Wpływ polisacharydów Cordyceps na starzenie nerek wywołane przez D-galaktozę

Podsumowanie

Model starzenia został opracowany u myszy i komórek HK-2 z użyciem D-galaktozy. Wpływ polisacharydów Cordyceps (CCP) na starzenie nerek oceniono za pomocą western blottingu i immunofluorescencji, a zmiany mitochondrialne oceniano za pomocą wykrywania reaktywnych form tlenu i barwienia JC-1.

Streszczenie

Przewlekła choroba nerek (PCH) stanowi poważne globalne zagrożenie zdrowotne. Starzenie się komórek nabłonkowych nerek (RTEC) zaburza regenerację i naprawę nerek oraz sprzyja postępowi CKD poprzez uwalnianie fenotypu wydzielniczego związanego ze starzeniem (SASP). Cordyceps sinensis, którego kluczowymi bioaktywnymi składnikami są polisacharydy Cordyceps (CCP), jest włączony do wielu klinicznych preparatów CKD i wykazuje korzyści terapeutyczne. Aby zbadać rolę CCP w starzeniu się nerek, u myszy opracowano model starzenia nerek indukowany D-galaktozą, z CCP jako interwencją. Wyniki leczenia oceniano za pomocą barwienia związanego ze starzeniem oraz oceny funkcji nerek. Model starzenia indukowany D-galaktozą w komórkach HK-2 został dodatkowo opracowany do badania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw. Do oceny zmian mitochondrialnych po leczeniu CCP w warunkach senescentyjnych zastosowano barwienie JC-1 oraz reaktywne gatunki tlenu (ROS). Przeprowadzono immunofluorescencję, western bloting oraz ilościowe PCR (RT-PCR), aby ocenić wpływ CCP na fosforylację MAP, translokację jądrową NF-κB oraz aktywację inflammasomu NLRP3. Wyniki pokazują, że CCP tłumi starzenie komórek tubulointerstycjalnych, uszkodzenie nerek oraz włóknienie, jednocześnie poprawiając funkcję mitochondriów zarówno w modelach komórkowych, jak i zwierzęcych starzenia wywołanego przez D-galaktozę. Efekty te są związane z modulacją szlaku sygnalizacyjnego ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3.

Wprowadzenie

Przewlekła choroba nerek (CKD) jest jednym z najczęstszych schorzeń nerek i dotyka dużą populację na całym świecie. Jej występowanie jest ściśle związane ze starzeniem^{się 1}. Kanaliki nerekowe są podstawowymi jednostkami funkcjonalnymi nerek, a starzenie komórkowe w komórkach nabłonkowych nerek (RTEC) jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do spadku funkcji nerek². Narażenie na leki i inne stresory mogą wywoływać starzenie związane ze stresem rurkowo-rurkowym, prowadząc do postępującej utraty funkcji nerek i ostatecznego przejścia do końcowego stadium choroby nerek (ESKD). Dlatego celowanie w starzenie się w RTEC może być skuteczną strategią opóźnienia starzenia nerek oraz zapobiegania lub leczenia CKD.

Przewlekłe zapalenie jest cechą charakterystyczną starzenia^{się 3} i ważnym czynnikiem napędzającym wiele chorób związanych z wiekiem. Prozapalne cytokiny uwalniane przez komórki starzejące się są łącznie znane jako fenotyp wydzielniowy związany ze stareniem (SASP)⁴. SASP sprzyja długotrwałemu zapaleniu, indukuje starzenie się w sąsiednich komórkach i przyczynia się do postępującego spadku funkcji⁵. Model starzenia indukowanego D-galaktozą (D-gal) jest jednym z najczęściej stosowanych eksperymentalnych modeli starzenia. Wcześniejsze badania wykazały, że leczenie D-gal prowadzi do wewnątrzkomórkowego nagromadzenia reaktywnych rodzajów tlenu (ROS), dysfunkcji mitochondrialnych, zakłócenia homeostazy redoksowej oraz indukcji starzenia komórkowego związanego ze stresem⁶. W porównaniu z naturalnymi modelami starzenia, które są czasochłonne i wykazują dużą zmienność międzyosobową, model indukowany D-galaktozą oferuje zalety, takie jak prostota, szybka indukcja oraz stosunkowo niska zmienność wewnątrzgrupowa. Model ten jest stosowany zarówno w badaniach in vivo, jak i in vitro. Chociaż nie odtwarza w pełni powolnego, wolnego od patologii naturalnego starzenia, jest dobrze przystosowany do modelowania starzenia nerek, biorąc pod uwagę wysoką aktywność metaboliczną nerek oraz podatność nerek na stres oksydacyjny. Z mechanistycznego punktu widzenia D-galaktoza sprzyja starzeniu komórkowemu głównie poprzez stres oksydacyjny, co jest zgodne z badaniami skupiającymi się na generowaniu ROS i dysfunkcji mitochondriów podczas starzenia.

