Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Standaryzacja modelu intraluminalnego zakrzepu MCA u szczurów: Szczegółowy protokół z środkami kontroli jakości

121 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69573

⸱

7 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Xuanwu Hospital, Capital Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół pokazuje zoptymalizowaną 60-minutową technikę zamknięcia środkowej tętnicy mózgowej (MCAO) u szczurów. Protokół został zweryfikowany za pomocą multimodalnych podejść, osiągając 87,5% sukcesu przy minimalnej śmiertelności i dając wyniki udaru o wysokiej powtarzalności w zakresie zmian zawałowych i zachowań.

Streszczenie

Model zapalenia tętnicy środkowej mózgu u szczurów (MCAO) pozostaje standardem referencyjnym w wyjaśnianiu patofizjologii udaru niedokrwiennego i walidacji terapii neuroprotekcyjnych. Subtelne odchylenia chirurgiczne mogą jednak znacząco zmieniać objętość zawału i wyniki behawioralne. Stosując ramy „wizualizuj-następnie uporządkuj”, ponownie zbadaliśmy każdy krok ustanawiania i walidacji modelu. Przeprowadzono szczegółowe zdjęciowe dokumentowanie kluczowych punktów chirurgicznych i krytycznych kroków, aby standaryzować orientację anatomiczną i umiejscowienie włókna. Barwienie chlorkiem 2,3,5-trifenylotetrazolium (TTC) zostało zastosowane do precyzyjnego odwzorowania objętości i topologii zawałów po 24 h i 72 h po reperfuzji. Deficyty neurologiczne oceniano za pomocą skal Zea-Longa, Bedersona i zmodyfikowanej Garcii. Dwadzieścia cztery samce szczurów Sprague-Dawley przeszły 60-minutowe przemijające MCAO; objętość zawału i wyniki neurologiczne oceniono po 24 h i 72 h. Około 87,50% zwierząt osiągnęło pomyślne zablokowanie przepływu krwi do mózgu (Zea-Longa ≤ 1 i jednoznaczne zawały określone przez TTC), przy ogólnej śmiertelności 12,50%, co świadczy o wysokiej wierności modelu. Ten standaryzowany protokół zapewnia technicznie dopracowaną, powtarzalną podstawę do przedklinicznych badań nad udarem, ułatwiając spójność między laboratoriami w badaniach nad patofizjologią udaru i interwencjami terapeutycznymi.

Wprowadzenie

Udar jest drugą przyczyną zgonów i trzecią przyczyną niepełnosprawności na świecie1,2. Udar z otoczenia krążenia dotyka nieproporcjonalnie kraje o niskich i średnich dochodach, gdzie występuje średnio 15 lat wcześniej niż w krajach o wysokich dochodach1. Dwa główne typy to udar niedokrwienny (85%) i krwotok śródmózgowy (15%)3. Udar niedokrwienny, odpowiadający za przeważającą większość udarow, wynika z zablokowania przepływu krwi w mózgu, prowadząc do śmierci komórek i zawału mózgu4. Kaskadowość niedokrwienia obejmuje wiele biochemicznych zdarzeń, w tym znaczące procesy prooksydacyjne5,6.

Mimo rozległych wysiłków przedklinicznych i klinicznych, tylko niewiele terapii—głównie trombolityczna terapia dożylna z aktywatorem plazminogenu tkankowego i mechaniczna trombektomia—okazały się skuteczne, a te leki są ograniczone przez wąskie okna terapeutyczne i rygorystyczne kryteria doboru pacjentów. W konsekwencji, istnieje pilna potrzeba wyjaśnienia mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw urazu niedokrwienia, naprawy neuronaczyniowej i powrotu do zdrowia po udarze. Do osiągnięcia tego celu niezbędny jest odpowiedni model zwierzęcy o znaczeniu klinicznym.

