Artykuł metodologiczny

Ustanowienie zmodyfikowanej zakrzepicy zatoki strzałkowej wywołanej chlorkiem żelaza

379 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69563

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  , 
1Department of Neurology, Xuanwu Hospital Capital Medical University, 2Department of Neurosurgery, Xuanwu Hospital Capital Medical University

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejsze badanie przedstawia protokół umożliwiający ustanowienie powtarzalnego, minimalnie inwazyjnego modelu zakrzepicy zatoki strzałkowej górnej u szczura wywołanego chlorkiem żelaza, wykorzystując metodę szu jedwabnego w połączeniu z laserowym obrazowaniem z rozróżnieniem oraz ultrasonografią wysokiej rozdzielczości do oceny.

Streszczenie

Zakrzepica żylna mózgu (CVT) to rzadkie, ale potencjalnie zagrażające życiu zaburzenie neurologiczne. Modele zwierzęce stanowią kluczowe platformy do badania ich patofizjologii i oceny potencjalnych terapii. W niniejszym badaniu przedstawiamy zmodyfikowany model zakrzepicy zatoki strzałkowej (SSS) u szczurów, wykorzystując technikę szu nasączonego FeCl₃. Samce szczurów Sprague-Dawley (220-250 g) przeszły nacięcie przyśrodkowe na skórze głowy i stworzenie 1 cm okna kości czaszkowej nad SSS. W porównaniu do tradycyjnego nacięcia środkowego, to podejście zapobiega zrostom między naciętą skórą, oknem kostnym oraz poddany mięśniem twardym. Dodatkowo unika zakłóceń spowodowanych węzłami szwowymi umieszczonymi nad SSS, poprawiając tym samym jakość obrazowania ultradźwiękowego. Na odsłoniętą zatokę nakładano bezpośrednio na odsłoniętą zatokę szew 2-0 nasączony 40% FeCl3 przez dwa kolejne 5-minutowe odstępy. W porównaniu do tradycyjnej metody papieru FeCl z3 filtrami, ta technika minimalizuje bezpośrednie uszkodzenia chemiczne kory przysagittalnej. Do oceny perfuzji żylnej mózgu przed i po zastosowaniu FeCl3 zastosowano laserowe obrazowanie z kontrastem plamkowym (speckle contrast). Znaczące zmniejszenie przepływu krwi potwierdziło skuteczną zakrzepicę. Siedem dni po operacji formowanie się zakrzepów i zmiany hemodynamiczne zostały ocenione za pomocą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości i przeanalizowane za pomocą oprogramowania Vevo LAB, które dostarczyło danych objętościowych i hemodynamicznych zakrzepa. Ten zmodyfikowany model oferuje powtarzalne, minimalnie inwazyjne i zgodne z obrazowaniem podejście do przedklinicznych badań CVT.

Wprowadzenie

Zakrzepica żylna mózgu (CVT) to szczególny typ choroby naczynia mózgowego, stanowiący 0,5-3% wszystkich udarów i będący ważną przyczyną udaru u młodych dorosłych1. Podstawową zmianą patologiczną tej choroby jest zakrzepica w żyłach oponowych i/lub żyłach mózgowych, która prowadzi do upośledzenia drenażu żylnego mózgu, a następnie do zwiększonego ciśnienia wewnątrzczaszkowego, obrzęku mózgu, zawału żylnego lub krwotoku2. Aby lepiej wyjaśnić jej mechanizmy i ocenić nowe interwencje terapeutyczne, niezbędne są wiarygodne i powtarzalne modele zwierzęce. Biorąc pod uwagę, że zatoka górna strzałkowa (SSS) jest najczęściej dotkniętym miejscem, a jej powierzchowne położenie ułatwia procedury operacyjne 2,3, obecne eksperymenty na zwierzętach wykorzystują głównie model zakrzepicy zatoki strzałkowej górnej (SSST).