Cordyceps sinensis to tradycyjny chiński grzyb leczniczy, szeroko stosowany w leczeniu chorób związanych z nerkami⁷. Zawiera wiele składników bioaktywnych, w tym polisacharydy, adenozynę, aminokwasy, kordycepinę i ergosterol. Ekstrakty i fermentowane preparaty Cordyceps sinensis wykazują właściwości przeciwzapalne, antyoksydacyjne i przeciwstarzeniowe 8,9,10,11. Na przykład wykazano, że polisacharydy Cordyceps zmniejszają infiltrację zapalną w modelu myszy astmowej poprzez hamowanie szlaku sygnalizacyjnego TGF-β1/Smad¹². Ponadto polisacharydy Cordyceps mogą hamować fosforylację szlaku MAPK i zmniejszać ekspresję cytokin zapalnych, takich jak IL-6 i IL-1β, w komórkach RAW264.7¹³. Wcześniejsze badania wykazały, że polisacharydy Cordyceps (CCP), główny bioaktywny składnik Cordyceps sinensis, mogą hamować starzenie się w komórkach nabłonka rurkowego nerek poprzez regulację autofagii i hamowanie produkcji SASP. Jednak mechanizmy molekularne, dzięki którym CCP przeciwdziała uszkodzeniom wywołanym przez ROS, pozostają niedokładnie scharakteryzowane.

Niniejsze badanie bada ochronne działanie CCP przeciwko starzeniu się nerek u myszy oraz analizuje jego wpływ na stan zapalny, stres oksydacyjny i starzenie się, wykorzystując model starzenia się komórek nabłonkowych nerek indukowany przez D-galaktozę. Dalej badamy, czy CCP moduluje produkcję ROS, funkcję mitochondrialną oraz dalsze szlaki sygnalizacyjne, w tym fosforylację MAP, translokację jądra NF-κB oraz aktywację inflammasomu NLRP3. Wspólnie praca ta ma na celu dostarczenie dowodów eksperymentalnych wspierających zastosowanie CCP w badaniach starzenia nerek i uszkodzenia nerek związanych z wiekiem. Cały proces eksperymentalny i proponowany mechanizm podsumowano na Rysunku 1.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycyny Chińskiej w Nankinie (Etyczne Zatwierdzenie nr 202108A006). Wszystkie odpady powstałe podczas hodowli komórek i barwienia były zbierane w szczelnie zamkniętych pojemnikach i workach na zagrożenia biologiczne i utylizowane przez licencjonowaną usługę zarządzania odpadami medycznymi.

Model zwierzęcy i interwencje terapeutyczne

Aby zminimalizować zmienność międzyosobnikową, 40 myszy zostało losowo przydzielonych do pięciu grup (n = 8 na grupę) i poddanych następującym interwencjom: (1) Grupa kontrolna: Otrzymano dobrzuchowe podawanie 0,2 mL soli fizjologicznej na mysz; (2) Grupa modelowa: Otrzymywano codziennie podskórne zastrzyki D-galaktozy (250 mg/kg), podawane jako 0,2 mL roztworu 25 mg/mL na mysz; (3) Grupa z niską dawką CCP: Otrzymano zastrzyki z D-galaktozy połączone z podaniem CCP w żołądku w dawce 50 mg/kg (0,2 mL roztworu 5 mg/mL na mysz); (4) Grupa z wysokimi dawkami CCP: Otrzymali zastrzyki z D-galaktozy połączone z podaniem CCP dożłołkowo w dawce 100 mg/kg (0,2 mL roztworu 10 mg/mL na mysz); (5) Grupa witaminy E: Otrzymali zastrzyki z D-galaktozy połączone z podaniem witaminy E w żołądku w dawce 100 mg/kg (0,2 mL roztworu 10 mg/mL na mysz). Po 8 tygodniach leczenia myszy zostały uśpione, a następnie pobrano próbki surowic, moczu i tkanek nerek do kolejnych analiz.

