Wytłumaczenie i opis szczepu Ent2*/CyO Drosophila melanogaster za pomocą metody CRISPR/Cas9

Podsumowanie

Transporter równoważący nukleozydów 2 (ENT2) to zachowany białkowy transporter transbłonowy zaangażowany w transport nukleozydów i metabolizm komórkowy. W niniejszym badaniu, zastosowano przepływ edycji genomu oparty na CRISPR/Cas9, aby wygenerować allel ukierunkowany na Ent2 w Drosophila melanogaster. Stała linia Ent2*/ CyO heterozygotyczna została stworzona i utrzymywana za pomocą strategii chromosomu bilansującego. Praca ta opisuje projekt, wytworzenie i molekularną weryfikację linii mutantów, a także jej charakterystykę fenotypową w różnych warunkach temperaturowych. Ustalony przepływ pracy i szczep mutantów zapewniają praktyczny ramowy dla badania genów z fenotypami śmiertelnymi dla homozygot oraz dla badania zmienności fenotypowej związanej z temperaturą w Drosophila.

Streszczenie

W niniejszym badaniu zastosowano podejście do edycji genomu oparte na CRISPR/Cas9 w celu wprowadzenia mutacji w genie transportera nukleozydów równoważającym 2 (Ent2) u Drosophila melanogaster. Przewodnie RNA skierowane na region kodujący Ent2 zostały zaprojektowane i współwstrzyknięte z mRNA Cas9 do zarodków w¹¹¹⁸ . Allele mutantne zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania Sangera i utrzymywano jako stabilną heterozygotyczną linię Ent2*/CyO za pomocą chromosomu wyważającego. Następnie ocenialiśmy masę ciała, zdolność do wspinania się, wskaźnik przeżywalności oraz aktywność superoksydoreduktazy (SOD) i katalazy (CAT) u muszek owocowych w temperaturze 22 °C i 25 °C odpowiednio. Wyniki wskazują, że zarówno w 22 °C, jak i 25 °C, długość ciała i masa muszek Ent2*/CyO były znacząco mniejsze w porównaniu z w¹¹¹⁸, a ich rozwój opóźniony. W 22 °C, łączny okres życia muszek Ent2*/CyO był nieco dłuższy niż u w¹¹¹⁸, podczas gdy w 25 °C nie zaobserwowano znaczącej różnicy. Jeśli chodzi o zdolność ruchową, zdolność wspinaczki heterozygotycznych muszek była znacząco niższa niż u w¹¹¹⁸ w obu temperaturach, przy czym samce były bardziej dotknięte. Ponadto aktywność enzymów przeciwutleniających CAT i SOD u muszek Ent2*/CyO była znacząco obniżona, co wskazuje na wyraźne upośledzenie zdolności przeciwutleniających. Te wyniki opisują profil fenotypowy linii mutantów Ent2 wygenerowanej za pomocą CRISPR i demonstrują wykonalność łączenia edycji genomu z strategiami chromosomu wyważającego u Drosophila. Niniejsze badanie dostarcza ram metodologicznych i zasobów genetycznych dla przyszłych badań nad genami związanymi z metabolizmem i reakcji na środowisko.

Wprowadzenie

Drosophila melanogaster pozostaje jednym z najczęściej stosowanych organizmów modelowych w genetyce i biologii rozwoju¹. Charakteryzuje się krótkim cyklem życia, szybkim rozmnażaniem, ustabilizowanymi narzędziami manipulacji genetycznej i w pełni zaanotowanym genomem^2,3. Gatunek ten jest szeroko stosowany w badaniach nad funkcją genów, regulacją metaboliczną i przystosowaniem do środowiska^4,5. Nukleozydy i ich pochodne, takie jak ATP, są centralne dla generacji energii komórkowej, syntezy kwasów nukleinowych i przekazywania sygnałów w Drosophila, co odzwierciedla zachowaną regulację metaboliczną wśród metazoan⁶. Drogi sygnalizacyjne purynergiczne w Drosophila, które opierają się na pozakomórkowym adenozynie i mechanizmach transportu nukleozydów, podkreślają funkcjonalną rolę przemieszczania nukleozydów przez błony w koordynacji odpowiedzi energetycznych i przekazywania sygnałów⁷. Wśród tych procesów transport nukleozydów przez błonę cytoplazmatyczną jest głównie pośredniczony przez rodzinę równoległych transporterów nukleozydów (ENT), przy czym DmENT2 wykazuje funkcjonalną aktywność transportu w Drosophila⁸.