Spośród różnych metod modelowania, metoda indukcji chlorkiem żelaza (FeCl3) stała się jedną z najczęściej stosowanych ze względu na swoją prostotę operacyjną i opłacalność4. W tym modelu miejscowe zastosowanie roztworu FeCl3 bezpośrednio uszkadza śródbłonek zatoki żylnej, odsłaniając macierz podśródbłonkową dzięki silnym właściwościom oksydacyjnym. To narażenie aktywuje agregację płytek krwi i kaskadę krzepnięcia, ostatecznie indukując zakrzepicę zatoki żylnej5. Jednak w porównaniu z innymi metodami, tradycyjny model papieru FeCl z3 filtrami ma również kilka wad. Najważniejszym problemem jest to, że właściwości paramagnetyczne i wysoka podatność magnetyczna FeCl3 generują znaczne artefakty podczas obrazowania rezonansem magnetycznym, co poważnie obniża dokładność oceny zakrzepu i obserwacji reanalizacji zatoki żylnej6. Ponadto kształt papieru filtrującego nie pasuje dobrze do SSS, co czyni go podatnym na uszkodzenie mięźmiaszka mózgu otaczającego zatokę. Dlatego trudno jest ustalić, czy uszkodzenie mięźmiaszkowe wokół SSS wynika z samej zakrzepicy, czy z bezpośredniego uszkodzenia chemicznego spowodowanego przez FeCl3.

Głównym celem niniejszej pracy jest opracowanie zmodyfikowanego modelu SSST indukowanego FeCl3, który zmniejsza bezpośrednie uszkodzenia kory spowodowane przez FeCl3 oraz umożliwia ocenę przepływu krwi i wielkości zakrzepa w SSS. Badanie wprowadza podejście paramedialne połączone z techniką szywania nasączonego FeCl3, która minimalizuje bezpośrednie uszkodzenia chemiczne kory spowodowane FeCl3 oraz umożliwia monitorowanie w czasie rzeczywistym, nieinwazyjnego i ilościowego przepływu krwi i powstawania zakrzepów w zatokach żylnych za pomocą ultrasonografii wysokiej rozdzielczości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten został zatwierdzony przez Komitet ds. Eksperymentów na Zwierzętach i Dobrostanu Zwierząt Doświadczalnych Capital Medical University z numerem Zatwierdzenia. AEEI-2025-138. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Ustanowienie zmodyfikowanego modelu SSST szczura indukowanego FeCl3

  1. Do eksperymentu użyj samców szczurów Sprague-Dawley (SD) w wieku 6-7 tygodni, ważących 220-250 g. Przed zabiegiem chirurgicznym przyzwyczaj szczury przez tydzień i wstrzymaj jedzenie przez 12 godzin.
  2. Przygotuj następujące odczynniki, narzędzia i sprzęt: 2% roztwór pentobarbitalu, 40% roztwór FeCl3 , 5% jodona povidonu, 75% alkohol, sól fizjologiczną, maść okulistyczną, jednorazowe żyletki, skalpele, nożyczki chirurgiczne, kleszcze, szwy jedwabne 2-0 i 4-0, igły do cięcia odwrotnego, uchwyty na igły, strzykawki 1 mL i 5 mL, taśmy medyczne, platforma operacyjna dla gryzoni, poduszka grzewcza z sondą temperatury odbytu, oraz mikro ręczną wiertłę czaszkową.
  3. Po ważeniu podaj przedoperacyjne środki przeciwbólowe za pomocą podskórnego zastrzyku buprenorfiny (0,1 mg/kg). Po 15–20 minutowym odstępie znieczulaj szczura, podając dootrzewnowy 2% pentobarbitalu (50 mg/kg) (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). Następnie uszczypnij skórę kończyny tylnej szczypcami, aby potwierdzić brak reakcji odstawienia i bólu.
  4. Nałóż maść okulistyczną i ogol włosy szczura na skórze głowy jednorazową żyletką.
  5. Zabezpiecz szczura w pozycji leżącej na platformie operacyjnej dla gryzoni za pomocą taśm medycznych, utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,2 °C za pomocą poduszki grzewczej, a następnie stale monitoruj temperaturę rdzenia sondą odbytniczą.
  6. Dezynfekuj skórę głowy naprzemiennie podawaniem 5% povidon-jodu, następnie 75% alkoholu i powtarzaj po trzy razy każda.
  7. Wykonaj 15-milimetrowe nacięcie na skórze głowy w kształcie paramedian, a następnie tępo rozcinaj powięzi i okost pod spodem, aby całkowicie odsłonić czaszkę.
  8. Przecieńczaj czaszkę wiertłem czaszkowym aż SSS będzie wyraźnie odsłonięty, zaczynając od lambda i rozciągając się 10 mm do przodu wzdłuż szwu strzałkowego. Stosuj technikę wiercenia przerywanego, aby uniknąć uszkodzenia podłoża twardego i SSS, oraz wielokrotnie nawadniaj wiertło solą fizjologiczną, aby zapobiec uszkodzeniom termicznym kory mózgowej.
  9. Nałóż 10-mm segment szwu 2-0 z jedwabiu nasączonego roztworem 40% FeCl3 na odsłoniętą powierzchnię SSS przez 5 minut, a następnie zamień szew na nowo namoczony segment na kolejne 5 minut.
  10. Przepłucz pole operacyjne 0,5 ml soli fizjologicznej trzy razy, aby usunąć pozostałości FeCl3.
  11. Skórę zamykaj szwami przerwanymi za pomocą szwów jedwabnych 4-0, a następnie dezynfekcję povidonem jodem.
  12. Obserwuj szczura, aż całkowicie się obudzi, a następnie wróć go do klatki.

