Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wytłumaczenie i opis szczepu Ent2*/CyO Drosophila melanogaster za pomocą metody CRISPR/Cas9

62 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69546

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 2Innovative Team for Medicinal Plant Resources and Breeding, Institute of Special Agricultural Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Transporter równoważący nukleozydów 2 (ENT2) to zachowany białkowy transporter transbłonowy zaangażowany w transport nukleozydów i metabolizm komórkowy. W niniejszym badaniu, zastosowano przepływ edycji genomu oparty na CRISPR/Cas9, aby wygenerować allel ukierunkowany na Ent2 w Drosophila melanogaster. Stała linia Ent2*/ CyO heterozygotyczna została stworzona i utrzymywana za pomocą strategii chromosomu bilansującego. Praca ta opisuje projekt, wytworzenie i molekularną weryfikację linii mutantów, a także jej charakterystykę fenotypową w różnych warunkach temperaturowych. Ustalony przepływ pracy i szczep mutantów zapewniają praktyczny ramowy dla badania genów z fenotypami śmiertelnymi dla homozygot oraz dla badania zmienności fenotypowej związanej z temperaturą w Drosophila.

Streszczenie

W niniejszym badaniu zastosowano podejście do edycji genomu oparte na CRISPR/Cas9 w celu wprowadzenia mutacji w genie transportera nukleozydów równoważającym 2 (Ent2) u Drosophila melanogaster. Przewodnie RNA skierowane na region kodujący Ent2 zostały zaprojektowane i współwstrzyknięte z mRNA Cas9 do zarodków w1118 . Allele mutantne zidentyfikowano za pomocą sekwencjonowania Sangera i utrzymywano jako stabilną heterozygotyczną linię Ent2*/CyO za pomocą chromosomu wyważającego. Następnie ocenialiśmy masę ciała, zdolność do wspinania się, wskaźnik przeżywalności oraz aktywność superoksydoreduktazy (SOD) i katalazy (CAT) u muszek owocowych w temperaturze 22 °C i 25 °C odpowiednio. Wyniki wskazują, że zarówno w 22 °C, jak i 25 °C, długość ciała i masa muszek Ent2*/CyO były znacząco mniejsze w porównaniu z w1118, a ich rozwój opóźniony. W 22 °C, łączny okres życia muszek Ent2*/CyO był nieco dłuższy niż u w1118, podczas gdy w 25 °C nie zaobserwowano znaczącej różnicy. Jeśli chodzi o zdolność ruchową, zdolność wspinaczki heterozygotycznych muszek była znacząco niższa niż u w1118 w obu temperaturach, przy czym samce były bardziej dotknięte. Ponadto aktywność enzymów przeciwutleniających CAT i SOD u muszek Ent2*/CyO była znacząco obniżona, co wskazuje na wyraźne upośledzenie zdolności przeciwutleniających. Te wyniki opisują profil fenotypowy linii mutantów Ent2 wygenerowanej za pomocą CRISPR i demonstrują wykonalność łączenia edycji genomu z strategiami chromosomu wyważającego u Drosophila. Niniejsze badanie dostarcza ram metodologicznych i zasobów genetycznych dla przyszłych badań nad genami związanymi z metabolizmem i reakcji na środowisko.

Wprowadzenie

Drosophila melanogaster pozostaje jednym z najczęściej stosowanych organizmów modelowych w genetyce i biologii rozwoju1. Charakteryzuje się krótkim cyklem życia, szybkim rozmnażaniem, ustabilizowanymi narzędziami manipulacji genetycznej i w pełni zaanotowanym genomem2,3. Gatunek ten jest szeroko stosowany w badaniach nad funkcją genów, regulacją metaboliczną i przystosowaniem do środowiska4,5. Nukleozydy i ich pochodne, takie jak ATP, są centralne dla generacji energii komórkowej, syntezy kwasów nukleinowych i przekazywania sygnałów w Drosophila, co odzwierciedla zachowaną regulację metaboliczną wśród metazoan6. Drogi sygnalizacyjne purynergiczne w Drosophila, które opierają się na pozakomórkowym adenozynie i mechanizmach transportu nukleozydów, podkreślają funkcjonalną rolę przemieszczania nukleozydów przez błony w koordynacji odpowiedzi energetycznych i przekazywania sygnałów7. Wśród tych procesów transport nukleozydów przez błonę cytoplazmatyczną jest głównie pośredniczony przez rodzinę równoległych transporterów nukleozydów (ENT), przy czym DmENT2 wykazuje funkcjonalną aktywność transportu w Drosophila8.

Rodzina ENT obejmuje wiele podtypów, spośród których ENT2 jest szeroko badanym transbłonowym transporterem nukleozydów9. Ułatwia energetycznie niezależny transport przez błonę różnych nukleozydów purynowych i pirymidynowych10,11. U ssaków ENT2 jest wszechobecnie ekspresowanym transporterem dwukierunkowym, który ułatwia wejście do komórki nukleozydów purynowych i pirymidynowych oraz nukleozasad. Ta aktywność transportowa przyczynia się do odbicia nukleotydów i pomaga w utrzymaniu homeostazy metabolicznej komórkowej12. ENT2 pośredniczy również w transporcie różnych leków pochodnych nukleozydów, rozszerzając jego funkcjonalne znaczenie poza endogenny ruch nukleozydów, podkreślając jego szersze znaczenie fizjologiczne i kliniczne13. Ponadto ENT2 jest implikowane w zaburzeniach neurologicznych14, metabolizmie nowotworowym15, dysfunkcji naczyniowej16 i metabolizmie energetycznym komórek u ludzi17. Jednak badania dotyczące ról Ent2 na poziomie organizmu w Drosophila są ograniczone.

