Artykuł metodologiczny

Izolacja komórek nabłonkowych typu II pęcherzyka z płuc noworodkowych, młodociowych i dorosłych myszy, przystosowanych do zakaźnych warunków eksperymentalnych

761 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69581

⸱

19 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Infection Immunology Research Group, Institute of Medical Microbiology and Hospital Hygiene, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 2Immune Regulation Research Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 3Flow Cytometry and Cell Sorting Platform, Helmholtz Centre for Infection Research, 4Experimental Immunology Department, Helmholtz Centre for Infection Research

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia metodę opartą na cytometrii przepływowej, która izoluje żywotne komórki nabłonkowe typu II (AECII) z płuc noworodków, młodocień lub dorosłych myszy (zakażonych lub niezakażonych). Takie podejście umożliwia późniejszym badaniam molekularnym i/lub funkcjonalnym AECII identyfikację ich roli podczas zapalenia i infekcji płuc.

Streszczenie

Komórki nabłonkowe typu II (AECII) odgrywają kluczową rolę w regulacji odporności w płucach i są kluczowymi elementami koordynującymi homeostazę płuc. Te funkcje sprawiają, że AECII jest szczególnie istotne w kontekście infekcji wirusami układu oddechowego, które atakują nabłonek dolnych dróg oddechowych i zaburzają integralność pęcherzyków oddechowych. Przedkliniczne modele myszy są kluczowym narzędziem do wyjaśnienia roli AECII w kontekście zapalenia i/lub infekcji płuc. Protokół ten przedstawia szczegółowy i powtarzalny proces izolowania żywotnych i wysoko oczyszczonych AECII z płuc myszy w stadium noworodkowym, młodociowym i dorosłym. Metodologia łączy dysocjację mechaniczną, trawienie enzymatyczne oraz późniejsze sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), aby uzyskać wysoko wzbogacone populacje AECII, które sprawdzają się jako odpowiednie do dalszych analiz molekularnych i funkcjonalnych. W zastosowaniach z wirusami patogennymi protokół zawiera opcjonalny etap wiązania paraformaldehydu (PFA), umożliwiający bezpieczne traktowanie w warunkach niższego bezpieczeństwa biologicznego bez naruszania integralności RNA. Dzięki optymalnemu procesu regeneracji komórek na różnych etapach rozwoju, dając do 1,0 × 10komórek AECII na dorosłe płuco, protokół ten wspiera badania przedkliniczne np. patogenezy wirusa, funkcji nabłonka oraz zdolności regeneracyjnej.

Wprowadzenie

Dzięki swojej wieloaspektowej roli w rozwoju płuc, fizjologii, odporności i procesach naprawy, komórki nabłonkowe typu II (AECII) mają istotny wkład w utrzymanie oraz przywrócenie homeostazy po uszkodzeniu płuc. Ponieważ AECII są głównymi celami komórkowymi wirusów pandemicznych, takich jak wirus grypy typu A (IAV) czy SARS-CoV-2, ich los i funkcje znalazły się w centrum uwagi badań nad biologią zakażeń. W tym kontekście wcześniejsze badania wykazały, że zarówno sygnały wewnętrzne (np. status genetyczny1, wiek 2,3 lata), jak i zewnętrzne (np. bodźce mikrobiologiczne4) mają istotny wpływ na fenotypy AECII oraz ich zdolność do reagowania na czynniki środowiskowe, takie jak patogeny przenoszone drogą powietrzną. Warto zauważyć, że wykazano, że zapalenie płuc powoduje trwałe zmiany w stanie transkryptomicznym, proteomicznym i epigenetycznym AECII 5,6. Złożone interakcje komórkowe AECII w płucach, a także wkład różnych czynników biotycznych i abiotycznych do biologii AECII, podkreślają znaczenie odpowiednich modeli in vivo, które pozwalają na dokładniejsze badanie tych komórek.

FACS stanowi obecnie złoty standard techniki wzbogacania i oczyszczania komórek pierwotnych z tkanek ludzkich i zwierzęcych, ponieważ umożliwia jednoczesną realizację selekcji wieloparametrycznej (lub wykluczenia) oraz stanowi jedyną metodę, w której właściwości wewnętrzne komórek, takie jak rozmiar, ziarnistość czy autofluorescencja, mogą być niezawodnie integrowane w procesie selekcji/wykluczania. Do tej pory kilka opublikowanych protokołów dostarcza metodologii izolacji pierwotnego mysiego AECII opartego na FACS. Sinha i Lowell opisali metodę izolacji AECII od dorosłych myszy, która charakteryzuje się podobnym procesem przetwarzania tkanek i cytometrii przepływowej, a także wzbogacanie AECII przed FACS poprzez magnetyczne wyniszczenie na podstawie kulek na komórkach niedocelowych7. Inny protokół opisuje stosowanie izolacji komórek płuc EpCAM pozytywnych na bazie kulek magnetycznych lub użycie myszy transgenicznych, które umożliwiały izolację AECII opartą na FACS na podstawie identyfikacji komórek SPC-dodatnich (GFP+) przy użyciu warunkowego modelumyszy reporter 8. Chociaż ekspresja SPC niezawodnie identyfikuje AECII w płucach myszych, metoda ta stosuje się tylko w połączeniu z dedykowanym szczepem myszy reportera, co uniemożliwia izolację AECII np. u myszy typu dzikiego. Co ważne, choć zgłaszano podobne wydajności i czystość AECII, żaden z tych protokołów nie zapewniał adaptacji do izolacji AECII od noworodków, młodociowych lub zakażonych gospodarzy.