Rodzina ENT obejmuje wiele podtypów, spośród których ENT2 jest szeroko badanym transbłonowym transporterem nukleozydów⁹. Ułatwia energetycznie niezależny transport przez błonę różnych nukleozydów purynowych i pirymidynowych^10,11. U ssaków ENT2 jest wszechobecnie ekspresowanym transporterem dwukierunkowym, który ułatwia wejście do komórki nukleozydów purynowych i pirymidynowych oraz nukleozasad. Ta aktywność transportowa przyczynia się do odbicia nukleotydów i pomaga w utrzymaniu homeostazy metabolicznej komórkowej¹². ENT2 pośredniczy również w transporcie różnych leków pochodnych nukleozydów, rozszerzając jego funkcjonalne znaczenie poza endogenny ruch nukleozydów, podkreślając jego szersze znaczenie fizjologiczne i kliniczne¹³. Ponadto ENT2 jest implikowane w zaburzeniach neurologicznych¹⁴, metabolizmie nowotworowym¹⁵, dysfunkcji naczyniowej¹⁶ i metabolizmie energetycznym komórek u ludzi¹⁷. Jednak badania dotyczące ról Ent2 na poziomie organizmu w Drosophila są ograniczone.

Role ENT2 w wzroście i rozwoju, metabolizmie energetycznym, wydajności ruchowej i zdolności przeciwutleniającej w różnych warunkach temperaturowych nie zostały w pełni zbadane¹⁸. Temperatura silnie wpływa na podstawową szybkość przemiany materii i żywotność Drosophila, przy czym wyższe temperatury chowu ogólnie zwiększają aktywność metaboliczną i zmniejszają długowieczność¹⁹. Te zależne od temperatury zmiany ekspresji genów mogą wpływać na szlaki fizjologiczne, a zatem mogą modyfikować fenotypowe efekty określonych mutacji genów²⁰.

Zgrupowane Regularnie Przerwane Krótkie Palindromowe Powtórzenia/Białko związane z CRISPR-związanym systemem odpornościowym 9 (CRISPR/Cas9) było szeroko stosowane w Drosophila do różnych operacji modyfikacji genomu, takich jak miejscowo specyficzne wyłączenie, delecja, zastępowanie i wprowadzanie tagów, co pokazuje jego efektywność i niezawodność^21,22,23. Ostatnie postępy wskazują, że edytory baz pochodne CRISPR mogą być również użyte do drobniejszych, miejscowo specyficznych modyfikacji baz w Drosophila, dostarczając nowego narzędzia do badania punktowych mutacji i precyzyjnej kontroli fenotypu²⁴. Tradycyjne metody mutagenezy, w tym mutagenezy chemiczne i radiacyjne, jak również badania za pomocą transpozonów, mogą generować mutacje genetyczne²⁵. Te podejścia są często ograniczone przez niską efektywność i wysoką przypadkowość zdarzeń mutacyjnych. W rezultacie badacze muszą przesiewać duże ilości osobników, aby izolować określone allele o interesujących cechach²⁶. CRISPR/Cas9 umożliwia programowane cięcie kierunem wskaźnika RNA (gRNA) w określonych sekwencjach DNA. Powstałe podwójne łamania są naprawiane przez niehomologiczną końcową łączność lub naprawę kierowaną homologią, generując zdefiniowane, dziedziczne mutacje i znacząco zmniejszając tło mutacji, które mogą zakłócić analizę fenotypową^27,28. Allele mutantne wygenerowane za pomocą CRISPR/Cas9 mogą być utrzymywane w stanie heterozygotycznym przez połączenie z chromosomami zbilansowanymi, takimi jak Curly O (CyO)²⁹. Ta strategia okazała się skuteczna w zapobieganiu stratom alleli śmiertelnych w postaci homozygotycznej w genetyce Drosophila. W rezultacie wspiera długoterminową i systematyczną ocenę fenotypową,