Role ENT2 w wzroście i rozwoju, metabolizmie energetycznym, wydajności ruchowej i zdolności przeciwutleniającej w różnych warunkach temperaturowych nie zostały w pełni zbadane18. Temperatura silnie wpływa na podstawową szybkość przemiany materii i żywotność Drosophila, przy czym wyższe temperatury chowu ogólnie zwiększają aktywność metaboliczną i zmniejszają długowieczność19. Te zależne od temperatury zmiany ekspresji genów mogą wpływać na szlaki fizjologiczne, a zatem mogą modyfikować fenotypowe efekty określonych mutacji genów20.

Zgrupowane Regularnie Przerwane Krótkie Palindromowe Powtórzenia/Białko związane z CRISPR-związanym systemem odpornościowym 9 (CRISPR/Cas9) było szeroko stosowane w Drosophila do różnych operacji modyfikacji genomu, takich jak miejscowo specyficzne wyłączenie, delecja, zastępowanie i wprowadzanie tagów, co pokazuje jego efektywność i niezawodność21,22,23. Ostatnie postępy wskazują, że edytory baz pochodne CRISPR mogą być również użyte do drobniejszych, miejscowo specyficznych modyfikacji baz w Drosophila, dostarczając nowego narzędzia do badania punktowych mutacji i precyzyjnej kontroli fenotypu24. Tradycyjne metody mutagenezy, w tym mutagenezy chemiczne i radiacyjne, jak również badania za pomocą transpozonów, mogą generować mutacje genetyczne25. Te podejścia są często ograniczone przez niską efektywność i wysoką przypadkowość zdarzeń mutacyjnych. W rezultacie badacze muszą przesiewać duże ilości osobników, aby izolować określone allele o interesujących cechach26. CRISPR/Cas9 umożliwia programowane cięcie kierunem wskaźnika RNA (gRNA) w określonych sekwencjach DNA. Powstałe podwójne łamania są naprawiane przez niehomologiczną końcową łączność lub naprawę kierowaną homologią, generując zdefiniowane, dziedziczne mutacje i znacząco zmniejszając tło mutacji, które mogą zakłócić analizę fenotypową27,28. Allele mutantne wygenerowane za pomocą CRISPR/Cas9 mogą być utrzymywane w stanie heterozygotycznym przez połączenie z chromosomami zbilansowanymi, takimi jak Curly O (CyO)29. Ta strategia okazała się skuteczna w zapobieganiu stratom alleli śmiertelnych w postaci homozygotycznej w genetyce Drosophila. W rezultacie wspiera długoterminową i systematyczną ocenę fenotypową,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Projektowanie celów CRISPR/Cas9 dla genu Ent2

  1. Wybierz potencjalne miejsca CRISPR w egzonach 2 i 5 genu Ent2 (FlyBase ID: FBgn0263916), korzystając z programów CHOPCHOP (v3)31 oraz CCTop (v1.0)32.
  2. Jako genom referencyjny zdefiniowano Drosophila melanogaster Release 6 (dm6) (numer dostępu RefSeq assembly: GCF_000001215.4). Następnie zidentyfikowano potencjalne miejsca gRNA, a ostatecznie przefiltrowano je w celu uzyskania optymalnych gRNA.
  3. Przefiltruj cele według następujących kryteriów: MIT Specificity Score ≥ 80 (CHOPCHOP), wynik CFD ≤ 0,1 (CCTop), zawartość GC 40%–60% oraz minimalna odległość PAM.
  4. Uszereguj cele na podstawie ważonego wyniku (wydajność 50%, swoistość 30%, optymalizacja GC 20%) i wybierz dwa gRNA.
  5. Dodaj jedną nukleotydową zasadę „G” do końca 5′ każdego gRNA, aby spełnić wymagania promotora T7. Użyj następujących specyficznych dla gRNA oligosów forward, aby wygenerować pełnej długości matrycę transkrypcyjną sgRNA za pomocą PCR:
    Ent2-sg1-F: TAATACGACTCACTAT
    AGGTGACGTTAAATCCATCGTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
    Ent2-sg2-F: TAATACGACTCAC
    TATATTGCCGTTGGAATCATGGGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC
  6. Pozostała sekwencja rusztowania (scaffold) sgRNA jest dostarczana przez uniwersalny oligos reverse podczas PCR.