2. Ocena skutecznego ustanowienia modelu

UWAGA: Podczas zabiegu chirurgicznego LSCI było używane do pomiaru przepływu krwi żylnej w SSS po utworzeniu okna czaszkowego, przed zastosowaniem FeCl3 , a następnie ponownie po aplikacji FeCl3 i płukaniu pola chirurgicznego, ale przed zamknięciem skóry. Model ten jest uznawany za dobrze opracowany, gdy przepływ krwi żylnej w SSS wykazuje znaczne spadki.

  1. Włącz LSCI i odpowiednie oprogramowanie (RFLSI v5.0), a następnie naciśnij przycisk trybu online .
  2. Reguluj wysokość i pozycję instrumentu, aż laser wskaźnikowy zostanie wyśrodkowany w polu widzenia.
  3. Umieść szczura na platformie z pianki i dostosuj pozycję, aż SSS wyrówna się z laserem wskaźnikowym.
  4. Dostosuj powiększenie i ostrość, aż obraz będzie widoczny wyraźnie. Ustaw dolne i górne granice progu pseudokolorów na 10 i 200, aby zoptymalizować wizualny wygląd pseudokolorowego obrazu.
  5. Naciśnij przycisk Ustaw ROI , wybierz narzędzie okrągłe i wyznacz obszar SSS.
  6. Naciśnij przycisk Nagrywaj , aby uzyskać przepływ krwi żylnej i uchwycić zarówno oryginalne, jak i pseudokolorowe obrazy.

3. Ocena powierzchni/objętości zakrzepa oraz zmian hemodynamicznych

UWAGA: Kilka dni do kilku tygodni po zabiegu użyj ultrasonografii wysokiej rozdzielczości do oceny zmian zakrzepów i rekanalizacji naczyniowej.

