniem leków oraz precyzyjną farmakologią.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Próbki białaczki użyte w tym badaniu pochodzą z biobankowanych fiolek pacjentów leczonych w Centro Infantil Boldrini, którzy zezwolili na wykorzystanie swoich komórek na podstawie formularza świadomej zgody. Projekt został zatwierdzony przez Komitet Etyki Instytucjonalnej (CAAE 34601120.7.0000.5376). Protokoły generowania PDX u zwierząt były realizowane zgodnie z przepisami i wytycznymi etycznymi Komitetu Etyki Zwierząt (Comissão de Ética no Uso de Animais) Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0011-2020).

1. Przygotowanie próbki i inkubacja leków (dzień 1)

  1. Przygotowanie zapasów i roztwory robocze
    1. Waż 2,5 mg siarczanu winkrystyny (masa cząsteczkowa: 923 g/mol) i rozpuszcza go w 2,0 mL dimetylosulfoklenku (DMSO) w mikrorurce o pojemności 2,0 mL, aby przygotować roztwór wywarowy o pojemności 1,354 mM. Wir aż do całkowitego rozpuszczenia.
      UWAGA: DMSO to drażniące; Noś rękawiczki i obsługiwać to w okapu z chemicznym oparem.
    2. Przygotuj roztwór roboczy o pojemności 100 μM, mieszając 147,71 μL roztworu zapasowego magnetowida z 1 852,28 μL DMSO w mikrorurce 2,0 mL. Dokładnie przeszukaj wir.
    3. Rozprowadz 500 μL roztworu roboczego do czterech mikrorurek po 0,6 mL i przechowuj w temperaturze -20 °C przez kilka miesięcy. Unikaj rozmrażania aliquotów więcej niż trzy razy.
    4. Przygotuj roztwór roboczy o zawartości winblastyny (VINB) o zawartości 100 μM, mieszając 181,81 μL roztworu zapasowego o pojemności 1,1 mM (siarczan winblastyny 1 mg/mL, masa cząsteczkowa: 909,07 g/mol) z 1 818,19 μL sterylnej wody ultraczystej w mikrorurce o pojemności 2,0 mL. Wiruj, aż będą jednorodne.
    5. Zachowaj rozwiązanie działające VINB w taki sam sposób, jak zrobione z magnetowidami.
    6. Przygotuj roztwór VINB metanolu + 0,1 μM, mieszając 49,95 mL metanolu z 50 μL roztworu roboczego VINB w probówce o pojemności 50 mL. Wiruj, aż będą jednorodne. Przechowuj ją w temperaturze -20 °C do 3 miesięcy.
      UWAGA: Metanol jest toksyczny i łatwopalny; Obchodzić się z odpowiednim sprzętem ochronnym w okapie wyparowym.
    7. Przygotuj wodę + 0,1% roztwór kwasu mrówkowego, mieszając 49,95 mL wody ultraczystej z 50 μL kwasu mrówkowego w probówce o pojemności 50 mL. Dobrze wiruj. Przechowuj w temperaturze pokojowej (RT).
      UWAGA: Kwas mrówkowy jest żrący; Obchodzić się z rękawicami i ochroną oczu.
  2. Rozmrażanie i płukanie komórek pierwotnych
    1. Próbki komórek kriokonserwowanych rozmrażać poprzez delikatne mieszanie fiolki w zlewce zawierającej 15 mL wody destylowanej 37 °C, aż do całkowitego rozmrozzenia.
      UWAGA: Informacje dotyczące protokołów pobierania i zamrażania komórek można znaleźć w poprzednich publikacjach 9,10.
    2. Przelej zawartość fiolki do stożkowej probówki o pojemności 50 mL zawierającej 10-15 ml sterylnego 1x PBS za pomocą sterylnej jednorazowej pipety Pasteura. Wirówka na 300 × g przez 5 minut w RT.
    3. Odrzuć supernatant, odwracając rurkę.
    4. Ponownie zawiesij granulkę w 10 mL medium AIM V za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Liczyć żywotne komórki i mierzyć średni rozmiar komórek za pomocą automatycznego licznika.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie komórek, które wykazują co najmniej 80% żywotności względem całkowitej liczby pobranych komórek.
    5. Oblicz objętość potrzebną do zebrania 2,5 × 10 6 żywotnych komórek, stosując prostą proporcję opartą na zmierzonym stężeniu. Na przykład, jeśli stężenie wynosi 5 × 106 komórek/mL, wymagana objętość wynosi 0,5 mL.
      UWAGA: Wykonaj każde leczenie w trzech egzemplarzach dla powtarzalności danych. Zachowaj średni rozmiar komórek dostępnych w automatycznym liczniku komórek; Użyj go do obliczenia objętości komórek.
  3. Układ leczenia uzależnień
    1. Oblicz objętość roztworu roboczego magnetowidu, która jest potrzebna do osiągnięcia końcowego stężenia 1 μM przy całkowitej objętości 2,0 mL. Przed pipetowaniem odłóż roztwór w formie vortex.
    2. Dodaj medium AIM V, następnie 2,5 × 106 ogniw, a na końcu roztwór magnetowida do mikrorurki 2,0 mL. Krótko zawij i lekko się obróć (5 s), aby zebrać płyn z nakrętki rurki.
    3. Inkubuj otwarte rurki w temperaturze 37 °C, 5%CO2 przez 3 godziny.
    4. Po inkubacji zamknąć pokrywki i wirować próbki w 300 × g przez 5 minut w RT.
    5. Ostrożnie odrzuć supernatant pipetą, a następnie dodaj 1 mL PBS przy RT do rurki.
    6. Powtarzaj wirowanie przy 300 × g przez 5 minut w RT, usuwam supernatant i płucz PBS jeszcze dwa razy, co daje łącznie trzy płukania.
    7. Ostrożnie usuń cały supernatant pipetą, ponownie zawiesz granulat w 100 μL PBS i wiruj, aż granulek zostanie całkowicie zawieszony.
    8. Dodaj 400 μL zimnego metanolu + 0,1 μM winbłastynu (-20 °C) bezpośrednio do próbki, unikając kontaktu ze ściankami probówki.
    9. Przechowuj próbki na noc w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez kilka tygodni (bezpieczny zastawk).