Analiza funkcji nerek

Funkcję nerek oceniano za pomocą komercyjnych zestawów testowych do pomiaru kreatyniny, kwasu moczowego i białka moczu zgodnie z instrukcjami producenta. Wartości absorpcji zmierzono na 505 nm dla kreatyniny, 510 nm dla kwasu moczowego oraz 585 nm dla białka moczu za pomocą wielofunkcyjnego czytnika mikropłyt.

Barwienie przekroju tkanki

Tkanki nerkowe z parafiną zostały przecięte przy grubości 4 μm. Sekcje zostały deparafinizowane, inkubowane hematoksyliną przez 5 minut, płukane bieżącą wodą, rozróżnione za pomocą 1% alkoholu kwasowego przez 5 sekund i ponownie płukane. Po 1-minutowym płukaniu solą fosforanową (PBS) przekroje były kontrumaowane eozyną przez 3 minuty, odwodnione i montowane. W przypadku barwienia trójchromowego Massona sekcje zostały odparafinizowane i barwione hematoksyliną, jak opisano powyżej, następnie Ponceau S przez 5 minut i aniline blue przez 5 minut. Następnie sekcje były odwodnione i montowane.

Badanie żywotności komórki

Komórki HK-2 zostały zasiane na płytkach 12-dołkowych w ilości 1 × 10⁵ komórek na dołek. Po 24-godzinnej ekspozycji na polisacharydy D-galaktozy i Cordyceps do każdego dołku¹⁴ dodano roztwór CCK-8. Po inkubacji w 37 °C przez 30 minut odnotowano absorpcję na poziomie 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt. Dokumentacja kontroli jakości polisacharydów Cordyceps oraz uwierzytelnianie STR komórek HK-2 znajduje się w Pliku Uzupełniającym 1.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy odwrotnej transkrypcji

Po 24 godzinach hodowli komórkowej usunięto podłoże, a całkowite RNA wyodrębniono za pomocą odczynnika ekstrakcyjnego. Stężenie RNA zmierzono za pomocą spektrofotometru mikropłytowego, a integralność RNA zweryfikowano za pomocą elektroforezy żelu agarozowego o stężeniu 2%. Usunięto DNA genomowe, a cDNA zostało zsyntetyzowane przez transkrypcję odwrotną. Sekwencje primerów są wymienione w Tabeli Materiałów.

Pomiar poziomów ROS wewnątrzkomórkowych

Komórki HK-2 zostały zasiadzone do płytek 12-dołkowych w ilości 1 × 10⁵ komórek na dołek. Po osiągnięciu 60-70% zbiegu komórek poddawano przedzabiegowi D-galaktozy przez 12 godzin. Po 24 godzinach ekspozycji na lek podłoże zostało odrzucone, a komórki raz przepłukane PBS. ROS wewnątrzkomórkowy wykryto poprzez inkubację fluorescencyjną sondą wrażliwą na ROS w temperaturze 37 °C przez 20 minut, a obrazy fluorescencyjne wykonano przy falach wzbudzona/emisji 488/525 nm¹⁵.

Western blot

Białka komórkowe były lizowane za pomocą buforu RIPA i oczyszczane przez wirowanie w 13 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Białka były denaturowane przez gotowanie przez 10 minut, a równe ilości białka (20 μg na próbkę) poddawano separacji elektroforetycznej i przekazywano do membran PVDF. Po blokowaniu przez 1 godzinę membrany były inkubowane przez noc z przeciwciałami pierwotnymi. Kolejne płukania PBST były następowane inkubacją z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP, a detekcja przeprowadzono przy użyciu podłoża¹⁶ o zwiększonej chemiluminescencji (ECL). Szczegóły dotyczące przeciwciał i identyfikatory odczynników są wymienione w Tabeli Materiałów.

Zabarwienie SA-β-gal starzenia

Komórki HK-2 były powlekiwane w płytkach 12-dołkowych o gęstości 1 × 10⁵ komórek na dołek. Gdy komórki osiągały 60-70% zbiegu, były wcześniej traktowane D-galaktozą przez 12 godzin. Barwienie SA-β-galon przeprowadzono zgodnie z protokołem producenta, a barwione komórki obserwowano za pomocą mikroskopu^{optycznego 17}.

