Platforma punktowa do jednoczesnego wykrywania tripplex PCR zakażeń Chikungunya, dengą i wirusem Zika

Summary

W artykule zaleca się w pełni zautomatyzowany, zintegrowany system wykorzystujący technologię potrójnej PCR do jednoczesnego diagnozowania współzakażeń wirusem Chikungunya, dengi i wirusa Zika na podstawie jednej próbki, co optymalizuje efektywność testów w laboratoriach klinicznych i podstawowej opieki zdrowotnej.

Abstract

Gorączka Chikungunya (CHIKF), ostra choroba wirusowa przenoszona przez komary i po raz pierwszy odkryta w Tanzanii w 1952 roku, wykazuje przerywane rozprzestrzenianie się w Chinach, z rosnącą liczbą lokalnych epidemii. Do lipca 2025 roku prowincja Guangdong, obecnie centrum ogniska, zgłosiła 4 824 lokalne przypadki, w tym prawie 3 000 nowych zakażeń w ciągu zaledwie jednego tygodnia. Ten szybki wzrost stwarza pilną potrzebę zaawansowanych technologii diagnostycznych. Takie narzędzia są kluczowe dla wsparcia działań na pierwszej linii walki z ograniczeniem walki. Proponujemy rozwiązanie umożliwiające szybkie jednoczesne wykrywanie zakażeń dengą (DENV), chikungunya (CHIKV) oraz wirusem Zika (ZIKV), aby zwiększyć możliwości wczesnej zapobiegawczości i kontroli epidemii. Podejście to polega na opracowaniu dostosowanych protokołów testowych dla przejściów granicznych i placówek podstawowej opieki zdrowotnej.

Tradycyjne metody diagnostyczne CHIKV i DENV często nie wykazują czułości ani specyficzności w przypadkach współzakażeń. Ponieważ CHIKV, DENV i ZIKV mają podobne wzorce transmisji i objawy, jednoczesne monitorowanie jest kluczowe. Protokół ten przedstawia metodę tripleksową qPCR z wykorzystaniem sond TaqMan do wykrywania tych arbowirusów w pojedynczej tubie w ciągu 90 minut. W porównaniu z posiewami wirusowymi i testami serologicznymi, metoda ta zwiększa efektywność poprzez identyfikację aktywnych infekcji i współinfekcji z wysoką specyficznością, jednocześnie upraszczając przepływ pracy i eliminując wymagania specjalistycznego sprzętu.

Walidacja za pomocą próbek klinicznych i zewnętrznych metod oceny jakości (EQA) potwierdziła 100% zgodność z złotym standardem testów singleplex. Ta metoda jest skutecznym narzędziem monitorowania gorączek gorączkowych w regionach endemicznych, szczególnie w warunkach o ograniczonych zasobach, gdzie szybkie opanowanie epidemii jest kluczowe.

Introduction

Gorączka Chikungunya (CHIKF) to coraz powszechniejsza choroba arbowirusowa, głównie przenoszona przez wektory komarów Aedes aegypti i Aedes albopictus. Charakteryzując się nawracającymi ogniskami w regionach tropikalnych, choroba ta klinicznie objawia się jako ostra gorączkowa choroba, często towarzysząca silnemu bólowi stawów i utrzymującemu się artretyzmie¹. Na dzień 26 lipca łączna liczba laboratoryjnie potwierdzonych przypadków chikungunya w mieście Foshan osiągnęła 4 824, z czego imponujące 87,2% przypadków miało miejsce w dystrykcie Shunde. To wyraźne koncentrowanie geograficzne nakłada znaczne obciążenie na regionalną infrastrukturę zdrowia publicznego i skutkuje znacznymi kosztami opieki zdrowotnej, a także szerszymi wyzwaniami makroekonomicznymi².