2. Przygotowanie matryc transkrypcyjnych sgRNA

  1. Przygotowanie matryc transkrypcyjnych sgRNA
    1. Przygotować 60 µL mieszaniny reakcyjnej PCR, stosując metodę hybrydyzacji podwójnych oligonukleotydów i PCR33 zgodnie z instrukcjami producenta. Połączyć specyficzny dla gRNA oligonukleotyd forward (Ent2-sg1-F lub Ent2-sg2-F) z uniwersalnym oligonukleotydem reverse kodującym rusztowanie sgRNA, aby uzyskać pełnej długości matrycę dsDNA do transkrypcji in vitro.
    2. Zaprogramować termocykler: 95 °C 3 min; 35 cykli: 95 °C 30 s, 55 °C 30 s, 72 °C 20 s; następnie 72 °C 10 min; przechowywanie w 12 °C.
  2. Oczyszczanie matrycy transkrypcyjnej
    1. Do 60 µL produktu PCR dodać 100 µL octanu amonu (patrz Tabela materiałów) i wymieszać. Dodać 400 µL bezwodnego etanolu, odwrócić probówkę w celu wymieszania i inkubować w -20 °C przez 20 min.
    2. Wirować w 4 °C przy 20,000 x g przez 15 min; odrzucić nadsącz.
    3. Suszyć osad na powietrzu przy otwartej probówce przez 10 min. Resuspendować osad w 10 µL wolnej od nukleaz ddH₂O.
  3. Transkrypcja in vitro gRNA
    1. Przygotować 10 µL reakcji transkrypcji in vitro T7 zgodnie z instrukcją zestawu (patrz Tabela materiałów).
    2. Inkubować w 37 °C przez 35 min. Dodać 0,5 µL DNazy I (dołączonej do zestawu do transkrypcji) i inkubować w 37 °C przez 15 min.
  4. Oczyszczanie gRNA
    1. Rozcieńczyć mieszaninę transkrypcyjną do 60 µL za pomocą wolnej od nukleaz ddH₂O. Dodać 60 µL nasyconego wodą fenolu/chloroformu (patrz Tabela materiałów), krótko wymieszać w wirówce typu vortex i wirować w 4 °C przy 16,000 x g przez 5 min.
    2. Przenieść 45 µL fazy wodnej do nowej probówki 1,5 mL wolnej od RNaz. Dodać 5 µL octanu sodu i wymieszać.
    3. Dodać 125 µL schłodzonego bezwodnego etanolu, wymieszać i inkubować w -20 °C przez 20–30 min. Wirować w 4 °C przy 20,000 x g przez 15 min; odrzucić nadsącz.
    4. Przemyć osad 200 µL 70% etanolu (wolnego od RNaz); wirować w 4 °C przy 20,000 x g przez 5 min; usunąć nadsącz.
    5. Suszyć osad w 37 °C aż do całkowitego odparowania etanolu. Resuspendować w 20 µL ddH₂O; podzielić na alikwoty i przechowywać w -80 °C.
    6. Zmierzyć stężenie gRNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop i dostosować stężenie do 250 ng/µL przed wstrzyknięciem. Sprawdzić czystość gRNA, upewniając się, że stosunek A260/A280 wynosi około 2,0.
      ​UWAGA: Podkreślamy, że przez cały proces należy nosić rękawiczki w celu ochrony przed RNazami. Wszystkie materiały zużywalne, w tym wstępnie schłodzone probówki do wirowania i końcówki do pipet wolne od RNaz, muszą być konsekwentnie stosowane podczas procedury. Odpady z reagentów organicznych powstałe podczas operacji muszą być zbierane oddzielnie w wyznaczonych pojemnikach na odpady zgodnie z ich typem i regularnie transportowane do certyfikowanego zakładu utylizacji odpadów niebezpiecznych w celu prawidłowej utylizacji.

