Artykuł metodologiczny

Analiza stabilnych izotopowych znaczników witaminy A z użyciem LC-MS/MS

677 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69558

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Newcastle University Centre for Cancer, 3Fera Science Ltd

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający jednoczesną ilościową ilościową identyfikację zarówno izotopowo oznakowanych, jak i natywnych retinoidów w ludzkim osoczu, wykorzystując LC-MS/MS, z limitami wykrywalności 6 fmol w kolumnie. Metoda ta obejmuje prostą procedurę ekstrakcji próbek oraz krótki czas działania analitycznego, co umożliwia wysoką przepustowość próbek.

Streszczenie

Metoda rozcieńczania izotopów retinolu (RID) szacuje całkowite zapasy (TBS) witaminy A u ludzi poprzez stabilne rozcieńczenie izotopów w organizmie. W tym celu kluczowe jest dokładne i efektywne określenie stosunku izotopowego plazmy między retinolem oznakowanym a nieoznakowanym za pomocą spektrometrii mas. Aby uniknąć rozległych i czasochłonnych procedur ekstrakcji i/lub oczyszczania, takich jak przygotowawcze HPLC i derytacja, stosuje się LC-MS/MS do szybkiej, czułej i jednoczesnej analizy oznakowanych i nieoznakowanych retinoidów. Metoda wykorzystuje dwa poziomy detekcji: (i) początkowe rozdzielenie masy/ładunku (m/z) jonów macierzystych (prekursorowych), a następnie (ii) wykrywanie fragmentowanych jonów potomnych (produktowych). Skutkuje to wysoką czułością, a limity wykrywania retinolu mogą wynosić nawet 6 fmol na kolumnie. Pomimo zalet tandemowej spektrometrii mas, do oddzielenia retinolu od esterów retinylowych konieczne jest rozdzielenie chromatograficzne ciekłe, ponieważ końcowe grupy funkcjonalne są tracone podczas jonizacji, co skutkuje podobnymi wzorcami fragmentacji jonów rodzicielskich (m/z 269) i potomnych. Artykuł opisuje izolację endogennego i znakowanego (13C lub 2H) retinolu z plazmy za pomocą ekstrakcji rozpuszczalnikowej, po czym następuje ilościowa identyfikacja metodą LC-MS/MS pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) w dodatnim trybie jonowym.

Wprowadzenie

Witamina A to składnik odżywczy rozpuszczalny w tłuszczach, niezbędny dla zdrowia człowieka1. Niedobór witaminy A zwiększa podatność na ciężką zachorowalność i śmiertelność zakaźną i szacuje się, że globalna częstość występowania wynosi 29%, z wyższymi poziomami w Afryce Subsaharyjskiej (48%) i Azji Południowej (44%)2. Suplementacja witaminą A to skuteczna strategia zmniejszania nadmiarowej śmiertelności dzieci, szczególnie w obszarach wysokiego ryzyka, takich jak AfrykaSubsaharyjska. Jednak wprowadzenie półrocznej suplementacji witaminą A wraz z masową suplementacją witaminą A w podstawowych produktach spożywczych oraz dystrybucją proszku mikroskładnikowego, które często są zarządzane przez różne podmioty publiczne i prywatne, może narażać osoby na nadmierne spożycie witaminy A 4,5,6,7,8,9,10 . Dlatego biomarkery witaminy A powinny idealnie pokrywać cały zakres jej statusu, od niedoboru po toksyczność. Metoda rozcieńczania izotopów retinolu (RID) jest obecnie najdokładniejszą pośrednią metodą oceny całkowitych zapasów witaminy A u ludzi 11,12,13 i została zweryfikowana w odniesieniu do stężeń witaminy A w wątrobie, uznawanych za najlepszy biochemiczny marker statusu witaminy A 14,15. Metoda opiera się na zasadzie, że doustna dawka markera stabilnej izotopowej witaminy A miesza się z nieoznakowaną witaminą A (śladową) w wymiennych zbiornikach ciała. Pomiar specyficznej aktywności retinolu w osoczu (tj. stosunku znakowanego retinolu do całkowitej ilości retinolu w osoczu (śladnik/ślad w osoczu)) w określonym czasie po dawkowaniu pozwala oszacować status witaminy A za pomocą równania RID 11,12,13.

Aby określić dokładne i precyzyjne stężenia zarówno retinolowego znacznika, jak i śladowego składnika w osoczu, zastosowano różne metody ilościowe ilościowego określenia stabilnej izotopowo znakowanej witaminy A, w tym chromatografię gazową-spektrometrię mas (GC-MS), spektrometrię mas stosunku izotopów (IRMS) oraz tandemonową spektrometrię mas w chromatografii cieczowej (LC-MS/MS)16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Co ważne, LC-MS/MS łączy wysoką czułość, swoistość i prostotę operacyjną z możliwością bezpośredniego pomiaru zarówno natywnego, jak i znakowanego retinolu w złożonych macierzach. Aby uniknąć czasochłonnego przygotowania próbki, takiego jak przygotowawcza wysokowydajna chromatografia cieczowa (HPLC) dla IRMS czy deriwatyzacja dla GC-MS, analiza LC-MS/MS jest idealnym wyborem, ponieważ ta metoda wymaga prostej procedury ekstrakcji, bardzo niskich limitów wykrywania dla stabilnych izotopów oraz krótkich czasów działania 7,18,19. Przedstawiamy tutaj zaktualizowaną metodę LC-MS/MS z krótszym czasem działania, prostymi przepływami pracy połączoną z wysoką czułością i selektywnością, jako wysoce odpowiednią metodę do analizy wysokowydajności próbek z dużych badań interwencji na ludziach i obserwacyjnych, gdzie wymagane jest określenie całkowitych zapasów witaminy A w organizmie.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Research Ethics Board Uniwersytetu Filipińskiego w Manili (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), Institutional Review Board na UC Davis (IRB ID: 903681-2) i zarejestrowane jako ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Służb Zdrowotnych Ghany (GHS-ERC 012/07/20), a badanie zarejestrowano w https://clinicaltrials.gov roku jako NCT04632771.

