Praca ta opisuje test mikrofluidyczny, który wykorzystuje naprężenie ścinające do wywołania powstawania zakrzepów we krwi i charakteryzuje zakrzep za pomocą wielu wymiarów odczytu. Test pozwala mierzyć tendencję protrombotyczną próbek krwi, dzięki czemu jest przydatny w diagnozowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz podstawowych badaniach mechanistycznych związanych z zakrzepicą.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Testy profilowania zakrzepów: platforma oparta na mikrofluidyce do kompleksowej charakterystyki trombogenezy biomechanicznej
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zakrzepica to stan patologiczny opisujący nieprawidłowe gromadzenie płytek krwi i czynników krzepnięcia w naczyniu krwionośnym. Chociaż wiele badań koncentrowało się na aktywacji płytek krwi przez rozpuszczalnych agonistów jako mechanizmie zakrzepicy, często pomijano, że przepływ krwi sprzyja także powstawaniu zakrzepów. Szczególnie w tętnicach zakrzepica wiąże się z zwężeniem tętnic, które zwiększa naprężenie ścinające w przepływie krwi i ułatwia proces trombogenezy, zjawiska określanego jako trombogeneza biomechaniczna. Przez długi czas nie było dostępnego biotestu, który dostarczałby kompleksowych i szczegółowych informacji na temat procesu trombogenezy biomechanicznej. Aby temu zaradzić, opracowano test profilowania zakrzepów poprzez połączenie mikrofluidyki z wielokolorowym obrazowaniem fluorescencyjnym, który umożliwia kompleksową charakterystykę trombogenezy biomechanicznej z siedmioma odczytami obejmującymi wielkość i skład zakrzepu oraz poziom aktywacji płytek. Ten test profilowania zakrzepów może być używany do oceny tendencji protrombowej u ludzi oraz skuteczności leków przeciwzakrzepowych, a także jest przydatny do lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zakrzepicy tętniczej.
Wprowadzenie
Zakrzepica jest główną przyczyną chorób sercowo-naczyniowych, odpowiedzialną za miliony zgonów na całymświecie każdego roku. Obecnie nie ma dostępnych badań biologicznych w standardowych warunkach klinicznych do oceny ryzyka zakrzepicy. Wśród skomercjalizowanych laboratoryjnych i punktów badań hematologicznych konwencjonalnych testów koagulacyjnych i aggregometria okazały się niewiarygodne w przewidywaniu zakrzepicy lub poważnych niepożądanych zdarzeń sercowo-naczyniowych 2,3,4. Globalne testy zakrzepicy5, PFA-100/200
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Protokół ten jest zgodny z wytycznymi i został zatwierdzony przez Komitet Etyki Badań Ludzkich Oddziału Medycznego Uniwersytetu Teksaskiego. Sprzęt eksperymentalny składa się z urządzenia mikrofluidycznego, elementów perfuzji (złącza, rurki, strzykawki i pompy strzykawkowej) oraz odwróconego mikroskopu z komponentami optycznymi umożliwiającymi obrazowanie w jasnym polu i wielokolorową fluorescencję. W mikroskopie stosuje się wielodiodowy oświetlnię oraz sześcian filtra wieloprzepustowego do rozdzielania 4 kanałów fluorescencyjnego przy minimalnym wzajemnym przeciekaniu: wzbudzenie: 391/32, 479/33, 554/24, 638/31 oraz emisje: 435/30, 519/25, 594/32, 695/58. Na wszystki....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Badanie profilowania zakrzepów perfuzuje krew przez kanał stenotyczny, umożliwiając powstawanie krzepca sterowanego ścinaniem, oraz wykonuje wielokolorowe obrazowanie fluorescencyjne w czasie rzeczywistym, aby zebrać wielowymiarowe informacje o utworzonym zakrzepcie. Wykonując eksperymenty z użyciem czujników Zestawu 1 i Zestawu 2, można scharakteryzować zakrzep pod względem takich jak rozmiar, wzbogacenie białek sieciujących (czynnik von Willebranda, fibrynogen), a także poziom aktywacji płytek (odzwierciedlony ekspresj.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Łącząc test zwężenia mikrofluidycznego z wielokolorowym obrazowaniem fluorescencyjnym, test profilowania zakrzepów zapewnia wygodne i skuteczne podejście do badania trombogenezy biomechanicznej oraz mechanobiologii płytek krwi. Z kolei test jest przydatny w wielu zastosowaniach. Na przykład może być używany do przesiewu środków przeciwzakrzepowych, które specyficznie hamują agregację płytek biomechanicznych, gdzie cel molekularny i mechanizm działania można wywnioskować z kodu kreskowego efektu21........
