Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej

Summary

Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.

Abstract

Zakrzepica to stan patologiczny opisujący nieprawidłowe gromadzenie płytek krwi i czynników krzepnięcia w naczyniu krwionośnym. Chociaż wiele badań koncentrowało się na aktywacji płytek krwi przez rozpuszczalnych agonistów jako mechanizmie zakrzepicy, często pomijano, że przepływ krwi sprzyja także powstawaniu zakrzepów. Szczególnie w tętnicach zakrzepica wiąże się z zwężeniem tętnic, które zwiększa naprężenie ścinające w przepływie krwi i ułatwia proces trombogenezy, zjawiska określanego jako trombogeneza biomechaniczna. Przez długi czas nie było dostępnego biotestu, który dostarczałby kompleksowych i szczegółowych informacji na temat procesu trombogenezy biomechanicznej. Aby temu zaradzić, opracowano test profilowania zakrzepów poprzez połączenie mikrofluidyki z wielokolorowym obrazowaniem fluorescencyjnym, który umożliwia kompleksową charakterystykę trombogenezy biomechanicznej z siedmioma odczytami obejmującymi wielkość i skład zakrzepu oraz poziom aktywacji płytek. Ten test profilowania zakrzepów może być używany do oceny tendencji protrombowej u ludzi oraz skuteczności leków przeciwzakrzepowych, a także jest przydatny do lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zakrzepicy tętniczej.

Introduction

Zakrzepica jest główną przyczyną chorób sercowo-naczyniowych, odpowiedzialną za miliony zgonów na całym^{świecie każdego roku}. Obecnie nie ma dostępnych badań biologicznych w standardowych warunkach klinicznych do oceny ryzyka zakrzepicy. Wśród skomercjalizowanych laboratoryjnych i punktów badań hematologicznych konwencjonalnych testów koagulacyjnych i aggregometria okazały się niewiarygodne w przewidywaniu zakrzepicy lub poważnych niepożądanych zdarzeń sercowo-naczyniowych ^2,3,4. Globalne testy zakrzepicy⁵, PFA-100/200⁶ oraz globalne testy krzepnięcia 7,8,9,10,11 również mają ograniczone dane potwierdzające ich wydajność.

Na podstawie obecnej wiedzy, proces trombogenezy jest głównie wspierany przez trzy mechanizmy. Poza dwoma konwencjonalnie uznawanymi mechanizmami, czyli biochemiczną agregacją płytek krwi i koagulacją, trzecim mechanizmem, który jest niedostatecznie zbadany i często niedoceniany, jest agregacja płytek sterowana ścinaniem, określana również jako "agregacja płytek biomechanicznych"^12,13. W agregacji płytek biomechanicznych wysokie naprężenia ścinania i gradient ścinania są głównym czynnikiem umożliwiającym usieciowanie płytek za pomocą czynnika GPIbα-von Willebrand (VWF), integriny α_IIbβ 3-VWF oraz integriny α_IIbβ interakcji_{3-fibrynogenów}. W zakrzepicy tętniczej najważniejszym mechanizmem prawdopodobnie jest agregacja płytek biomechanicznych, biorąc pod uwagę, że jest ona znacznie wzmocniona przez wysoki przepływ ścinający spowodowany stenozą tętnic. Dlatego trombogeneza wywołana przez agregację płytek biomechanicznych została nazwana "trombogenezą biomechaniczną"^12,14.

W poprzednich pracach powszechną metodą eksperymentalnej obserwacji agregacji płytek biomechanicznych jest test zwężenia mikrofluidycznego, w którym miejsce ciężkiej stenozy jest osadzone w prostym kanale. Gdy krew jest przepuszczana przez kanał pod fizjologicznym naprężeniem ścinającym ściany, wokół miejsca stenotycznego powstaje wysokie naprężenie ścinające, co powoduje gromadzenie płytek krwi w kształcie krzepka. Jednak wcześniejsze badania wykorzystywały tylko jeden odczyt (dla płytek krwi, odzwierciedlający rozmiar zakrzepa) 15,16,17,18,19 lub co najwyżej dwa (jeden dla płytek krwi, drugi dla innego biomarkera) odczyt^13,20, co nie jest w stanie zapewnić kompleksowej charakterystyki zakrzepca.

