Profilowanie RNA-seq węzłów chłonnych drenażujących i przerzutowych w raku piersi z HER2 dodatnim wskazuje POSTN jako marker prognostyczny

Podsumowanie

Ujawniamy program skoncentrowany na macierzy zewnątrzkomórkowej i PI3K-AKT, który leży u podstaw dystrybucji węzłów chłonnych w raku piersi z HER2 dodatnim i identyfikujemy POSTN jako marker złej rokowania, wspierający stratyfikację ryzyka i strategie terapeutyczne ukierunkowane na szlaki.

Streszczenie

HER2-dodatni rak piersi jest klinicznie agresywny i często rozprzestrzenia się do regionalnych węzłów chłonnych, jednak programy transkryptomiczne związane z rozprzestrzenianiem się węzłów pozostają niedo do końca zdefiniowane. Tutaj sprofilowaliśmy dopasowane węzły chłonne odprowadzające drenaż nowotworowych (TDLN) oraz przerzutowe węzły chłonne związane z guzem (TMLN) u sześciu pacjentek z rakiem piersi HER2-dodatnim za pomocą sekwencjonowania RNA (RNA-seq). Analizę różniczkową wykonano za pomocą DESeq2, stosując korekcję Benjaminiego-Hochberga (FDR < 0,05) oraz absolutny próg zmiany gałdności log2 (|log2FC| ≥ 1). Zidentyfikowaliśmy 237 genów różnicowo ekspresowanych (182 zwykłych i 55 obniżonych w TMLN vs. TDLN). Analizy wzbogacenia funkcjonalnego podkreśliły interakcje macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) z receptorem, sygnalizację PI3K-AKT, adhezję ogniskową oraz metabolizm cholesterolu jako istotne szlaki związane z przerzutowymi węzłami chłonnymi, co sugeruje skoordynowaną remodelację ECM i aktywację sygnalizacji podczas rozprzestrzeniania się węzłów. Wśród najbardziej zwykłych genów, POSTN wyłonił się jako kluczowy kandydat i został dodatkowo powiązany z niekorzystnymi cechami kliniczno-patologicznymi. W kohorcie niezależnej walidacji (n = 120) wyższa ekspresja POSTN była związana z gorszym przeżyciem wolnym od choroby. Łącznie wyniki te nominują POSTN jako potencjalny biomarker prognostyczny i wspierają mechanizmy ECM-centryczne oraz związane z PI3K-AKT jako aktywne cechy biologiczne przerzutów do węzłów chłonnych w raku piersi z HER2-dodatnim.

Wprowadzenie

Rak piersi (BC) jest najczęściej diagnozowanym nowotworem u kobiet i jedną z głównych przyczyn śmiertelności nowotworowej na całym świecie, z istotnym i rosnącym obciążeniem w Chinach¹. Około 15%-20% BC to HER2-dodatnie (HER2+), charakteryzujące się amplifikacją/nadekspresją ERBB2 oraz agresywnym fenotypem o wyższym ryzyku nawrotu i śmierci ^2,3. Chociaż terapia ogólnoustrojowa przeciw HER2 znacznie poprawiła wyniki, znaczna część pacjentów nadal nawraca lub rozwija przerzuty, co podkreśla potrzebę biologicznie uświadomionej stratyfikacji ryzyka i nowych opcji terapeutycznych⁴.

Przerzuty do węzłów chłonnych (LNM) są kluczowym czynnikiem determinującym stadium, wybór leczenia adiuwantowego oraz rokowanie w BC; Zajęcie pachów zapowiada gorsze przeżycie i ułatwia dalsze rozprzestrzenianie się do odległych narządów ^5,6. Jednak solidne biomarkery rejestrujące biologię rozprzestrzeniania się węzłów w chorobie HER2+ pozostają ograniczone, a obecne czynniki kliniczno-patologiczne tylko częściowo wyjaśniają heterogeniczność wyników⁷.

Postępy w RNA-seq umożliwiają profilowanie transkryptomowe o wysokim zakresie dynamicznym i są obecnie szeroko stosowane w onkologii translacyjnej⁸. Jednak większość badań ekspresji w HER2+ BC koncentruje się na pierwotnych guzach lub niesparowanych kohortach, podczas gdy porównawcze profilowanie dopasowanych węzłów chłonnych drenażujących guz (TDLN) i węzłów chłonnych z przerzutami guzowymi (TMLN) jest skąpe, co ogranicza wgląd w programy molekularne leżące u podstaw kolonizacji i progresji węzłów⁹.

