Standaryzowane modele zwierzęce indukowane niestabilnością do badań przedklinicznych choroby zwyrodnieniowej stawów

Podsumowanie

Protokół ten ma na celu opracowanie odpowiednich modeli zwierzęcych do badań nad chorobą zwyrodnieniową stawów.

Streszczenie

Jako najczęstsze schorzenie stawów na świecie, choroba zwyrodnieniowa stawów kolen (OA) stanowi poważne globalne obciążenie zdrowotne, co skłoniło do szeroko zakrojonych badań nad jego patogenezą i strategiami leczenia. Pomimo licznych badań, ustandaryzowane metody tworzenia modelu pozostają niewystarczające. Aby wypełnić tę lukę, przedstawiamy kompleksowe, powtarzalne protokoły opracowywania zwierzęcych modeli chorob zwyrodnieniowych stawów wywołanych niestabilnością, w szczególności model Destabilizacji łąkotki przyśrodkowej (DMM) u myszy oraz model rozerwania łąkotki przyśrodkowej (MMT) u szczurów. Ponadto opisujemy prostą i łatwą do wdrożenia procedurę oceny progów bólu pooperacyjnego oraz stabilności przestrzennego chodu, mającą na celu promowanie spójności metodologicznej w przedklinicznych badaniach OA. Walidacja histologiczna i behawioralna potwierdziła sukces obu modeli, gdyż wyniki Osteoarthritis Research Society International (OARSI) były wyraźnie podwyższone, długość kroku istotnie zmieniona, a progi bólu mechanicznego znacznie obniżone w grupach DMM i MMT w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na wyraźną degenerację stawów i nadwrażliwość. Wyniki te podkreślają powtarzalność i znaczenie translacyjne obu modeli. Dzięki dostarczaniu szczegółowej dokumentacji wideo praca ta promuje standaryzację procedur i ułatwia spójność między laboratoriami, zwiększając tym samym wiarygodność i porównywalność wyników badań OA.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów (OA) to bardzo powszechne zwyrodnieniowe zaburzenie stawów i jedna z głównych przyczyn niepełnosprawności na świecie ^1,2. Pomimo szeroko zakrojonych badań, rozwój skutecznych leków modyfikujących chorobę na OA (DMOAD) przebiegał stosunkowo powoli³. Obecnie powszechnie uznaje się, że OA jest chorobą wieloczynnikową, obejmującą złożone zmiany patologiczne w wielu tkankach okołostawowych, w tym chrząstce stawowej, kości podszyjkowej, ścięgnach oraz błonie maziowej ^4,5. Skuteczne badania przedkliniczne nad różnorodnymi procesami patologicznymi OA wymagają stosowania dobrze zdefiniowanych i odpowiednich modeli zwierzęcych. Chociaż opracowano różne modele zwierząt OA, które zgłoszono 6,7,8,9,10,11, wiele badań nadal wykorzystuje nieodpowiednie modele zwierzęce, co ogranicza translacyjną istotność ich wyników. Aby rozwiązać ten problem, prezentujemy standaryzowane modele OA wywołane niestabilnością, w tym powtarzalne procedury destabilizacji łąkotki przyśrodkowej (DMM) oraz rozerwania łąkotki przyśrodkowej (MMT), w formacie wideo, które służą jako praktyczne źródło badań nad OA przedklinicznym i standaryzacji modeli.

Jak zgłaszano w poprzednich badaniach, niestabilność łąkotki jest głównym czynnikiem przyczyniającym się do degeneracji stawu kolanowego w przypadkach klinicznych. Dlatego chirurgicznie indukowana niestabilność łąkotki u myszy i szczurów stanowi skuteczne podejście do eksperymentalnej indukcji OA. W tym kontekście przedstawiamy dwa reprezentatywne modele OA wywołane niestabilnością, w tym model DMM u myszy oraz model MMT u szczurów. Model DMM u myszy jest szczególnie cenny do badania molekularnych mechanizmów OA, ponieważ myszy są podatne na transgeniczną manipulację, a model ten wykazuje stopniowy i długotrwały postęp choroby, ściśle naśladując ludzką OA. Warto jednak zauważyć, że model DMM jest mniej odpowiedni do badań skupiających się na patologicznych zmianach kości podchrząstowej, gdzie alternatywne modele mogą zapewnić lepszą istotność translacyjną.