Niedawno opracowano test profilowania zakrzepowego, który wykorzystuje wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w teście zwężenia mikrofluidycznego, umożliwiając śledzenie w czasie rzeczywistym 7 biomarkerów (płytki krwi, poziom fibrynogenu, poziom czynnika von Willebranda, poziom ekspresji P-selektyny, poziom ekspozycji na fosfatydyloserynę, rozszerzony poziom integriny_{α IIb}β₃ , w pełni aktywną integrinę α_IIbβ₃ poziom ekspresji) w zakrzepie, który stanowi podstawę do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej²¹. W tej pracy przedstawiono szczegółowe protokoły dotyczące przygotowania i wykonania testu profilowania zakrzepów oraz powiązanej analizy danych. Sprzęt wymagany do testu obejmuje odwrócony wielokolorowy mikroskop fluorescencyjny oraz układ mikrofluidyczny. Test wykorzystuje stosunkowo niewielką ilość ludzkiej krwi pełnej (mniej niż 2 mL), ma wysoką opłacalność (~$12 za próbkę) i daje wyniki w ciągu 30 minut. Test pozwala dokładnie wykrywać wielowymiarowe nieprawidłowości protrombotyczne u osób oraz oceniać wpływ środków przeciwzakrzepowych na zmianę rozmiaru, składu i aktywacji płytek krwi, co potwierdza szerokie zastosowanie zarówno w badaniach, jak i klinicznych^{w przyszłości.} Warto zauważyć, że test musi wykorzystywać świeżo pobraną heparynizowaną krew. Przechowywanie krwi w temperaturze 4 °C lub przez ponad 6 godzin lub stosowanie antykoagulantów innych niż heparyna może zapobiec powstawaniu zakrzepów lub spowodować niedokładne wyniki.

Protocol

Protokół ten jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Ludzkich Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksaskiego. Sprzęt eksperymentalny składa się z urządzenia mikrofluidycznego, elementów perfuzji (złącza, rurki, strzykawki i pompy strzykawkowej) oraz odwróconego mikroskopu z komponentami optycznymi umożliwiającymi obrazowanie w jasnym polu i wielokolorową fluorescencję. W mikroskopie stosuje się wielodiodowy oświetlnię oraz sześcian filtra wieloprzepustowego do rozdzielania 4 kanałów fluorescencyjnego przy minimalnym wzajemnym przeciekaniu: wzbudzenie: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31 oraz emisje: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. Na wszystkie procedury eksperymentalne należy nosić środki ochrony osobistej, w tym rękawiczki, ochronę oczu oraz kurtkę laboratoryjną. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie urządzeń mikrofluidycznych

1. Zaprojektuj formę główną z prostokątnymi kanałami (200 μm szerokości × 50 μm wysokości), które zawierają miejsce zwężenia światła w 80%. Każdy kanał ma dedykowane wloty i wyjścia do połączeń rur (Rysunek 1; zobacz Plik Uzupełniający 1 dla oryginalnego pliku projektowego).
2. Na podstawie tego projektu użyj płytki krzemowej do wykonania formy głównej fotorezystycznej SU-8 za pomocą standardowej fotolitografii. Przyklej formę na dno 15-centymetrowej miski Petriego (rysunek 2A).
3. Przygotować mieszankę PDMS, mieszając bazę prepolimerową i środek utwardzający w zestawie silikonowego elastomeru w stosunku wagowym 10:1. Wylej mieszankę na formę główną (rysunek 2B).
4. Umieść płytę zawierającą mieszaninę PDMS w desykatorze próżniowym, aby odgazować i wyeliminować uwięzione pęcherzyki powietrza.
   UWAGA: Utrzymuj płytę pod próżnią przez co najmniej 2 godziny, aż bąbelki zostaną całkowicie usunięte.
5. Termicznie utwardzaj mieszaninę PDMS, inkubując ją w temperaturze 75 °C przez 2 godziny.
6. Ostrożnie wytnij utwardzone PDMS z formy głównej (rysunek 2C,D) i podziel je na pojedyncze jednostki układowe.
7. Utwórz wlot i wylot, wybijając otwory w wyznaczonych miejscach za pomocą igły sondy (Rysunek 2E).
   UWAGA: Użyj sprężonego powietrza, aby usunąć wszelkie resztki z dziurków z dziurkanych otworów. Aby zminimalizować zanieczyszczenia powierzchni, przed klejeniem czyść urządzenia PDMS taśmą uszczelniającą za pomocą taśmy uszczelniającej.
8. W okapu chemicznym spryskaj chusteczkę do pracy 75% etanolem, a zwilżoną chusteczką do wycierania i czyszczenia szkiełek. Zostaw szkiełka do wyschnięcia.
9. W okapie chemicznym obrób szklane szkiełka i układy PDMS generatorem wysokiej częstotliwości odpowiednio przez 30 i 20 sekund, a następnie wyrównaj każdy układ ze szklanym szkiełem. Delikatnie dociskaj chip do powierzchni szkła szkła, aby można go było okleić.
   UWAGA: Ten krok należy wykonać w okapie chemicznym, ponieważ generator wysokiej częstotliwości wytwarza ozon podczas użytkowania, co jest szkodliwe dla zdrowia.
10. Termicznie związać urządzenia, inkubując je w temperaturze 150 °C przez 15 minut. Po ostudzeniu urządzenia będą gotowe do użycia (rysunek 2F).
11. Przechowuj urządzenia w temperaturze pokojowej i bez kurzu.
12. Użyj szczypców, aby usunąć plastikową część igieł sondy i wygiąć metalowe rurki pod kątem 90°. Te wygięte rurki będą używane jako złącza dla urządzeń mikrofluidycznych.