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Badania związane z tym artykułem oraz opracowaniem testu profilowania zakrzepów w laboratorium Chena zostały wsparte grantem Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi R00HL153678 (Y.C.), National Institute on Aging, nagrodą Claude D. Pepper Older Americans Independence Center Award #P30-AG024832 (Y.C.), UTMB Team Science Pilot Research Award (Y.C.), stypendium podoktorskim American Heart Association 20POST 35080023 (Y.C.), oraz Nagrodę Projektu Transformacyjnego Amerykańskiego Stowarzyszenia Kardiologicznego 25TPA1471420 (Y.C.). Prace te były częściowo realizowane w San Diego Nanotechnology Infrastructure (SDNI) UCSD, będącym członkiem National Nanotechnology Coordinat....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawki 10 mL | Henke Sass Wolf | 5100-X00V0 | Pobranie próbki krwi |
| Rurki falcon o pojemności 15 mL | Genesee Scientific | 28-101 | Przechowywanie próbek krwi |
| 1 mL gazoszczelna szklana strzykawka | Hamilton | 81331 | Montaż sprzętu |
| 2.2.9 | MERU VasImmune | Barwienie zakrzepu | |
| 20 igieł sond 20 x 2 | McMaster-Carr | M919 | Tworzenie urządzeń PDMS |
| Strzykawki 20 mL | Henke Sass Wolf | 5200-X00V0 | Pobranie próbki krwi |
| 70% etanolu | Sigma-Aldrich | EX0281-1 | Dezynfekcja gazoszczelnych strzykawek i czyszczenie szkiełek szklanych |
| AK4-Alexa Fluor 647 | BioLegend | 304918 | Barwienie zakrzepu |
| Alexa Fluor 405 NHS Ester | Invitrogen | A30000 | Znakowanie fibrynogenów |
| Zestaw do etykietowania przeciwciał Alexa fluor 555 | Invitrogen | A88065 | Oznaczenia MBC 370.2 i 2.2.9 |
| Annexin V-Pacific Blue | Invitrogen | 501121505 | Barwienie zakrzepu |
| Sprzątacz do | Office Depot | 911245 | Tworzenie urządzeń PDMS |
| Zestaw noży hobbystycznych do rękodzieła z drewnianym pudełkiem | Łopatki Excel | 44282 | Tworzenie urządzeń PDMS |
| Woda dejonizowana | ThermoFisher Scientific | 751-628 | Mycie gazoszczelnych strzykawek |
| Suszarka | Bel Art | F420270000 | Odgazowywanie PDMS |
| Jednorazowa wielofunkcyjna szpatułka laboratoryjna | LevGo | 17211 | Mieszanie bazy silikonowo-elastomerowej i środka do utwardzania; |
| Kolumna do usuwania barwników i biotyn | Zeba | A44296S | Znakowanie fibrynogenów |
| Fibrynogen | Innowacyjne badania | IHUFBG25MG | Barwienie zakrzepu |
| Pompa strzykawkowa Fusion 200-X | Chemyx Inc. | 0720X | Montaż sprzętu |
| Heparyna | Sigma-Aldrich | H3149 | Antykoagulacja próbki krwi |
| Generator wysokich częstotliwości | Electro-technic product Inc. | BD-20 | Tworzenie urządzeń PDMS |
| Ludzki monomer VWF | Sino Biological Inc. | 10973-H08C | Powłoka urządzeń mikrofuidycznych |
| Oprogramowanie Image J v1.53 | Fidżi, Narodowy Instytut Zdrowia | Analiza danych | |
| Mikroskop odwrócony | Leica | DM IL PROWADZIŁ; kostka filtra: Leica DFT51010; Latarnia morska: LED5 | Montaż sprzętu |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 34120 | Czyszczenie szkiełek szklanych |
| Nasadki zamków luer | International Medical Industries, Inc. | 57100B | Pobranie próbki krwi |
| MBC 370.2 | Kerafast | EBW104 | Barwienie zakrzepu |
| Okulary osłonowe na mikroskop | Paul Marienfeld GmbH & Kompania KG | ES0107222 | Tworzenie urządzeń PDMS |
| Mini-skrobak do żyletki | Stanley | 28-100 | Tworzenie urządzeń PDMS |
| Spektrofotometr UV-Vis NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | Pomiar stężenia białka i stosunku F/P |
| Piekarnik | Instrumenty linii laboratoryjnej | 3512 | Tworzenie urządzeń PDMS |
| PAC-1-Alexa Fluor 647 | BioLegend | 362806 | Barwienie zakrzepu |
| Plastikowy kubek | ThermoFisher Scientific | S04589 | Mieszanie bazy silikonowo-elastomerowej i środka do utwardzania; |
| SU-8 fotorezysta master Pleśń | Zakład Czystej Nano3 Nanofabrykacji UC San Diego | Tworzenie urządzeń PDMS | |
| Sylgard 184 Zestaw Silikonowego Elastomera | Krayden Dow | DC4019862 | PDMS |
| SZ22-FITC | Beckman Coulter | IM 1756U | Barwienie zakrzepu |
| Rurki | Cole-Palmer Instrument Co. | 06422-01 | Montaż sprzętu |
Bibliografia
- Lindstrom, M., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risks collaboration, 1990-2021. J Am Coll Cardiol. 80 (25), 2372-2425 (2022).
- Lim, H. Y., O'malley, C., Donnan, G., Nandurkar, H., Ho, P. A review of global coagulation assays ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