3. Przygotowanie mRNA Cas9

  1. Przygotowanie matrycy transkrypcyjnej
    UWAGA: Podczas wszystkich etapów związanych z RNA należy używać końcówek i probówek wolnych od RNaz.
    1. Rozmrozić plazmid ekspresyjny Cas9 MLM3613 (patrz Tabela materiałów) na lodzie. W probówce wolnej od RNaz połączyć 20 µg DNA plazmidowego, 7,5 µL 10x buforu do restrykcji, 1 µL PmeI (10 000 U/mL) i uzupełnić nukleazowo wolną wodą ddH₂O do objętości 75 µL.
    2. Inkubować w 37 °C przez 30 min. Zweryfikować całkowitą linearyzację, nakładając 5 µL na 1% żel agarozy i prowadząc elektroforezę przy 120 V przez 30 min.
  2. Oczyszczanie matryc transkrypcyjnych
    1. Do 70 µL produktu trawienia dodać 23 µL 2% dodecylosiarczanu sodu (SDS, szczegóły w Tabeli materiałów) oraz 0,5 µL proteinazy K (szczegóły w Tabeli materiałów); inkubować w 50 °C przez 30 min.
    2. Dodać 45 µL chloroformu i 45 µL fenolu nasyconego Trisem; krótko wymieszać w wirówce typu vortex; wirować przy 13 800 x g przez 5 min.
    3. Przenieść 90 µL fazy wodnej do nowej probówki. Dodać 10 µL octanu sodu (załączonego do zestawu) i 200 µL schłodzonego bezwodnego etanolu; wymieszać; inkubować w −20 °C przez 30 min.
    4. Wirować przy 20 000 x g w 4 °C przez 15 min; odrzucić nadsącz. Przemyć osad dwukrotnie 100 µL 70% etanolu; wirować przy 20 000 x g przez 2 min po każdym myciu; wysuszyć na powietrzu.
    5. Rozpuścić DNA w 20 µL nukleazowo wolnej wody ddH₂O; potwierdzić stężenie >500 ng/µL.
  3. Transkrypcja in vitro z jednoczesnym nakładaniem czapeczki (co-capping)
    1. Przygotować reakcję, używając zestawu do transkrypcji in vitro T7 z nakładaniem czapeczki (patrz Tabela materiałów), zgodnie z instrukcjami producenta.
    2. Inkubować w 37 °C przez 2 h w celu uzyskania mRNA Cas9 z nakładką.
    3. Po zakończeniu reakcji transkrypcji dodać 1 µL DNazy (załączonej do zestawu, stężenie 2 U/µL), dokładnie wymieszać i inkubować w 37°C przez 15 min w celu degradacji matrycy DNA.
  4. Dodanie ogona poli(A)
    1. Dopełnić objętość RNA do 14 µL wodą ddH₂O.
    2. Dodać 2 µL 10x buforu do polimerazy poli(A) z E. coli, 2 µL ATP (10 mM), 1 µL inhibitora RNaz i 1 µL polimerazy poli(A).
    3. Inkubować w 37 °C przez 45 min.
  5. Oczyszczanie mRNA
    1. Przenieść mieszaninę z reakcji do zestawu do izolacji całkowitego RNA opartego na kolumienkach wirowych (patrz Tabela materiałów). Nałożyć próbkę na kolumienkę wirową z membraną krzemionkową o pojemności 2 mL; wirować przy 8 000 x g przez 15 s; odrzucić przelew.
    2. Do kolumienki RNeasy dodać 500 µL buforu RPE, wirować przy 8000 x g przez 15 s i odrzucić pozostałą ciecz. Powtórzyć ten krok raz, a następnie wirować przez 2 min i odrzucić pozostałą ciecz.
    3. Umieścić kolumienkę RNeasy w nowej probówce wirówkowej 1,5 mL. Dodać 30 µL nukleazowo wolnej wody ddH₂O, wirować przy 8000 x g przez 1 minutę, aby elucyjnie odzyskać RNA. Dostosować stężenie mRNA do 500 ng/µL przed iniekcją. Eluowane RNA przechowywać w -80 ℃.

4. Mikroiniekcja zarodków Drosophila

  1. Przygotowanie próbek do wstrzyknięcia
    1. Wymieszać 15 µg mRNA Cas9 z 7.5 µg dwuniciowy gRNA w stosunku objętościowym 2:1.
    2. Dostosować do 30 µL wodą wolną od RNaz traktowaną DEPC; przechowywać w lodzie.
  2. Muszka owocówka hodowla
    1. Przenieś wstrzykniętą Muszka owocówka szczep w1118 do dużych probówek do amplifikacji.1118 Muchy wykorzystano jako kontrolę referencyjną w celu przedstawienia bazowego stanu fizjologicznego bez efektów związanych z balancerem.
    2. Utrzymywać muchy w komorze klimatycznej z ustawionymi parametrami 25 °C przy wilgotności 60%–70% i 12-godzinnym cyklu światło-ciemność przez 14 dni.
    3. O godzinie 17:00 w dniu następującym po 14-dniowym okresie hodowli (dzień 15.), należy zebrać dorosłe muchy, aby zsynchronizować czas składania zarodków. Ten konkretny czas zbioru zapewnia, że zarodki wykorzystywane do mikroiniekcji znajdują się na spójnym etapie rozwoju. Kontrola pory dnia jest istotna dla zminimalizowania wpływu rytmu okołodobowego na rozwój zarodków oraz zachowania rozrodcze, co zapewnia powtarzalność eksperymentu i zmniejsza zmienność fizjologiczną między partiami.
  3. Mikroiniekcja Muszka owocówka
    1. Zbierz dorosłe muchy do klatek w celu przeprowadzenia iniekcji, umieszczając około 400 osobników w każdej klatce. Zbierz embriony z płytek agarowych pokrytych drożdżami; zbiór należy przeprowadzić w ciągu 60 min od złożenia jaj, a następnie przepłukać embriony na szkiełka nakrywkowe. Przed iniekcją nie przeprowadzono dechorionizacji.
    2. Ułożyć zarodki na szkiełkach podstawkowych w sposób uporządkowany, od góry do dołu, tak aby ich bieguny tylne były skierowane na zewnątrz. Należy upewnić się, że igła do iniekcji penetruje biegun tylny na odpowiednią głębokość (około jednej piątej długości zarodka), aby zapewnić powtarzalne dostarczanie cytoplazmy. W badaniu wykorzystano łącznie 300 zarodków.
    3. Pod stereomikroskopem ustaw ostrość tak, aby końcówka igły i zarodek znajdowały się w tej samej płaszczyźnie.
    4. Za pomocą instrumentu do iniekcji przebij biegun tylny i wstrzyknij 0.001 µL mieszaniny do każdego zarodka.
    5. Przenieść wstrzyknięte embriony do fiolek z pożywką; inkubować w temperaturze 25 °C, ~70% wilgotności względnej (RH), aby uzyskać pokolenie P₀ (zaaplikowane osobniki dorosłe, które przeżyły i doprowadziły do powstania potomstwa).