W kontekście coraz częściej nakładającego się obiegu wirusów CHIKV, DENV i ZIKV obecne metody diagnostyczne napotykają trzy główne ograniczenia. Po pierwsze, testy serologiczne nie są w stanie wyróżnić ostrych infekcji ze względu na długotrwałe utrzymywanie się przeciwciał po wylaszeniu wirusa¹. Po drugie, techniki hodowli wirusowej wykazują niskie wskaźniki wrażliwości i wymagają kilku dni, co utrudnia terminowe podejmowanie decyzji klinicznych. Po trzecie, chociaż ilościowe testy PCR wykazują wysoką swoistość (przekraczającą 95%), nie mogą wykryć współzakażeń w jednej reakcji, co jest istotną wadą biorąc pod uwagę zgłaszany wskaźnik współzakażeń CHIKV-DENV na poziomie 12,8% w Indiach³. Monitorowanie filogenetyczne wskazuje na zmianę paradygmatu. Linia ECSA, która dominowała podczas epidemii w Indiach w latach 2019-2022, nabyła zbieżne mutacje w białkach otocznicowych: E1-A226V (zwiększająca zakażenie komarów) oraz E2-K252Q (związana z unikiem immunizmu). Te mutacje spowodowały powstanie genotypu o udokumentowanej wyższej zjadliwości, co odnotowano w najnowszych badaniach nadzoru z Kerali i Maharasztry³. Równocześnie Chiny borykają się z wyzwaniami związane z importem genotypu ECSA, udokumentowanym podczas epidemii w Yunnanie, oraz innymi genotypami, przy czym transmisja autochtonna odnotowano w wielu prowincjach, w tym w Yunnanie⁴.

Te realia tworzą pilne, ograniczone zasoby potrzeby (i) diagnostyki różnicowej pomimo nakładających się objawów klinicznych⁵, (ii) testów diagnostycznych eliminujących złożoność instrumentacji zwykle wymaganej przez konwencjonalną ilościową PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)⁶ oraz (iii) kompleksową walidację nowych technologii punktu opieki punktowej, w tym RT-LAMP i metod opartych na CRISPR⁵. Aby sprostać tym wyzwaniom diagnostycznym, proponujemy szybki test potrójny PCR z wykorzystaniem w pełni zautomatyzowanego, zintegrowanego systemu, umożliwiającego jednoczesne wykrywanie CHIKV, DENV i ZIKV w jednej reakcji. Zweryfikowaliśmy wydajność naszego testu tripplex qPCR poprzez bezpośrednie porównanie z ugruntowanymi testami singleplex⁵, które służyły jako standard odniesienia. Poniższe sekcje szczegółowo opisują procedury zarówno dla testu triplex, jak i referencyjnych testów singleplex. Analiza porównawcza wyników obu metod została przedstawiona w sekcji Reprezentatywne Wyniki.

Protocol

Niniejsze badanie jest zgodne z wytycznymi etycznymi ustanowionymi przez Komitet Etyki Szpitala Ludowego Prowincji Guangdong, Południowego Uniwersytetu Medycznego w Kantonie, Chiny (nr zatwierdzenia: KY2025-510-01). Szczegółowe informacje dotyczące materiałów używanych w tych badaniach (odczynniki, chemikalia, sprzęt i oprogramowanie) można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Wybór uczestników

1. Wybierz uczestników w wieku od 18 do 60 lat.
2. Wybierz uczestników, którzy zgłaszają się z ostrą gorączką (T pachowy ≥ 38 °C) w ciągu 12 dni od pojawienia się objawów, a także z wysypką, artralgią lub chłoniakiem szyjkowym oraz niedawnymi podróżami do obszarów endemicznych chikungunya; lub osoby bezobjawowe z identyczną historią podróży.
3. Wyłączenie: stosowanie leków przeciwdrobnoustrojowych/przeciwwirusowych w ciągu 7 dni lub gorączkowa choroba spowodowana potwierdzonym HIV lub nowotworem.