2. Przetwarzanie próbek dla LC-MS/MS (dzień 2)

  1. Ekstrakcja próbki
    1. Przed wyjęciem próbek z zamrażarki o temperaturze -80 °C schłodź wirówkę do 4 °C.
    2. Bezpośrednio po wyjęciu próbek z zamrażarki wiruj je w temperaturze 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Przelej 300 μL supernatantu do mikrorurki o pojemności 1,5 mL.
    4. Próbki całkowicie wysusz za pomocą koncentratora próżniowego w temperaturze 40-45 °C przez 1 godzinę i 40 minut.
      UWAGA: Suszone pellety można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni (bezpieczny zastawk).
    5. Każdą granulkę ponownie zawiesić w 400 μL wody + 0,1% kwasu mrówkowego (wcześniej przygotowanym). Delikatnie wiruj, aż granulka całkowicie się rozpuści.
    6. Ponownie wiruj próbki w 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Przelej 300 μL supernatantu do fiolki z zakrętką 2,0 mL do analizy LC-MS/MS.

3. Konfiguracja LC-MS/MS i akwizycja danych

  1. Przygotowanie fazy komórkowej i kondycjonowanie kolumny
    1. Przygotuj rozpuszczalnik A, mieszając wodę ultraczystą z kwasem mrówkowym o stężeniu 0,1%.
    2. Przygotuj rozpuszczalnik B, mieszając acetonitryl z kwasem mrówkowym 0,1%.
      UWAGA: Acetonitryl jest toksyczny i łatwopalny; Uchwyt w okapie chemicznym.
    3. Każdy rozpuszczalnik przeprowadzić sonikiem do kąpieli ultradźwiękowej przez 5 minut. Podłącz butelki do modułu pompy i przepłukaj system z dużym przepływem, aby usunąć zanieczyszczenia.
    4. Zamontować kolumnę BEH C18 o odwróconej fazie (1,7 μm, 2,1 mm × 50 mm).
      UWAGA: Do przeprowadzenia analizy w tym badaniu użyto systemu chromatograficznego klasy Acquity H-Class sprzężonego z potrójnym spektrometrem mas Xevo TQS-Micro.
    5. Użyj binarnego gradientu złożonego z rozpuszczalników A i B, oba wcześniej przygotowane.
    6. Przeprowadź gradient chromatograficzny od 5% do 95% rozpuszczalnika B przez pierwsze 2 minuty, a następnie 2 minuty rozpuszczalnika A do płukania kolumny i ponownego wyważenia.
    7. Ustaw przepływ na 0,2 mL/min przez cały 4-minutowy bieg. Utrzymuj temperaturę kolumny na poziomie 40 °C i wstrzykuj 10 μL każdej próbki.
  2. Konfiguracja metody LC-MS/MS
    1. Otwórz oprogramowanie LC-MS/MS. Kliknij Plik > Nowa > metoda MS , aby rozpocząć nową metodę.
    2. Przejdź do zakładki Funkcja i ustaw typ funkcji na monitorowanie wielokrotnych reakcji (MRM). Wprowadź przejścia jonowe i parametry wymienione w Tabeli 1 dla magnetowida i VINB (standard wewnętrzny).
    3. Ustaw czas nabycia na 4 minuty. Kliknij Aplikuj , aby zapisać.
      UWAGA: Nie przekraczaj 4 minut, aby zapewnić równowagę kolumny między iniekcjami.
    4. Konfiguruj parametry UHPLC w Inlet Method > Edytuj LC Method i zapisz jako plik .mth (Tabela 2).
    5. Ustaw parametry źródłowe w zakładce Tune zgodnie z Tabelą 3. Zapisz jako plik .tun.
    6. Zapisz pełną metodę: Plikuj > Zapisz jako i eksportuj jako plik .mth.
  3. Tworzenie listy próbek i rozpoczęcie biegu
    1. Na ekranie głównym oprogramowania otwórz Listę próbek i stwórz listę z nazwami próbek, objętościami do zastrzyków, pozycjami fiolek oraz metodą do użycia.
    2. Włóż fiolkę z wodą ultraczystą do tacy autosamplera i oznacz ją jako pustą. Używaj pustego zaszczepienia między każdym zestawem potrójnych zastrzyków, aby uniknąć przeniesienia się.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem pracy upewnij się, że ciśnienie w kolumnie (ΔP) jest stabilne i niższe niż 10 psi.
    3. Wybierz pożądane wiersze w Liście Przykładów i kliknij Uruchom > OK , aby rozpocząć akwizycję danych.