5. Konstrukcja szczepów o stabilnej ekspresji u Drosophila

  1. Skrzyżować wyklute osobniki P₀ z muchami Bc/CyO.
    1. Mikroiniekcją wprowadzić mieszaninę gRNA celującego w badany gen oraz białka Cas9 do 300 embrionów szczepu w1118 Drosophila. Po iniekcji uzyskać łącznie 30 żywotnych i płodnych osobników dorosłych P0. Każdego osobnika P0 (mozaikę) skrzyżować indywidualnie z muchami szczepu w1118, co da 16 krzyżówek pojedynczych par (8 fiolek z samcami P0 skrzyżowanymi z dziewiczymi samicami i 8 fiolek z samicami P0 skrzyżowanymi z samcami). Wszystkie krzyżówki utrzymywać w temperaturze 25 °C w stałych warunkach hodowlanych.
    2. Po pojawieniu się larw F1 usunąć rodzicielskie muchy P0. Wyekstrahować DNA genomowe z potomstwa F1 i poddać je analizie PCR w celu określenia genotypów osobników dorosłych F1 (Ent2/+).
    3. Uzyskać potomstwo F2 poprzez pojedyncze krzyżowania między muchami Bc/CyO. Wybrać pojedyncze osobniki dorosłe F2 i przeprowadzić ich genotypowanie, aby zidentyfikować muchy o genotypie Ent2/CyO.
    4. Przeprowadzić krzyżowanie wewnątrz linii much F3 (Ent2/CyO), aby ocenić obecność mutantów homozygotycznych. Jeśli nie odzyskano much homozygotycznych, kontynuować krzyżowanie much Ent2/CyO przez dodatkowe pokolenie, aby dalej ustalić, czy genotyp homozygotyczny jest letalny.
  2. Ekstrakcja DNA genomowego Drosophila
    1. Przenieść jedną lub dwie muchy dorosłe do probówki EP 1,5 mL i dodać 110 µL buforu do ekstrakcji DNA roślinnego Plant DNA Extraction Buffer PA.
    2. Dokładnie zhomogenizować próbki za pomocą homogenizatora do tkanek przez co najmniej 3 min.
    3. Inkubować homogenaty w łaźni metalowej w temperaturze 65 °C przez nie mniej niż 30 min.
    4. Dodać 100 µL chloroformu, delikatnie odwrócić probówkę w celu wymieszania, a następnie wierzchołkować przez 10 s. Odwirować próbki przy 14 000 rpm przez 10 min w temperaturze pokojowej.
    5. Ostrożnie przenieść około 65 µL (lub więcej) nadsączu do nowej probówki, dodać dwie objętości schłodzonego absolutnego etanolu (wstępnie inkubowanego w 4 °C przez co najmniej 10 min), delikatnie odwrócić w celu wymieszania i inkubować w -20 °C przez co najmniej 15 min.
    6. Odwirować próbki przy 14 000 rpm przez 10 min w 4 °C i ostrożnie usunąć nadsącz.
    7. Osuszyć osad DNA na powietrzu w temperaturze pokojowej lub w inkubatorze do całkowitego wyschnięcia, a następnie resuspenderować w odpowiedniej objętości buforu PB. W przypadku próbek samic (f) dodać 50 µL buforu PB, a dla próbek samców (m) dodać 15 µL.
  3. Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie metodą Sangera
    1. Przeprowadzić amplifikację PCR przy użyciu specyficznych starterów zaprojektowanych tak, aby flankowały regiony powyżej i poniżej miejsca docelowego gRNA.
    2. Oczyścić produkty PCR i poddać je sekwencjonowaniu metodą Sangera. Przeanalizować chromatogramy sekwencjonowania za pomocą oprogramowania SnapGene34 i wyrównać je z referencyjną sekwencją typu dzikiego w celu analizy porównawczej.
    3. Zbadać wykresy pików w pobliżu miejsca docelowego gRNA pod kątem nakładających się pików wskazujących na mutacje typu indel. Przeprowadzić rozdzielanie pików (peak splitting), aby rozstrzygnąć zmieszane sygnały i potwierdzić typ mutacji, w tym insercje lub delecje w miejscu docelowym.
    4. Przeprowadzić krzyżowanie wsteczne z samcami Bc/CyO przez 4 pokolenia w celu ustanowienia linii Ent2/CyO.
      Uwaga: Zaobserwowano, że Ent2*/Ent2* oraz CyO/CyO są letalne we wczesnych stadiach rozwoju; dlatego utrzymuje się heterozygoty Ent2*/CyO.
  4. Po ustanowieniu heterozygot Ent2*/CyO zebrać próbki z tej samej partii heterozygot Ent2*/CyO pod stereomikroskopem.
  5. Losowo wybrać 20 much dorosłych i zważyć je za pomocą wagi precyzyjnej o rozdzielczości 0,001 g. Wykonać zdjęcia próbek w celu udokumentowania cech fenotypowych.

6. Opisowa charakterystyka fenotypowa

  1. Hoduj 120 samców i 120 samic (trzy fiolki dla każdej grupy, każda zawierająca 20 much) szczepów Ent2*/CyO oraz w1118 w temperaturze 22 °C i 25 °C.
  2. Odnotowuj tygodniowo liczbę zgonów i wykreśl krzywe przeżywalności.
  3. Utwórz 30 par do przypadkowego kojarzenia w każdej grupie; pozostaw na 24 h w celu kopulacji;
  4. Przenieś osobniki dorosłe do nowych probówek; hoduj potomstwo.
  5. W 7. dniu po wyjściu z poczwarki oceń sukces wspinania (≥8 cm w ciągu 30 s), wykonując sześć powtórzeń dla każdej grupy.
  6. Wszystkie obserwacje zapisano jako cechy opisowe linii mutantów i nie były one wykorzystywane do wnioskowania o funkcji genu.