Model okluzji tętnicy mózgowej środkowej (MCAO) jest szeroko stosowany do badania udaru niedokrwiennego u gryzoni7,8. Metoda okluzji filamentu śródnaczyniowego jest jedną z najklasyczniejszych i najczęściej stosowanych technik MCAO9. Ta technika pozwala na modelowanie zarówno trwałych, jak i przejściowych okluzji bez konieczności kraniektomii. Nowsza technika przezudowowa z wykorzystaniem przewodów endowazalnych wykazała obiecujące rezultaty w wywoływaniu przejściowych MCAO u szczurów, oferując bardziej spójne wyniki10. Ten model polega na zablokowaniu tętnicy mózgowej środkowej, zazwyczaj za pomocą techniki filamentu śródnaczyniowego11. MCAO powoduje ogniskową hipoperfuzję mózgu, prowadząc do urazu niedokrwienia i reperfuzji12.

Chociaż MCAO jest cenny w badaniu patofizjologii udaru i potencjalnych terapii, może powodować różne objętości uszkodzeń7. Dlatego ulepszenia modelu MCAO—takie jak udoskonalenie technik reperfuzji, ustanowienie znormalizowanych protokołów operacyjnych i opracowanie zjednoczonych kryteriów oceny—mogą zmniejszyć zmienność w lokalizacji i objętości zawału, zwiększając tym samym przydatność tego modelu w badaniach nad udarem niedokrwiennym.

Ten protokół wymaga krzywej uczenia się około 10–15 operacji, aby osiągnąć spójne wyniki13. Stopień sukcesu może się różnić w zależności od doświadczenia operatora i rasy szczurów14. Model jest odpowiedni do badania ostrego udaru niedokrwiennego, ale może nie całkowicie odzwierciedlać ludzkie choroby współistniejące, takie jak nadciśnienie tętnicze czy cukrzyca15. W związku z tym postanowiliśmy opracować i rygorystycznie zweryfikować zoptymalizowany protokół MCAO, który ma na celu zmniejszenie zmienności eksperymentalnej poprzez standaryzowane procedury i rygorystyczne środki kontroli jakości. Cztery uzupełniające się innowacje zostały zintegrowane, aby osiągnąć podwójne korzyści w standaryzacji i rzetelności danych: (1) Ocena podłużna w dwóch punktach czasowych—punkty z łusek Zea-Longa, Bederson i zmodyfikowanej skali Garcii były uzyskiwane równolegle z objętościami zawału pochodzącymi z 2,3,5-Trifenylotetrazolu (TTC) w 24 i 72 godziny po reperfuzji, określając zależność czasową między ustępowaniem obrzęku a odzyskiem czynności; (2) Trójstopniowa kalibracja krzyżowa—ocena z zastosowaniem ślepo przeprowadzonej oceny przez dwóch badaczy z zintegrowaną kalibracją trzech łusek znacznie zwiększyła czułość i precyzję oceny behawioralnej; (3) Całkowita hipotermiczna szybka sekcja—zestawowy standardowy protokół operacyjny (SOP) "90-sekundowa ekstrakta lodowa z następującym jednostopniowym cięciem koronalnym o grubości 2 mm w wyprężonych formach" został ustalony w celu minimalizowania autolizy i błędów ludzkich, zapewniając wysoką wierność pomiarów objętości; (4) Zintegrowana struktura kontroli jakości—opracowano kompleksowy SOP obejmujący przedoperacyjne posty, kontrolę głębokości znieczulenia, kontrolę termoregulacji przedoperacyjnej i zapobieganie współzakażeniom w celu zapewnienia powtarzalnego i łatwo przenoszonego standardowego protokołu operacyjnego MCAO, kładąc solidne podstawy pod jednolitymi wynikami międzylaboratoryjnymi i porównywalnością międzybadań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperyment został zatwierdzony i nadzorowany przez Instytucjonalny Komitet ds. Doświadczeń na Zwierzętach i Opieki nad Zwierzętami Eksperymentalnymi Uniwersytetu Medycznego w Stolicy. Wszystkie protokoły były zgodne z Wytycznymi NIH ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (NIH Publ. 80-23, 1996 rev.), a wymagane były sterylne sprzęty i techniki aseptyczne.

