Artykuł metodologiczny

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

407 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69562

⸱

10 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Investigaciones Biomédicas Sols-Morreale, Consejo Superior de Investigaciones Científicas, Universidad Autónoma de Madrid, 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas CIBERDEM, Instituto de Salud Carlos III

W tym artykule

Podsumowanie

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Streszczenie

Pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) komórki endokrynnego trzustki stanowią obiecujące źródło dla terapii komórkowej cukrzycy i modelowania choroby. Chociaż ustanowiono kilka protokołów różnicowania, do badania dojrzewania i funkcji w fizjologicznym kontekście zwykle wymagana jest implantacja in vivo. Większość podejść transplantacyjnych opiera się na miejscach takich jak torebka nerki lub przestrzeń podskórna, które mogą stwarzać ograniczenia techniczne lub fizjologiczne. Przedstawiamy tu szczegółowy protokół dotyczący wewnątrzmięśniowej transplantacji wywodzących się z hPSC wysp SC trzustki do szczurów immunodeficytarnych. To miejsce pozwala na bezpośredni dostęp chirurgiczny, zmniejsza inwazyjność i zapewnia niezawodne pobranie przeszczepu do dalszej analizy. Procedura umożliwia wewnątrzmięśniową implantację wysp pochodzenia komórkowego macierzystej i wspiera ich odzyskanie do dalszej oceny wydzielanie insuliny po doustnym podaniu glukozy. Protokół obejmuje kroki przygotowania i zagęszczania klastrów, operację przeszczepienia, in vivo wydzielanie insuliny stymulowanej glukozą (GSIS) i pobranie przeszczepu do analizy histologicznej, zapewniając reproduktywalny rachunek dla wewnątrzmięśniowej transplantacji w preklinicznych modelach mysich.

Wprowadzenie

Cukrzyca jest heterogenicznym zaburzeniem metabolicznym, którego częstość wystąpienia podwoiła się w ciągu ostatnich trzech dekad i spodziewa się, że do 2050 roku dotrze 1,3 miliarda ludzi1. Podczas gdy czynniki środowiskowe, takie jak dieta i styl życia, odgrywają znaczącą rolę w wystąpieniu cukrzycy typu 2 (T2D), predyspozycje genetyczne również w znacznym stopniu przyczyniają się do jej patogenezy2. Komórki ß trzustki są odpowiedzialne za syntezę i wydzielania insuliny i odgrywają centralną rolę w patofizjologii cukrzycy3. Aby zrozumieć, jak ryzyko genetyczne przyczynia się do dysfunkcji komórek ß, ludzkie komórki macierzyste pochodzenia płodowego zorganizowane jako trójwymiarowe klastry dokrewne (dalej określane jako SC-wysepki) stanowią wysoce pouczający i istotny system modelowy4,5. Ostatnie protokoły skutecznie prowadzą różnicowanie ludzkich komórek macierzystych w komórki ß wytwarzające insulinę, poprzez odtworzenie kluczowych etapów rozwoju trzustki za pomocą specyficznych inhibitorów i czynników wzrostu6,7.

Te systemy niezawodnie replikują kamienie milowe rozwoju w skalowalny, powtarzalny sposób, pokonując ograniczenia wysp pochodzenia dawcy, które nie wspierają modelowania rozwoju i są podatne na ograniczenia zaopatrzenia. Modele na myszach dostarczyły cenny wgląd w rozwój trzustki, ale często nie udaje im się w pełni odtworzyć manifestacji fenotypu obserwowanych u ludzkich pacjentów5. W związku z tym, użycie systemu opartego na komórkach macierzystych umożliwia charakterystykę wariantów genetycznych zaangażowanych w rozwój trzustki człowieka i dysfunkcji komórek ß8.

Mimo tych postępów, SC-wysepki wygenerowane in vitro pozostają transkrypcyjnie i funkcyjnie niedojrzałe w porównaniu z natywnymi komórkami ß dorosłych. Wykazują suboptymalne wydzielanie insuliny stymulowanej glukozą i brak ekspresji dojrzałych markerów komórek ß, takich jak MAFA i G6PC29,10. Aby zapobiec tej luki, często stosuje się dojrzewanie in vivo poprzez przeszczepienie do szczurów immunodeficytarnych; to zazwyczaj poprawia zarówno dynamiki wydzielania insuliny, jak i profile ekspresji genów6.