7. Pomiar aktywności enzymów przeciwutleniających

  1. Zebrać 300 dorosłych samców i 300 dorosłych samic (przetestowano trzy fiolki dla każdej grupy, każda zawierająca 100 much) much Ent2*/CyO oraz kontrolnych much w1118 w 5. dniu po wykluciu, aby zapewnić dojrzałość fizjologiczną i porównywalny wiek.
  2. Przenieść muchy do pustych probówek bez pożywki i głodzić przez 2 h w celu ustandaryzowania stanu metabolicznego przed analizami biochemicznymi.
  3. Dodać jedną stalową kuleczkę do każdej probówki; homogenizować przy 60 Hz przez 2 min.
  4. Wirować w temperaturze 4 °C, 161 x g przez 10 min; zebrać nadsącz.
  5. Zmierzyć całkowitą aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD, szczegóły w Tabeli Materiałów) oraz katalazy (CAT, szczegóły w Tabeli Materiałów) zgodnie z instrukcją zestawu.

8. Statystyka i analiza danych

  1. Wszystkie dane należy przedstawić jako średnią ± błąd standardowy średniej (Równanie kinematyki: x̄=vt, wykres, badanie ruchu liniowego, analiza zależności prędkość-czas.​ ± SEM).
  2. Do porównania danych dotyczących aktywności enzymatycznej należy zastosować jednoczynnikową analizę wariancji (one-way ANOVA); w przypadku masy ciała, zdolności wspinania się i długości ciała należy zastosować trójczynnikową analizę wariancji (three-way ANOVA; czynniki: genotyp, temperatura, płeć). W razie potrzeby należy przeprowadzić test post hoc Tukeya (HSD)35.
  3. Istotność dla wszystkich testów statystycznych należy zdefiniować jako P < 0.05.
  4. Dane dotyczące długości życia należy analizować za pomocą krzywych przeżycia oraz testu log-rank (Mantel-Cox), który ocenia, czy między kohortami eksperymentalnymi istnieją istotne różnice w trajektoriach przeżycia36.
  5. Wszystkie analizy i wykresy należy wykonać w oprogramowaniu GraphPad Prism 9.5.0 zgodnie z wytycznymi producenta37.
  6. Wszystkie analizy statystyczne zostały przeprowadzone wyłącznie w celu porównania opisowego, a nie w celu ustalenia związków przyczynowo-skutkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Projektowanie i analiza weryfikacji skuteczności miejsc celowania genu Ent2
Kandydackie miejsca celowania dla genu Ent2 zostały zaprojektowane przy użyciu platform CHOPCHOP i CCTop (Rysunek 1). Na podstawie kryteriów specyficzności i wydajności wybrano dwa gRNA celujące w regiony eksonu 2 i eksonu 5. Aby zweryfikować pomyślne edytowanie genomu, DNA genomowe od losowo wybranych osobników z ustanowionej linii Ent2*/CyO zostało amplifikowane i poddane sekwencjonowaniu metodą S...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ent jest konserwatywnym ewolucyjnie białkiem, które wpływa na wiele procesów biologicznych38. Kiedy jest wyrażany w komórkach jajnikowych Xenopus laevis, Ent2 wykazuje aktywność transportu nukleozydów8. Badania wykazały, że homozygotyczny mutant Ent2 jest śmiertelny w późnym stadium larw lub wczesnym stadium poczwarki10. W niniejszym badaniu ustanowiono przepływ edytowania genomu oparty na CRISPR/Cas9 w celu wygenerowania a...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy nie mają żadnych sporów interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

Wspieraj tę pracę dzięki Programowi Rozwoju Nauki i Technologii Prowincji Jilin (Numer projektu 20230505044ZP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ammonium acetateSigma A1542
Catalase (CAT) Assay Kit (Visible Light Method) (Ammonium Molybdate Method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA007-1-1
Dodecyl sulfateSigmaL3771
Injection deviceEppendorf FemtoJet 4i
Linearized plasmid: MLM3613Addgene42251
MicroscopeOLYMPUS CKX3-SLP
mMESSAGE mMACHINE T7 kitThermo FisherAM1344
mMESSAGE mMACHINE T7 Transcription KitThermo FisherAM1344
PmeI restriction enzymeNEB R0560S
Poly(A) polymeraseNEBM0276S
Protease KThermo FisherEO0491
RNeasy Mini KitQIAGEN74104
T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production SystemPromega P1320
T7 RiboMAX KitPromega P1320
Total Superoxide Dismutase (T-SOD) assay kit (Hydroxylamine method)Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA001-1
w1118 Drosophila Fangjing Biology
Water-saturated phenol/chloroformSigmaP2069