Na podstawie klinicznego znaczenia przerzutów do węzłów chłonnych oraz wcześniejszych dowodów wskazujących na remodelację macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) i aktywację PI3K-AKT w przerzutowym zasiewaniu¹⁰, wysunęliśmy hipotezę, że u tego samego pacjenta węzły chłonne z przerzutami nowotworowymi (TMLN) będą wykazywać odrębny program transkryptomiczny w porównaniu z dopasowanymi węzłami chłonnymi drenażującymi guz (TDLN), a podzbiór konsekwentnie zwiększonych genów związanych z ECM będzie powiązany z niekorzystnymi cechami kliniczno-patologicznymi oraz Ryzyko nawrotu. Aby przetestować tę hipotezę, sprofilowaliśmy sparowane TDLN i TMLN u sześciu pacjentów z HER2, aby zidentyfikować geny różnicowo ekspresyjne (DEGs) oraz szlaki związane z rozprzestrzenianiem się węzłów. Następnie priorytetowo określiliśmy POSTN i oceniliśmy jego prognostyczne znaczenie w niezależnej kohorcie, łącząc remodelację ECM i sygnalizację PI3K-AKT z klinicznie użyteczną stratyfikacją ryzyka w raku piersi HER2+. Szczegóły oceny HER2 (zgodnie z ówczesnymi kryteriami ASCO-CAP), sekwencjonowania kontroli jakości, wywołań DEG z kontrolą DESeq2 i Benjamini-Hochberg FDR oraz procedur walidacyjnych znajdują się tutaj^11,12.

Protokół

Badanie to zostało zatwierdzone przez instytucjonalną komisję etyki i przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską oraz lokalnymi przepisami dotyczącymi wykorzystania ludzkich próbek biologicznych. Badanie to zostało zatwierdzone przez komisję etyczną szpitala Boai w Zhongshan (KY-2020-012-124). Przed jakąkolwiek procedurą specyficzną dla badania uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich uczestników.

Kohorty i próbki badań
Kohorta odkrywcza obejmowała parowane tkanki węzłów chłonnych drenażujących guz (TDLN) oraz przerzutowych węzłów chłonnych (TMLN), pobrane wewnątrzoperacyjnie od 6 pacjentek z rakiem piersi HER2-dodatnim. Dla każdego pacjenta dopasowany TDLN został zdefiniowany jako węzeł chłonny drenażujący bez histologicznych dowodów przerzutów i służył jako kontrolny komparator w obrębie pacjenta, podczas gdy TMLN był tkanką przerzutową potwierdzoną patologicznie. Świeże tkanki były krótko płukane w zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), wysuszane, zamrażano na bieżąco w ciekłym azocie w ciągu 30 minut od wycięcia i przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji. Kryteria włączenia obejmowały patologicznie potwierdzony inwazyjny rak piersi, status HER2-dodatni według ASCO/CAP, dostępność parowanych węzłów oraz brak terapii neoadiuwantowej. Kryteria wykluczenia to niewystarczająca integralność tkanki lub RNA (RIN) < 7,0. Jedna początkowo przesiewowa próba nie przeszła kontroli kontroli z powodu RIN < 7,0 i została wykluczona, więc wszystkie analizy odkrywcze konsekwentnie stosują n = 6. Niezależna kohorta walidacyjna obejmowała 120 archiwalnych próbek węzłów chłonnych FFPE z kliniczną kontrolą i była wykorzystywana do analiz qRT-PCR oraz wyników. W modelowaniu prognostycznym pacjentów porównywano według grup ekspresji POSTN (High vs. Low, z punktem przecięcia określonym przez X-tile), przy czym grupa Low pełniła rolę porównawca referencyjnego. Przypadki z brakującymi kontrolami lub niekompletnymi kowarianami zostały wykluczone z modelowania prognostycznego.