1. Przygotowanie standardów wewnętrznych

  1. Wewnętrzny standardowy roztwór zapasowy: Przygotować wewnętrzny roztwór w stężeniu 1 mg/mL retinylooctanu w etanolu zawierającym 0,1% butylowanego hydroksytoluenu (BHT; w/v). Roztwory wywarowe dziel na aliquoty i przechowuj je w temperaturze -80 °C do 3 miesięcy.
    UWAGA: Dla wewnętrznego standardu możliwe jest stosowanie albo nieoznakowanego octana retinylowego, albo oznakowanego octana retinylu. Jeśli stosuje się standard nieoznakowany i octanu retinylowego, kluczowe jest uzyskanie bazowej rozdzielczości pików octanowych retynyli i retinolu (patrz Rysunek 1).
  2. Wewnętrzny roztwór roboczy standardu: Przygotuj wewnętrzny standard roboczy przez rozcieńczenie standardu standardowego (1 mg/mL) do 1 μg/mL. Najpierw rozcieńcz 60 μL standardu standardowego 300 μL etanolu, a następnie rozcieńcz 60 μL tego roztworu w 10 000 μL etanolu. Do każdej próbki dodaje się 20 μL roboczego wewnętrznego roztworu standardu, zawierającego 20 ng octana retinylu.
    UWAGA: Wewnętrzne standardowe roztwory robocze mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do 1 tygodnia.

2. Przygotowanie standardów kalibracyjnych

  1. Standard kalibracyjny: Przygotuj roztwory standardu kalibracyjnego w stężeniu 1 mg/mL retinolu zawierającego 0,1% BHT (w/v) zarówno dla śladu, jak i śledźnika. Roztwory Aliquot magazynują i przechowują w temperaturze -80 °C do 3 miesięcy. Używaj każdego aliquota tylko raz, aby uniknąć cykli zamrożenia i rozmrażania.
  2. Roztwór roboczy standardu kalibracyjnego: Wyjmij 100 μL roztworu standardowego kalibracyjnego i rozcieńcz 10 000 μL etanolu w kolbie objętościowej. Określ stężenie rozcieńczonego roztworu kalibracyjnego na 325 nm w spektrofotometrze za pomocą kwarcowej kuwety (szczegóły w Tabeli 1 ).
  3. Weź aliquot rozcieńczonego standardu kalibracyjnego i dostosuj stężenie do 8 μM/L dla śladu, używając 50% etanolu i 50% acetonitrylu/dH,2O (70:30 (v/v)) oraz do 2 μM/L dla znacznika, używając 100% etanolu.
  4. Przygotuj duplikaty kalibracyjne w siedmiu różnych stężeniach dla śladu, używając 50% etanolu i 50% acetonitrylu/dH2O(70:30 (v/v). Jeśli wyekstrahowane zostanie 200 μL plazmy, standardy kalibracji śladów powinny mieścić się w zakresie od 6 do 0,03 μM/L.
    UWAGA: Dla dokładnej ilościowości, izotopowo oznakowane retinolowe i retynylowe estry w plazmie są ilościowane za pomocą zdublowanych 7-punktowych krzywych kalibracyjnych27. Najwyższy punkt na krzywej kalibracyjnej (dwukrotnie wyższy od najwyższego oczekiwanego stężenia śladu i śladnika w plazmie) uwzględnia współczynnik stężenia rekonstituowanego ekstraktu z oryginalnej objętości plazmy. Zapoznaj się z plikiem uzupełniającym 1 dotyczącym przygotowania duplikatów kalibracji.

3. Ekstrakcja retinoidów z osocza

  1. Pobierz próbki plazmy z zamrażarki o temperaturze -80 °C i rozmraź w temperaturze pokojowej (około 30 minut).
  2. Po rozmrożnięciu przewij każdą próbkę i obróć przez kilka sekund, aby upewnić się, że w pokrywce nie pozostała plazma. Następnie umieszczaj próbki w lodzie.
  3. Włącz chłodzoną wirówkę i pozwól jej ostygnąć do 4 °C. Oznacz szklane rurki o pojemności 15 mL z nakrętkami (identyfikator podmiotu i punkt czasu) i pipetuj 200 μL wody dejonizowanej (dH2O) do każdej probówki.
  4. Z wewnętrznego standardowego roztworu roboczego pipetować 20 μL wewnętrznej mieszanki standardowej do szklanej rurki.
  5. Za pomocą pipety wydaj 200 μL plazmy do odpowiedniej rurki zawierającej wewnętrzny standard i dH2O.
  6. Pipeta włóż 400 μL etanolu do każdej probówki i zakręć probówką, aby wymieszać etanol z plazmą. Nie wiruj, aby zapobiec przyklejaniu się reszt białkowych do szklanej ściany.
  7. Przy pierwszej ekstrakcji heksanu dodaj 2 mL heksanu do każdej probówki i mocno zakręć pokrywki rurek.
  8. Umieść rury w orbitalnym shakerze i potrząsaj z prędkością 15 000 obr./min przez 30 minut. Przełóż rurki do chłodzonego wirówki i obróć w 1800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  9. Używając szklanych pipet Pasteura, przenieś supernatant do czystego zestawu oznaczonych szklanych probówek. Uważaj, by nie przenoszyć białka, osadu ani wody.
  10. Wykonaj drugą ekstrakcję heksanu, dodając kolejne 2 mL heksanu do pozostałej resztki, mocno zakręć pokrywy rurek i umieść je w wstrząsie orbitalnej, potrząsając z prędkością 15 000 obr./min przez 15 minut.
  11. Przełóż probówki do chłodniczej wirówki i wiruj w 1800 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Za pomocą szklanych pipet Pasteura przenieś supernatant do szklanej probówki zawierającej supernatant pierwszej ekstrakcji heksanu (krok 3.9) dla każdej próbki, odpowiednio.
  12. Odparować połączony rozpuszczalnik do ekstrakcji heksanu (pierwszy i drugi supernatant ekstrakcyjny dla każdej próbki) pod delikatnym strumieniem N2 w zaciemnionym okapie spalinowym przez około 30 minut. Ustaw blok grzewczy na 35 °C.
  13. Ponownie zawiesić zaschnięty osad w 50 μL etanolu, krótko zawiesić i dodać 50 μL fazy ruchomej (70:30 acetonitrylu/dH,2O (v/v)) i ponownie zawiśnij.
    UWAGA: Rezawisija wysuszonego osadu powinna być przeprowadzana przy użyciu 100 μL etanolu tylko wtedy, gdy celem jest ilościowe określenie esterów retinylowych.
  14. Przelej do oznakowanych rurek mikrowirówek o pojemności 0,5 mL. Wirówka w 16 900 x g przez 5 minut.
  15. Przelej 80 μL zrekonstytuowanego resztka do bursztynowych fiolek HPLC z wkładkami 300 μL. Natychmiast zakręć fiolkę, aby zapobiec utracie rozpuszczalnika spowodowanej parowaniem.
  16. Przełóż szklane fiolki do krioboxa, oznacz je nazwą badania, datą ekstrakcji i identyfikatorami próbek, a następnie przechowuj w zamrażarce o temperaturze -80 °C do czasu analizy.
    UWAGA: Analiza przechowywanych próbek musi zostać ukończona w ciągu 3-5 dni. Objętość osocza wynosząca 200 μL jest zazwyczaj wystarczająca, aby wykryć oznakowany znacznik witaminy A do 90 dni po dawce. Jednak objętość plazmy można regulować do 400 μL, jeśli proporcje plazmy/wody/etanolu są utrzymywane na poziomie 1:1:2 objętościowo.