Metabolizm glukozy jest ściśle regulowany i wymaga integracji wskazówek systemowych. Przeszczepione SC-wysepki są w stanie zintegrować sygnały z wielu narządów, zapewniając bardziej fizjologicznie istotne środowisko, które jest kluczowe dla oceny konsekwencji funkcjonalnych wariacji genetycznych w ludzkich komórkach ß11.

Przeszczepianie SC-wysepek u myszy było wykonywane w różnych miejscach anatomicznych. Konwencjonalnym miejscem jest torebka nerkowa, skuteczna w promowaniu dojrzewania komórek ß i odwracaniu cukrzycy u szczurów leczonych streptozotocynę (STZ)12, ale wiąże się to ze złożoną inwazyjną operacją, co ogranicza jego implementację w laboratoriach13. Co więcej, ta metoda nie jest przenośna do ustawień klinicznych w leczeniu pacjentów z cukrzycą typu 1 z powodu ograniczeń wielkości i unaczynienia14. Zgłaszano alternatywne miejsca przeszczepu, takie jak tkanki mięśniowe, podskórne i tkanki tłuszczowej, oferujące mniej inwazyjne i bardziej stosowalne klinicznie drogi. Chociaż przeszczepienie domięśniowe może stanowić wyzwanie dla osiągnięcia optymalnego dojrzewania komórek ß i wydzielania insuliny w porównaniu z torebką nerkową12, może jednak osiągnąć skuteczne wydzielanie insuliny i utrzymanie homeostazy glukozy, oferując prostszy i bardziej dostępny podejście chirurgiczne15,16.

Dlatego w tym protokole przedstawiamy podejście do przeszczepiania domięśniowego, które rozwiązuje kilka ograniczeń innych protokołów przeszczepiania. Ta metoda jest minimalnie inwazyjna i zapewnia niezawodną strategię in vivo dojrzewania SC-wysepek i badania wariantów genetycznych związanych z dysfunkcją komórek ß.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty z udziałem pluripotentalnych komórek macierzystych (hPSC) i zwierząt laboratoryjnych zostały zatwierdzone przez instytucjonalne, regionalne i krajowe komitety etyczne. Zastosowane tu linie hPSC zostały pierwotnie wyhodowane i rozprowadzane zgodnie z odpowiednimi zatwierdzeniami etycznymi i procedurami udzielenia zgody świadomie u instytucji źródłowych. Rysunek 1 przedstawia ogólny przebieg procesu, od utrzymania hPSC poprzez ukierunkową różnicowanie linii trzustkowej i dojrzewanie do SC-wysepek nadających się do przeszczepu.

1. Różnicowanie hPSC do przodków trzustkowych

UWAGA: Ten protokół opiera się na dwóch kluczowych krokach przygotowawczych: 1) utrzymaniu i rozmnażaniu hPSC oraz 2) ich ukierunkowanym różnicowaniu w kierunku trzustki dokrewnej. Obie fazy zostały szczegółowo opisane7,17. hPSC są utrzymywane na pokrytych płytkach z pożywką B8 zgodnie z zaleceniami Lyria-Leyte i wsp.17. Zebranie hPSC do różnicowania powinno odbywać się podczas eksponencjalnego wzrostu, zanim stają się zwarte. Przy zalecanej gęstości siewu powinny osiągnąć 90-100% zwartości następnego dnia, gotowe do rozpoczęcia różnicowania. Różnicowanie w kierunku trzustki dokrewnej przeprowadza się zgodnie z procedurą opisana przez Barsby i wsp.7. Pełne szczegóły pożywek znajdują się w Tabeli 1.

  1. Świeżo pokryć płytki do różnicowania substancją zewnątrzkomórkową pochodzącą z błony podstawnej.
  2. Zasiew 0,16-0,19 mln komórek/cm2 w Dniu 0 (1,7 mln komórek w dołku z 6-doku płytki). Użyj 1,5-2x objętości pożywki B8 + CEPT, aby zapobiec wyczerpaniu składników odżywczych (3-4 mL na dołek w 6-doku płytki).
    UWAGA: Podczas przesiewu hPSC lub zasiewu eksperymentów różnicujących, preferujemy uzupełnienie pożywki B8 koktajlem CEPT, zawierającym chroman 1, emricasan, poliaminy i trans-ISRIB, zamiast konwencjonalnego inhibitora ROCK Y-27632, ze względu na jego sprawdzone właściwości poprawiające przeżywalność hPSC18. Mimo to, Y27632 pozostaje ważną alternatywą dla tego protokołu.
  3. Wykonuj zmiany pożywki za pomocą pożywki do różnicowania S1 do S4 zgodnie z poniższym harmonogramem: S1 (Dni 1-4), S2 (Dni 4-7), S3 (Dni 7-9) i S4 (Dni 9-11).
    UWAGA: Pełne składniki pożywki znajdują się w Tabeli 1; dodatkowe szczegóły proceduralne opisano przez Barsby i wsp.7.