W tym celu obecny protokół zawiera zestaw dostosowanych procesów izolacji wysoce czystej i żywotnej AECII z myszy za pomocą trawienia enzymatycznego w połączeniu z FACS. Ta nowoczesna metodologia opiera się na wcześniej opracowanym protokole izolacyjnym AECII9 opartym na FACS i zawiera istotne udoskonalenia poprawiające czystość AECII poprzez dodanie kolejnych markerów identyfikacyjnych i wykluczających. Co ważne, ten zaktualizowany protokół umożliwia pobieranie AECII zarówno poprzez strategie sortowania "dotknięte", jak i "nietknięte". Ponadto, ponieważ rozwój płuc poporodowych wiąże się z istotnymi zmianami w składzie komórkowym i reorganizacji strukturalnej, protokół ten obejmuje adaptacje w celu optymalizacji pobierania AECII z płuc noworodkowych, młodzieńczych i dorosłych. Pozwala to badać biologię AECII podczas ontogenezy, np. w kontekście dojrzewania płuc lub badań biologii infekcji. To podejście może być stosowane do uzyskania żywotnego AECII do późniejszej hodowli ex vivo oraz zakażenia IAV. Dodatkowo protokół ten obejmuje procedurę utrwalania z użyciem chemicznego utrwalacza paraformaldehydu (PFA). Ten krok wymaga inaktywacji różnych patogenów oddechowych (np. SARS-CoV-2, IAV) w zawiesinach komórek płucnych, co z kolei umożliwia późniejsze przetwarzanie próbek (w tym izolację AECII na podstawie FACS) w placówkach o niższych środkach ostrożności bioizolacji. Chociaż fiksacja oparta na PFA wyklucza późniejszą hodowlę AECII ex vivo w badaniach funkcjonalnych, pozwala na odzyskanie znacznych ilości nienaruszonego RNA do profilowania transkryptomicznego AECII, aby wyjaśnić ich biologiczne role w kontekście infekcji dróg oddechowych.

Protokół

Wszystkie zwierzęta zostały wyhodowane i umieszczone w ośrodku zwierzęcym w Helmholtz Centre for Infection Research w warunkach wolnych od patogenów specyficznych (SPF) oraz zgodnie z krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi. Eutanazja niedoświadczonych myszy w celu późniejszej izolacji AECII przeprowadzono zgodnie z krajowymi wytycznymi Towarzystwa Nauk o Zwierzętach Laboratoryjnych (GV-SOLAS, Gesellschaft für Versuchstierkunde). Użyto samców myszy o tło genetycznym C57BL/6 w wieku 2 dni (noworodek), 3 tygodnie (młodociane) lub 8-12 tygodni (dorosły). Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie płuc myszy

  1. Poświęcaj mysz (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnie):
    1. U dorosłych i młodych myszy: podać przedawkowanie znieczulenia (np. ketamina/ksylazyna) za pomocą iniekcji dootrzewnej.
    2. Dla noworodkowych myszy: odcięcie głowy.
      UWAGA: Unikaj zwichnięć szyjki macicy u dorosłych i młodych myszy, ponieważ ten zabieg może uszkodzić tchawicę.
  2. Wysterylizuj sierść myszy etanolem 70% (v/v).
    UWAGA: Płyn łatwopalny. Drażniąca oczy. Trzymaj się z dala od ciepła. Trzymaj pojemnik szczelnie zamknięty i wykonaj nacięcie w linii środkowej brzusznej, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
  3. Ostrożnie usuń skórę i otrzewną.
  4. Wykrwawić mysz, przecinając obie żyły szyjne i żyłę cerną (vena cava), co pozwala krwi odpływać z organizmu.
  5. Ostrożnie usuń przeponę, aby odsłonić serce i płuca.
    UWAGA: Uważaj, aby nie uszkodzić płuc. Perforacja tkanki płucnej znacząco utrudniłaby efektywność późniejszego trawienia tkanki płucnej za pomocą enzymów.
  6. Otwórz klatkę piersiową nożyczkami.
  7. Wprowadź kaniulę do prawej komory serca i przekręć zimną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aż resztkowa krew zostanie usunięta z płuc i tkanka płucna stanie się blada:
    1. Dla dorosłych myszy: użyj kanyli 26 g i przekręć płuco 10 ml PBS.
    2. Dla noworodkowych myszy: użyj kanyli o wadze 30 g i przekrąż płuco 1 ml PBS.
      UWAGA: Nie perfuzuj płuc młodych myszy, aby zapobiec pęknięciu struktury pęcherzyka na skutek nadmiernego nacisku w naczyniach krwionośnych płuc. Perfuzja może być mniej skuteczna w zapalnych płucach, a zmiana koloru tkanki płucnej może być mniej wyraźna. W razie potrzeby przed kolejnym krokiem u dorosłych i młodych myszy można wykonać płukanie oskrzelowo-pęcherzykowego.

2. Enzymatyczne trawienie tkanki płucnej

  1. Dorosłe i młode myszy:
    1. Odsłonij tchawicę, usuwając gruczoły ślinowe i otaczające je mięśnie.
    2. Wkładam do tchawicy kaniulę o masie 22 G, wyjmij igłę i przesuwaj plastikowy cewnik w stronę płuc.
    3. Mocno zawiąż kawałek włóczki wokół tchawicy i cewnika, aby utrzymać je na miejscu.
    4. Przygotuj tkankę płucną, wprowadzając dyspaszję.
      UWAGA: Może powodować objawy alergii lub astmy albo trudności z oddychaniem, jeśli zostanie wdychany. Unikaj wdychania kurzu. Zakładaj ochronę oddechową. Zawartość lub pojemnik należy utylizować do zatwierdzonej zakłady utylizacji odpadów.) przez cewnik wprowadzony do tchawicy:
      1. Dla dorosłych myszy: Włóż 2 mL dyspase.
      2. Dla młodych myszy: Włóż 500 μL dyspase.
        UWAGA: Użyj strzykawki z połączeniem luer slip, aby ułatwić wymianę strzykawek między krokami 2.1.4 a 2.1.5. Aby zapewnić efektywne trawienie enzymatyczne tkanki płucnej, niezbędne jest zapewnienie pełnego wypełnienia przestrzeni oskrzelowo-pęcherzykowych enzymami.
    5. Wymień strzykawkę i powtórz z niskostopioną agarozą (1% (w/v), 45 °C), aby zachować strukturę podczas przetwarzania.
      1. Dla dorosłych myszy: Użyj 500 μL agarozy o niskim topnieniu.
      2. Dla młodych myszy: Użyj 200 μL agarozy o niskim topnieniu.
        UWAGA: Aby uniknąć cofania się płynów, zostaw strzykawkę przymocowaną.
        UWAGA: Przed użyciem: rozpuszczać agarozę niskotopniową w temperaturze (95 °C), pozwól roztworowi agarozy ostygnąć do 45 °C, np. w termobloku.
    6. Przykryj płuco papierem laboratoryjnym i dodaj lód, aby agaroza mogła się stwardnieć przez 2 minuty.
    7. Usuń lód, bibułkę, strzykawkę i cewnik.
    8. Zawiąż włóczkę, aby zamknąć tchawicę i zatrzymać enzym w dolnych drogach oddechowych.
    9. Usuń serce i grasicę.
    10. Przetnij tchawicę nad włóczką i usuń nienaruszone płuco z klatki piersiowej.
    11. Przełóż płuco do 15 mL rurki zawierającej wcześniej podgrzaną substancję (37 °C) i inkubuj tkankę płuca w dyspazie przez 45 minut w temperaturze pokojowej (20-25 °C).
      1. Dla dorosłych myszy: inkubować płuca w 2 mL dyspasażu.
      2. Dla młodych myszy: inkubować płuco w 1,5 mL dyspaszje.
  2. Myszy noworodkowe
    1. Zbieraj i mielę pojedyncze płatki płuca cienkimi nożyczkami w pokrywce probówki 2 mL.
    2. Dodaj 500 μL dispase, zamknij pokrywkę i odwróć tubę, aby upewnić się, że cała tkanka jest pokryta dispasem.
    3. Inkubuj tkankę płucną w stanie w temperaturze pokojowej przez 45 minut.