4. Przygotowanie wewnętrznych próbek kontroli standardowej

  1. Przygotuj roztwór fazy etanolowo-mobilnej przez pipetowanie 120 μL etanolu do rurki mikrowirówki i dodanie 200 μL (70:30) acetonitrylu/dH2O (v/v) oraz wirowania.
  2. Do trzech oddzielnych probówek 0,6 mL podłącz pipetą 20 μL wewnętrznego standardowego roztworu roboczego.
  3. Dodaj 80 μL roztworu etanolu/fazy mobilnej przygotowanej i wypląć wir. Przenieś trzy wewnętrzne próbki kontrolne do bursztynowych fiolek HPLC z wkładkami 300 μL i natychmiast zatkać fiolki, aby zapobiec utracie rozpuszczalnika spowodowanej parowaniem.

5. Standardy domów plazmowych

  1. Aby przygotować standardowe próbki dla domu, należy uzyskać wystarczającą objętość plazmy, aby umożliwić analizę co najmniej trzech próbek na jeden przebieg analityczny. Całkowita wymagana objętość plazmy jest określana przez liczbę próbek do analizy.
  2. Aliquot przechowuje standardową plazmę w małych kriovialach o objętościach potrzebnych na każdy cykl analityczny i przechowywa w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Kluczowe jest, aby standard domowy zawierał izotopowo oznakowany retinolowy znacznik używany w nieznanych próbkach. Wystarczające ilości materiału można uzyskać, łącząc próbki ochotników w jeden aliquot.
  3. Ekstrakt co najmniej trzech standardowych próbek plazmy dla każdego przebiegu analitycznego przy tej samej objętości co nieznane próbki plazmy, jak w kroku 3.
  4. Umieść standardy plazmowe w całej stoisku na próbki, pomiędzy nimi co najmniej 10 nieznanych próbek plazmy. Do obliczania różnic wewnątrzdniowych i wewnątrzdniowych należy stosować standardy domów plazmowych.

6. Zewnętrzne próbki standardowe

  1. Uzyskaj certyfikowane zewnętrzne próbki standardowe i przechowuj je w temperaturze -80 °C. Powszechnie stosowanym certyfikowanym zewnętrznym standardem jest NIST Standard Reference Material SRM 968.
  2. Ekstrahować co najmniej cztery zewnętrzne próbki standardowe plazmy na analizę w tej samej objętości co nieznane próbki plazmy według kroku 3. Użyj zewnętrznych próbek standardowych do weryfikacji dokładności uzyskanych wyników.

7. Ręczna optymalizacja złożona

  1. Upewnij się, że sonda APCI Heated Nebulizer jest zainstalowana w obudowie źródła MS. Przygotuj roztwór infuzji dla każdego stabilnego izotopowego znacznika przy stężeniu około 1 μg/mL.
    UWAGA: Roztwór powinien być podobny do fazy komórkowej i zawierać trochę kwasu do protonacji. Dobrym rozpuszczalnikiem do użycia byłby 1:1 acetonitryl/dH2Oz 0,1% kwasem mrówkowym (v/v).
  2. Napełnij 1 mL strzykawkę Hamilton z blokadą Luer-lock roztworem infuzyjnym, a następnie podłącz ją do źródła rurką PEEK przez złącze uziemiające. Ustaw przepływ wlewu na 10 μL/s.
  3. Wybierz Manualne strojenie i upewnij się, że instrument jest w trybie strojenia i kalibracji. Uruchom pompę strzykawkową i wybierz Q1 Scan Type w trybie dodatnim.
  4. Ustaw dolny zakres mas na 50 Da, a górny zakres masowy około 100 Da powyżej masy cząsteczkowej celu związku.
  5. Ustaw cykle na 500, prędkość skanowania 200 Da/s. Kliknij Start i obserwuj sygnał w oknie spektrum mas.
  6. Poczekaj, aż sygnał się ustabilizuje, a potem sprawdź, czy pojawiają się oczekiwane szczyty m/z. Rozważmy piki [M+H]+ i [M+2H]2+, ponieważ MS jest w trybie dodatnim.
  7. Docelowa szczytowa wysokość powinna wynosić około 1e6. Całkowity prąd jonowy (TIC) powinien wynosić 1e7-1e9. Kontynuuj infuzję, aż sygnał się ustabilizuje, wtedy kliknij Stop. Powinien istnieć wyraźny szczyt o wysokiej intensywności, który powstaje ze związku w roztworze infuzyjnym. Wyświetlany jest całkowity prąd jonowy (TIC), który pokazuje łączny sygnał dla wszystkich jonów razem z zamiarem.
    UWAGA: oczekiwana masa 12Cretinolu wynosi 269 Da, więc zakres 50-300 Da jest odpowiedni, aby pokazać [M+H]+ i [M+2H]2+ .