Ponadto ustanowiliśmy model MMT u szczurów, który uzupełnia model DMM myszy. Procedura MMT powoduje bardziej rozległe uszkodzenia strukturalne obejmujące zarówno chrząstkę stawową, jak i kość podchrząstkową, co lepiej odzwierciedla zaawansowane cechy patologiczne OA obserwowane w warunkach klinicznych. To sprawia, że model MMT szczurów jest szczególnie odpowiedni do bioinżynierii i badań translacyjnych, w tym oceny biomateriałów, terapii regeneracyjnych oraz systemów dostarczania leków skierowanych do naprawy stawów. Chociaż techniki chirurgiczne MMT i DMM były opisywane w poprzednich badaniach, nadal brakuje kompleksowego, krok po kroku protokołu wizualnego, który zapewniłby standaryzację, powtarzalność i precyzję techniczną we wszystkich laboratoriach badawczych. Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy szczegółową demonstrację wideo ilustrującą każdy kluczowy etap tworzenia modelu, od przygotowania zwierząt po opiekę pooperacyjną. Ponadto wprowadzamy dwie powszechnie stosowane metody oceny behawioralnej: jedną do oceny progu bólu oraz drugą do analizy stabilności przestrzennej chodu, aby zapewnić spójne ramy oceny funkcjonalnej po indukcji OA. W związku z tym, integrując protokoły chirurgiczne i behawioralne, artykuł ten ma na celu promowanie standaryzacji metodologicznej w przedklinicznych badaniach OA, poprawiając tym samym porównywalność danych i znaczenie translacyjne w różnych badaniach.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Etyki i Dobrostanu Zwierząt Chińskiego Uniwersytetu Medycznego w Zhejiang i zatwierdzono je na podstawie protokołu o numerze IACUC-20251020-11. Do operacji DMM użyto samców myszy C57BL/6 w wieku 10-12 tygodni, natomiast samce szczurów Sprague-Dawley ważących 200-225 g do zabiegu MMT. Wszystkie zwierzęta były trzymane w określonych warunkach wolnych od patogenów (SPF) i miały tydzień aklimatyzacji przed eksperymentami. Utrzymywano standardowe warunki hodowla, a jedzenie, wodę i ściółkę wymieniano co najmniej dwa razy w tygodniu, aby zapewnić dobrostan zwierząt i spójność eksperymentów.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Należy podawać odpowiednie środki przeciwbólowe (np. buprenorfinę) przed operacją zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Znieczulanie zwierzęcia za pomocą inhalacyjnego znieczulenia (np. 2% izofluranu przy 0,4 L/min przy przepływie świeżego gazu 4 L/min w komorze indukcyjnej) i utrzymuj znieczulenie przez cały zabieg za pomocą stożka nosowego. Potwierdź głębokość znieczulenia, upewniając się, że nie występuje odruch wycofania pedałów.
2. Nałóż 2-3 mm pasek nawilżającej maści okulistycznej do worka spojówkowego dolnej powieki i delikatnie ją masuj, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie maści na powierzchni oka.
3. Ogol sierść wokół prawego stawu kolanowego i zdezynfekuj miejsce operacji trzystopniowym zabiegiem oczyszczania z użyciem jodu povidonu, a następnie 70% etanolu. Ustaw zwierzę na sterylnym stole operacyjnym.

2. Operacja DMM u myszy

UWAGA: Procedura ta wywołuje destabilizację stawów poprzez przecięcie przyśrodkowego więzadła łąkotkowego (MMTL), zaznaczonego na czerwono na Rysunku 1, który normalnie kotwiczy łąkotkę przyśrodkową do płatki piszczeliowej.

1. Ustaw znieczuloną mysz w pozycji leżącej i wykonaj niewielkie nacięcie przyrzeździkowe (około 3-5 mm) nad prawym kolanem.
2. Ostrożnie rozczłonkaj leżące tkanki miękkie, aby odsłonić torebkę stawową. Wykonaj nacięcie przyśrodkowo od ścięgna rzepki i delikatnie przesuń rzepkę bocznie, aby zobaczyć staw kolanowy. Potwierdź, że MMTL wygląda jako cienka, więzadłowa paska łącząca przedni róg łąkotki przyśrodkowej z płatkiem piszczelowym. Używaj stereomikroskopu, aby poprawić wizualizację i zminimalizować ryzyko uszkodzenia chrząstki stawowej.
3. Ostrożnie przeciąć przyczep piszczelowy MMTL za pomocą mikronożyczek, ostrza skalpela #11 lub wygiętej igły strzykawki. Podczas stosowania zgiętej igły strzykawki krawędź pomaga chronić podłożną chrząstkę stawową. Powierdź pomyślne przecięcie, obserwując powstałą destabilizację łąkotki przyśrodkowej.
4. Zamknij naciętą kapsułę stawową za pomocą 8-0 Szwy wchłanialne, a następnie zamykanie nacięcia skórnego za pomocą klipsów ranowych lub szwów 6-0.
   UWAGA: Należy uważać, aby nie przebić lub nie uszkodzić chrząstki stawowej podczas szycia oraz upewnić się, że napięcie stawu jest prawidłowo utrzymane podczas zamykania nacięcia.
5. Pozwól zwierzęciu na poduszce grzewczo i uważnie je obserwuj, aż odzyska pełną ruchomość.

