Analiza transkryptomiczna oparta na zbiorowych danych RNA-seq

Summary

Niniejszy protokół ustanawia kompletny pipeline do analizy procesu masowego RNA-seq od surowych danych do analizy wzbogacenia funkcjonalnego.

Abstract

Bezalkoholowa stłuszczona wątroba (NAFL) jest zwykle uważana za łagodne schorzenie; jednak gdy choroba przechodzi w niealkoholowe steato-wątroby (NASH), pacjenci są znacznie bardziej narażeni na rozwój końcowej choroby wątroby. Wiele badań próbuje wyjaśnić molekularny mechanizm leżący u podstaw przejścia z NAFL do NASH. Technologie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości (takie jak RNA-seq w masie) pozwoliły badaczom uzyskać głębsze zrozumienie poprzez badanie transkryptomu, ujawnianie ekspresji cząsteczek, aktywacji szlaków sygnalizacyjnych oraz innych czynników związanych z postępem choroby. Dostępnych jest mnóstwo otwartych źródeł danych, które badacze mogą analizować w celu identyfikacji potencjalnych celów leczenia chorób. Jednak powiązane badania są ograniczone przez brak efektywnego i wiarygodnego procesu analizy transkryptomu w górnym zakresie. Tutaj dostępna jest wysoce powtarzalna i przyjazna dla użytkownika analiza upstream oraz powiązany potok analizy różnicowej genów, umożliwiający ustandaryzowane przetwarzanie i głęboką analizę danych prywatnych lub publicznych. Potok podzielony jest na cztery etapy: (1) kontrola jakości danych; (2) mapowanie genów; (3) różnicowa analiza genów; oraz (4) analizę funkcjonalną. Proces ten ma na celu odkrycie molekularnych mechanizmów transformacji choroby oraz wsparcie naukowców w przesiewaniu potencjalnych celów leków i podejść terapeutycznych poprzez analizę danych RNA-seq w całości.

Introduction

Niealkoholowa stłuszczeniowa choroba wątroby (NAFLD) jest najpowszechniejszą chorobą przewlekłej wątroby na świecie, dotykającą ponad jedną czwartą populacji. Jego częstość gwałtownie wzrosła w ostatnich dekadach ^1,2,3. Rosnące obciążenie chorobą, zwłaszcza jej bardziej zaawansowaną formą, niealkoholowym steato-zapaleniem wątroby (NASH), stanowi poważne globalne wyzwanie zdrowotne i duże obciążenie ekonomiczne⁴. Pierwszym stadium NAFLD jest niealkoholowa stłuszczona wątroba (NAFL), któremu towarzyszą stany zapalne i włóknienie, które mogą przechodzić d....

Protocol

Do celów demonstracyjnych publicznie dostępny zbiór danych PRJNA1023502 opracowany przez Lan Bai i in. został wykorzystany do zilustrowania każdego etapu zarówno analiz w górnym, jak i dalszym ciągu²⁰. Ponieważ ten zbiór danych pochodzi z otwartej bazy danych NCBI, nie są wymagane dodatkowe uprawnienia ani etyczne zgody. Zobacz Tabelę Materiałów , aby zweryfikować wszystkie wymagane wersje oprogramowania i pakietów R. Publicznie dostępny zbiór danych PRJNA1023502 zawiera 6 próbek nie-NASH, 6 NAFL oraz 6 NASH RNA-seq wątroby. W tym protokole zbiór danych został wykorzystany do demonstracji wszystkich etapów masowego workflow RNA....

Results

Przepływ analizy upstream dla masowego RNA-seq został zilustrowany na Rysunku 1A. Ten workflow wykonuje kolejno następujące kluczowe kroki na platformie Linux: po pierwsze, rygorystyczna kontrola jakości surowych danych sekwencjonowania jest wykonywana za pomocą fastp, aby usunąć niskiej jakości odczyty i sekwencje adapterów; następnie HISAT2 dopasowuje wysokiej jakości odczyty do genomu referencyjnego, a Samtools konwertuje i sortuje pliki wyrównania; wreszcie FeatureCounts przeprowadza kwa.......

Discussion

Analiza danych RNA-seq w całości charakteryzuje się interdyscyplinarnym zadaniem integrującym genomikę, bioinformatykę, statystykę i informatykę. Pełny przepływ pracy analityczny obejmuje wiele etapów w górę i w dolnym kierunku, w tym wstępne przetwarzanie surowych danych, kontrolę jakości, wyrównywanie sekwencji, kwantyfikację na poziomie genów, normalizację danych, analizę różnicowej ekspresji oraz interpretację biologiczną. Wśród tych etapów szczególnie istotne jest dokładne przekształcenie surowych odczytów sekwencjo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
biomaRt	Bioconductor	2.64.0	Adnotacja genów z Ensembl
clusterProfiler	Bioconductor	4.16.0	Analiza wzbogacania funkcjonalnego
DESeq2	Bioconductor	1.48.1	Analiza różniczkowa ekspresji
FactoMineR	AgroParisTech	2.11.0	Analiza PCA i wielowymiarowa
fastp	OpenGene	1.0.1	Kontrola jakości i filtrowanie danych FASTQ
Liczba cech	Dział Bioinformatyki, Instytut Badań Medycznych im. Waltera i Elizy Hallów	2.0.0	Policz liczbę odczytów przypisanych do każdego genu w celu ilościowania ekspresji genów
ggplot2	Pozycja	3.5.2	Wizualizacja danych
Ggrepel	Kamil Slowikowski	0.9.6	Etykiety tekstowe nienakładające się
Ggridges	Claus O. Wilke	0.5.6	Tworz działki grzbietowe
HISAT2	Uniwersytet Johnsa Hopkinsa	2.2.1	Dopasuj filtrowane wysokiej jakości odczyty do genomu referencyjnego
R	R Core Team	4.5.0	Środowisko do obliczania, analizy i wizualizacji danych
RColorBrewer	Erich Neuwirth	1.1.3	Palety kolorów do wyznaczania wykresów
samtools	Strumień pracy w genomice na dużą skalę	1.22.0	Konwertowanie i przetwarzanie plików SAM dla efektywnego odzyskiwania i dostępu
Zestaw narzędzi	Narodowe Centrum Informacji Biotechnologicznej	3.2.1	Pobierz i wstępnie przetwarzaj surowe dane sekwencjonowania z bazy danych NCBI