Bibliografia

  1. Tolwinski, N. S. Introduction: Drosophila-A Model System for Developmental Biology. J Dev Biol. 5 (3), (2017).
  2. Ogienko, A. A., et al. Drosophila as a Model Organism to Study Basic Mechanisms of Longevity. Int J Mol Sci. 23 (19), (2022).
  3. Lu, T. C., et al. Aging Fly Cell Atlas identifies exhaustive aging features at cellular resolution. Science. 380 (6650), eadg0934(2023).
  4. Koyama, T., Texada, M. J., Halberg, K. A., Rewitz, K. Metabolism and growth adaptation to environmental conditions in Drosophila. Cell Mol Life Sci. 77 (22), 4523-4551 (2020).
  5. Moraes, K. C. M., Montagne, J. Drosophila melanogaster: A Powerful Tiny Animal Model for the Study of Metabolic Hepatic Diseases. Frontiers in Physiology. 12, 2021(2021).
  6. Chatterjee, N., Perrimon, N. What fuels the fly: Energy metabolism in Drosophila and its application to the study of obesity and diabetes. Sci Adv. 7 (24), (2021).
  7. Volonté, C., Alberti, F., Vitale, G., Liguori, F. Delineating Purinergic Signaling in Drosophila. International Journal of Molecular Sciences. 23 (23), 15196(2022).
  8. Machado, J., Abdulla, P., Hanna, W. J., Hilliker, A. J., Coe, I. R. Genomic analysis of nucleoside transporters in Diptera and functional characterization of DmENT2, a Drosophila equilibrative nucleoside transporter. Physiol Genomics. 28 (3), 337-347 (2007).
  9. Ho, H. T., Xia, L., Wang, J. Residue Ile89 in human plasma membrane monoamine transporter influences its organic cation transport activity and sensitivity to inhibition by dilazep. Biochem Pharmacol. 84 (3), 383-390 (2012).
  10. Knight, D., et al. Equilibrative nucleoside transporter 2 regulates associative learning and synaptic function in Drosophila. J Neurosci. 30 (14), 5047-5057 (2010).
  11. Sidorov, R., Kucerova, L., Kiss, I., Zurovec, M. Mutation in the Drosophila melanogaster adenosine receptor gene selectively decreases the mosaic hyperplastic epithelial outgrowth rates in wts or dco heterozygous flies. Purinergic Signal. 11 (1), 95-105 (2015).
  12. Naes, S. M., Ab-Rahim, S., Mazlan, M., Abdul Rahman, A. Equilibrative Nucleoside Transporter 2: Properties and Physiological Roles. Biomed Res Int. 2020, 5197626(2020).
  13. Boswell-Casteel, R. C., Hays, F. A. Equilibrative nucleoside transporters-A review. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 36 (1), 7-30 (2017).
  14. Wu, K. C., Lee, C. Y., Chou, F. Y., Chern, Y., Lin, C. J. Deletion of equilibrative nucleoside transporter-2 protects against lipopolysaccharide-induced neuroinflammation and blood-brain barrier dysfunction in mice. Brain Behav Immun. 84, 59-71 (2020).
  15. Rattray, Z., et al. ENT2 facilitates brain endothelial cell penetration and blood-brain barrier transport by a tumor-targeting anti-DNA autoantibody. JCI Insight. 6 (14), (2021).
  16. Chiang, H. L., et al. The Critical Role of Equilibrative Nucleoside Transporter-2 in Modulating Cerebral Damage and Vascular Dysfunction in Mice with Brain Ischemia-Reperfusion. Pharm Res. 40 (11), 2541-2554 (2023).
  17. Chen, M., et al. SLC29A1 and SLC29A2 are human nicotinamide cell membrane transporters. Nat Commun. 16 (1), 1181(2025).
  18. Bajgar, A., et al. Extracellular adenosine mediates a systemic metabolic switch during immune response. PLoS Biol. 13 (4), e1002135(2015).
  19. Mołoń, M., et al. Effects of Temperature on Lifespan of Drosophila melanogaster from Different Genetic Backgrounds: Links between Metabolic Rate and Longevity. Insects. 11 (8), (2020).
  20. Chen, J., Nolte, V., Schlötterer, C. Temperature-Related Reaction Norms of Gene Expression: Regulatory Architecture and Functional Implications. Mol Biol Evol. 32 (9), 2393-2402 (2015).
  21. Gratz, S. J., Rubinstein, C. D., Harrison, M. M., Wildonger, J., O'Connor-Giles, K. M. CRISPR-Cas9 Genome Editing in Drosophila. Curr Protoc Mol Biol. 111, 31.32.31-31.32.20 (2015).
  22. Bassett, A., Liu, J. L. CRISPR/Cas9 mediated genome engineering in Drosophila. Methods. 69 (2), 128-136 (2014).
  23. Port, F., Muschalik, N., Bullock, S. L. Systematic Evaluation of Drosophila CRISPR Tools Reveals Safe and Robust Alternatives to Autonomous Gene Drives in Basic Research. G3 Genes|Genomes|Genetics. 5 (7), 1493-1502 (2015).
  24. Clark, M., et al. Expanding the CRISPR base editing toolbox in Drosophila melanogaster. Communications Biology. 7 (1), 1126(2024).
  25. Venken, K. J., Bellen, H. J. Chemical mutagens, transposons, and transgenes to interrogate gene function in Drosophila melanogaster. Methods. 68 (1), 15-28 (2014).
  26. Port, F., Boutros, M. Drosophila: Methods and Protocols. Dahmann, C. , Springer US. 157-176 (2022).
  27. Liao, H., Wu, J., VanDusen, N. J., Li, Y., Zheng, Y. CRISPR-Cas9-mediated homology-directed repair for precise gene editing. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (4), 102344(2024).