8. Skanowanie jonowe produktu (MS2) / kontrola widm CE

  1. Ustaw masę startową na niższą masę, np. 50 Da, a masę Stop tuż powyżej masy Q1 (np. 269,1 dla 12C retinolu). Ustaw Cykle na 5 i zmień energię kolizji (CE) na 10. Sprawdź masę Q1 jako jon prekursor. Jeśli nie pojawiają się mniejsze fragmenty, zwiększ CE do 20.
  2. Wraz ze wzrostem CE powstaje więcej jonów produktowych. Kontynuuj zwiększanie CE, aż jon prekursorowy po prawej stronie widma całkowicie zniknie. Zwiększ CE jeszcze bardziej, aby zobaczyć potencjalną fragmentację wtórną.

9. Skanowanie MRM

  1. Z badania MS2 wybierz trzy najbardziej obfite lub najbardziej odpowiednie jony produktowe, które zostaną wykorzystane do dalszej optymalizacji.
  2. Dla każdego iloczynu jonu wpisz masę Q1 (prekursor) oraz Q3 (iloczyn) mas znalezionych. Ustaw czas zatrzymania na 200 ms. Nazwij każdy fragment odpowiednio (np. 12C_Frag_93).
  3. Wybierz energię kolizji i określ optymalną wartość CE, korzystając z funkcji rampy. Wypełnij kolumnę CE optymalną wartością CE dla każdego fragmentu.
  4. Optymalizacja potencjału deklasterowania (DP) zoptymalizowana po optymalizacji CE, aby zminimalizować zakłócenia izobaryczne. Optymalizuj potencjał wyjścia komórki kolizyjnej (CXP) dla jednego przejścia naraz.

10. Optymalizacja źródeł/gazów

  1. Tych parametrów nie da się automatycznie optymalizować. Jeśli chcesz poprawić natężenie sygnału, wykonaj ręczną optymalizację. Zmieniaj parametr po jednym i porównaj, czy sygnał wzrósł, pozostał taki sam lub zmalał.

11. Warunki chromatografii cieczowej

  1. Do chromatografii stosuje się binarny komórkowy gradient fazy wynoszący 0,1% (v/v) kwasu mrówkowegow dH2O (A) oraz 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w acetonitryle (B).
  2. W zależności od zastosowanego systemu LC, można użyć kolumny ABZ PLUS o wymiarach 100 mm x 2,1 mm (3 μm) wyposażonej w wkład C18 4 mm x 2 mm (dla HPLC), lub 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) Premier BEH Shield wyposażoną w kolumnę RP18 FIT (do chromatografii ultrawysokociśnieniowej (UPLC)) do analizy retinolu. Utrzymywać kolumny w temperaturze odpowiednio 40 °C lub 50 °C.
  3. Wstrzyknąć 10 μL ekstraktu osocza na kolumnę. Analizowane eluty z przepływem 0,4 mL/min. W systemach HPLC gradient liniowy wynosi: 60% B do 95% B w ciągu 6,0 min; 100% B od 6,1 min do 13,0 min; 100% B do 60% B od 13,1 do 14,0 min; oraz 60% B od 14,0 do 17,0 min. W systemach UPLC gradient liniowy zależy od pytania badawczego. Jeśli ma być określany tylko retinol, gradient wynosi: 40% B do 60% B w ciągu 1,0 minuty; 60% B do 95% B od 1,0 min do 6,0 min; 100% B od 6,5 do 7,5 min; 100% B do 40% B od 7,5 do 7,6 min; oraz 40% B w czasie od 7,6 do 8,5 min. Jeśli celem jest również analiza retinylesterów obok retinolu, gradient liniowy wynosi: 60% B do 95% B w ciągu 3,0 min; 100% B od 3,5 min do 6,5 min; 100% B do 60% B od 6,5 do 7,0 min; oraz 60% B od 7,0 do 8,5 min.

12. Warunki MS/MS

  1. Wykonaj analizę MS/MS pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI) w trybie dodatnim jonowym. APCI jest wybierane zamiast jonizacji elektronatryskowej, ponieważ zapewnia wyższą intensywność sygnału, szerszy zakres liniowy oraz oferuje niższy szum tła26.
  2. Dla odpowiednich przejść masowych dla [12C]retinol, [13C]retinolu i [2H6]retinolu oraz ich odpowiednich estrów/octana z wybranymi parametrami monitorowania reakcji (SRM) dla API4000 oraz spektrometru mas QTRAP 5500, sprawdź Tabelę 2, Tabelę 3 i Rysunek 2.
    UWAGA: Wybrany jon monitorujący retinol, retynylowe estery i octan retynyloctanu to ten sam fragmentowy jon m/z 269 dla ilościowej APCI, ponieważ ten jon odpowiada utracie wody, kwasów tłuszczowych lub kwasu octowego z protonowanych cząsteczek. Ponieważ LC-MS/MS potrafi oddzielić piki retinolu od swoich esterów, pojedyncze wstrzyknięcie pozwala na określenie wzbogacenia izotopów zarówno w frakcjach retinolu, jak i retinyl-esterów w jednej próbce.

13. Ilościowa identyfikacja retinolu

  1. Ilościowo określić stężenia próbek retinolu [12C], [2H6] oraz [13C10] w porównaniu z odpowiednimi standardami kalibracyjnymi.
  2. Określ straty ekstrakcyjne, wykorzystując uzyskanie wewnętrznych stężeń standardowych dla każdej próbki w porównaniu z wewnętrznymi próbkami kontrolnymi.
  3. Wykonaj potwierdzenie stężenia retinolu w osoczu przy użyciu standardowego materiału referencyjnego (SRM) 968 Narodowego Instytutu Standardów i Technologii (NIST).