Protokół

1. Projektowanie docelów CRISPR/Cas9 dla genu Ent2

1. Wybierz kandydackie miejsca CRISPR w ekzonie 2 i 5 Ent2 (ID FlyBase: FBgn0263916) za pomocą CHOPCHOP (v3)³¹ i CCTop (v1.0)³².
2. Genom referencyjny został zdefiniowany jako Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (RefSeq accession do zestawu: GCF_000001215.4). Następnie zidentyfikowano kandydackie miejsca gRNA. Wreszcie, zidentyfikowane miejsca zostały przefiltrowane, aby uzyskać optymalne gRNA.
3. Przefiltruj cele za pomocą Punktacji Specyficzności MIT ≥ 80 (CHOPCHOP), wyników CFD ≤ 0.1 (CCTop), zawartości GC 40%–60% oraz minimalnej odległości PAM.
4. Uporządkuj cele według wagowego wyniku (efektywność 50%, specyficzność 30%, optymalizacja GC 20%) i wybierz dwa gRNA.
5. Dodaj jedno “G” do 5′ końca każdego gRNA, aby spełnić wymóg promotora T7. Użyj następujących specyficznych dla gRNA oligonukleotydów w przód, aby wygenerować pełny szablon transkrypcji sgRNA przez PCR:
   Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
   AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
   Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
   TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
6. Pozostała sekwencja szkieletu sgRNA jest dostarczana przez uniwersalny oligonukleotyd wsteczny podczas PCR.

2. Przygotowanie szablonów transkrypcji sgRNA

1. Przygotowanie szablonów transkrypcji sgRNA
   1. Zmontuj 60 µL mieszaninę reakcji PCR z wykorzystaniem metody anulowania oligonukleotydów-PCR³³ zgodnie z instrukcjami producenta. Złącz specyficzny dla gRNA oligonukleotyd w przód (Ent2-sg1-F lub Ent2-sg2-F) z uniwersalnym oligonukleotydem wstecznym kodującym szkielet sgRNA, aby uzyskać pełny dsDNA szablon do transkrypcji in vitro.
   2. Zaprogramuj termocykler: 95 °C 3 min; 35 cykli 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s; następnie 72 °C 10 min; utrzymaj w 12 °C.
2. Oczyszczanie szablonu transkrypcji
   1. Dodaj 100 µL octanu amonu (zobacz Tabela materiałów) do 60 µL produktu PCR; wymieszaj. Dodaj 400 µL bezvodnego etanolu; wywróć, aby wymieszać i inkubować w -20 °C przez 20 min.
   2. Wiruj w 4 °C, 20,000 xg przez 15 min; odrzuć nadstan.
   3. Odsączaj nalewkę powietrzem z otwartą probówką przez 10 min. Ponownie zawieś pellet w 10 µL bezvodnej ddH₂O.
3. Transkrypcja in vitro gRNA
   1. Skonfiguruj 10 µL reakcji T7 in vitro transkrypcji zgodnie z instrukcjami zestawu (zobacz Tabela materiałów).
   2. Inkubacja w 37 °C przez 35 min. Dodaj 0.5 µL DNase I (zawarte w zestawie transkrypcji) i inkubacja w 37 °C przez 15 min.
4. Oczyszczanie gRNA
   1. Rozcień miksturę transkrypcji do 60 µL bezvodną ddH₂O. Dodaj 60 µL nasyconego wody fenolu/chloroformu (zobacz Tabela materiałów); krótkotrwale wiruj i wiruj w 4 °C, 16,000 xg przez 5 min.
   2. Przenieś 45 µL fazy wodnej do nowej 1.5 mL probówki bez RNazy. Dodaj 5 µL octanu sodu; wymieszaj.
   3. Dodaj 125 µL wstępnie schłodzonego bezvodnego etanolu; wymieszaj i inkubacja w -20 °C przez 20–30 min. Wiruj w 4 °C, 20,000 xg przez 15 min; odrzuć nadstan.
   4. Przemyj pellet 200 µL 70% etanolu (bez RNazy); wiruj w 4 °C, 20,000 xg przez 5 min; usuń nadstan.
   5. Odsączaj pellet w 37 °C, aż etanol całkowicie się odparzy. Ponownie zawieś w 20 µL ddH₂O; podziel na alikwoty i przechowuj w -80 °C.
   6. Zmierzyj stężenie gRNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop i dostosuj stężenie do 250 ng/µL do wstrzyknięcia. Upewnij się, że czystość gRNA wynosi stosunek A260/A280 około 2.0.
      ​UWAGA: Podkreślamy, że w całym procesie należy nosić rękawiczki w celu ochrony przed RNazą. Wszystkie materiały jednorazowego użytku, w tym wstęp