2. Przygotowanie czujnika świetlówkowego

UWAGA: Eksperyment wykorzystuje łącznie 7 czujników fluorescencjowych: SZ22-FITC, fibrinogen-Alexa Fluor 405, 2.2.9-Alexa Fluor 555, AK4-Alexa Fluor 647, Annexin V-Pacific Blue, MBC 370.2-Alexa Fluor 555, PAC-1-Alexa Fluor 647. Wśród nich fibrynogen, 2.2.9 i MBC 370.2 są dostępne komercyjnie tylko w formie niesprzężonej i muszą być fluorescencyjne sprzężone w laboratorium.

1. Aby sprzężyć fibrynogen z Alexa Fluor 405:
   1. Przygotuj świeży bufor wodorowęglanu sodu o pojemności 0,1 M, pH 8,5.
   2. Rozcieńcz zapas fibrynogenu do 1 mg/mL w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4).
   3. Dodaj 1/10 objętości buforu wodorowęglanu sodu do roztworu fibrynogenu.
   4. Wymieszaj 1 ml fibrynogenu z 1 mg Alexa Fluor 405 NHS-ester i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze. Chroń się przed światłem.
   5. Usuń bufor magazynowy z kolumny oczyszczającej, wirując kolumnę w 1 100 × g przez 2 minuty, a następnie wyrzuć przepływ. Załaduj roztwór reakcji na kolumnę, zamontuj kolumnę na kompatybilnej fiolce zbierającej i wiruj w 1100 × g przez 5 minut, aby pobrać fibrynogen Alexa Fluor 405.
   6. Użyj spektrofotometru do pomiaru absorpcji przy 280 nm (A₂₈₀; sygnał białkowy) i długości fali 405 nm (A₄₀₅; sygnał barwnikowy). Oblicz stężenie białka i stosunek F/P (fluorescencja: stosunek molowy białka).
      UWAGA: Stosunek F/P powinien mieścić się w zakresie 8-10.
   7. Przechowuj fibrinogen-Alexa Fluor 405 w temperaturze 4 °C w ciemności.
2. Aby sprzężyć przeciwciała 2.2.9 i MBC 370.2 z Alexa Fluor 555:
   1. Przygotuj świeży bufor wodorowęglanu sodu o pojemności 0,1 M, pH 8,5.
   2. Rozcieńcz zapas przeciwciał do 1 mg/mL w buforze wolnym od amin.
   3. Dodaj 1/10 objętości buforu wodorowęglanu sodu do roztworu przeciwciał.
   4. Wymieszaj przeciwciało 100 μL z 1 fiolką (100 μg) esteru NHS Alexa Fluor 555 i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze. Chroń się przed światłem.
   5. Usuń bufor magazynowy z kolumny oczyszczającej, wirując kolumnę w 1100 × g przez 2 minuty, a następnie wyrzuć przepływ. Załaduj roztwór reakcyjny na kolumnę, montuj kolumnę na kompatybilnej fiolce zbierającej i wiruj w 1 100 × g przez 5 minut, aby pobrać 2.2.9- lub MBC 370.2-Alexa Fluor 555.
   6. Użyj spektrofotometru do pomiaru absorpcji przy 280 nm (A₂₈₀; sygnał białkowy) i 555 nm (A₅₅₅; sygnał barwnikowy) długości fali. Oblicz stężenie przeciwciał oraz stosunek F/P (fluorescencja: molowy stosunek przeciwciał).
      UWAGA: Stosunek F/P powinien mieścić się w zakresie 1-1,5.
   7. Przechowywać 2.2.9- oraz MBC 370.2-Alexa Fluor 555 w temperaturze 4 °C w ciemności.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego oznakowania – wysoki stosunek F/P może zaburzać funkcjonowanie biologiczne.