3. Przygotowanie tkanki płucnej

  1. Dla dorosłych i młodych myszy:
    1. Usuń płuco z otworu i rozciągnij płaty płuca od łodygi oskrzeli.
    2. Umieść płatki płuc w szalce Petriego (średnica: 8,5 cm) zawierającej 7 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL (końcowe stężenie) przeciwciało blokujące anty-CD16/32 oraz 100 μL DNA (końcowe stężenie ~600 jednostek Kunitza).
      UWAGA: Może powodować objawy alergii lub astmy albo trudności z oddychaniem, jeśli zostanie wdychany. Unikaj wdychania kurzu. Zakładaj ochronę oddechową. Zawartość lub pojemnik wyrzucaj do zatwierdzonej oczyszczalni odpadów.
    3. Rozłóż tkankę płucną za pomocą kleszczy.
      UWAGA: Aby zapewnić efektywne trawienie enzymatyczne tkanki płucnej, niezbędne jest zapewnienie dokładnej dezintegracji tkanek mechanicznych.
    4. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc przy 200 obr./min.
      UWAGA: Zawiesina ogniwowa może być przechowywana w temperaturze 4 °C do następnego etapu, jeśli jest to konieczne.
  2. Dla noworodkowych myszy:
    1. Przenieś dyspasz, w tym trawioną tkankę, do szalki Petriego (średnica: 5,4 cm) zawierającej 3 mL DMEM + HEPES, 1 μg/mL (końcowe stężenie) przeciwciało blokujące anty-CD16/32 oraz 100 μL DNA (końcowe stężenie ~600 jednostek Kunitza).
    2. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej, delikatnie kołysząc przy 200 obr./min.
      UWAGA: Zawiesina ogniwowa może być przechowywana w temperaturze 4 °C do następnego etapu, jeśli jest to konieczne.
  3. Kontynuacja dla wszystkich grup wiekowych:
    1. Przefiltruj zawiesinę komórkową przez serię nylonowych filtrów komórkowych o zmniejszającej się wielkości porów (100 μm - 70 μm - 40 μm), aby usunąć zanieczyszczenia i duże kruszywa.
    2. Ostrożnie płucz sita i rurki komórkowe, aby zminimalizować ich utratę komórek. W przypadku zebrania próbek można przepuścić przez te same sita komórkowe zawiesiony myszy z tej samej grupy.
      UWAGA: W przypadku zatkania wymień filtry komórkowe.
    3. W zależności od objętości przenieś filtrowaną zawiesinę ogniwową do jednej lub więcej rurek 15 mL i wiruj zawiesinę ogniwową przez 12 minut w temperaturze 140 x g w 4 °C.
    4. Usuń supernatant i ponownie zawiesij osad komórkę w buforze lizy erytrocytów (bufor ACK).
      1. Dla dorosłych i młodych myszy: Użyj 2 mL buforu lizy erytrocytów i inkubuj przez 2 minuty.
      2. U noworodków : Użyj 3 mL buforu do lizy erytrocytów i inkubuj przez 3 minuty.
    5. Zatrzymaj lizę erytrocytów, napełniając probówkę 15 mL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS i ponownie wiruj przez 12 minut w dawce 140 x g w 4 °C.

4. Barwienie przeciwciał do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

  1. Ponownie zawiesi komórki w roztworze barwienia przeciwciał zawierającym przeciwciała sprzężone z anty-F4/80, CD93, CD11c, CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 oraz przeciwciałami sprzężonymi fluorochromem CD326 przygotowanymi w DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
    UWAGA: Aby uzyskać optymalne efekty barwienia, używaj wyłącznie wstępnie zmiarkowanych przeciwciał. Jeśli AECII muszą pozostać nietknięte do sortowania komórek, nie należy dodawać anty-CD326 do roztworu barwienia przeciwciał.
    1. Dla dorosłych myszy: Stosuj roztwór przeciwciał 600 μL na każde płuco.
    2. Dla młodych myszy: Stosuj roztwór przeciwciał 400 μL na każde płuco.
    3. Dla noworodkowych myszy: Stosuj roztwór przeciwciał 200 μL na każde płuco.
  2. Inkubuj zawiesinę komórkową z przeciwciałami przez 10 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
  3. Po inkubacji umyj komórki, napełniając probówkę DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS.
  4. Wirówka przez 12 minut w 140 x g w 4 °C.
  5. Ponownie zawiesij komórki DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS:
    1. Dla dorosłych myszy: Ponownie zawieszać 300 μL na każde płuco.
    2. Dla młodych myszy: Ponownie zawieszać 200 μL na każde płuco.
    3. Dla noworodkowych myszy: Ponownie zawieszać 100 μL na każde płuco.

5. Sortowanie AECII

UWAGA: Przygotowanie instrumentów: zamontować dyszę 100 μm do sortowania AECII za pomocą urządzenia FACS.