2. Generowanie klastrów 3D i różnicowanie do komórek wytwarzających insulinę

UWAGA: W 11. dniu różnicowane komórki powinny różnicować się w przodków trzustki. Aby promować różnicowanie dokrewne na tym etapie, komórki przechodzą z kultury płaskiej do kultury 3D.

  1. Dodaj 0,5 mL 5% (w/v) roztworu przeciw przylegającego (zobacz Tabela 1 dla szczegółów) w celu pokrycia dna 24-doku mikrodołka zawierającego odwrócone piramidowe mikrodołki (400 µm średnicy). Wyśrodkuj przez 10 min w 1300 g w temperaturze pokojowej (RT).
    UWAGA: Roztwór przeciw przylegającego tworzy powierzchnię przeciw przylegającą, która uniemożliwia komórkom przyleganie do plastiku i wspomaga jednolite agregację.
  2. Sprawdź mikrodołki pod mikroskopem pod kątem pęcherzyków powietrza i ponownie wyśrodkuj, jeśli konieczne, aby usunąć uwięzione powietrze (Rysunek 2A). Aspiruj roztwór przeciw przylegającego i wypłucz 2x 0,5 mL PBS/dołek. Pozostaw dołki pokryte PBS do momentu użycia.
  3. Wypłucz komórki 1 mL PBS-0,5 mM EDTA, zaabsorbuj PBS-EDTA i pokryj dołki trypsyną (1 mL na dołek 6-doku płytki). Inkubuj w 37 °C przez 8-12 min (do momentu, gdy stukanie powoduje zauważalne oderwanie).
  4. Nie usuwaj trypsyny; zamiast tego, rozcieńcz 2x objętością DMEM-F12 lub PBS i delikatnie zawieś przez pipetowanie. Umieść zawiesinę w stożkowym pojemniku i natychmiast przejdź do następnego kroku.
    UWAGA: Lepiej inkubaować dłużej w trypsynie niż wykonywać brutalnego mechanicznego rozdrabniania.
  5. Wyśrodkuj zawiesinę w 200 g przez 3 min w RT. Delikatnie zaabsorbuj nadstan i ponownie zawieś ulotkę w przegrzanym medium S4 (1,25 mL dla każdego dołka 24-doku mikrodołka).
  6. Zaabsorbuj PBS z mikrodołkowych naczyń. Delikatnie dodaj 1,25 mL zawiesiny komórek do każdego dołka mikrodołkowego.
    UWAGA: Każdy dołek 24-mikrodołkowej płytki zawiera 1200 mikrodołków. Gęstość zasiewu wymagana do uzyskania odpowiednio wielkich klastrów wynosi 1500 komórek na mikrodołek, co odpo

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawione wyniki odpowiadają transplantacji śródmięśniowej wysepek SC na 7. etapie do myszy immunodeficytarnych i analizie przeprowadzonej 6 tygodni po przeszczepie. Analizie poddano ograniczoną liczbę zwierząt z reprezentatywnymi przeszczepami w celu przedstawienia wykonalności procedury. W niniejszym badaniu, sukces określany jest jako makroskopowe odzyskanie śródmięśniowego przeszczepu wraz z potwierdzeniem histologicznym przeżywalności i tożsamości endokrynne przeszczepowanych wys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole opisujemy wmażanie domięśniowe wysp SC jako prostą, powtarzalną i minimalnie inwazyjną metodę dojrzewania in vivo, z potencjalną możliwością oceny funkcjonalnej. Chociaż przeszczepienie pod torebkę nerki jest powszechnie uważane za "złoty standard" do przeszczepiania wysp lub SC-wysp u gryzoni, wymaga większej fachowej wiedzy i dłuższego zabiegu chirurgicznego. W przeciwieństwie do tego, miejsce domięśniowe oferuje prostotę zabiegu i szybką realizację, zgodnie z zasadami ulepszania ram 3R poprzez...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych sporów o interesie do zadeklarowania.