1. Selekcja zwierząt

  1. Wykorzystaj samce szczurów Sprague-Dawley (w wieku 6–8 tygodni, ważących 240–270 g) uzyskanych od certyfikowanego dostawcy zwierząt laboratoryjnych (Numer licencji SCXK (Pekin) 2021-0011), aby utworzyć model MCAO.
  2. Umieść zwierzęta w konwencjonalnym środowisku z wolnym dostępem do pokarmu i wody; wszystkie procedury przestrzegano Międzynarodowego Kodeksu Etycznego.
  3. Wykorzystaj następujące kryteria oparte na wadze ciała zwierząt do wyboru wielkości nici w celu zapewnienia spójnego zwężenia:
    - 220–250 g: 0.33–0.35 mm średnicy
    - 250–280 g: 0.35–0.38 mm średnicy
    - 280–310 g: 0.38–0.40 mm średnicy
    UWAGA: Te specyfikacje uwzględniają wiek-związane zwiększenie średnicy naczyń i zmniejszają wystąpienie SAH lub niepełnego zwężenia13.

2. Wielkość próby

  1. Oblicz wielkość próby za pomocą oprogramowania do obliczania wielkości próby. Na podstawie wstępnych danych pokazujących oczekiwany objętość zawału 35% ± 10% (średnia ± SD) w grupie MCAO versus 0% ± 2% w grupie SHAM, oszacuj wielkość efektu (Cohen's d). Dla dwustronnego testu Manna-Whitneya U (nieparametryczna alternatywa dla testu t), przy α = 0.05 i mocy (1-β) = 0.80, oblicz minimalną wielkość próby.
    UWAGA: Wielkość efektu oszacowano na 3,5, a minimalna wielkość próby wynosiła 6 zwierząt na grupę.
  2. Aby uwzględnić przewidywaną śmiertelność (12,5%) i stopę wykluczenia (5–10%), włącz 24 szczury do grupy MCAO i 6 szczurów do grupy SHAM, zapewniając odpowiednią moc (>0,90) dla głównego punktu końcowego (objętość zawału po 24 h).

3. Kryteria włączenia i wykluczenia

  1. Uwzględnij zwierzęta, jeśli spełniają następujące kryteria: (1) samce szczurów Sprague-Dawley, 240–270 g, w wieku 6–8 tygodni; (2) brak wcześniejszych niedoborów neurologicznych (przedoperacyjny wynik neurologiczny = 0); (3) pomyślne wdrożenie znieczulenia bez powikłań.
  2. Wyklucz zwierzęta z analizy, jeśli wykazywały: (1) krwotok podpajęczynówkowy (SAH) widoczny w sekcji zwłok; (2) przedwczesna śmierć (<24 h po reperfuzji) niezwiązana z interwencją eksperymentalną; (3) nieudane zwężenie (wynik neurologiczny = 0 i brak zawału zdefiniowanego przez TTC); (4) techniczne niepowodzenie chirurgiczne (np. pęknięcie CCA).
    UWAGA: Te kryteria zostały wstępnie określone przed rozpoczęciem badania, aby zminimalizować zniekształcenie selekcyjne.
  3. Zasady dotyczące wymiany zwierząt: Zastępuj tylko zwierzęta wykluczone z powodu technicznego niepowodzenia chirurgicznego lub śmierci w trakcie operacji, aby zachować statystyczną moc. Nie zastępuj zwierząt z nieudaną modelizacją (nieudane zwężenie), ale raportuj je jako część obliczenia współczynnika sukcesu, aby uniknąć sztucznego zmniejszenia zmienności.

4. Przygotowania przed zabiegiem

  1. Przygotuj narzędzia sterylizowane w autoklawie, sterylną nic i sterylne pole wokół operacji.
  2. Nie jest wymagane rutynowe wygłodzenie; jeśli konieczne, ogranicz czas postu do 2–4 h. Wprowadź znieczulenie za pomocą izofluranu (3–4%) i podtrzymuj je na poziomie 1,5–2% w 30–40% O₂ podczas zabiegu. Potwierdź głębokość znieczulenia przez utratę odruchu prawidłowej pozycji ciała i szczypnięcie palca.
  3. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 ± 0,5 °C za pomocą podgrzewacza z regulacją zwrotną i monitorowaniem temperatury rektalnej.
  4. Ogol szyję i skórę głowy, a następnie wyczyść obszar piaskową jodową, a następnie 70% alkoholem.
  5. Podaj buprenorfinę (0,05 mg/kg, podskórnie) 30 min przed zabiegiem i co 12 h pooperacyjnie przez 48 h lub meloxicam (1 mg/kg, podskórnie) raz dziennie przez 3 dni16. Oceniaj ból poprzez monitorowanie zachowań czyszczenia, postawy i spontanicznej aktywności; zapewnij dodatkową analgezję, jeśli ut