Wyniki

Design and effectiveness verification analysis of Ent2 gene targeting sites
Candidate target sites for the Ent2 gene were designed using CHOPCHOP and CCTop platforms (Figure 1). Two gRNAs targeting exon 2 and exon 5 regions were selected based on specificity and efficiency criteria. To verify successful genome editing, genomic DNA from randomly selected individuals of the established Ent2*/CyO line was amplified and subjected to Sanger sequencing. Sequencing chromatograms showed overlapping peaks beginning near the target site, consistent with insertion/deletion (indel) mutations. Further sequence analysis revealed frameshift mutations leading to premature stop codons (Figure 2). These results confirm that the CRISPR/Cas9 system successfully introduced mutations at the targeted Ent2 locus and demonstrate the feasibility of the genome editing workflow.

Figure 1. The schematic diagram of the knockout site of the Ent2 gene and the location of the detection primer in the genome. This schematic illustrates the genomic structure of the Ent2 locus, highlighting the CDS (green), start and stop codons (red), gRNA PAM motif (gray), gRNA target sequence (blue), and gRNA amplification primer sequence (yellow) Please click here to view a larger version of this figure.

Figure 2. The peak plot of sequencing results of Drosophila progeny of stable line self-inbred Ent2*/CyO. Sequencing chromatogram confirming the genotype of progeny obtained from self-crossing the stable Ent2*/CyO heterozygous line. Please click here to view a larger version of this figure.

Descriptive morphological observations of the Ent2/CyO line
We observed body shape differences between the two genotypes of fruit flies across genders under 22 °C and 25 °C conditions using a stereomicroscope (Figure 3). Under both temperature conditions, both male and female fruit flies exhibited a typical "long spindle" body shape. Female abdomens were wide and spindle-shaped, with wing tips slightly extending beyond the abdominal tip. The thorax–abdomen junction in males was clearly defined, and the darkened pigmentation at the end of the abdomen—a distinguishing feature of males—was visible. The wings of w¹¹¹⁸ flies of both genders were transparent with clearly defined veins, and no wing edge curvature or vein breakage was observed. In contrast, Ent2*/CyO heterozygotes exhibited noticeable wing base bending and wing edge curvature. At 22 °C, regardless of gender, the body length of fruit flies was significantly greater than that of the same genotype at 25 °C. Additionally, female body length was significantly greater than that of males at the same temperature. Furthermore, at both 22 °C and 25 °C, the body size of Ent2*/CyO heterozygotes was smaller than that of the corresponding w¹¹¹⁸ flies. To investigate the morphological basis, we simultaneously measured the body length of the flies (Figure 3E, Table 1). A three-way ANOVA revealed significant main effects of genotype (F(1,16)=230.1, P<0.0001), temperature (F(1,16)=19.50, P=0.0004), and sex (F(1,16)=166.9, P<0.0001). Significant genotype x sex interaction (F(1,16)=14.96, P=0.0014) and a significant genotype x temperature x sex three-way interaction (F(1,16)=6.231, P=0.0239) were also observed.