3. Pobieranie krwi od ludzi

UWAGA: Procedura ta musi być przeprowadzana przez wykwalifikowany personel medyczny (np. licencjonowane pielęgniarki, certyfikowane flebotomistki). Uzyskaj także pisemną, świadomą zgodę od osób biorących udział w badaniu.

1. Przygotuj strzykawkę, aspirując 500 μL buforu Tyrode (12 mM NaHCO₃, 10 mM Hepes, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 5,5 mM D-Glukozy, 0,5% albuminy surowicy bydłej, pH 7,4) zawierającego 0,32 U/mL heparyny na 10 mL krwi do pobrania.
2. Pobieraj krew przez wenipunkcję. Użyj pustej strzykawki, aby zebrać pierwsze 2 mL krwi do wyrzucenia. Następnie przełącz się na strzykawkę zawierającą heparynę, aby pobrać próbkę krwi. Ciągnij strzykawkę powoli, aby zminimalizować aktywację płytek.
3. Przelej pobraną krew do probówki do wirówki o pojemności 15 ml i utrzymuj ją w temperaturze poniżej 37 °C.
   UWAGA: Próbki krwi należy wykorzystać do eksperymentów w ciągu 6 godzin od pobrania.

4. Testowanie zakrzepów

UWAGA: Zaleca się wykonywanie wszystkich procedur związanych z handlem krwią w szafce bioasekuracyjnej, gdy to możliwe, aby uniknąć rozcieków krwi na eksperymentaliście. Jeśli to niemożliwe, użyj tarczy ochronnej na ławce.

1. Rozcieńcz monomer VWF do 2 μg/mL w PBS. Wstępnie pokryj urządzenia mikrofluidyczne monomerem VWF i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Inkubuj próbkę krwi za pomocą czujnika fluorescencyjnego Set 1 lub 2 przez 10 minut w temperaturze pokojowej:
   1. Zestaw 1: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), fibrynogen-Alexa Fluor 405 (60 μg/mL), 2,2,9-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), AK4-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
   2. Zestaw 2: SZ22-FITC (0,5 μg/mL), Annexin V-Pacific Blue (1 μg/mL), MBC 370,2-Alexa Fluor 555 (1 μg/mL), PAC-1-Alexa Fluor 647 (1 μg/mL).
      UWAGA: Ponieważ dwa zestawy czujników muszą być używane oddzielnie, każda próbka krwi musi być zbadana co najmniej dwukrotnie (raz zestawem sensorów 1, raz zestawem czujników 2), aby uzyskać pełny zestaw danych.
3. Podłącz urządzenie mikrofluidyczne z wlotami i wyjściami oraz rurkami. Drugi koniec złącza wlotowego należy połączyć z rurką zawierającą PBS, a drugi koniec złącza wylotowego za pomocą strzykawki. Zamontuj strzykawkę na pompce strzykawkowej. Zamontuj urządzenie mikrofluidyczne na odwróconym mikroskopie i ręcznie manewruj stopniem, aby znaleźć miejsce zwężenia pod mikroskopem (rysunek 3A).
4. Napełnij kanał mikrofluidyczny i rurkę PBS za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,5 mL/min. Upewnij się, że wokół miejsca zwężenia nie ma pęcherzyków powietrza.
5. Połącz rurkę wlotową z próbką krwi i przeprowadź próbkę krwi przez kanał mikrofluidyczny za pomocą pompy strzykawkowej z przepływem 0,018 mL/min (Rysunek 3A).
6. Ustaw czas naświetlania i wzmocnienie każdego kanału fluorescencji. Wykonaj wielokolorowe obrazowanie fluorescencji w czasie rzeczywistym, naprzemiennie przeplatając 4 kanały, pobudzając jeden rodzaj fluoroforu naraz. Tymczasem znajdź płaszczyznę ogniska krzepu i rejestruj sygnały w miejscu stenozy, zwykle trwające 15-30 minut (rysunek 4).
   UWAGA: Czas naświetlania każdego kanału należy dostosować tak, aby sygnał fluorescencjonalny był łatwo rozpoznawalny, unikając jednocześnie nasycenia (Rysunek 4). W obecnym systemie próbki krwi zdrowych pacjentów zazwyczaj wykazują następujący zakres intensywności sygnału w obrębie uformowanego zakrzepca: SZ22-FITC, 70-110; fibrinogen-Alexa Fluor 405, 60-100; 2.2.9-Alexa Fluor 555, 70-110; AK4-Alexa Fluor 647, 45-75; Annexin V-Pacific Blue, 35-65; MBC 370.2-Alexa Fluor 555, 45-85; PAC-1-Alexa Fluor 647, 10-30. Warto jednak zauważyć, że niewielka część zdrowych osób dawała nietypowy wynik. Dlatego zaleca się badanie co najmniej 5 próbek krwi zdrowego pacjenta, aby upewnić się, że czas ekspozycji dla każdego kanału jest prawidłowo dobrany.