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Zwierzęta zostały losowo przydzielone do grup przeżycia 24 h (n = 10) lub 72 h (n = 10) po reperfuzji w celu końcowego barwienia TTC. Dodatkowe 4 szczury przeszły zabieg MCAO, lecz padły przed planowanym punktem końcowym (wskaźnik śmiertelności 12,5%). Grupa SHAM składała się z n = 6 osobników. Zatem całkowita liczba użytych zwierząt wyniosła 30 (24 MCAO + 6 SHAM).

Szczury poddano 60-minutowej MCAO w celu wywołania niedokrwienia mózgu (Rysunek 1). Reperfuzję rozpo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Ważne jest, aby wyjaśnić, że głównym celem tego badania była standardyzacja metodologiczna, a nie odkrycie biologiczne. Opracowanie zstandaryzowanego protokołu MCAO jest niezbędne do zmniejszenia różnic międzylaboratoryjnych i poprawy odtwarzalności w badaniach nad udarem mózgu. Protokół ten poprawia przejrzystość postępowania poprzez rygorystyczne środki kontroli jakości i rozwiązuje typowe niedociągnięcia techniczne w modelowaniu MCAO, w tym standaryzowane wprowadzanie filamentu, regulację temperatury i przetwarzanie h...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca ta była wspierana przez Fundację Nauki Przyrodniczej w Pekinie (nr 7232269) oraz Fundusz Rozwoju Nauki i Technologii Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Pekinie (nr JJ-2023-93).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2% TTC staining solutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.T817025 g/bottle, ≥98 % purity
4% PFABeijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.P1110500 mL ready-to-use
Absorbable sutureShandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd.VCP345H5-0 Vicryl
Adson forcepsShanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.JD-110101×2 teeth, 12 cm
Dumont curved forcepsShanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.JD-1105211 cm length, 0.05 mm fine tip
Feedback heating padShenzhen Reward Life Science & Technology Co., Ltd.6900137 ± 0.3 °C closed loop
ImageJNational Institutes of Healthversion 1.53k
Iris scissorsShanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.JD-14060Curved tip, 10 cm
Micro-vascular clipsShenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.JD-160101.5 cm curved clip
Non-absorbable silkShanghai Pudong Jin-Huan Medical Products Co., Ltd.S-23046-0 Black silk thread
PASS software NCSS, LLC, Kaysville, UT, USAversion 15.0 Sample size calculation software 
Rat brain matrixShenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.686102 mm coronal slots
Silicone-coated nylon filamentShenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.60-12500.35 mm OD, 30 mm silicone tip, EO-sterile
Small-animal anesthesia machineShenzhen Ruiwode Lift Technology Co.,Ltd.R500IEIsoflurane vaporizer, induction chamber & mask included
SPSSIBM Corp., Armonk, NY, USAversion 26.0 Statistical analysis software
Vannas micro-scissorsShanghai Jinzhong Surgical Instrument Co., Ltd.JD-14058Curved tip, 8 cm