  1. Bezpośrednio przed sortowaniem przefiltruj komórki przez sitko o pojemności 50 μm. Przepłucz sitko komórkowe DMEM z dodatkiem HEPES i 10% (v/v) FBS, aby zapobiec nadmiernej utracie komórek:
    1. Dorosłe myszy: Przepłucz sitko komórkowe 300 μL na każde płuco.
    2. Młode myszy: Przepłukuj sitko komórkowe 200 μL na każde płuco.
    3. Myszy noworodkowe : Przepłukaj sitko komórki 100 μL na każde płuco.
  2. Ponownie zawiesij komórki przez wirowanie bezpośrednio przed sortowaniem.
  3. Gate for AECII poprzez identyfikację zdarzeń, które I) mają wysokie rozpraszanie boczne (wysokie SSC), II) są ujemne dla fluorochromów linii oraz III) są dodatnie dla fluorochromu CD326 sprzężonego z przeciwciałem anty-CD326.
    UWAGA: Używaj fluorochromów o wysokich do bardzo wysokich wskaźników jasności (takich jak APC, PE i BV785), aby ułatwić rozróżnienie między nie-AECII a AECII. Dla nietkniętego podejścia sortowania (z wyłączeniem anty-CD326 w roztworze barwiącym) AECII są identyfikowane jako komórki geneatyczne ujemne, SSCwysokie orazautofluorescencyjne/wysokie/wysokie . Autofluorescencję AECII można zidentyfikować w detektorach zielonego światła, np. detektorach FITC lub GFP.
  4. Wyklucz dublety lub agregaty z wykorzystując wysokość rozrzutu do przodu względem obszar (FSC-H vs. FSC-A) oraz wysokość rozpraszania bocznego względem obszar (SSC-H vs. SSC-A).
  5. Zebrać posortowane komórki do probówki zawierającej DMEM z dodatkiem HEPES i 10% (v/v) FBS oraz do wirówki do dalszej analizy lub hodowli.

6. Izolacja RNA od AECII zafiksowanego przez PFA (opcjonalnie)

UWAGA: W przypadku izolowania AECII z myszy zakażonych np. patogenami wirusowymi układów oddechowych, izolacja AECII musi być przeprowadzona w warunkach BSL2 lub BSL3, w zależności od patogenu. Jeśli badacz nie ma dostępu do sortowania komórek w odpowiednich warunkach bezpieczeństwa, AECII izolowane według opisanego powyżej protokołu można naprawić PFA po barwieniu przeciwciał. Ten etap inaktywuje patogeny10,11, dzięki czemu kolejne sortowanie cytometryczne AECII przepływowe może być przeprowadzone w warunkach BSL1. Chociaż komórki nie mogą być już wykorzystywane do testów funkcjonalnych z powodu procesu utrwalania, nadają się do analiz molekularnych.

  1. W przypadku inaktywacji wirusów należy utrwalić zawiesiny pojedynczych komórek znakowane przeciwciałami w 500 μL 4% (w/v) PFA.
    UWAGA: Łatwopalne w stałym materiale. Szkodliwe, jeśli się połknie lub wdycha. Powoduje podrażnienia skóry, poważne uszkodzenia oczu. Może powodować alergiczną reakcję skórną, podrażnienia dróg oddechowych oraz raka. Podejrzewa się o spowodowanie wad genetycznych. Trzymaj się z dala od ciepła. JEŚLI SIĘ POCHŁONIESZ: Zadzwoń do CENTRUM TROCT / lekarza, jeśli źle się czujesz. W PRZYPADKU WDECHU: Wyprowadź osobę na świeże powietrze i zadbaj o komfort oddychania. Zadzwoń do CENTRUM TROCT/lekarza, jeśli źle się czujesz. JEŚLI W OCZACH: Ostrożnie płucz wodą przez kilka minut. Zdejmij soczewki kontaktowe, jeśli są obecne i łatwe do zrobienia. Kontynuuj płukanie. JEŚLI JESTEŚ NARAŻONY LUB ZANIEPOKOJONY: Zasięgnij porady medycznej/pomocy.
    UWAGA: Zgodnie z wytycznymi 3R, w tym badaniu zastosowano AECII pochodzące z myszy niezakażonych. AECII były utrwalane przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Czas utrwalania musi być indywidualnie badany dla każdego patogenu, który stanowi potencjalne zagrożenie dla ludzi i środowiska. Kolejne sortowanie w warunkach S1 wymaga wcześniejszej weryfikacji w laboratorium BSL2 lub BSL3, że po wiązaniu PFA nie ma wirusa replikowalnego.
  2. Po utrwaleniu płucz komórki DMEM i wiruj przez 15 minut przy 140 x g.
  3. Ponownie zawiesz komórki w 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) FBS i przeprowadź zawiesinę przez sitko o pojemności 100 μm.
  4. Przepłucz sitko dodatkowym 300 μL DMEM + HEPES + 10% (v/v) medium FBS, aby zapobiec nadmiernej utracie komórek.
  5. Sortuj komórki zgodnie z krokiem 5. "Sortowanie AECII".
    UWAGA: Po obowiązkowej weryfikacji eksperymentalnej, że każdy wirus został inaktywowany przez leczenie 4% (w/v) PFA, AECII może być sortowane w warunkach BSL1.
  6. Do izolacji RNA z komórek PFA zaznaczonych PFA użyj zestawu RNeasy FFPE.
    UWAGA: Ten zestaw zawiera niebezpieczne chemikalia. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta. Zwróć uwagę na dołączoną kartę charakterystyki bezpieczeństwa, wprowadzając następujące poprawki:
    1. Po sortowaniu odwidź ogniwa przez 15 minut w temperaturze 140 x g w 4 °C.
    2. Ponownie zawiesijcie komórki w 150 μL Buffer PKD i przenieście je do probówki 1,5 mL.
    3. Dodaj 10 μL proteinazy K i inkubuj w temperaturze 56 °C przez 15 minut, a następnie inkubuj w 80 °C przez maksymalnie 15 minut, w zależności od liczby komórek (patrz Tabela 1).
  7. Kontynuuj proces izolacji RNA zgodnie z protokołem, w tym obróbkę DNazą, kroki płukania oraz końcową elucię w wodzie wolnej od RNazy 30 μL.

Wyniki

Opisany tutaj protokół stanowi zoptymalizowaną i szczegółową metodę izolowania i analizy AECII z tkanki płucnej myszy na różnych etapach rozwoju, od noworodków po młode i dorosłe myszy. Metodologia ta obejmuje mechaniczną i enzymatyczną dysocjację płuc, połączoną z zoptymalizowanym procesem sortowania komórek cytometrycznych przepływowo, wykorzystując niestandardowe protokoły odpowiednie do przetwarzania próbek od zakażonych zwierząt na potrzeby kolejnego sortowania przepływowego w warunkach BSL1.