Wyniki

Aby zilustrować skuteczność metody analitycznej w analizie stabilnego retinolu znakowanego izotopem w różnych układach chromatograficznych, prezentujemy wyniki z dwóch różnych badań.

Do użycia API4000 z HPLC na początku, przeanalizowano próbki osocza od 111 filipińskich dzieci w wieku od 12 do 18 miesięcy, które otrzymały doustną dawkę 400 μg (1,17μmol) [13 C10] octana retinylowego w dniu 0, a następnie pobranie próbki krwi 6 mL 4 dni po dawce, przeanalizowano 7,28 mg. Średnie stężenia całkowitego retinolu w osoczu wynosiły 1,1 μmol/L, a średnie [13C10] retinolu 0,007 μmol/L. Ponieważ poziom szumu tła w przejściu m/z 279 do 100 miał średnią szczytową wysokość ~50 cps (rysunek 1), poziom detekcji (LOD) i ilościowości (LOQ) dla [13C10] retinolu został ustawiony na 150 cps i 500 cps, co odpowiada odpowiednio 6 fmol i 19 fmol na kolumnie. Ponieważ uzyskano dobrą rozdzielczość bazową pomiędzy retinolem [12C] a zastosowanym wewnętrznym standardem octanowym retinylu, nie było potrzeby stosowania stabilnego izotopowo znakowanego octana retinylu.

Szybsze rozdzielenie chromatograficzne można osiągnąć dzięki UPLC w połączeniu z QTRAP 5500, z czasami pracy poniżej 10 minut. W zależności od pytania badawczego można zastosować dwie różne metody separacji; (i) jeśli celem jest określenie natywnego i izotopowo znakowanego retinolu, stosowany nieoznakowanym wewnętrznym standardem octanowym retinylowo-octanowym, czasy retencji między retinolem (4,37 min) a octanem retinylu (5,33 min) zapewniają dobrą separację bazową (Rysunek 3); (ii) jeśli celem jest rozdzielenie retinolu natywnego i izotopowego z natywnymi i oznakowanymi retinyl-esterami, można osiągnąć dobre rozdzielenie w ciągu 8,5 minuty (Rysunek 4). Jednak ze względu na krótkie czasy retinolu (2,10 min) i octanem retynylu (2,43 min), zaleca się stosowanie izotopowo oznakowanego octana retynylowego ([2H4] octan retinyla). W tym przykładzie przeanalizowano próbki surowicy od 80 ghańczyczek w wieku rozrodczym, które otrzymały równoważną dawkę 2 mg retinolu [2H6] octanu retynylowego oraz [13C10] octana retinylu, a następnie pobrano próbkę krwi 21 dni po dawce. Średnie stężenia całkowitego retinolu w surowicy wynosiły 1,89 μmol/L, ze średnią [2H6] retinolu 0,027 μmol/L, a średnią [13C10] retinolu 0,025 μmol/L.

Przedstawiona metoda osiągnęła niski poziom detekcji (LOD = 6 fmol; LOQ = 19 fmol w kolumnie), wykazując wysoką czułość i swoistość w wykrywaniu stabilnego retinolu znakowanego izotopem z wyraźnym rozdziałem bazowym między natywnym retinolem a standardami wewnętrznymi. Ponadto metoda działała skutecznie zarówno z układami HPLC, jak i UPLC, mimo różnic w czasie retencji. Zastosowanie izotopowo oznakowanych standardów wewnętrznych ([2H4] octan retinylu) zapewniło dokładne ilościowe określenie w szybszych warunkach UPLC, jeśli konieczne było określenie retinylowych esterów. Weryfikacja według certyfikowanych przez NIST standardów referencyjnych potwierdziła dokładność, podczas gdy współczynniki zmienności w ciągu dnia i między dniami (odpowiednio 2,3% i 4,4%) wykazały doskonałą precyzję i powtarzalność. Pomyślna analiza próbek osocza/surowicy z dwóch odrębnych populacji (filipińskich dzieci i ghańskich kobiet) z różnymi protokołami dawkowania wykazuje odporność i praktyczną użyteczność w różnorodnych badaniach żywieniowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Chromatogram LC-MS/MS za pomocą spektrometru masowego API4000. Chromatogram retinolu w surowicy uzyskano 4 dni po doustnym spożyciu 0,4 mg [13C10] octana retynylowego. Wybrane monitorowanie reakcji (SRM) m/z 269 do 93 pokazuje separację retinolu [12C] (RT = 5,06 min) i [12C] octana retynylowego (RT = 5,83 min) jako wewnętrzny standard (IS). Sygnał retinolu [13C10] przy m/z 279 do 100 znacznie przekracza zarówno granicę wykrywania (LOD), jak i granicę ilościowości (LOQ). Warunki chromatograficzne: (A) binarny mobilny gradient fazowy 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w dH2O oraz (B) 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w acetonitrylu; przepływ 0,4 mL/min z liniowym gradientem: 60% B do 95% B w ciągu 6,0 min; 100% B od 6,1 min do 13,0 min; 100% B do 60% B od 13,1 do 14,0 min; oraz 60% B od 14,0 do 17,0 min; Kolumna ABZ PLUS o wymiarach 100 mm x 2,1 mm (3 μm), wyposażona w nabój C18 o wymiarach 4 mm x 2 mm utrzymywane w temperaturze 40 °C. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