2. Zbieranie i przetwarzanie próbek

1. Sprawdź, czy zewnętrzne opakowanie pudełka próbek nie jest uszkodzone i nie przeterminowane, a następnie usuń materiały wewnętrzne.
2. Ustaw obiekt z wyprostowanym ramieniem. Zidentyfikuj żyłę środkową w kości łokciowej, załóż opaską uciskową i zdezynfekuj miejsce nakłucia żyłą za pomocą wymazu alkoholowego z 70% stężenia.
3. Pobierz 1~3 mL krwi z żyły przedkubitalnej badanej za pomocą probówki do pobierania krwi wolnej od antykoagulantów.
4. Delikatnie odwróć rurkę 5-8 razy i pozwól jej skrzepnąć w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
5. Wirówka krwi w 4 °C, 1000 x g w wirówce, przez 10 minut. Próbkę surowicy pobraną po wirowaniu można natychmiast przebadać.
6. Ostrożnie aliquotuj surowicę supernatantową do sterylnych rurek mikrowirówek. Użyj surowicy natychmiast do testów lub przechowuj alikwoty w temperaturze -80 °C do czasu dalszej analizy patogenu kwasów nukleinowych za pomocą qPCR.

3. Automatyczne wykrywanie triplex qPCR dla CHIKV, DENV i ZIKV

1. Przygotowanie odczynników i probówki
   1. Wyciągnij wszystkie potrzebne odczynniki ze składu i rozmroz je w temperaturze pokojowej.
   2. Wizualnie sprawdź każdą szczelną rurę wykrywającą TD pod kątem uszkodzeń lub awarii uszczelnienia. Wyrzuć wszelkie uszkodzone rurki.
   3. Krótko przeprowadzić przez 5 sekund bufor ekstrakcji kwasu nukleinowego TD, aby zapewnić jednorodność.
   4. Aseptycznie wylej 500 μL ujednoliconego buforu do rurki z odczynnikiem do ekstrakcji TD (zawierającej fioletowe, liofilizowane kulki magnetyczne).
   5. Wiruj mieszankę energicznie przez 30 sekund, aż wszystkie składniki całkowicie się rozpuszczą, a kulki zostaną całkowicie zawieszone.
   6. Przelej cały zrekonstytuowany roztwór do wcześniej oznaczonej rurki wykrywającej TD.
2. Ładowanie próbek
   1. Pipeta 200 μL przezroczystej, niehemolizowanej i nielipemicznej surowicy do przygotowanej probówki wykrywającej TD.
   2. Szczelnie uszczelnij tubkę i odwróć ją dziesięć razy, aby wymieszać się jednorodnie.
      UWAGA: Podczas inwersji pozwól warstwie parafiny na krótko unosić się w tubie. To normalna część procesu.
3. Obsługa instrumentów i akwizycja danych
   1. Umieść szczelnie zamknięte rurki detekcyjne do wyznaczonych otworów analizatora.
   2. Na ekranie dotykowym wprowadź dane identyfikacyjne próbki.
   3. NaciśnijS Tart Detection , aby uruchomić w pełni zautomatyzowany workflow z zamkniętymi tubami.
      UWAGA: System automatycznie wykonuje skanowanie kodów kreskowych, ekstrakcję kwasów nukleinowych za pomocą magnetycznego przechwytywania kulek magnetycznych oraz wzmacnianie fluorescencji PCR bez dalszej ingerencji użytkownika. Standardowy program obejmuje etap denaturacji w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, po którym następuje 40 cykli wzmacniania.
4. Interpretacja wyników
   1. Po zakończeniu testu obserwuj wyniki wzmacniania dla wszystkich trzech celów (CHIKV, DENV, ZIKV) oraz wewnętrzną kontrolę na tym samym ekranie.
   2. Zapisz automatycznie wygenerowany odczyt "Dodatni", "Ujemny" lub "Nieprawidłowy" dla każdego patogenu docelowego w jego odpowiednim kanale fluorescencji.
      UWAGA: Wewnętrzne oprogramowanie systemu używa progu cyklu (Ct) 37,0 do automatycznej interpretacji. Nie jest wymagana ręczna analiza danych.