4. Analiza danych

  1. Wizualizacja i eksport danych
    1. Po zakończeniu przebiegu obejrzyj chromatogramy, wybierając próbkę i klikając Chromatogram w górnym menu pasku.
    2. Na ekranie głównym kliknij TargetLynx, wybierz właśnie uruchomione pliki i kliknij Przetwarzaj > Wybierz metodę winkrystyny > OK, aby wygenerować tabele wyjściowe.
    3. Kliknij Raport > Eksport tabeli i zapisz przetworzone dane jako plik .csv lub .xlsx.
      UWAGA: Eksportuj surowe obszary szczytowe zarówno dla analitu, jak i standardu wewnętrznego.
  2. Organizacja danych i obliczanie stosunków
    1. Otwórz wyeksportowany plik i utwórz następujące kolumny:
      1. Próbka: Dodaj nazwę próbki lub fiolki.
      2. Run: Wskaz, do której replikacji odpowiada ta wartość.
      3. Obszar magnetowidu: Wprowadź obszar poniżej szczytu dla winkrystyny.
      4. Obszar VINB: Wprowadź obszar poniżej szczytu dla winblastyny.
      5. Stosunek VCR/VINB: Normalizuj każdą wartość magnetowidu, dzieląc ją przez odpowiadającą jej wartość VINB.
    2. Dodaj kolumny dla wartości odchylenia standardowego: powierzchni magnetowidu VCR, obszaru VINB oraz stosunku VCR/VINB dla każdego zestawu potrójnego.
      UWAGA: Normalizacja z użyciem wewnętrznego standardu pozwala na korektę zmienności w objętości ekstrakcji lub wtrysku.
  3. Wyniki wykresów
    1. Otwórz preferowane oprogramowanie do grafowania i wybierz format Grupowanej Tabeli .
    2. Wybierz Wprowadź lub zaimportuj dane do nowej tabeli, a w Opcje wybierz Wprowadź 3 wartości w podkolumnach obok siebie.
    3. Dla każdej próbki należy wykreślić tylko znormalizowane stosunki VCR/VINB, pomijając surowe wartości powierzchni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki chromatograficzne uzyskane po testach akumulacyjnych wewnątrzkomórkowych z użyciem pierwotnych WSZYSTKICH komórek PDX inkubowanych z VCR i VINB przedstawiono na Rysunku 1. Próbki przygotowywano przy użyciu 2,5 × 106 komórek na warunki. W opisanych warunkach chromatograficznych magnetowid był konsekwentnie utrzymywany przez 2,85 minuty przy minimalnym efekcie macierzowym, a kształt szczytu był symetryczny i dobrze rozdzielony. Profile te ilustrują oczekiwane ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Dokładna ocena poziomu leków wewnątrzkomórkowych w komórkach pierwotnej białaczki jest kluczowa dla zrozumienia obsługi leków na poziomie komórkowym oraz wspierania rozwoju testów funkcjonalnych uzupełniających profilowanie molekularne. Istniejące podejścia analityczne często wymagają dużej liczby komórek, obejmują długie etapy przetwarzania lub opierają się na pośrednich odczytach, które nie odzwierciedlają rzeczywistej dostępności środków chemioterapeutycznych wewnątrzkomórkowych 5,6<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Centro Infantil Boldrini oraz wszystkim pacjentom, którzy przekazali swoje próbki do badania. Adrielli C. Soares otrzymał stypendium od Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) oraz od São Paulo Research Foundation (FAPESP, 2023/18389-3). José A. Yunes otrzymał stypendium produktywności od National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq, 308399/2021-8). Prace te były wspierane przez badania z brazylijskiego Ministerstwa Zdrowia w ramach programu PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2,0 mL fiolka z zakrętkąPrzepływ8-2400Używany z szklanymi wkładkami ze sprężyną (5 x 29 mm) tej samej firmy (Cat. 5-29015)