figure-results-2
Rysunek 2: Spektrum mas jonowych produktów APCI-MS/MS. Spektra masowe z produktem przepływowym APCI-MS/MS, obejmujące (A) m/z 269 [12C] retinol, (B) m/z 273 [2H4] retinol, (C) m/z 275 [2H6] retinol oraz (D) m/z 279 [13C10] retinol w trybie dodatnim jonowym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Chromatogram LC-MS/MS za pomocą spektrometru mas QTRAP 5500. Chromatogram LC-MS/MS typowego ekstraktu ze standardu plazmowego pobrano 21 dni po doustnym spożyciu 1,0 mg octana retynylowego [2H6] oraz 90 dni po doustnym spożyciu 1,0 mg octana retynylowego [13C10]. Wybrane monitorowanie reakcji (SRM) m /z 269→93 pokazuje [12°C] szczyt retinolu (RT = 4,37 min) oraz octan retynylu (RT = 5,33 min) jako standard wewnętrzny (IS); retinol [2H6] (RT = 4,36 min) przy m/z 275→96; oraz [13C10] retinolu (RT = 4,38) przy m/z 279→100. Warunki chromatograficzne: (A) binarny komórkowy gradient fazy 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w dH, 2O oraz (B) 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w acetonitryle; przepływ 0,4 ml/min z liniowym gradientem: 40% B do 60% B w ciągu 1,0 min; 60% B do 95% B od 1,0 min do 6,0 min; 100% B od 6,5 do 7,5 min; 100% B do 40% B od 7,5 do 7,6 min; oraz 40% B od 7,6 do 8,5 min; 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) AcquityTM Premier BEH Shield RP18 kolumna VanGuard FIT, utrzymywana w temperaturze 50°C. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

figure-results-4
Rysunek 4: Chromatogram LC-MS/MS retinolu i retinylesterów za pomocą spektrometru mas QTRAP 5500. Chromatogram LC-MS/MS typowego ekstraktu ze standardu plazmowego pobrany 6 godzin po doustnym spożyciu 1,0 mg octana retynylowego [2H6] oraz 90 d po doustnym spożyciu 1,0 mg octana retynylowego [13C10]. Wybrane monitorowanie reakcji (SRM) m /z 269→93 pokazuje szczyt [12C]retinolu (RT = 2,10 min); [2H4]octan retinyla przy m/z 273→94 (RT = 2,43 min) jako wewnętrzny standard (IS); separacja [2H6]retinolu (RT = 2,09 min) i [2H6]retinylowopalmitanu (RT = 5,11 min) osiąga szczyt m/z 275→96; oraz [13C10] retinolu (RT = 2,10) przy m/z 279→100. Warunki chromatograficzne: (A) binarny komórkowy gradient fazy 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w dH, 2O oraz (B) 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w acetonitryle; przepływ 0,4 ml/min z liniowym gradientem: 60% B do 95% B w ciągu 3,0 min; 100% B od 3,5 min do 6,5 min; 100% B do 60% B od 6,5 do 7,0 min; oraz 60% B od 7,0 do 8,5 min; 100 mm x 2,1 mm (1,7 μm) kolumna AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FIT, utrzymywana w temperaturze 50 °C. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

Parametry
Trzonowcowa absorpcja (ɛ) retinolu w etanolu:52 770 M-1 cm-1
Współczynnik rozcieńczenia:100 (100μL standardu kalibracyjnego w 10mL etanolu)
Zmierzona średnia absorpcja:0.575
Obliczenia
Stężenie (mol) [12C]retinolu w etanolu:Stężenie (mol) = Absorpcja / ɛ x Długość kuwety
= 0,575 / 52770 M-1 cm-1 x 1 cm = 1,09 x 10-5 M
Korygowanie pod kątem rozcieńczenia:1,09 x 10-5 M x 100 = 1,09 x 10-3 M lub 1,09 mM

Tabela 1: Określenie stężenia zapasów retinolu w standardzie kalibracyjnym.

AnalitPrzejścia MRM (m/z)Potencjał deklasterujący (V)Potencjał wejściowy (V)Energia kolizji (eV)Potencjał wyjścia z kolizji (V)
[12C]-retinol/estery269→935110276
[2H4]octan retinylu273→945110276
[2H6]retinol/estery275→965110276
[13C10]-retinol/estery279→1004110276

Tabela 2: Wybrane parametry monitorowania reakcji (SRM). Parametry dla retinolu [12C], retinolu [13C10] oraz retinolu [2H6] i ich odpowiednich esterów przy użyciu API4000

AnalitPrzejścia MRM (m/z)Potencjał deklasterujący (V)Potencjał wejściowy (V)Energia kolizji (eV)Potencjał wyjścia z kolizji (V)
[12C]-retinol/estery269→939410338
[2H4]octan retinylu273→9454102011
[2H6]retinol/estery275→966910253
[13C10]-retinol/estery279→10010210359

Tabela 3: Wybrane parametry monitorowania reakcji (SRM). Parametry dla retinolu [12C], retinolu [13C10] oraz retinolu [2H6] i ich odpowiednich esterów przy użyciu QTRAP 5500

Plik uzupełniający 1: Przygotowanie standardów kalibracyjnych dla siedmiu różnych stężeń dla tracera Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Prezentowana metoda LC-MS/MS oferuje niezwykle wysoką czułość, z limitami detekcji już od 6 fmol/L, co pozwala badaczom użyć już od 100 do 200 μL plazmy19. Ta metoda ukierunkowanego tandemowego MS jest szczególnie skuteczna w potwierdzaniu tożsamości izotopologów retinoidów, gdy stosuje się zarówno jony produktu kwantyfikatora, jak i kwalifikatora18. Jednakże, ponieważ retinoidy znakowane izotopem występują w znacznie niższych stężeniach niż fizjologicznie nieoznakowane retinoidy, próbki osocza zawierające znakowane retinolowe i retynylowe estry mogą wymagać dodatkowego etapu stężenia. Ta konieczność zależy od takich czynników jak czas pobrania próbki krwi po dawce, stężenie doustnego śladownika oraz czułość układu LC-MS/MS. Historycznie wyższe dawki zastosowano do przezwyciężenia niższej czułości wcześniejszych spektrometrów mas, ale ostatnie osiągnięcia ułatwiły stosowanie niższych dawek13. W przedstawionych przykładach wyższa dawka doustna zwiększa poziom stabilnego retinolu znakowanego izotopem nawet w późniejszych momentach, czyli po 21 dniach w porównaniu do 4 dni.