5. Analiza danych

1. Otwórz plik danych za pomocą ImageJ 1.53 (Fidżi, National Institutes of Health).
   UWAGA: Każdy plik powinien zawierać łącznie 4 filmy z 4 różnych kanałów. Poniższa procedura jest zazwyczaj stosowalna do każdego punktu czasowego, który użytkownik chce analizować.
2. Użyj kanału SZ22-FITC do identyfikacji konturu trombu oraz użyj 'Polygon selections', aby mniej więcej wybrać powierzchnię trombu (rysunek 5A,B).
3. Dla każdego kanału użyj Obraz -> Reguluj -> Próg , aby wyeliminować tło (Rysunek 5C), a następnie użyj Analizuj -> Mierz , aby zmierzyć powierzchnię i średnią intensywność sygnału w obrębie trombu.
   UWAGA: SZ22-FITC barwi płytki krwi, a tym samym odzwierciedla rozmiar zakrzepa. W Zestawie 1 fibrynogen-Alexa Fluor 405 odzwierciedla poziom wzbogacenia fibrynogenu, 2.2.9-Alexa Fluor 555 odzwierciedla poziom wzbogacenia czynnika von Willebrand (VWF), a AK4-Alexa Fluor 647 odzwierciedla ekspresję P-selekcji. W Zestawie 2 Annexin V-Pacific Blue odzwierciedla ekspozycję na fosfatydyloserynę (PS), MBC 370.2-Alexa Fluor 555 odzwierciedla aktywację integriny α_IIbβ₃ do przedłużonej konformacji (E⁺ α_IIbβ₃), a PAC-1-Alexa Fluor 647 odzwierciedla pełną aktywację integriny α_IIbβ₃ (Akt. α_IIbβ₃)²¹.

Results

Badanie profilowania zakrzepów perfuzuje krew przez kanał stenotyczny, umożliwiając powstawanie krzepca sterowanego ścinaniem, oraz wykonuje wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym, aby zebrać wielowymiarowe informacje o utworzonym zakrzepcie. Wykonując eksperymenty z użyciem czujników Zestawu 1 i Zestawu 2, można scharakteryzować zakrzep pod względem takich jak rozmiar, wzbogacenie białek sieciujących (czynnik von Willebranda, fibrynogen), a także poziom aktywacji płytek (odzwierciedlony ekspresj...