4. Referencyjne testy qPCR Singleplex do porównania metod

1. Przygotowanie odczynników do ekstrakcji kwasów nukleinowych
   1. Wyjmij gotową 96-dołkową płytkę z zestawu. Delikatnie stuknij w płytę z 96 dołkami, aby odczynniki i kulki magnetyczne skoncentrowały się na dnie płyty z 96 dołkami. Ostrożnie zerwij folię uszczelniającą folię aluminiową, unikając drgań płyty z 96 dołkami, aby zapobiec wytryskowi cieczy.
   2. W kolumnach 1 i 7 płytki 96-dołkowej najpierw dodaje się 20 μL proteinazy K, a następnie 200~300 μL próbki do pobrania.
   3. Automatyczna ekstrakcja kwasów nukleinowych (metoda oparta na kulkach magnetycznych)
      1. Gotowe 96-dołkowe płytki (z próbkami) umieszcza się w odpowiednich szczelinach zautomatyzowanego systemu ekstraktora kwasów nukleinowych.
      2. Proces ekstrakcji kwasów nukleinowych wygląda następująco: Adsorbacja magnetycznych kulek związanych z kwasem nukleinowym za pomocą pręta magnetycznego wewnątrz komory laboratoryjnej. Przenieś kompleks kulek do następnego wyznaczonego otworu odczynnikowego. Aktywuj urządzenie mieszające, aby dokładnie wymieszać płyn z magnetycznymi kulkami poprzez szybkie i powtarzane mieszanie. Pozwól automatycznemu ekstraktorowi kwasów nukleinowych wykonać następujące kroki automatycznie: i) Liza komórek: 10 minut w 25 °C. ii) Adsorpcja kwasów nukleinowych: 15 minut w 70 °C, z adsorpcją magnetyczną wykonaną 3 razy. iii) Mycie: Mieszaj przez 2 minuty (powtarzaj 3 razy), a następnie adsorpcję magnetyczną dwukrotnie (po 15 sekund każda). iv)Elution: Wykonaj dwa razy (po 5 minut), z adsorpcją magnetyczną wykonaną 3 razy. Ostatecznie uzyskaj kwasy nukleinowe o wysokiej czystości.
   4. Aby natychmiast wykryć, bezpośrednio aspiruj eluat zawierający kwasy nukleinowe z kolumn 6 i 12. Do długoterminowego przechowywania należy przenieść pozostałe próbki kwasów nukleinowych do temperatury -20°C.
2. Przygotowanie odczynników amplifikacyjnych
   UWAGA: Do reakcji Singleplex PCR przygotuj trzy oddzielne probówki PCR z użyciem trzech różnych enzymów i trzech odpowiadających im mieszanin reakcji. Przygotowanie odczynnika wykonaj w trzech oddzielnych etapach. Ponieważ etapy przygotowania są podobne, poniżej przedstawimy jedynie kroki przygotowania do odczynnika wykrywającego CHIKV.
   1. Usuń z zestawu roztwór reakcji amplifikacyjnej kwasów nukleinowych oraz roztwór reakcji CHIKV (spodniki/sondy specyficzne dla CHIKV). Po rozmrożeniu umieść je w środowisku o temperaturze 22~25 °C, dokładnie wymieszaj przez mocne potrząsania, a następnie wykonaj krótką wirówkę (1000 x g, 15 s, 22~25 °C).
   2. Całkowitą liczbę reakcji obliczamy jako N + 2 (gdzie N = liczba próbek testowych, +2 = jedna negatywna i jedna dodatnia kontrola jakości). Przygotuj mieszankę główną w odpowiednio dużej rurce mikrowirówki, łącząc dla każdej reakcji następujące składniki: 17 μL roztwór reakcji amplifikacyjnej kwasu nukleinowego (zawierający bufor, dNTP, polimerazę DNA, enzym UDG), 3 μL roztwór reakcji CHIKV (zawierający startery, sondy do genów docelowych CHIKV oraz IC). Vortex Master Mix dokładnie przejrzyj, aby zapewnić pełne miksowanie. Krótko wiruj rurkę w 10 000 x g przez 15 sekund w temperaturze pokojowej (22~25 °C), aby zebrać roztwór na dnie. Do każdej probówki PCR należy podać 20 μL Master Mix.