Ponieważ końcowe grupy funkcjonalne retynylowych esterów są tracone podczas jonizacji, obserwuje się te same wzorce m/z 269 oraz podobne wzorce fragmentacji jonów potomnych zarówno dla retinolu, jak i retynylowych esterów. Dlatego separacja chromatograficzna jest kluczowa do określenia ich oddzielnych stężeń18. Ponadto, ze względu na wysoką naturalną ilość stabilnych izotopów 13C w endogennych izotopologach retinolu, zaleca się włączenie więcej niż trzech atomów 13Cdo tracera retinolu, aby uniknąć konieczności korekcji bazowego naturalnego wzbogacenia retinolu o 13C w ludzkim osoczu29.

Próbki plazmy wymagają przetwarzania przed analizą izotopową w dwóch etapach. Najpierw należy odizolować próbki osocza, a następnie ekstrakcję retinolu i esterów retynylowych za pomocą rozpuszczalnika niepolarnego, co tworzy układ dwufazowy 18,19,20. Chociaż uzyskano wyraźne rozdzielenie fazowe za pomocą powyższego protokołu, kluczowe jest, aby interfaza w układzie bifazowym nie była zakłócana ani zbierana, ponieważ wydłuży to czas suszenia i obniży dokładność analizy. Alternatywnie, nasza grupa badała także zastosowanie jednofazowej metody ekstrakcji retinoidów20. W tym celu próbki plazmy o pojemności 200 μL są poddawane pipetą do plastikowej mikrowirówki o pojemności 2 mL, a retinoidy są pobierane za pomocą kombinacji etanolu i octana etylu. Zastosowanie tego protokołu ekstrakcji pozwala na analizę retinolu i bardziej polarnych retinoidów, takich jak izomery kwasu retinowego, z równoważną odzyskiem w porównaniu do ekstrakcji bifazowej, a także jest porównywalny z metodą ekstrakcji jednoetapowej acetonitryli Kane'a i Napoli30.

Biorąc pod uwagę, że retinoidy są podatne na utlenianie i izomeryzację pod wpływem światła UV i ciepła, kluczowe jest przeprowadzenie analizy jak najszybciej, a podczas zbierania, obsługi i przechowywania plazmy30 należy zachować ogólne środki ostrożności. Tradycyjne metody analizy stabilnych retinoidów znakowanych izotopami wykorzystują czasochłonną izolację i/lub deriwatyzacje. Analiza GC-MS wymaga izolowania frakcji retinolu z surowicy ludzkiej za pomocą wysokowydajnej chromatografii ciekłej (HPLC), a następnie derywacji retinolu22. Chociaż deriwatyzacja nie jest wymagana dla GC-C-IRMS, zaleca się wcześniejsze rozdzielenie retinolu za pomocą dwóch oddzielnych etapów oczyszczania HPLC 17,25,31, a także wymagane jest określenie bazowego naturalnego wzbogacenia retinolu o 13°C w ludzkim osoczu w populacji próbki. 17,32. Dla porównania, prezentowana metoda LC-MS/MS ma kilka zalet. Unika rozległych i czasochłonnych procedur ekstrakcji i/lub oczyszczania, umożliwiając szybką, czułą i jednoczesną analizę retinolowych esterów oraz wolnego retinolu 16,18,26,32. Ponadto metoda jest skuteczna, ponieważ zapewnia wysoką dokładność przy niskiej zmienności i jest adaptowalna do różnych systemów LC-MS/MS.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do oświadczenia.

Podziękowania

Wsparcie dla tych działań zapewniły Fundacja Billa i Melindy Gatesów (numer projektu: OPP1115464) oraz Międzynarodowa Agencja Energii Atomowej (MAEA) w Wiedniu (Numer projektu E4.30.30).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rozpuszczalniki
Absolutna jakość etanolu HPLCFisher10428671
Acetonitrylowa klasa HPLCFisher10660131
Heksan 95% n-heksan dla HPLC CertiFied HPLCFisherH/0406/17
Izopropanol HPLCVWR20880.32
Izopropanol HPLCVWR20880.32
Metanol 99% 2,5 lThermo Scientific11367996
Standardy/izotopy
Całkowicie trans-retinolBioXtra95144
Octan retynyluSigmaPHR1236
Stabilny izotop oznaczony retinolem:ReseaChem/Buchem BV
Stabilny izotop oznaczony jako octan retinylu:ReseaChem/Buchem BVNie maDla metody RID można użyć różnych stabilnych izotopów. Lista różnych komercyjnie dostępnych izotopów znajduje się w Tabeli 1. 
witamina A i nie jest to nic innego; (19,19,19,20,20,20-D6)
witamina A i nie jest to nic innego; (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Octan witaminy A (10,19,19,19-D4)
Octan witaminy A (19,19,19,20,20,20-D6)
Octan witaminy A (8,9,10,11,12,13,14,15,19,20-13C10)
Sprzęt
Regulowany dozownik rozpuszczalnika 5mlSigma-AldrichZ627607-1EA
ABI 4000 LC-MS/MS.AB Sciex
Wagi analityczne & nbsp;Fisher13592970
Tłoki kapilarne (końcówki pipety) CP100 10x96 TIPACKGilsonFD148314
Tłoki kapilarne CP250ST 6x96GilsonF148714
Szafka spalinowa
Microman E M100E Pipette (dodatnia przeporność)GilsonFD10004
Microman E M250E Pipette (dodatnia przeporność)GilsonFD10005
Pipetman P100, 10-100ul, metalowy wyrzutnikGilsonF114057M
Pipetman P1000, 100-1000ul, metalowy wyrzutnikGilsonF114059M
Pipetman P20, 2-20ul, metalowy wyrzutnikGilsonF144056M
QTRAP 5500 LC-MS/MSAB Sciex
Chłodzenie 5810 REppendorf
Sonikacja kąpieli wodnejVWRUSC100T
SpektrofotometrThermo Fisher ScientificA51119600C
Koncentrator próbek techne i blok grzewczy.VWR
Vibrax VXR Basic ShakerIKA0002819002
Mieszacz wirowy; MS3 podstawowy IKAFisherMPR-555-050L
Mocowanie probówki VX2 – werke typ VX2IKA0000568900
Przedmioty jednorazowe
Rurki mikrowirówki 1,5 mlFisherFB74323
100 mm x 2,1 mm (1,7 μ m) Kolumna AcquityTM Premier BEH Shield RP18 VanGuard FITWody186009498
100 mm x 2,1 mm (3 i mikro; m) kolumna Supelcosil ABZ PLUSSupelco57917
Końcówki pipety 1000 ULStarlabS1122-1830
Kolby objętościowe 100mlFisher11323644Certyfikowana kolba objętościowa Pyrex Borosilikatowego Szkła Klasy A
Końcówki pipety 200 ulStarlabS1120-8810
Nabój SecurityGuard C18 4 mm x 2 mmFenomeneksAJ0-4286
Kolby objętościowe 50 mlFisher11313644Certyfikowana kolba objętościowa Pyrex Borosilikatowego Szkła Klasy A
Fiolki z bursztynowego szkła 9mm z wkładkamiFisher11583680
Nakrętki na fiolki 9 mmFisher13206419
Kartonowa skrzynka krio-skrzynkaStarlabA9623-8181
Hellma cuvette UV quartzSLSCEL1600
Gaz azotowy (o najwyższej czystości i bez tlenu)BOC
Pasteur PipetteFisher11546963
Rurki do hodowli pyreksowej 100x16mmCorningCLS9944916
Śruby na zakrętkach PTFE 16mmCorningCLS999815
Kapsle z fiolki bursztynowe 2ml PTFEFisher11573542
Nakrętka na fiolkę 9mm silikonowa biała/PTFE czerwonyTermo 13206419