Dane eksperymentalne wykazały wysoką skuteczność tej procedury izolacji (podsumowanej na Rysunku 1) w produkcji żywotnych i wysoce czystych (>95%) populacji AECII. Sortowanie przepływowe generowało czyste populacje AECII, a analiza po sortowaniu potwierdziła niemal 100% swoistość dla ustalonych markerów komórkowych (Rysunek 2). Ilościowa analiza próbek komórek po sortowaniu wykazała wysokie wyniki: od 0,15 ×10 6 żywotnych AECII z płuc noworodków oraz 1,0 ×10 6 komórek z próbek dorosłych na całe przygotowanie płuc (Rysunek 3A). Izolowane AECII zachowały typową morfologię (rysunek 3B) oraz integralność komórkową przez cały proces izolacji (rysunek 3C). Dodatkowo, zastosowanie protokołu w badaniach funkcjonalnych zostało potwierdzone dzięki udanemu zakażeniu ex vivo z użyciem przystosowanego do myszy IAV (H1N1, szczep A/Puerto Rico/8/34) ekspresującego białko reporterowe mCherry (IAV-mCherry12), demonstrując zdolność komórek do wspierania replikacji wirusa (Rysunek 4).

Aby wspierać eksperymentalne procesy wymagające utrwalania próbki, protokół zawiera specjalistyczne podejście do ekstrakcji RNA z wykorzystaniem wiązania PFA. Dokładne badania jakości RNA z AECII ustalonych na PFA w różnych punktach przetwarzania wykazały, że wysokiej jakości RNA zdolne do dalszych analiz molekularnych można niezawodnie wyodrębnić ze stałych próbek (Tabela 1). Jakość wyodrębnionego RNA wykazywała bezpośredni związek z czasem trwania obróbki termicznej w temperaturze 80 °C podczas procesu ekstrakcji, oferując jasne wytyczne optymalizacyjne oparte na konkretnych potrzebach eksperymentalnych (Tabela 1, Rysunek 5). Walidacja za pomocą ilościowej analizy PCR (qRT-PCR) z transkrypcją odwrotną wykazała skuteczną amplifikację zarówno genów housekeeping (białko rybosomalne S9, Rps9), jak i markerów specyficznych dla AECII (białko powierzchniowo czynne C, Sftpc) za pomocą próbek związanych z PFA oraz świeżych preparatów kontrolnych (Rysunek 6).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny workflow izolacji AECII z płuc noworodków, młodości i dorosłych myszy z wykorzystaniem trawienia tkanek enzymatycznych oraz sortowania komórek cytometrycznych przepływowo. Diagram ilustruje systematyczne przetwarzanie płuc myszy z różnych grup wiekowych. Eutanazja myszy i ekstrakcji płuc następuje wieloetapowe trawienie enzymatyczne z opóźnieniem rozkładu tkanek. Po zakłóceniu mechanicznym komórki są oczyszczane poprzez serię etapów filtracji przy zmniejszaniu rozmiaru porów. Następnie erytrocyty są lizowane. Specyficzne wzbogacenie AECII osiąga się poprzez negatywną selekcję z użyciem znakowania przeciwciał przeciwko markerom hematopoetyckim (CD45, CD11b, CD11c, F4/80, CD19, CD16/32), markerowi śródbłonkowemu CD31, markerowi płytek CD93 oraz markerowi komórek nabłonkowych oskrzeli CD24, dodatniemu selekcji komórek nabłonkowych z użyciem znakowania przeciwciał przeciwko CD326 oraz późniejszemu sortowaniu cytometrycznym przepływem na podstawiecharakterystycznego wysokiego poziomu SSC profil granulowanego AECII. Protokół ten umożliwia izolację wysoce czystych (≥ 95%), użytecznych pierwotnych AECII do dalszych analiz funkcjonalnych i molekularnych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywna strategia bramkowania stosowana do izolacji AECII od dorosłych myszy. (A) Zawiesiny jednokomórkowe płuc zostały zabarwione przeciwciałami przeciwko następującym antygenom: F4/80, CD93, CD11c (sprzężone z APC) oraz CD19, CD31, CD11b, CD16/32, CD45, CD24 (sprzężone z PE) oraz CD326 (sprzężone z BV785). (B) Ponowna analiza (A) dla analizy czystości. Sortowane AECII zostały ponownie przeanalizowane, aby potwierdzić 97,2% czystości AECII. (C) Reprezentatywne obrazy mikroskopii fluorescencyjnej AECII po sortowaniu. Jądra były barwione DAPI (niebieskim). Barwienie wewnątrzkomórkowe przeprowadzono za pomocą pierwotnego przeciwciała przeciw SPC (gatunek: królik), a wtórne barwienie za pomocą koziego przeciwkróliczego IgG sprzężonego z Alexą 594 (czerwonym). AECII barwiony wyłącznie przeciwciałami DAPI i przeciwciałami wtórnymi, a splenocyty barwione przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi służyły jako istotne kontrole, wskazujące na specyficzne wiązanie anty-SPC oraz anty-rabbitAlexa 594. Skala: 20 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-3
Rysunek 3: Wydajność, morfologia i witalność AECII po sortowaniu komórek aktywowanych fluorescencją. (A) Całkowita liczba żywotnych AECII na płuco uzyskanych od noworodków, młodych i dorosłych myszy. (B) Obraz mikroskopii świetlnej sortowanego po sortowaniu AECII. Pasek skali: 75 μm. (C) Żywotność AECII obserwowana przez barwienie trypanowe na niebiesko po sortowaniu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Zakażenie ex vivo sortowanym AECII IAV-mCherry. Komórki AECII wyizolowane od dorosłych myszy były hodowane ex vivo na płytkach tkankowych pokrytych Matrigelem przez noc, aby umożliwić przymocowanie. Następnie komórki były zakażone IAV-mCherry (wielokrotność zakażenia 2) przez 8 godzin. Zaobserwowano zależny od czasu wzrost intensywności sygnału mCherry. Skala: 200 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-5
Rysunek 5: integralność RNA z 4% PFA stałego AECII. Reprezentatywne profile RNA PFA ustalone i posortowane AECII po izolacji RNA przy użyciu zestawu QIAGEN FFPE RNeasy z modyfikacjami. Specyficzne piki dla rRNA 18S i 28S, wraz z numerem jakości RNA (RQN), reprezentują integralność i jakość RNA dla nienaruszonego izolowanego RNA z PFA ustalonego AECII. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-6
Rysunek 6: Krzywe amplifikacji genu Rps9 housekeeping oraz genu AECII specyficznego dla AECII z grupy kontrolnej (nieleczonej) oraz 4% PFA fiksowanego AECII. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