2,0 mL fiolka z zakrętkąPrzepływ8-2400Używany z szklanymi wkładkami ze sprężyną (5 x 29 mm) tej samej firmy (Cat. 5-29015)
AcetonitrylMerck (Sigma-Aldrich)100030
AcetonitrylMerck (Sigma-Aldrich)24010152
AIM VThermo Fisher Scientific12055091
System chromatograficzny Acquity UPLC Klasa HSpółka Watershttps://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW
Hrabina 3 FLThermo Fisher ScientificA49892
DMSOMerck (Sigma-Aldrich)D 8418
Falcon 50 mLSarstedt62.547.254
Kwas mrówkowyMerck (Sigma-Aldrich)F0507
Szklana butelkaMerck (Sigma-Aldrich)41121800
InkubatorPHCBIMCO-50M-PE
MetanolMerck (Sigma-Aldrich)34860
Mikrorurka 1,5 mLEppendorf41121702
Microtube 2,0 mLEppendorf30120094
PBSMerck (Sigma-Aldrich)PPB006
Speevac miVacFisher Scientific56340
Oprogramowanie do akwizycji danychSpółka WatersMassLynx
Spektrometr masowy potrójny kwadrupolowy Xevo TQ-S microSpółka Watershttps://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW
Sonicator ultradźwiękowyQuimisQ335D
Winblastyna 1 mg/mLLibbshttps://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/Siarczan winblastyny
WinkrystynaCayman Chemicals11764

Bibliografia

  1. Inaba, H., Pui, C. H. Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia. J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).
  2. Pui, C. H., et al. Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration. J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).
  3. Gaudichon, J., et al. Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues. Blood Rev. 36, 40-56 (2019).
  4. Dhyani, P., et al. Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine. Cancer Cell Int. 22, 206(2022).
  5. Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations. Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).
  6. Chien, H. C., et al. Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells. Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).
  7. Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR. Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).
  8. Richter, M., et al. From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines. Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).
  9. Borgmann, A., et al. Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  10. Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia. J Vis Exp. (224), e68797(2025).
  11. Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid. J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).
  12. Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome. J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).
  13. Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations. Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wewn trzkom rkowa winkrystynaoznaczanie ilo ci lekuksenoprzeszczepy pochodz ce od pacjent wprecypitacja bia ekstandard wewn trznybia aczka dzieci caanaliza przebiegu czasowego
Opracowanie i standaryzacja mikrometody ex vivo do ilościowej identyfikacji winkrystyny wewnątrzkomórkowej w komórkach pierwotnych ALL przez LC-MS/MS
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.