Podziękowania

Dziękujemy Dr. Danwei Huangfu (Memorial Sloan Kettering Cancer Center, New York, USA) za hojne dostarczenie linii hPSC wykorzystanych w tym badaniu. Praca ta była wspierana przez granty PID2021-122284NA-I00 i CNS2023-145179 od Ministerstwa Nauki, Innowacji i Uniwersytetów Hiszpanii MICIU/AEI/10.13039/501100011033 i Next GenerationEU/PRTR (A.B.) oraz przez Konsorcjum CIBER ds. Badań Biomedycznych w Sieci, CB07/08/0029 i PID2023-150719OB-I00 (M.V.), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII). Centrum Badań Biomedycznych nad Cukrzycą i Chorobami Metabolicznymi (CIBERDEM) jest inicjatywą ISCIII i częściowo wspierane przez Europejski Fundusz Rozwoju Regionalnego (FEDER).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium saltSigma Aldrich49752
Activin AQkineQk001
AggreWell 400 24-well (microwell plate)Stemcell34415
BetacellulinGenScriptZ03102
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Fatty Acid FreeGoldbioA-421
CHIR 99021LC labsC-6556 
Chroman-1Medchem ExpressHY-15392CEPT cocktail
CMRL-1066Pan BiotechP04-84600
D-(+)-GlucoseSigma AldrichG7021
Dibenzazepine (DBZ)SyncomCustom productGamma-secretase inhibitor
Dulbecco's Modified Eagle Medium and Ham’s F12 media (DMEM/F12)Corning15383541
EGFQkineQk011
EmricasanMedchem ExpressHY-10396CEPT cocktail
EthanolamineSigma AldrichE9508
FGF2-G3GenScriptCustom product
FGF7GenScriptZ03047
HeparinSigma AldrichH3149
InsulinGibco30284510
L-Alanyl-L-GlutamineLinusX0551-100
L-Ascorbic AcidSanta Cruzsc-202686
LDN-193189 Sigma AldrichSML0559
Lipid ConcentrateGibco11548846
Matrigel (basement membrane-derived extracellular matrix)Falcon354230
MCDB 131Corning15-100-CV
N-acetylcysteineThermo Scientific10521221
NaHCO3Fisher Scientific10553325
NicotinamideSigma AldrichN0636
NRG-1QkineQk045
Pluronic F-127 (anti-adherence solution)Sigma Aldrich82184Used at 5% (w/v)
Polyamine Supplement (1000×)Sigma AldrichP8483CEPT cocktail
RepSoxMedChemExpressHY-13012Alk5 Inhibitor
Retinoic AcidSigma AldrichR2625
SANT-1SelleckchemS7092
Sobetirome (GC1)Sigma AldrichSML1900-5MGCell-permeable T3 analog
Sodium PyruvateCorning25-000-CI
Sodium SeleniteSigma AldrichS5261
T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt)Sigma AldrichT6397
TGF-β1 QkineQk010
TPBTocris5343
Trace Elements ACorning15333641
Trace Elements BCorning15343641
Trans-ISRIBMedchem ExpressHY-12495CEPT cocktail
TransferrinInVitria777TRF029
Triton X-100 (nonionic surfactant)Thermo Scientific11488696
TrypLEGibco11538856
Y-27632LC LaboratoriesY-5301ROCK inhibitor
ZM-447439 MedChemExpressHY-10128
ZnSO4Sigma AldrichZ0251
Antibodies
Rat anti-Human C-peptide (insulin)DSHBGN-ID4-sUsed at 150 ng/mL
Mouse anti-glucagonProteintech67286-1-Ig1:2000
Rabbit anti-somatostatinMilliporeAB54941:500
Goat anti-rat AF488InvitrogenA-110061:500
Donkey anti-mouse AF488InvitrogenA-212021:500
Donkey anti-rabbit AF488InvitrogenA-212061:500