PrzykładCzas inkubacji w temperaturze 80 °C28S/18SRQNRNA conc. [ng/μ]
Sterowanie 0,5x106-2105.8
Control 1x106-1.91012.3
PFA stała 0,5x106526.45.5
PFA stała 0,5x106101.98.13.7
PFA stała 0,5x106151.88.22.76
PFA fixed 1 x106528.26.26
PFA fixed 1 x106101.18.45.12
PFA fixed 1 x106150.98.55

Tabela 1: Jakość RNA izolowanego z 4% PFA stałego AECII – wpływ różnych czasów wiązania. RNA z AECII zostało wyizolowane zgodnie z protokołem producenta (FFPE RNeasy Kit) z modyfikacjami opisanymi w kroku 6. Ustalone komórki były inkubowane w temperaturze 80 °C przez 5 minut, 10 lub 15 minut, aby wyludzić RNA z próbki. Integralność RNA została określona za pomocą analizatora fragmentów firmy Agilent

Dyskusja

Opisany tutaj zoptymalizowany protokół zapewnia wiarygodne i powtarzalne podejście do izolacji i analizy AECII z tkanki płucnej myszy w wieku noworodkowym, młodocianym i dorosłym. Ponadto oferuje opcjonalny etap utrwalania PFA przed sortowaniem, który pozwala na oddzielenie AECII od myszy w warunkach BSL1, nawet jeśli były one wcześniej zakażone patogenami oddechowymi. Dzięki połączeniu starannie przeprowadzonej ekspozycji płuc i perfuzji, a następnie intubacji wewnątrztchawicowej enzymów i niskotopniącej agarozy do płuc, struktura tkanek jest utrzymywana, umożliwiając odzyskiwanie wysokiej jakości zawiesin jednokomórkowych do dalszej analizy. Dodanie cytometrycznego sortowania przepływowego na podstawie właściwości rozpraszania bocznego, gatingu genealogicznego oraz selekcji pozytywnej dla komórek CD326-dodatnich skutkowało niezwykle czystymi populacjami AECII. Taka czystość ma szczególne znaczenie dla zapewnienia, że molekularne i funkcjonalne testy w dalszej części są reprezentatywne dla wewnętrznej biologii AECII, a nie zakłócają przez zanieczyszczenia typów komórek, co zwiększa interpretowalność badań nad ekspresją genów i interakcjami wirus-gospodarz.

Wspomniany wcześniej protokół obejmuje wykluczenie nie-AECII przy użyciu szerokiego spektrum fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom leukocytarnym i nieleukocytycznym oraz późniejszy pozytywny selekcja AECII poprzez właściwości rozpraszania bocznego i ekspresję specyficznej dla komórek nabłonkowych cząsteczki CD326. Chociaż wykazano, że ta metodologia prowadziła do wysoce czystych populacji AECII (z wykorzystaniem SPC, charakterystycznego markera AECII), czystość uzyskanych populacji można było potwierdzić jedynie za pomocą barwienia wewnątrzkomórkowego po sortowaniu, jak dotąd. Protokół ten może być stosowany do izolacji AECII z płuc zakażonych wirusami SARS-CoV-2 i grypą, w których AECII są głównie celem wirusa i wykazują wyraźne adaptacje komórkowe1. Jednak ta metoda może nie być odpowiednia do izolowania mysiego AECII w kontekście badań biologicznych raka płuc, ponieważ EpCAM (CD326) jest również wyrażany przez komórki nowotworowe płuc u myszy i ludzi13. W tych badaniach zastosowanie transgenicznych szczepów myszy ekspresujących białka fluorescencyjne pod kontrolą transkrypcyjną promotora Spc może stanowić bardziej odpowiednie podejście do niezawodnej izolacji pierwotnego AECII.

Wydajność 0,15 × 106 żywotnych AECII na płuco noworodka oraz do 1,0 ×10 komórek na płuco dorosłego ilustruje efektywność i skalowalność protokołu. Główną przeszkodą w skutecznej izolacji dużych ilości AECII jest nieefektywne trawienie enzymatyczne oraz mechaniczna dezintegracja tkanki płucnej. Dlatego kluczowe jest zapewnienie pełnego wypełnienia przestrzeni oskrzelowo-pęcherzykowych enzymem w kroku 2.1.4 oraz staranne przeprowadzenie rozkładu tkanek mechanicznych w kroku 3.1.3. Skuteczne trawienie enzymatyczne prowadzi do powstania mętnej zawiesiny komórek z minimalnym wkładem widocznych kruszyw, które zwykle można rozłożyć za pomocą tłoka w kolejnych etapach filtracji. Większe agregaty, których nie można przepuścić przez sitko komórkowe, zwykle powstają w wyniku niewystarczającego trawienia enzymatycznego. Należy zauważyć, że nie zaleca się przedłużania czasu trawienia enzymatycznego, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na kolejne immunodbarwienia14 , a tym samym na dokładność izolacji AECII opartej na FACS.

Obok efektywności enzymatycznego i mechanicznego rozkładu tkanek, tło genetyczne może wpływać na wydajność AECII. Do tego protokołu użyto myszy na tle C57BL/6. Zgodnie z zgłaszanymi różnicami rozwojowymi15,immunologicznych 16 oraz fizjologicznych 17,18,19 specyficznymi dla szczepów, możliwe jest, że stosowanie innych szczepów myszy laboratoryjnych (np. BALB/c, DBA) może skutkować różnymi wydajnościami AECII. Ponadto wydajność AECII z zapalonych płuc (zakaźnych lub niezakaźnych) może być znacząco zmniejszona. Może to być wynikiem pośredniej (zapalnej) lub bezpośredniej (pośredniczonej przez patogeny) śmierci komórek AECII, które stanowią główne cele np. IAV20,21 i SARS-CoV-2 22,23,24.