Figure 3. The control morphology of w¹¹¹⁸ and Ent2*/CyO adults. Representative images showing posture characteristics of female (A, C) and male (B, D) Drosophila at 22 °C and 25 °C, along with quantitative comparison of body length (E). ** P < 0.01. Scale bar: 1 mm. Please click here to view a larger version of this figure.

Survival analysis under different temperature conditions
We statistically analyzed the survival curves of Ent2*/CyO heterozygotes and w¹¹¹⁸ flies at 22 °C and 25 °C (Figure 4). The results showed that the survival curve of Ent2*/CyO heterozygous females was the highest, with two individuals still alive at the 14th week. All w¹¹¹⁸ females died by the 14th week. All Ent2*/CyO heterozygous males died by the 12th week, while all w¹¹¹⁸ males died by the 11th week. These findings indicate that at 22 °C, the overall lifespan of females is longer than that of males, and within the same gender, the survival ability of Ent2*/CyO heterozygotes is slightly stronger than that of the w¹¹¹⁸ type.

Under 25 °C conditions, the overall survival period was significantly shortened. The survival curves of w¹¹¹⁸ females and Ent2*/CyO heterozygous males dropped to zero by the 10th week. The survival curves of Ent2*/CyO heterozygous females and w¹¹¹⁸ males declined to 1–2 individuals by the 8th week and reached zero by the 9th week. The difference between the mutant and w¹¹¹⁸ was not statistically significant (P > 0.05). These observations describe the survival characteristics of the mutant line under different environmental conditions

Dyskusja

Ent jest konserwatywnym ewolucyjnie białkiem, które wpływa na wiele procesów biologicznych³⁸. Kiedy jest wyrażany w komórkach jajnikowych Xenopus laevis, Ent2 wykazuje aktywność transportu nukleozydów⁸. Badania wykazały, że homozygotyczny mutant Ent2 jest śmiertelny w późnym stadium larw lub wczesnym stadium poczwarki¹⁰. W niniejszym badaniu ustanowiono przepływ edytowania genomu oparty na CRISPR/Cas9 w celu wygenerowania alleli ukierunkowanych na Ent2 w Drosophila melanogaster. Obserwowana śmiertelność homozygotycznych mutantów podczas ustanawiania szczepów jest zgodna z wcześniejszymi raportami, co potwierdza ważność strategii edycji genomu. W tym kontekście, heterozygotyczna linia Ent2*/CyO wygenerowana w niniejszym badaniu zapewnia model dokumentowania cech fenotypowych związanych z częściową utratą Ent2. W badanych warunkach eksperymentalnych stwierdzono różnice w wielkości ciała, wadze ciała, aktywności lokomocyjnej i poziomach enzymów przeciwutleniających między muchami Ent2*/CyO a w¹¹¹⁸. Te obserwacje opisują profil fenotypowy ustalonej linii mutantów.