Bibliografia

  1. Ong, K. L., et al. regional, and national burden of diabetes from 1990 to 2021, with projections of prevalence to 2050: A systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. The Lancet. 402 (10397), 203-234 (2021).
  2. Ismail, L., Materwala, H., Al Kaabi, J. Association of risk factors with type 2 diabetes: A systematic review. Comput Struct Biotechnol J. 19, 1759-1785 (2021).
  3. Prasad, M. K., Mohandas, S., Ramkumar, K. M. Dysfunctions, molecular mechanisms, and therapeutic strategies of pancreatic β-cells in diabetes. Apoptosis. 28 (7-8), 958-976 (2023).
  4. Xue, D., et al. Functional interrogation of twenty type 2 diabetes-associated genes using isogenic human embryonic stem cell-derived β-like cells. Cell Metab. 35 (11), 1897-1914.e11 (2023).
  5. Bartolomé, A. Stem cell-derived β cells: A versatile research platform to interrogate the genetic basis of β cell dysfunction. Int J Mol Sci. 23 (1), 501(2022).
  6. Balboa, D., et al. Functional, metabolic and transcriptional maturation of human pancreatic islets derived from stem cells. Nat Biotechnol. 40 (7), 1042-1055 (2022).
  7. Barsby, T., et al. Differentiating functional human islet-like aggregates from pluripotent stem cells. STAR Protoc. 3 (4), 101711(2022).
  8. Shi, Z. -D., et al. Genome editing in hPSCs reveals GATA6 haploinsufficiency and a genetic interaction with GATA4 in human pancreatic development. Cell Stem Cell. 20 (5), 675-688.e6 (2017).
  9. Fantuzzi, F., et al. In depth functional characterization of human induced pluripotent stem cell-derived beta cells in vitro and in vivo. Front Cell Dev Biol. 10, e967765(2022).
  10. Augsornworawat, P., Maxwell, K. G., Velazco-Cruz, L., Millman, J. R. Single-cell transcriptome profiling reveals β cell maturation in stem cell-derived islets after transplantation. Cell Rep. 32 (8), 108850(2020).
  11. Lin, H., et al. Glucose metabolism and regulation in establishing human stem cell-derived β cell maturation. Cell Rep. 44 (7), 115892(2025).
  12. Maxwell, K. G., Kim, M. H., Gale, S. E., Millman, J. R. Differential function and maturation of human stem cell-derived islets after transplantation. Stem Cells Transl Med. 11 (3), 322-331 (2022).
  13. Thévenet, J., Gmyr, V., Delalleau, N., Pattou, F., Kerr-Conte, J. Pancreatic islet transplantation under the kidney capsule of mice: Model of refinement for molecular and ex-vivo graft analysis. Lab Anim. 55 (5), 408-416 (2021).
  14. Scholl, V. G. S., et al. Assessing implantation sites for pancreatic islet cell transplantation: Implications for type 1 diabetes mellitus treatment. Bioengineering. 12 (5), 499(2025).
  15. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), e141553(2021).
  16. Lithovius, V., et al. Non-invasive quantification of stem cell-derived islet graft size and composition. Diabetologia. 67 (9), 1912-1929 (2024).
  17. Lyra-Leite, D. M., Fonoudi, H., Gharib, M., Burridge, P. W. An updated protocol for the cost-effective and weekend-free culture of human induced pluripotent stem cells. STAR Protoc. 2 (1), 100213(2021).
  18. Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nat Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
  19. Wells, S. A., Ellis, G. J., Gunnells, J. C., Schneider, A. B., Sherwood, L. M. Parathyroid autotransplantation in primary parathyroid hyperplasia. N Engl J Med. 295 (2), 57-62 (1976).
  20. Kim, H. -I., Yu, J. E., Park, C. -G., Kim, S. -J. Comparison of four pancreatic islet implantation sites. J Korean Med Sci. 25 (2), 203(2010).
  21. Axen, K. V., Pi-Sunyer, F. X. Long-term reversal of streptozotocin-induced diabetes in rats by intramuscular islet implantation. Transplantation. 31 (6), 439-441 (1981).
  22. Prokhorova, T. A., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells is site dependent and enhanced by the presence of Matrigel. Stem Cells Dev. 18 (1), 47-54 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Pluripotencjalne kom rki macierzystewysepki z kom rek macierzystychterapia kom rkowa w cukrzycymyszy z niedoborem odporno ciinsulinowa sekrecja stymulowana glukozpobieranie przeszczepuprzygotowanie skupiskanaliza histologiczna

Powiązane artykuły