  28. Shumega, A. R., et al. CRISPR/Cas9 as a Mutagenic Factor. International Journal of Molecular Sciences. 25, 823(2024).
  29. Miller, D. E., Cook, K. R., Hawley, R. S. The joy of balancers. PLoS Genet. 15 (11), e1008421(2019).
  30. Muron, S., Kucera, S., Oliver, B., Benner, L. Creation of a new Drosophila melanogaster X chromosome balancer, First Multiple 8 ( FM8 ), using the CRISPR/Cas9 gene-editing system. MicroPubl Biol. 2022, (2022).
  31. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  32. Stemmer, M., Thumberger, T., Del Sol Keyer, M., Wittbrodt, J., Mateo, J. L. CCTop: An Intuitive, Flexible and Reliable CRISPR/Cas9 Target Prediction Tool. PLoS One. 10 (4), e0124633(2015).
  33. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  34. Wang, H., Zheng, S., Yu, X., Wu, K., Zhao, M. Clinical characteristics and genotypes of patients with Congenital fibrinogen disorders. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 42 (3), 264-273 (2025).
  35. Chotcomwongse, P., et al. The Impact of Various Surface Treatments on Adhesion Between Co-Cr Alloy and Acrylic Teeth. Int J Dent. 2026, 2199689(2026).
  36. Prakash, S., Havard, M., Hodges, E., Agrawal, A., Ahuja, S. In the artificial intelligence age, is Oswestry spinal risk index still useful? an external validation of Oswestry spinal risk index applied to radiotherapy patients and its relevance. Br J Neurosurg. , 1-9 (2026).
  37. Anaya-Ayala, J. E., et al. Analysis of Inflammatory and Angiogenic Activities in Patients with Abdominal Aortic Aneurysms with the Radiotracers (99m)Tc-HYNIC-CCR2-L and (99m)Tc-RGD with Single-Photon Emission Computed Tomography. Ann Vasc Surg. 124, 312-317 (2026).
  38. Rose, J. B., Coe, I. R. Physiology of nucleoside transporters: back to the future. Physiology (Bethesda). 23, 41-48 (2008).
  39. Niveditha, S., Deepashree, S., Ramesh, S. R., Shivanandappa, T. Sex differences in oxidative stress resistance in relation to longevity in Drosophila melanogaster. Journal of Comparative Physiology B. 187 (7), 899-909 (2017).
  40. Carvalho, G. B., et al. The 4E-BP growth pathway regulates the effect of ambient temperature on Drosophila metabolism and lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9737-9742 (2017).
  41. Martelli, F., Alves, A. N., Yang, Y. T., Batterham, P., Wedell, N. Genotype and sex affect the combined impact of temperature and low-dose insecticide exposure on insect survival. Insect Sci. , (2024).
  42. Goh, G. H., Blache, D., Mark, P. J., Kennington, W. J., Maloney, S. K. Daily temperature cycles prolong lifespan and have sex-specific effects on peripheral clock gene expression in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 224 (10), (2021).
  43. Robillard, K. R., Bone, D. B. J., Hammond, J. R. Hypoxanthine uptake and release by equilibrative nucleoside transporter 2 (ENT2) of rat microvascular endothelial cells. Microvasc Res. 75 (3), 351-357 (2008).
  44. Kropotov, A., et al. Equilibrative Nucleoside Transporters Mediate the Import of Nicotinamide Riboside and Nicotinic Acid Riboside into Human Cells. Int J Mol Sci. 22 (3), (2021).
  45. Katsyuba, E., et al. De novo NAD(+) synthesis enhances mitochondrial function and improves health. Nature. 563 (7731), 354-359 (2018).
  46. Suman, R., et al. Deregulation of mitochondrial reverse electron transport alters the metabolism of reactive oxygen species and NAD+/NADH and presents a therapeutic target in Alzheimer's disease. Ageing Neur Dis. 4 (1), 4(2024).
  47. Pérez, S. E., Gooz, M., Maldonado, E. N. Mitochondrial Dysfunction and Metabolic Disturbances Induced by Viral Infections. Cells. 13 (21), (2024).
  48. Ballard, J. W., Melvin, R. G., Miller, J. T., Katewa, S. D. Sex differences in survival and mitochondrial bioenergetics during aging in Drosophila. Aging Cell. 6 (5), 699-708 (2007).
  49. Yi, Y., Xu, W., Fan, Y., Wang, H. X. Drosophila as an emerging model organism for studies of food-derived antioxidants. Food Res Int. 143, 110307(2021).
  50. Tiberi, J., et al. Sex differences in antioxidant defence and the regulation of redox homeostasis in physiology and pathology. Mechanisms of Ageing and Development. 211, 111802(2023).
  51. Gratz, S. J., et al. Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease. Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).
  52. Yan, Y., Schetelig, M. F. Protocol for genetic engineering in Drosophila suzukii using microinjection. STAR Protocols. 5 (3), 103248(2024).
  53. Aguilar, G., et al. Seamless knockins in Drosophila via CRISPR-triggered single-strand annealing. Developmental Cell. 59 (19), 2672-2686.e5 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

GenetykaNumer 234Numer 234Warto pustaNumerstres oksydacyjny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.