  1. Przygotuj następujące leki, instrumenty i sprzęt: izofluran, żel ultradźwiękowy, jednorazowe żyletki, taśmy medyczne, aparat do znieczulenia dla małych zwierząt, wysokorozdzielczy system ultrasonografii i obrazowania fotoakustycznego dla małych zwierząt, liniowy przetwornik UHF57x o ultrawysokiej częstotliwości 70 MHz oraz silnik akwizycji 3D.
  2. Zamontuj silnik 3D akwizycji oraz przetwornik UHF57x. Następnie inicjalizuj silnik.
  3. Znieczulaj szczura w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem zmieszanym z 1 L/min tlenu.
  4. Umieść szczura w pozycji leżącej na 37 °C na termostatycznej płycie obrazowej, delikatnie zabezpieczając głowę i kończyny taśmami medycznymi, a następnie utrzymuj znieczulenie 1,5%-2% izofluranem przez stożek nosa.
  5. Ogol włosy na skórze głowy jednorazową żyletką, aby odsłonić obszar detekcji, a następnie nałóż żel USG.
  6. Dostosuj pozycję i orientację szczura względem przetwornika, aż SSS i zakrzep śródświatłowy będą wyraźnie widoczne.
  7. Wykonanie sekwencyjnych obrazów tomograficznych SSS zarówno w płaszczyźnie strzałkowej, jak i koronowej za pomocą obrazowania 3D w trybie B z krokiem 0,04 mm.
  8. Użyj trybu Color Doppler, aby obserwować przepływ krwi w SSS, a następnie zastosuj tryb Dopplerowski z falą impulsową (PW), aby zmierzyć prędkość przepływu krwi.
  9. Odłóż znieczulenie i odłóż szczura do klatki po całkowitym przebudzeniu.
  10. Eksportuj obrazy i analizuj je za pomocą oprogramowania Vevo LAB. Zapisz maksymalne obszary przekroju strzałkowego i koronnego oraz objętość zakrzepa w SSS, a także maksymalną prędkość przepływu krwi w zatoce.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schematyczny diagram zmodyfikowanego modelu SSST indukowanego FeCl3 przedstawiono na Rysunku 1. Wyniki eksperymentalne wykazały, że po zastosowaniu szwu nasyconegoFeCl 3 jedwabiem do SSS, LSCI wykryło istotne zmniejszenie lokalnego przepływu krwi, co wskazuje na skuteczne zatkanie zatoki żylnej i potwierdza wrażliwość LSCI na wykrywanie dynamicznych zmian perfuzji (Rysunek 2). W 7. dniu pooperacyjnym USG u małych zwierząt potwierdziło powst...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

CVT to rzadki, ale potencjalnie zagrażający życiu specyficznytyp choroby naczyniowej 1. Aby dalej zbadać jego mechanizmy patologiczne i opracować skuteczne strategie interwencji, naukowcy opracowali różne modele zwierzęce SSST, głównie w tym podwiązanie lub zamknięcie SSS 7,8,9, iniekcję z substancji protoklawowej10, inkcję do skrzepów krwi autologiczną11, i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82401527).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL strzykawkiShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3020
Szwy jedwabne 2-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,LtdA224
Silnik akwizycji 3DFujifilm VisualSonicshttps://www.visualsonics.com/gallery/extended-3d-motor
Szwy jedwabne 4-0Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,LtdA222
5% jodu povidonuShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/100.html
5 mL strzykawkiShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.21-3023
Jednorazowa żyletkaDongyang Jinmin Trading Co., Ltd.ST300
FeCl3MacklinI811935
Poduszka grzewczaShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.36-0001
IzofluranNauki o życiu z napędem na tylne kołaR510-22-10
System obrazowania laserowego plamkowegoNauki o życiu z napędem na tylne kołaRFLSI III
Przetwornik matrycowy liniowyFujifilm VisualSonicsUHF57x
Taśma medycznaSuzhou Konlida Medical Supplies Co., Ltd.B02
Mikro ręczna wiertła czaszkowaNauki o życiu z napędem na tylne koła78001
Uchwyt na igłyNauki o życiu z napędem na tylne kołaF31025-13
Sól fizjologiczna normalnaShanghai Beyotime Biotechnology Co., Ltd.ST341-500ml
Maść okulistycznaShenzhen Huayon Biotechnology Co., Ltd.19-7223
Druty do cięcia odwrotnegoShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co.,LtdTJ-3-514
Platforma operacyjna dla gryzoniShanghai Yuyan Scientific Instrument Co., Ltd.30150
Ostrze skalpelaNauki o życiu z napędem na tylne kołaS31015-01
Rękojeść skalpelaNauki o życiu z napędem na tylne kołaS32003-12
Aparat do znieczulenia dla małych zwierzątNauki o życiu z napędem na tylne kołaR500
System ultrasonografii i obrazowania fotoakustycznego dla małych zwierzątFujifilm VisualSonicsVevo F2
Gładkie kleszczeNauki o życiu z napędem na tylne kołaF12013-10
Pentobarbital soduSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.P3761
Nożyczki chirurgiczneNauki o życiu z napędem na tylne kołaS14014-10
Ząbkowe kleszczeNauki o życiu z napędem na tylne kołaF12011-13
Żel ultradźwiękowyShandong Lircon Medical Technology Co., Ltd.https://www.lircon.cn/products_details/230.html