Bibliografia

  1. Walter, J., Oyere, O., Mayowa, O., Sonal, S. Stroke: a global response is needed. Bull World Health Organ. 94 (9), 1816-1834 (2016).
  2. Mira, K., Andreas, L. Global burden of stroke. Semin Neurol. 38 (2), 1649-2211 (2018).
  3. Stephen, J. M., David, J. W. Stroke: causes and clinical features. Medicine (Abingdon). 48 (9), 1561-1566 (2020).
  4. Narayanaswamy, V. Ischemic stroke: new insights from risk factors, mechanisms and outcomes. J Cardiovasc Dev Dis. 10 (12), 472(2023).
  5. Chao, L., Tao, S., Chen, J. Recent advances in nanomedicines for the treatment of ischemic stroke. Acta Pharm Sin B. 11 (7), 1767-1788 (2021).
  6. Marcelo, F., Leonardo, E. V., Brigitta, B., Elisabetta, P., Luciano, S. The nrf2 pathway in ischemic stroke: a review. Molecules. 26 (16), 5001(2021).
  7. Melissa, T. -L., Claire, L. G. A review of experimental models of focal cerebral ischemia focusing on the middle cerebral artery occlusion model. F1000Res. 10, 51752(2021).
  8. Lang, Z., et al. Animal models of ischemic stroke with different forms of middle cerebral artery occlusion. Brain Sci. 13 (7), 1007(2023).
  9. Rosalia, C., Rosanna, D. P., Emanuela, E., Salvatore, C. Middle cerebral artery occlusion by an intraluminal suture method. Methods Mol Biol. 1727, 1393-1401 (2018).
  10. Afshin, A. D., et al. Transfemoral approach to induce transient middle cerebral artery occlusion in rats: the use of commercially available endovascular wires. Neurocrit Care. 32 (2), 575-585 (2020).
  11. Seunghoon, L., et al. Middle cerebral artery occlusion methods in rat versus mouse models of transient focal cerebral ischemic stroke. Neural Regen Res. 9 (7), 1315-1318 (2014).
  12. Kitti, T., Nipon, C., Siripron, C. C. The effects of hyperbaric oxygen therapy on the brain with middle cerebral artery occlusion. J Cell Physiol. 236 (3), 21677-21694 (2021).
  13. Gary, P. M., et al. A comparative study of variables influencing ischemic injury in the longa and koizumi methods of intraluminal filament middle cerebral artery occlusion in mice. PLoS One. 11 (2), e0148503(2016).
  14. J, S., et al. Strain differences in intraluminal thread model of middle cerebral artery occlusion in rats. Physiol Res. 68 (1), 933937-933948 (2019).
  15. Chang, L., Xiaoqing, W., Yueru, Z., Songli, Y., Xiangshi, T. Study on the efficacy and pharmacological mechanism of innate immune sting pathway regulators in the treatment of ischemic brain injury. Pharmaceuticals. 18 (12), 1775(2025).
  16. Pei-Kang, L., et al. Neuroprotective effects of low-dose G-CSF plus meloxicam in a rat model of anterior ischemic optic neuropathy. Sci Rep. 10 (1), 66977(2020).
  17. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 1184-1191 (1989).
  18. Bederson, J. B., et al. Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination. Stroke. 17 (3), 1472-1476 (1986).
  19. David, W. H., et al. Different strokes for different folks: the rich diversity of animal models of focal cerebral ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (8), 1412-1431 (2010).
  20. Kudret, T., Raghu, V., Kurt, A. S., Robert, J. D. Ideal suture diameter is critical for consistent middle cerebral artery occlusion in mice. Neurosurgery. 56 (1 Suppl), 196-200 (2005).
  21. Ilya, L. G., et al. MRI guiding of the middle cerebral artery occlusion in rats aimed to improve stroke modeling. Transl Stroke Res. 9 (4), 12417-12425 (2018).
  22. Nathalie, P. D. S., et al. The IMPROVE guidelines (Ischaemia models: procedural refinements of in vivo experiments). J Cereb Blood Flow Metab. 37 (11), 17703488-17703517 (2017).
  23. Chintamani, N. J., Swatantra, K. J., Puvvada, S. R. M. An optimized triphenyltetrazolium chloride method for identification of cerebral infarcts. Brain Res Protoc. 13 (1), 1011-1017 (2004).
  24. Huaxin, S., Lihong, D., Xuan, L., Zhong, Y., Wei, Y. A modified transcranial middle cerebral artery occlusion model to study stroke outcomes in aged mice. J Vis Exp. (195), e65345(2023).
  25. Maria, S., et al. Modified middle cerebral artery occlusion model provides detailed intraoperative cerebral blood flow registration and improves neurobehavioral evaluation. J Neurosci Methods. 358, 109179(2021).
  26. Clemens, J. S. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathol. 133 (2), 245-261 (2017).
  27. Bharti, M., Louise, D. M. Sexual dimorphism in ischemic stroke: lessons from the laboratory. Womens Health (Lond). 7 (3), 2222-2239 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

NeuronaukaWydanie 234Wydanie 234Ten miesi c w JoVEWydanieS owa kluczowe udar niedokrwiennyzamkni cie t tnicy rodkowej m zgureperfuzjafilament wewn trzrzekowyszew wewn trzrzekowy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.