Uzasadnienie wielkości próby (Odkrycie i walidacja)
Etap odkrywania wykorzystywał parowany projekt TDLN-TMLN do maksymalizacji kontrastu wewnątrz pacjenta oraz zmniejszenia wariancji między osobami, jednocześnie kontrolując multipliczność przy FDR = 0,05. Dla kohorty walidacyjnej (n = 120) ekspresja POSTN była dychotomizowana w punkcie przecięcia określonym przez X-tile (High/Low = 40/80). Biorąc pod uwagę 48 zdarzeń przeżycia wolnego od choroby (DFS) i α = 0,05, przybliżenie Schoenfelda wskazuje ≥ 80% mocy do wykrywania klinicznie istotnych wskaźników zagrożeń o wartości około HR ≥ 2,3 przy równym przydziałze; jest to zgodne z obserwowanym rozmiarem efektu (HR = 2,31, 95% CI 1,41-3,77).

Definicja pozytywności HER2
Pozytywność HER2 spełniała współczesne kryteria ASCO/CAP ¹³: immunohistochemia (IHC) 3+ zdefiniowana jako jednolite intensywne barwienie błonowe w >10% komórek nowotworowych, lub hybrydyzacja in situ (ISH)-amplifikowana jako stosunek HER2/CEP17 ≥2,0 ze średnią liczbą kopii HER2 ≥4,0 sygnałów na komórkę. Wyniki IHC 2+ przeszły odruchowe ISH z zaślepionym przeliczeniem ≥20 inwazyjnych komórek nowotworowych w celu potwierdzenia statusu amplifikacji.

Przetwarzanie tkankowe i izolacja RNA
Wszystkie procedury wykonywano na lodzie, chyba że zakreślono inaczej, z użyciem produktów zużywalnych bez RNazy. Dla każdej próbki z ≤ 100 mg tkanki przeprowadzono homogenizację w 1 mL kwasowego odczynnika guanidinium-tiocyanian-fenol-chloroform (AGPC), następnie dodano 200 μL chloroformu z 15 sekundami intensywnego mieszania i inkubacją w temperaturze pokojowej trwającej 2-3 minuty. Separację fazową osiągnięto poprzez wirowanie w 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Warstwa wodna została następnie przeniesiona do świeżej rurki, a RNA wytrącono z 500 μL izopropanolu po 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Granulowanie zakończono w 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Pellet był myty 1 mL etanolu 75% i wirowany w 7 500 x g przez 5 minut w 4 °C, suszony na powietrzu przez 5-10 minut i rozpuszczany w wodzie wolnej od RNazy. W przypadku podejrzeń o przeniesienie DNA DNA z genomu stosowano trawienie DNazy I na kolumnie. Punkty kontrolne wizualne obejmowały wyraźne rozdzielenie fazowe po ekstrakcji chloroformu oraz nienaruszony przezroczysty pellet po wytrąceniu izopropanolów. Rozwiązywanie problemów obejmowało powtarzanie płukania etanolem przy niskich proporcjach A260/230 oraz wydłużenie opadów lub zapewnienie chłodzenia podczas peletowania przy niskich plonach.

Kontrola jakości RNA
Ilościowość wykorzystywała spektrofotometrię do monitorowania A260/280 i A260/230 z celami na poziomie około 1,8-2,1, uzupełnioną pomiarem fluorometrycznym dla dokładności. Integralność oceniano na mikrofluidycznej elektroforezie i wymagała RIN ≥ 7,0. Jako kryteria akceptacji zastosowano wyraźne szczyty rRNA 18S/28S oraz brak genomowego rozmazu DNA; próbki z progiem nie spełniały progów zostały ponownie wyodrębnione lub wykluczone.

Przygotowanie do biblioteki
Biblioteki mRNA z warstwami były konstruowane z selekcją poli(A) dla nienaruszonego RNA, natomiast wyczerpanie rRNA było dozwolone dla częściowo zdegradowanych wejść. Typowe dane wejściowe wynosiły ≥ 1 μg całkowitego RNA na bibliotekę. Fragmentacja przeprowadzono w temperaturze około 94 °C przez 8 minut; synteza cDNA pierwszej nici w temperaturze 50 °C przez 50 minut; synteza drugiej nici w 16 °C przez 60 minut; ligacja adaptera w 20 °C przez 15 minut; a amplifikacja PCR wykorzystywała 10-12 cykli korygowanych, aby uniknąć nadmiernego wzmocnienia. Czyszczenie wykorzystywało proporcje kulek w okolicach 0,8x-1,0x, a oczekiwany rozkład wielkości biblioteki wynosił 300 bp, wliczając adaptery. Jakość biblioteki została zweryfikowana za pomocą elektroforezy mikrofluidycznej; Zanieczyszczenie adapter-dimer wymagało surowszego sprzątania, a zbyt szerokie rozkłady rozmiarów zostały skorygowane przez umiarkowanie skracające fragmentację.