Bibliografia

  1. Saposnik, G., et al. Diagnosis and management of cerebral venous thrombosis: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 55 (3), e77-e90 (2024).
  2. Cohen, O., Pegoraro, S., Ageno, W. Cerebral venous thrombosis. Minerva Med. 112 (6), 755-766 (2021).
  3. Li, M., Chen, J., Meng, R., Ji, X. Rhythmic deep-brain magnetic stimulation promotes angiogenesis and inhibits apoptosis by regulating the JAK2/STAT3 pathway in rats with superior sagittal sinus thrombosis. Brain Res. 1852, 149509(2025).
  4. Röttger, C., et al. A new model of reversible sinus sagittalis superior thrombosis in the rat: magnetic resonance imaging changes. Neurosurgery. 57 (3), 573-580 (2005).
  5. Schoenwaelder, S. M., Jackson, S. P. Ferric chloride thrombosis model: unraveling the vascular effects of a highly corrosive oxidant. Blood. 126 (24), 2652-2653 (2015).
  6. Hachenberger, M., et al. Aluminium chloride instead of ferric chloride for inducing superior sagittal sinus thrombosis to reduce ferromagnetic artifacts on MRI imaging in experimental models. Sci Rep. 14 (1), 10998(2024).
  7. Gotoh, M., Ohmoto, T., Kuyama, H. Experimental study of venous circulatory disturbance by dural sinus occlusion. Acta Neurochir (Wien). 124 (2-4), 120-126 (1993).
  8. Mu, S., et al. A novel rat model for cerebral venous sinus thrombosis: verification of similarity to human disease via clinical analysis and experimental validation. J Transl Med. 20 (1), 174(2022).
  9. Fries, G., et al. Occlusion of the pig superior sagittal sinus, bridging and cortical veins: multistep evolution of sinus-vein thrombosis. J Neurosurg. 77 (1), 127-133 (1992).
  10. Wang, J., Ji, X., Ling, F., He, X. Comparison of anticoagulation and thrombolysis treatments in a rat model of superior sagittal sinus thrombosis. Int J Neurosci. 124 (7), 532-541 (2014).
  11. Ye, Y., et al. Impacts on thrombus and chordae Willisii during mechanical thrombectomy in the superior sagittal sinus. Front Neurol. 12, 639018(2021).
  12. Chen, C., et al. Photothrombosis combined with thrombin injection establishes a rat model of cerebral venous sinus thrombosis. Neuroscience. 306, 39-49 (2015).
  13. Rahal, J. P., Malek, A. M., Heilman, C. B. Toward a better model of cerebral venous sinus thrombosis. World Neurosurg. 82 (1-2), 50-53 (2014).
  14. Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
  15. Srivastava, A. K., Kalita, J., Haris, M., Gupta, R. K., Misra, U. K. Radiological and histological changes following cerebral venous sinus thrombosis in a rat model. Neurosci Res. 65 (4), 343-346 (2009).
  16. Wang, W., et al. Establishment of a rat model of superior sagittal-sinus occlusion and recanalization via a thread-embolism method. Neuroscience. 416, 41-49 (2019).
  17. Hachenberger, M., et al. Comparison of edoxaban and enoxaparin in a rat model of AlCl3-induced thrombosis of the superior sagittal sinus. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 396 (12), 3887-3892 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zakrzepica indukowana chlorkiem elazazakrzepica y m zgowiaszczurzy model zakrzepicyobrazowanie laserowy spekleultrad wi ki o wysokiej rozdzielczo citworzenie si zakrzepupomiar przep ywu krwiobrazowanie tr jwymiaroweDoppler impulsowy

Powiązane artykuły