Discussion

Łącząc test zwężenia mikrofluidycznego z wielokolorowym obrazowaniem fluorescencyjnym, test profilowania zakrzepów zapewnia wygodne i skuteczne podejście do badania trombogenezy biomechanicznej oraz mechanobiologii płytek krwi. Z kolei test jest przydatny w wielu zastosowaniach. Na przykład może być używany do przesiewu środków przeciwzakrzepowych, które specyficznie hamują agregację płytek biomechanicznych, gdzie cel molekularny i mechanizm działania można wywnioskować z kodu kreskowego efektu²¹....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Strzykawki 10 mL	Henke Sass Wolf	5100-X00V0	Pobranie próbki krwi
Rurki falcon o pojemności 15 mL	Genesee Scientific	28-101	Przechowywanie próbek krwi
1 mL gazoszczelna szklana strzykawka	Hamilton	81331	Montaż sprzętu
2.2.9	MERU VasImmune		Barwienie zakrzepu
20 igieł sond 20 x 2	McMaster-Carr	M919	Tworzenie urządzeń PDMS
Strzykawki 20 mL	Henke Sass Wolf	5200-X00V0	Pobranie próbki krwi
70% etanolu	Sigma-Aldrich	EX0281-1	Dezynfekcja gazoszczelnych strzykawek i czyszczenie szkiełek szklanych
AK4-Alexa Fluor 647	BioLegend	304918	Barwienie zakrzepu
Alexa Fluor 405 NHS Ester	Invitrogen	A30000	Znakowanie fibrynogenów
Zestaw do etykietowania przeciwciał Alexa fluor 555	Invitrogen	A88065	Oznaczenia MBC 370.2 i 2.2.9
Annexin V-Pacific Blue	Invitrogen	501121505	Barwienie zakrzepu
Sprzątacz do	Office Depot	911245	Tworzenie urządzeń PDMS
Zestaw noży hobbystycznych do rękodzieła z drewnianym pudełkiem	Łopatki Excel	44282	Tworzenie urządzeń PDMS
Woda dejonizowana	ThermoFisher Scientific	751-628	Mycie gazoszczelnych strzykawek
Suszarka	Bel Art	F420270000	Odgazowywanie PDMS
Jednorazowa wielofunkcyjna szpatułka laboratoryjna	LevGo	17211	Mieszanie bazy silikonowo-elastomerowej i środka do utwardzania;
Kolumna do usuwania barwników i biotyn	Zeba	A44296S	Znakowanie fibrynogenów
Fibrynogen	Innowacyjne badania	IHUFBG25MG	Barwienie zakrzepu
Pompa strzykawkowa Fusion 200-X	Chemyx Inc.	0720X	Montaż sprzętu
Heparyna	Sigma-Aldrich	H3149	Antykoagulacja próbki krwi
Generator wysokich częstotliwości	Electro-technic product Inc.	BD-20	Tworzenie urządzeń PDMS
Ludzki monomer VWF	Sino Biological Inc.	10973-H08C	Powłoka urządzeń mikrofuidycznych
Oprogramowanie Image J v1.53	Fidżi, Narodowy Instytut Zdrowia		Analiza danych
Mikroskop odwrócony	Leica	DM IL PROWADZIŁ; kostka filtra: Leica DFT51010; Latarnia morska: LED5	Montaż sprzętu
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34120	Czyszczenie szkiełek szklanych
Nasadki zamków luer	International Medical Industries, Inc.	57100B	Pobranie próbki krwi
MBC 370.2	Kerafast	EBW104	Barwienie zakrzepu
Okulary osłonowe na mikroskop	Paul Marienfeld GmbH & Kompania KG	ES0107222	Tworzenie urządzeń PDMS
Mini-skrobak do żyletki	Stanley	28-100	Tworzenie urządzeń PDMS
Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop 2000	Thermo Scientific	ND-2000	Pomiar stężenia białka i stosunku F/P
Piekarnik	Instrumenty linii laboratoryjnej	3512	Tworzenie urządzeń PDMS
PAC-1-Alexa Fluor 647	BioLegend	362806	Barwienie zakrzepu
Plastikowy kubek	ThermoFisher Scientific	S04589	Mieszanie bazy silikonowo-elastomerowej i środka do utwardzania;
SU-8 fotorezysta master  Pleśń	Zakład Czystej Nano3 Nanofabrykacji UC San Diego		Tworzenie urządzeń PDMS
Sylgard 184 Zestaw Silikonowego Elastomera	Krayden Dow	DC4019862	PDMS
SZ22-FITC	Beckman Coulter	IM 1756U	Barwienie zakrzepu
Rurki	Cole-Palmer Instrument Co.	06422-01	Montaż sprzętu