Sekwencjonowanie
Biblioteki indeksowane były sekwencjonowane w trybie parowanym 150 bp (PE150), z celem 30 milionów par odczytów na bibliotekę. Jakość na poziomie biegu wymagała Q30 ≥ 90% oraz stabilnych gęstości klastrów przy minimalnym biasie linii. Biblioteki były losowo rozmieszczone na różnych pasach, aby ograniczyć efekty wsadowe, oraz rejestrowały dokumentację przydziałów pasów i wszelkie kontrolne mechanizmy nadzoru krzyżowego zanieczyszczenia.

Analiza obliczeniowa i ekspresja różniczkowa
Analizy przeprowadzono w języku R (wersja 4.3.2) na Linuksie. Jakość odczytu surowego została oceniona za pomocą FastQC (wersja 0.11.9). Przycinanie adapterów i jakości wykonywano za pomocą fastp (v0.23.4) z wykorzystą automatycznego wykrywania adaptera, przycinania okien przesuwanych (rozmiar okna 4 bp; średnia wartość Phred Q ≥ 20), minimalnej długości odczytu 50 bp oraz przycinania poly-G w przypadku wykrycia odpowiednich chemii. Odczyty były wyrównane z genomem referencyjnym GRCh37/hg19 przy użyciu HISAT2 (v2.2.1) z odpowiednimi dla biblioteki parametrami nici i znanymi indeksami miejsc spajania. Liczenia na poziomie genów były generowane za pomocą featureCounts (Subread v2.0.3) względem GENCODE v19, używając liczenia parowanych końców, obsługi odczytu chimery, ustawień wielomapowych oraz poprawnej flagi niania. Geny o niskiej liczbie były filtrowane, wymagając liczby ≥ 10 w co najmniej trzech próbkach. Analiza różniczkowa (DE) została przeprowadzona przy użyciu DESeq2 (v1.40.2) w ramach projektu parowanego (projekt = ~ para + warunek), aby porównać TMLN z TDLN, z domyślną normalizacją współczynnika wielkości i log2 skurczeniem się fali za pomocą apeglm. Potencjalne odchylenia oceniano na podstawie odległości Cooka. Wielorakość w całym transkryptomie była kontrolowana za pomocą wskaźnika fałszywego wykrywania Benjamini-Hochberga (FDR). Istotność została zdefiniowana jako FDR < 0,05 oraz absolutny próg zmiany warstwy log2 (|log2FC|) ≥ 1. Ujemno-binomowe ramy DESeq2 zapewniają odpowiednie modelowanie średniej wariancji dla danych liczeniowych oraz stabilizują szacunki zmiany fałd w kohortach małych i umiarkowanych. Jako analizy czułości ponownie przeprowadziliśmy testy DE za pomocą edgeR i limma-voom z tymi samymi kryteriami filtrowania i progami FDR, co dało zgodne sygnały najwyższej klasyfikacji, wspierające odporność głównych wyborów analiz.

Funkcjonalne wzbogacenie (GO i KEGG)
Adnotacje funkcjonalne były wykonywane w R za pomocą clusterProfiler (v4.8.3). Wskaźniki DEG o regulacji w górę i w dół były analizowane oddzielnie. Identyfikatory genów zostały przypisane do identyfikatorów genu Entrez (organizm: Homo sapiens) przed wzbogaceniem. Wzbogacanie ontologii genów (GO) przeprowadzono za pomocą enrichGO (OrgDb: org. Hs.eg.db; ont = BP/CC/MF; pAdjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05), a wzbogacenie szlaku KEGG przeprowadzono za pomocą enrichKEGG (organizm = "has"; pAdjustMethod = "BH"; pvalueCutoff = 0,05; qvalueCutoff = 0,05). Wszechświat tła został zdefiniowany jako wszystkie ekspresowane geny zachowane po filtrowaniu przy niskiej liczbie w analizie DE. Dodatkowo filtrowano wzbogacone terminy, aby zachować zestawy genów z 10-500 adnotowanymi genami (minGSSize = 10; maxGSSize = 500). Wizualizacje zostały wygenerowane za pomocą ggplot2 (v3.5.1) i ComplexHeatmap (v2.16.1), w tym wykresy skalarne stosunku genów i wartości -log10 (skorygowane P); termin "szlaki odpowiedzi immunologicznej" odnosi się do starannie wyselekcjonowanych modułów GO obejmujących przetwarzanie i prezentację antygenów, sygnalizację interferonową oraz aktywację limfocytów.