Zachowanie integralności komórkowej podczas dysocjacji mechanicznej, trawienia enzymatycznego i sortowania przepływów jest dodatkowo kluczowe dla dalszych analiz molekularnych i/lub funkcjonalnych. Dlatego po sortowaniu oceniano żywotność AECII oraz funkcję komórkową. AECII były w stanie przylegać do Matrigela i utrzymać charakterystyczną morfologię bogatą w ciało lamelowe przez co najmniej 24 godziny, co wskazuje na kompetencje funkcjonalne po izolacji oraz przydatność do hodowli ex vivo (w tym modeli infekcji).

Efektywne zakażenie sortowanym AECII wirusem IAV-mCherryreporter 12 oraz obserwacje silnej replikacji wirusa potwierdzają ten system jako solidną platformę do wyjaśniania odpowiedzi przeciwwirusowych między nadomek a właściwościami nabłonkowymi. Ponieważ AECII reguluje kluczowe procesy zaangażowane w biosyntezę powierzchniowo czynnych, regenerację pęcherzyków i odporność wrodzoną25,26, zdolność do badania kinetyki replikacji IAV oraz odpowiedzi transkrypcyjnej gospodarzy w oczyszczonych populacjach AECII dostarczy wglądów niedostępnych w przygotowaniach mieszanych komórek.

Kluczową innowacją tego protokołu jest wprowadzenie procedury fiksacji, umożliwiającej analizę równoległą i inaktywowanych próbek. Procesy wiązania PFA oraz adaptowane procesy ekstrakcji RNA FFPE utrzymują integralność RNA w stopniu zgodnym z dalszymi analizami transkryptomicznych, co potwierdza skuteczność ilościowej transkrypcji PCR (qPCR).

Czas utrwalania PFA może wpływać na jakość barwienia, a tym samym na odzyskiwanie AECII przez FACS. Ponadto wydajność i jakość RNA są zazwyczaj zależne od procesów wiązania. W zależności od zastosowanego modelu zakażenia in vivo , te aspekty należy uwzględnić przy projektowaniu eksperymentalnym. Zaleca się unikanie długiego czasu utrwalania i zamiast tego optymalizację czasu trwania leczenia PFA, aby stosować minimalny niezbędny czas, co zostało eksperymentalnie udowodnione jako zapewnienie całkowitej dezaktywacji danego wirusa.

Ocena obfitości RNA rybosomalnego (rRNA) za pomocą instrumentu mikrofluidycznego służy jako zastępca do oceny jakości mRNA w próbkach biologicznych. Opisany protokół wiązania AECII/izolacji RNA pozwala na izolację nienaruszonego RNA o odpowiedniej jakości do dalszych analiz transkryptomicznych, co potwierdzają stosunki rRNA 28S/18S >1 oraz wartości RNA quality number (RQN) >8. Ważne jest, aby zauważyć, że krok inkubacji 80 °C krytycznie zmniejsza wydajność i jakość RNA. Opcjonalnie można zastosować adaptację czasów obróbki cieplnej, aby zwiększyć wydajność i jakość RNA w dalszych zastosowaniach.

Łącznie te ulepszenia metodologiczne stanowią obszerny zestaw narzędzi do badania biologii AECII w kontekście zdrowia, chorób zakaźnych i rozwoju (od noworodka do dorosłego). Wysoka wydajność i czystość AECII wyizolowanych przez to podejście umożliwiają wieloomiczne profilowanie obejmujące testy dostępności transkryptomicznej, proteomicznej i chromatyny, a także testy funkcjonalne (np. zakażenie ex vivo ), aby dalej analizować istotne mechanizmy AECII in vivo.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować Tatjanie Hirsch i Friederike Kruse za ich fachową pomoc techniczną, Lizie Hönicke i Justine Smout za pomocne dyskusje oraz Yoshihiro Kawaoka za dostarczenie wirusa reportera IAV-mCherry. Badanie to zostało sfinansowane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecka Fundacja Badawcza) - TRR 359 - Projekt numer 491676693 (dla D.B. i J.H.), inicjatywę COVIPA (KA1-Co-02, Stowarzyszenie Helmholtza; dla D.B.) oraz grant od Niemieckiej Fundacji Badawczej (BO 7036/1-1; dla J.D.B.). Dziękujemy wsparciu z Funduszu Publikacji Open Access Wydziału Medycznego Uniwersytetu Otto-von-Guericke w Magdeburgu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor ACK--8,29 g NH4Cl, 1 g KHCO3, 200 & mikro; L z 0. 5 M EDTA, dodaj 1000 mL Milli-Q, dostosuj pH do 7,2 do 7,4
anty-mysz CD11beBioscience12-0112-83klon M1/70; Sprzężone przez PE
anty-mysz CD11cBiolegenda117310klon N418; Sprzężone APC
anty-mysz CD16/32BD Biosciences553141klon 93; oczyszczony
anty-mysz CD16/32BD Biosciences561727klon 2.4G2; Sprzężone przez PE
anty-mysz CD19Biolegenda115508klon 6D5; Sprzężone przez PE
anty-mysz CD24Biolegenda101808klon M1/69; Sprzężone przez PE
anty-mysz CD31Biolegenda102408klon 390; Sprzężone przez PE
anty-mysz CD326Biolegenda118245klon G8.8; BV785 sprzężony
anty-mysz CD45BD Biosciences553081klon 30-F11; Sprzężone przez PE
anty-myszy CD93eBioscience17-5892-82klon AA4-1; Sprzężone APC
anty-myszy F4/80Biolegenda123116klon BM8; Sprzężone APC
przeciwmyszy SPC abcamab211326gatunek żywiciela: królik; Klon: EPR19839; oczyszczony
Aria-FusionBD BiosciencesSorter komórek
Aria-II SORPBD BiosciencesSorter komórek
Tablica Biozym AgaroseBiozym8401011% (w/v) w H2O
Sitnik komórkowy (100 & mikro; M, 70 & mikro; M, 40 & mikro; m)BD Falcon352360, 352350, 352340
CellTrics (50 & mikro; m)Sysmex04-004-2327
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydłego, 2000 jednostek Kunitz/fiolkaSigma-AldrichD4263świeżo rozpuszczać zawartość 1 fiolki w 330 mikrofalach; L DMEM
Dyspasz, 100 mL (5000 jednostek kazeinolitycznych)Corning354235przeprowadza sterylną filtrację (por o rozmiarze 0,22 & mikro; m), przygotować 4 mL aliquotów w probówkach po 15 mL, przechowywać w temperaturze -20 i stopień; C
DMEMGibco31885-049Niskie stężenie glukozy wraz z piruwanianem, dodaj HEPES (końcowe stężenie 25 mM)
FACS DivaBD BiosciencesOprogramowanie sortujące
FlowJoOprogramowanie do oceny danych FACS
Antykróliczka z kozamiAlexa 594 sprzężona
Indwelling canuala Introcan 22GBraun4252098B
Zestaw RNeasy FFPEQiagen73504
Symfonia S6 SEBD BiosciencesSorter komórek