   3. Dodaj próbki kwasu nukleinowego i kontroli jakości: Do przygotowanych powyżej probówek PCR (20 μL) odpowiednio dodaj 5 μL kwasu nukleinowego z badanych próbek, z kontrolą dodatnią i kontrolą ujemną, uzyskując końcową objętość 25 μL na probówkę; mocno zakręć rurki i przeprowadzić natychmiastową wirówkę (1000 x g, 15 s, 22 ~25 °C), a następnie umieścić rurki w przyrządzie PCR.
3. Wzmacnianie PCR
   1. Ustaw program rowerowy następująco: Przeddenaturacja: 50 °C przez 15 minut, następnie 95 °C przez 15 minut (oba etapy razem tworzą jeden cykl); następujące 2 kroki dla 40 cykli: wyżarzenie 94 °C przez 15 s i wyżażanie 55 °C przez 45 s.
   2. Ustaw parametry detekcji sygnału fluorescencyjnego następująco: fluorescencyjne znakowanie genów CHIKV FAM; Znakowanie fluorescencyjne VIC genu IC służyło jako wewnętrzna kontrola zestawu. Zbieraj dane w temperaturze 55 °C. Po zakończeniu reakcji upewnij się, że dane zostaną zapisane do przyszłej analizy.
   3. Analizuj dane za pomocą oprogramowania specyficznego dla qPCR
      1. Informacje o próbce: W schemacie układu płytek odwiertowych oprogramowania oznacz typy próbek (np. kontrola dodatnia, kontrola ujemna, nieznana próbka, gen referencyjny wewnętrzny itp.) odpowiadające pozycjom ładowania próbki.
      2. Umieszczanie rurek reakcyjnych: Otwórz pokrywę modułu grzewczego instrumentu, równomiernie umieść szczelną płytkę/rurki PCR w środku, upewnij się, że dobrze pasują do modułu grzewczego i szczelnie zamknij pokrywę modułu (aby uniknąć nierówności temperatury)
      3. Rozpoczęcie reakcji: Po potwierdzeniu, że ustawienia programu są poprawne, kliknij Start Run i zapisz ID eksperymentu na przyszłość.
      4. Zatrzymanie pracy i wyjęcie rurek: Po zakończeniu programu poczekaj, aż temperatura modułu grzewczego spadnie poniżej 50 °C. Następnie otwórz pokrywkę i ostrożnie zdejmij płytkę PCR lub probówki. Należy przejść do analizy dalszej lub przechowywania próbek w razie potrzeby.
      5. Analiza danych Przed rozpoczęciem analizy należy potwierdzić, że: i) Krzywe amplifikacyjne dla wszystkich próbek i wewnętrznej kontroli są charakterystycznie kształtem litery S; ii) Próg fluorescencji jest ustalony w fazie wykładniczej, co daje wartości Ct ≤ 38 cykli (CV < 5%); iii) Wyniki kontrolne są ważne i wskazują brak skażenia. Jeśli jakikolwiek warunek jest niespełniony lub próbka wykazuje nieprawidłową amplifikację (np. krzywą atypową lub Ct w zakresie krytycznym), należy ponownie sprawdzić całą partię lub konkretną próbkę.
      6. Przetworzenie surowych danych za pomocą oprogramowania, aby określić wartości Ct, korzystając z automatycznie wybieranego progu; próbka jest uznawana za dodatnią, jeśli Ct < 38, a jej krzywa amplifikacji wykazuje kształt egi.