Zewnętrzna baza danych
Geny kandydatów były badane w zewnętrznych źródłach, aby uzyskać kontekst ortogonalny. Badanie ekspresji mRNA w stosunku do normy w GEPIA2 (v2.0) z próbkami guza inwazyjnego raka piersi TCGA (TCGA-BRCA) porównano z prawidłowymi tkankami piersi (GTEx/TCGA normalne, w miarę dostępności). Wartości ekspresji raportowane przez GEPIA2 (log2[TPM+1]) oraz jej domyślne ramy testowe statystyczne do porównań grupowych zostały użyte do generowania wykresów pudełkowych i wartości P dla każdego zapytania. Lokalizację na poziomie białka oceniano za pomocą Human Protein Atlas (HPA) poprzez przegląd obrazów immunohistochemicznych i adnotacji z Tissue Atlas i Pathology Atlas dla tkanki piersi/nowotworu oraz rejestrowanie zgłaszanej intensywności barwienia i przedziału komórkowego (np. stromal vs epitel), gdy były dostępne.

Walidacja qRT-PCR
Niezależne tkanki węzłów chłonnych były przetwarzane w sposób powyższy w celu wyodrębnienia całkowitego RNA, a cDNA zostało zsyntetyzowane z 1 μg RNA w reakcjach odwrotnej transkrypcji 20 μL. Ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) przeprowadzono przy użyciu chemii opartej na SYBR, przy czym każda reakcja zawierała 1x mieszankę główną oraz 0,2-0,4 μM każdego startera. Specyficzność primerów została potwierdzona profilami krzywej stopień z pojedynczym szczytem, a efektywność amplifikacji oceniono za pomocą standardowych krzywych serii rozcieńczeń, z akceptowalną efektywnością zdefiniowaną na poziomie 90%-110%. Każda próbka była badana w technicznym trójegzemplarzu; replikacje musiały spełnić próg cyklowy (Ct) SD ≤ 0,3. Ekspresja genów została znormalizowana do GAPDH (lub innego zweryfikowanego genu referencyjnego, jeśli dotyczy), a ekspresję względną obliczono metodą 2^-ΔΔCt. Normalność oceniano za pomocą testów Shapiro-Wilka; porównania międzygrupowe wykorzystywały dwustronne testy t dla danych przybliżonych normalnych lub testy Mann-Whitney U w przeciwnym przypadku.

Analiza prognostyczna w kohorcie walidacyjnej
Przeżycie bez choroby (DFS) było głównym punktem końcowym i było obliczane od daty operacji do pierwszego udokumentowanego nawrotu lub ostatniej kontroli (ocenzurowanej). W analizie podstawowej ekspresja POSTN była dychotomizowana w punkcie przecięcia określonym przez X-tile (High vs Low = 40/80); analizy czułości wykorzystywały alternatywne punkty cięcia, takie jak tertyle. Do porównań jednozmiennych stosowano krzywe Kaplana-Meiera oraz testy logaritmowej rangi. Wielowymiarowe modele ryzyka proporcjonalnego Coxa zostały dostosowane do oszacowania wskaźników ryzyka (HR) i 95% przedziałów ufności, z góry korygując o wiek, wielkość guza, status węzłów, stopień histologiczny oraz status receptorów. Założenie ryzyka proporcjonalnego oceniano na podstawie reszt Schoenfelda, kolineariczność za pomocą czynników wariancji-inflacji, a wpływowe obserwacje oceniono za pomocą dfbeta. Kompletne analizy przypadków przeprowadzono po wykluczeniu przypadków z brakującymi badaniami obserwacyjnymi lub niepełnymi współwariacjami, jak opisano powyżej.