Pomiar potencjału błony mitochondrialnej

Potencjał błony mitochondrialnej oceniono za pomocą sondy fluorescencyjnej JC-1 zgodnie z instrukcjami dostawcy. Monomery JC-1 wykryto przy falach wzbudzenia/emisji 490/530 nm, natomiast agregaty JC-1 wykryto przy 525/590 nm. Obrazy uzyskano przy obserwowaniu wyraźnych sygnałów fluorescencji czerwonej lub zielonej.

Analiza statystyczna

Dane prezentowano jako wykresy krorowe lub słupkowe i analizowano za pomocą przypisanego oprogramowania. Intensywności pasm zachodnich blot były ilościowo określane za pomocą ImageJ. Dane analizowano za pomocą analizy wariancji (ANOVA) oraz kolejnych testów t dla porównań między grupami. Istotność statystyczna została zdefiniowana jako wartość P < 0,05. Symbole wskazują porównania z grupą kontrolną (*) lub grupą D-gal (#) (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

Wyniki

D-galaktoza została użyta do ustanowienia modelu starzenia się myszy, przy czym witamina E pełniła rolę powszechnie stosowanej pozytywnej kontroli przeciwstarzeniowej. Myszy starzejące się podano, podawano różne dawki polisacharydów Cordyceps (CCP). Starsze myszy wykazywały istotne uszkodzenie nerek, co potwierdzały zwiększone poziomy białka moczu, surowicy kwasu moczowego i kreatyniny (Rysunek 2B-D). Zarówno suplementacja witaminą E, jak i CCP łagodziła te nieprawidłowości....

Dyskusja

Badanie to wykazuje ochronne działanie polisacharydów Cordyceps na komórki nabłonka rurkowatego nerek i dostarcza dowodów na to, że tłumią one starzenie zapalne w komórkach HK-2 poprzez modulację szlaku sygnalizacyjnego ROS/MAPK/NF-κB/NLRP3. Wyniki te dodatkowo wyjaśniają potencjalne mechanizmy leżące u podstaw działania związków pochodzących od Cordyceps sinenesis w leczeniu ostrych i przewlekłych chorób nerek oraz stanowią referencję do przyszłych badań nad strategiami terapii ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Casepase1/PAb Rozciętego Królika	WL03450	Wanlei, Shengyang, Chiny
Zestaw CCK-8	C0037	Biyotime, Szanghaj, Chiny
KPCh	B21296	Yuanye Bio, Shengyang, Chiny
Zestaw do testu kreatyniny	C011-2-1	Jiancheng, Nankin, Chiny
D-gal	HY-N0210	MCE, USA
ERK Rabbit pAb	4695	CST, USA	AB_390779
gapdh Rabbit pAb	ac033	Abclonal, Wuhan, Chiny
Zestaw do bejcowania H & E	G1120	Solarbio, Pekin, Chiny
Zestaw JC-1	C2003S	Biyotime, Szanghaj, Chiny
Zestaw do bejcowania Massona	G1340	Solarbio, Pekin, Chiny
NLRP3 Rabbit pAb	WLH3383	Wanlei, Shengyang, Chiny
P21 Rabbit pAb	64016	CST, USA	AB_2892063
p38 Rabbit pAb	9212	CST, USA	AB_330713
p50 Rabbit pAb	3035	CST, USA	AB_330564
p65 Rabbit pAb	8242	CST, USA	AB_10859369
p-ERK Rabbit pAb	4370	CST, USA	AB_2315112
Phospho-SAPK/JNK mPrzeciwciało	4668	CST, USA	AB_823588
p-p38 Rabbit pAb	4511	CST, USA	AB_2139682
Zestaw do barwienia ROS	S0033S	Biyotime, Szanghaj, Chiny
Przeciwciało SAPK/JNK	9256	CST, USA	AB_2250373
SA-β-gal Kit	C0602	Biyotime, Szanghaj, Chiny
Zestaw do testu kwasu moczowego	C012-2-1	Jiancheng, Nankin, Chiny
Zestaw do wykrywania białek moczowych	C035-2-1	Jiancheng, Nankin, Chiny
Witamina E	S27812	Yuanye Bio, Shengyang, Chiny
Primer do PCR
Nazwa genu	Przedni zapłon	Odwrócony podkład
Kaspaza-1	5'-TACAGACAAGGGTGCTGAACAA-3'	5'-CGGAATAACGGAGTCAATCAAA-3'
GAPDH	5'-AGAAGGTGGTGAAGCAGGCGTC-3'	5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGTGTGTCG-3'
NLRP3	5'-GATCTTCGCTGCGATCAACAG-3'	5'-CGTGCATTATCTGAACCCCAC-3'