Bibliografia

  1. Stegemann-Koniszewski, S., et al. Alveolar type II epithelial cells contribute to the anti-influenza A virus response in the lung by integrating pathogen- and microenvironment-derived signals. mBio. 7 (3), (2016).
  2. Kumova, O. K., et al. Severity of neonatal influenza infection is driven by type I interferon and oxidative stress. Mucosal Immunol. 15 (6), 1309-1320 (2022).
  3. Angelidis, I., et al. An atlas of the aging lung mapped by single-cell transcriptomics and deep tissue proteomics. Nat Commun. 10 (1), 963(2019).
  4. Cleaver, J. O., et al. Lung epithelial cells are essential effectors of inducible resistance to pneumonia. Mucosal Immunol. 7 (1), 78-88 (2014).
  5. Boehme, J. D., et al. Epigenetic changes and serotype-specific responses of alveolar type II epithelial cells to Streptococcus pneumoniae in resolving influenza A virus infection. Cell Commun Signal. 23 (1), 278(2025).
  6. Worrell, J. C., et al. Lung structural cells are altered by influenza virus leading to rapid immune protection following re-challenge. Nat Commun. 16 (1), 7061(2025).
  7. Sinha, M., Lowell, C. A. Isolation of highly pure primary mouse alveolar epithelial type II cells by flow cytometric cell sorting. Bio Protoc. 6 (22), (2016).
  8. Chen, Q., Liu, Y. Isolation and culture of mouse alveolar type II cells to study type II to type I cell differentiation. STAR Protoc. 2 (1), 100241(2021).
  9. Gereke, M., et al. Flow cytometric isolation of primary murine type II alveolar epithelial cells for functional and molecular studies. J Vis Exp. (70), e4322(2012).
  10. Avelin, V., Sissonen, S., Julkunen, I., Österlund, P. Inactivation efficacy of H5N1 avian influenza virus by commonly used sample preparation reagents for safe laboratory practices. J Virol Methods. 304, 114527(2022).
  11. Jureka, A. S., Silvas, J. A., Basler, C. F. Propagation, inactivation, and safety testing of SARS-CoV-2. Viruses. 12 (6), (2020).
  12. Fukuyama, S., et al. Multi-spectral fluorescent reporter influenza viruses (Color-flu) as powerful tools for in vivo studies. Nat Commun. 6, 6600(2015).
  13. Hanssen, A., Loges, S., Pantel, K., Wikman, H. Detection of circulating tumor cells in non-small cell lung cancer. Front Oncol. 5, 207(2015).
  14. Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
  15. Soutiere, S. E., Mitzner, W. Comparison of postnatal lung growth and development between C3H/HeJ and C57BL/6J mice. J Appl Physiol. 100 (5), 1577-1583 (2006).
  16. Alberts, R., et al. Gene expression changes in the host response between resistant and susceptible inbred mouse strains after influenza A infection. Microbes Infect. 12 (4), 309-318 (2010).
  17. Kida, K., Fujino, Y., Thurlbeck, W. M. A comparison of lung structure in male DBA and C57 black mice and their F1 offspring. Am Rev Respir Dis. 139 (5), 1238-1243 (1989).
  18. Reinhard, C., et al. Inbred strain variation in lung function. Mamm Genome. 13 (8), 429-437 (2002).
  19. Soutiere, S. E., Tankersley, C. G., Mitzner, W. Differences in alveolar size in inbred mouse strains. Respir Physiol Neurobiol. 140 (3), 283-291 (2004).
  20. Koerner, I., Matrosovich, M. N., Haller, O., Staeheli, P., Kochs, G. Altered receptor specificity and fusion activity of the haemagglutinin contribute to high virulence of a mouse-adapted influenza A virus. J Gen Virol. 93 (Pt 5), 970-979 (2012).
  21. Weinheimer, V. K., et al. Influenza A viruses target type II pneumocytes in the human lung. J Infect Dis. 206 (11), 1685-1694 (2012).
  22. Youk, J., et al. Three-dimensional human alveolar stem cell culture models reveal infection response to SARS-CoV-2. Cell Stem Cell. 27 (6), 905-919.e10 (2020).
  23. Ziegler, C. G. K., et al. SARS-CoV-2 receptor ACE2 is an interferon-stimulated gene in human airway epithelial cells and is detected in specific cell subsets across tissues. Cell. 181 (5), 1016-1035.e19 (2020).
  24. Katsura, H., et al. Human lung stem cell-based alveolospheres provide insights into SARS-CoV-2-mediated interferon responses and pneumocyte dysfunction. Cell Stem Cell. 27 (6), 890-904.e8 (2020).
  25. Fehrenbach, H. Alveolar epithelial type II cell: Defender of the alveolus revisited. Respiratory Res. 2 (1), 33(2001).
  26. Mason, R. J. Biology of alveolar type II cells. Respirology. 11 (Suppl), S12-S15 (2006).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki p cherzyk w p ucnych typu IIizolacja p uc myszysortowanie kom rek aktywowane fluorescencjtrawienie enzymatycznedysocjacja mechanicznainfekcja wirusem uk adu oddechowegohomeostaza p ucutrwalanie paraformaldehydembia ko surfaktantu Cilo ciowa RT PCR
Izolacja komórek nabłonkowych typu II pęcherzyka z płuc noworodkowych, młodociowych i dorosłych myszy, przystosowanych do zakaźnych warunków eksperymentalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.