Ogólne statystyki i raportowanie
O ile nie zaznaczono inaczej, dane są podsumowywane jako średnia ± SD lub medianie (IQR), stosuje się testy dwustronne, a p < 0,05 jest uznawane za statystycznie istotne. W analizach i wzbogacaniu całego transkryptomu multipliczność jest kontrolowana za pomocą BH-FDR, a rozmiary efektów są uzupełniane 95% przedziałami ufności, gdy to możliwe.

Bezpieczeństwo i utylizacja odpadów
Odczynniki fenol-guanidyniowe oraz rozpuszczalniki organiczne były obsługiwane w certyfikowanym okapie oparniowym z fartuchami laboratoryjnymi, rękawicami nitrylowymi i ochroną przed rozbryzgnięciem. Odpady organiczne i halogenowane były segregowane do oznaczonych pojemników i utylizowane zgodnie z polityką instytucjonalną. Odpady biologiczne były autoklawowane lub chemicznie dezynfekowane przed utylizacją, a powierzchnie i narzędzia dekontaminowano roztworami inaktywującymi RNazy. Specyficzne dla odczynników zagrożenia, takie jak żrąca i toksyczność, były dokumentowane w laboratoryjnych SOP i obserwowane podczas wszystkich procedur.

Wyniki

Kohorty i cechy kliniczno-patologiczne
Kohorta odkrywcza składała się z 6 par próbek TDLN/TIMLN, a kohorta walidacyjna obejmowała 120 archiwalnych próbek węzłów chłonnych z podłużną kontrolą. Podstawowe cechy klinicznopatologiczne obu kohort, w tym wiek, wielkość guza, stopień zanieczyszczenia, status receptorów oraz stan węzłów, są podsumowane w Tabeli 1.

Jakość sekwencjonowania i globalna struktura danych
Wszystkie 12 bibliotek odkrywc...

Dyskusja

Rak piersi z HER2 charakteryzuje się zwiększoną inwazyjną inwazją, częstymi przerzutami do węzłów chłonnych (LNM) oraz gorszymi wynikami pomimo nowoczesnej terapii systemowej¹⁵. Konwencjonalne czynniki kliniczno-patologiczne tylko częściowo wyjaśniają rokowanie w tym podtypie, pozostawiając lukę dla biologicznie ugruntowanych markerów, które uwzględniają ryzyko rozprzestrzeniania się węzłów¹⁶. Poprzez porównawcze profilowanie dopasowanych węzłów chłonnych drenażują...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bioanalizator	2100-BA	Agilent, USA	Sprzęt do oceny integralności RNA i kontroli jakości.
DESeq2	Nie ma	R Bioconductor	Oprogramowanie do analizy ekspresji różniczkowej dla danych RNA-seq.
Oprogramowanie FastQC	Nie ma	Babraham Bioinformatics	Oprogramowanie do kontroli jakości danych RNA-seq do oceny jakości sekwencji.
Linia komórkowa HEK293	ATCC-CRL-1573	ATCC, USA	Ludzka embrionalna linia komórkowa nerek wykorzystywana do eksperymentów transfekcyjnych.
Zestaw qRT-PCR	4385616	ThermoFisher, USA	Ilościowy zestaw PCR do walidacji ekspresji genów.
Zestaw do ekstrakcji RNA	74204	Qiagen, Niemcy	Zestaw do ekstrakcji RNA używany do izolacji wysokiej jakości RNA z próbek tkanek.
Zestaw do sekwencjonowania RNA	RS-122-2001	Illumina, USA	Zestaw do przygotowania biblioteki RNA do sekwencjonowania próbek RNA.
Platforma sekwencjonowania	NovaSeq 6000	Illumina, USA	Platforma sekwencjonowania RNA o wysokiej przepustowości do sekwencjonowania bibliotek RNA.
Sprzęt do zamrażania tkanek	TFE-300	Thermo Fisher, USA	Sprzęt do zamrażania próbek tkanek w ciekłym azocie.
Termometr bębenkowy	55678-TT	ThermoScience, Japonia	Dokładny termometr używany do pomiaru temperatury ciała.