Bibliografia

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  2. Stevens, G. A., et al. Trends and mortality effects of vitamin A deficiency in children in 138 low-income and middle-income countries between 1991 and 2013: a pooled analysis of population-based surveys. Lancet Global Health. 3 (9), E528-E536 (2015).
  3. Baye, K., et al. Estimates of child mortality reductions attributed to vitamin A supplementation in sub-Saharan Africa: scale up, scale back, or refocus. Am J Clin Nutr. 116 (2), 426-434 (2022).
  4. Bielderman, I., Vossenaar, M., Melse-Boonstra, A., Solomons, N. W. The potential double-burden of vitamin A malnutrition: under- and overconsumption of fortified table sugar in the Guatemalan highlands. Eur J Clin Nutr. 70 (8), 947-953 (2016).
  5. Brown, K. H., Engle-Stone, R., Kagin, J., Rettig, E., Vosti, S. A. Use of Optimization Modeling for Selecting National Micronutrient Intervention Strategies: An Example Based on Potential Programs for Control of Vitamin A Deficiency in Cameroon. Food Nutr Bull. 36 (3 Suppl), S141-S148 (2015).
  6. Bruins, M. J., et al. Maximizing the benefits and minimizing the risks of intervention programs to address micronutrient malnutrition: symposium report. Matern Child Nutr. 12 (4), 940-948 (2016).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Engle-Stone, R., et al. Weighing the risks of high intakes of selected micronutrients compared with the risks of deficiencies. Ann New York Acad Sci. 1446 (1), 81-101 (2019).
  9. Raiten, D. J., et al. Perspective: Integration to Implementation (I-to-I) and the Micronutrient Forum-Addressing the Safety and Effectiveness of Vitamin A Supplementation. Adv Nutr. 11 (2), 185-199 (2020).
  10. van Stuijvenberg, M. E., et al. South African preschool children habitually consuming sheep liver and exposed to vitamin A supplementation and fortification have hypervitaminotic A liver stores: a cohort study. Am J Clinical Nutr. 110 (1), 91-101 (2019).
  11. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among Equations Used for Retinol Isotope Dilution in the Assessment of Total Body Stores and Total Liver Reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  12. Green, M. H., Green, J. B., Ford, J. L. Better Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method Are Possible with Deeper Understanding of the Mathematics and by Applying Compartmental Modeling. J Nutr. 150 (5), 989-993 (2020).
  13. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  14. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  15. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  16. Fleshman, M. K., Riedl, K. M., Novotny, J. A., Schwartz, S. J., Harrison, E. H. An LC/MS method for d8-β-carotene and d4-retinyl esters: β-carotene absorption and its conversion to vitamin A in humans. J Lipid Res. 53 (4), 820-827 (2012).
  17. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  18. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  19. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  20. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Meth Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  21. Parker, R. S., et al. Study of beta-carotene metabolism in humans using 13C-beta-carotene and high precision isotope ratio mass spectrometry. Ann N Y Acad Sci. 691, 86-95 (1993).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  23. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. G., Russell, R. M. Short-term (intestinal) and long-term (postintestinal) conversion of beta-carotene to retinol in adults as assessed by a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 78 (2), 259-266 (2003).
  24. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  25. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats with C-13(4)-retinyl acetate and gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry. J Nutr. 130 (11), 2844-2849 (2000).
  26. van Breemen, R. B., et al. Development of a method for quantitation of retinol and retinyl palmitate in human serum using high-performance liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionization-mass spectrometry. J Chromatogr A. 794 (1-2), 245-251 (1998).
  27. Fu, Y., Li, W., Flarakos, J. Recommendations and best practices for calibration curves in quantitative LC-MS bioanalysis. Bioanalysis. 11 (15), 1375-1377 (2019).
  28. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  29. van Lieshout, M., West, C. E., van Breemen, R. B. Isotopic tracer techniques for studying the bioavailability and bioefficacy of dietary carotenoids, particularly beta-carotene, in humans: a review. Am J Clinical Nutr. 77 (1), 12-28 (2003).
  30. Kane, M. A., Napoli, J. L. Quantification of endogenous retinoids. Methods Mol Biol. 652, 1-54 (2010).
  31. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84, 30-39 (2014).
  32. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

znaczniki witaminy Arozcie czanie izotopowe retinolutandemowa spektrometria masanaliza retinolu w osoczuoznaczanie ilo ciowe retinoluekstrakcja rozpuszczalnikiemjonizacja pod ci nieniem atmosferycznymrozdzielanie estr w retinylu
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.