5. Bezpieczeństwo biologiczne i utylizacja odpadów

1. Przenieś wszystkie materiały do wyznaczonego, odpornego na przebicie pojemnika na zagrożenie biologiczne i odkaż go poprzez autoklawowanie przed ostateczną utylizacją przez instytucjonalny system odpadów medycznych. Natychmiast przenieś te materiały do nieszczelnego, odpornego na przebicie pojemnika na zagrożenia biologiczne, oznaczonego jako odpady wysokiego ryzyka. Zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi należy zdekontaminować wszystkie odpady zawierające produkty wzmacniane poprzez autoklawowanie (np. 121 °C przez 30 minut), aby dezaktywować patogeny i rozkładać kwasy nukleinowe. Na koniec utylizacja sterylnych odpadów za pomocą wyznaczonego systemu zarządzania odpadami medycznymi.
   UWAGA: Wykonaj wszystkie kroki zgodnie z praktykami Poziomu Bezpieczeństwa Biologicznego 2 (BSL-2), używając odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej, aby zminimalizować ryzyko narażenia.

Results

Aby zweryfikować stabilność i dokładność systemu detekcji potrójnej PCR, wybraliśmy pięć klinicznie reprezentatywnych próbek z naszego wewnętrznego laboratorium oraz dziesięć zewnętrznych próbek EQA ślepych do weryfikacji. Te pięć reprezentatywnych próbek klinicznych obejmuje zarówno przypadki negatywne, jak i pozytywne (S1-S5), w tym próbki pozytywne na CHIKV i DENV, wybrane w celu wykazania klinicznej przydatności testu oraz wspierania wewnętrznej weryfikacji wyników testu (Tabela 1). Panel EQA z 2025 ...

Discussion

CHIKV to wirus RNA o pozytywnym sensie, jednoniciowy, klasyfikowany w rodzaju alfawirusów z rodziny Togaviridae⁷. Przyspieszone globalne ocieplenie, zintensyfikowany handel międzynarodowy oraz rozwijające się sieci turystyczne wspólnie zwiększyły ryzyko narażenia ludzi na zagrożenia arbowirusowe⁸. W ciągu ostatniej dekady szybki rozwój diagnostyki molekularnej zasadniczo odmienił krajobraz zarządzania chorobami zakaźnymi. Wśród tych technologii qPCR zyskała szczególną popul...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatyczny ekstraktor kwasów nukleinowych	DAAN	Smart 32	Do ekstrakcji DNA
BECKMAN X-12	BECKMAN	ALA04H01	For  wirowanie w surowicy & nbsp;
BSC-1500IIA2-X	BIOBAZA	SEDA 20143222263	Szafka bezpieczeństwa biologicznego
E-Centrifuga	WEALTEC		Wiruj resztki cieczy ze ścianki rurki
W pełni automatyczny analizator medycznego PCR	Bioustar‌	UP0102	Ilościowe wzmacnianie PCR fluorescencyjne
Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych dla wirusa chikungunya (metoda sondy fluorescencyjnej PCR)	DAAN	20250804	Wykrycie  Geny wirusa Chikungunya
Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych dla wirusa dengi (metoda sondy fluorescencyjnej PCR)	DAAN	202504003	Wykrycie  Geny wirusa dengi
Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych dla wirusa dengi, wirusa Zika i wirusa chikungunya (metoda sondy PCR-fluorescencyjnej)	Bioustar‌	20250724	Wykrycie  Wirus dengi, wirus Zika oraz geny wirusa chikungunya
Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych dla wirusa Zika (metoda fluorescencyjna PCR)	DAAN	202508041	Wykrywanie wirusa Zika  Geny
Zestaw do ekstrakcji kwasów nukleinowych	DAAN		Ekstrakt kwasu nukleinowego
SLAN Całkowicie automatyczny system analizy PCR medycznej	HONGSHI		Analiza danych
Maszyna PCR SLAN-96S w czasie rzeczywistym	HONGSHI	SLAN-96	Ilościowe wzmacnianie PCR fluorescencyjne
Zamrażarki ultra-niskiej temperatury (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 &°C; C oznacza przechowywanie odczynników
Vortex-5	Kylin-bell		Do mieszania odczynników