Pod względem rozwoju i wielkości ciała, heterozygotyczne osobniki Ent2*/CyO były znacznie mniejsze niż muchy w¹¹¹⁸ zarówno w 22 °C, jak i 25 °C. Ta różnica może być spowodowana zmniejszoną efektywnością transportu nukleozydów wynikającą z braku genu Ent2, co z kolei wpływa na stabilność metabolizmu energetycznego i regulację ekdyzonu. Ponadto, negatywne efekty stawały się bardziej wyraźne w 25 °C. Badania wskazują, że żywotność zwierząt jest wpłynięta przez szybkość metabolizmu, co jest znane jako teoria szybkości metabolizmu¹⁹. Wyniki tego badania sugerują, że podwyższona szybkość metabolizmu muszek owocowych w wyższych temperaturach może być ściśle związana z niedoborami żywieniowymi i opóźnieniami rozwojowymi wynikającymi z upośledzonego metabolizmu nukleozydów. Jednak, biorąc pod uwagę użycie pojedynczego allelu pochodzącego od CRISPR, te wyniki należy interpretować jako opisowe obserwacje, a nie bezpośrednie dowody funkcji genu.

Odpowiedź zależna od temperatury była również widoczna w wielu fenotypowych wskaźnikach. Mutant wykazuje skromne przedłużenie życia w 22 °C, szczególnie u samic, co jest zgodne z poprzednimi badaniami^39,40. Natomiast w 25 °C różnica żywotności zmniejsza się lub nawet znikają. Jako organizmy poikilotermiczne, muszki owocowe wykazują wyższą szybkość metabolizmu i w konsekwencji krótszą żywotność w podwyższonych temperaturach^41,42, co jest zgodne z wynikami tego badania. W tym kontekście, obserwowane wzorce mogą odzwierciedlać ogólne fizjologiczne reakcje na temperaturę.

Wydajność lokomocyjna i aktywność enzymów przeciwutleniających również różniła się między genotypami, płciami i warunkami temperaturowymi. Zmniejszona wydajność wspinania i niższa aktywność SOD i CAT były obserwowane u muszek Ent2/CyO w pewnych warunkach. Poprzednie badania łączyły transportery nukleozydów z metabolizmem NAD+ i funkcją mitochondriów oraz regulacją stresu oksydacyjnego^{17,43,44,45,46,47}. Chociaż te raporty zapewniają możliwy kontekst biologiczny, obecne dane są ograniczone do charakteryzacji fenotypowej i nie ustanawiają mechanistycznych łączy między Ent2 a tymi ścieżkami.

Nasze wyniki pokazują również, że w tych samych warunkach, samce muszek owocowych zwykle wykazują wyższą aktywność enzymów przeciwutleniających niż samice muszek owocowych^39,48. Oznacza to, że czynniki związane z płcią mogą regulować odpowiedź przeciwutleniającą poprzez różne ścieżki sygnałowe. Czynniki transkrypcyjne związane z reakcjami przeciwutleniającymi, takie jak Nrf2/CncC i ich zespoły docelowe, wykazują różnice w ekspresji między różnymi płciami, wpływając tym samym na ogólną zdolność przeciwutleniającą⁴⁹. Ta obserwacja jest zgodna z raportami o różnicach między płciami w odporności na stres oksydacyjny i obronach przeciwutleniających w Drosophila, gdzie samice zazwyczaj utrzymują niższy poziom ROS i wyższą bazową aktywność enzymów przeciwutleniających w stosunku do samców, co może przyczyniać się do różnic w odporności na stres i długowieczności między płciami⁵⁰. Te obserwacje jeszcze bardziej podkreślają znaczenie uwzględnienia zmiennych biologicznych takich jak płeć podczas charakteryzacji fenotypów mutantów.

Z metodologicznego punktu widzenia

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ammonium acetate	Sigma	A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A007-1-1
Dodecyl sulfate	Sigma	L3771
Injection device	Eppendorf FemtoJet	4i
Linearized plasmid: MLM3613	Addgene	42251
Microscope	OLYMPUS	CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kit	Thermo Fisher	AM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription Kit	Thermo Fisher	AM1344
PmeI restriction enzyme	NEB	R0560S
Poly(A) polymerase	NEB	M0276S
Protease K	Thermo Fisher	EO0491
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320
T7 RiboMAX Kit	Promega	P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute	A001-1
w1118 Drosophila	Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroform	Sigma	P2069