3. Operacja MMT u szczura

UWAGA: Procedura ta indukuje OA poprzez całkowite pęknięcie łąkotki przyśrodkowej po przecięciu więzadła pobocznego przyśrodkowego (MCL), co powoduje niestabilność stawów i postępującą degenerację chrząstki.

1. Odpowiednio umiejscowić znieczulonego szczura i wykonać nacięcie przypadpadkowe przypadkowo-przyśrodkowe, o długości około 6-8 mm, nad prawym kolanem.
2. Wykonaj rozwarstwienie, aby oddzielić warstwy mięśniowe i wyraźnie odsłonić MCL (Rysunek 2).
3. Za pomocą nożyczek chirurgicznych całkowicie przeciń MCL w jego środkowym punkcie.
4. Delikatnie cofnij przecięte MCL, aby odsłonić leżącą u podstawy łąkotkę przyśrodkową. Za pomocą cienkich kleszczy chwyć łąkotkę i przeprowadź przecięcie pełnej grubości w najwęższym obszarze, aby uzyskać całkowite rozdarcie.
5. Przestawiaj tkanki miękkie i zamykaj nacięcie warstwami, używając szwów 5-0 na mięsień i powięź, a następnie zaczepki rany lub niechłonne szwy 5-0 do zamknięcia skóry.
6. Pozwól zwierzęciu na regenerację, stosując tę samą procedurę opisaną w kroku 2.5.

4. Oceny behawioralne

1. Przeprowadz oceny wyjściowe przed operacją oraz powtarzane oceny w wyznaczonych punktach pooperacyjnych (np. 2, 4 i 8 tygodni).
   UWAGA: Aby zminimalizować zmienność między operatorami, testy behawioralne przeprowadził ten sam wyszkolony operator, który był ślepy na grupę eksperymentalną. Każdy pomiar powtarzano trzy razy na każde zwierzę, a do analizy wykorzystywano średnią wartość.
   1. Uproszczony mechaniczny test progu wycofania
      1. Umieść myszy w pojedynczych przegródkach na podwyższonej platformie z siatki drucianej i pozwól im się aklimatyzować przez co najmniej 30 minut przed testem. Mechaniczna wrażliwość na ból jest następnie oceniana za pomocą elektronicznego anestezjometru von Freya.
      2. Używając włókna Von Freya, przyłóż sondę do powierzchni podeszwowej prawej tylnej łapy myszy i stopniowo zwiększając silę¹².
      3. Zarejestruj odpowiedź, zauważając, że pozytywna reakcja objawia się nagłym wycofaniem łapy, drgnięciem lub lizaniem. Oceń obecność lub brak spójnej odpowiedzi, aby ocenić zmiany wrażliwości w czasie.
   2. Analiza chodu
      1. Wykorzystaj zautomatyzowany system analizy chodu do oceny.
      2. Pozwól zwierzęciu dobrowolnie przejść po szklanym chodniku urządzenia. Zdefiniuj ważną próbę jako taką, w której zwierzę porusza się w stałym tempie, nie zatrzymując się. Poczekaj, aż oprogramowanie systemowe automatycznie zidentyfikuje odciski łap i obliczy wiele parametrów chodu. Przeanalizuj kluczowe wskaźniki dla prawej (operowanej) kończyny tylnej, w tym czas trwania fazy postawy, prędkości zamachu i nacisku łapy, i porównaj je z parametrami w kontrolach przeciwległej kończyny i sterowania sztucznego.
         UWAGA: Wszystkie zwierzęta zostały przystosowane do aparatury testowej poprzez codzienne sesje treningowe przed oceną wyjściową. Dla każdego zwierzęcia rejestrowano trzy przejazdy na punkt czasowy, a za ważne uznano tylko próby, w których zwierzę utrzymywało stałą prędkość bez przerw. Wszystkie pomiary były wykonywane przez wykwalifikowanych operatorów w ramach podwójnie ślepego projektu, aby zminimalizować zmienność między operatorami, a powtarzane przebiegi były uśredniane, aby zapewnić powtarzalność danych.

Wyniki

Charakterystyka i walidacja modelu myszy DMM OA
Po tygodniowym okresie aklimatyzacji model zwyrodnieniowego stawów wywołanego DMM (OA) u myszy został opracowany zgodnie z procedurą przedstawioną na Rysunku 1. Badania patologiczne i behawioralne przeprowadzono dwa tygodnie po operacji. Jak pokazano na Rysunku 2A, najbardziej wyraźne zmiany zwyrodnieniowe były lokalizowane w przyśrodkowym stawie kości udowo-piszczelowej. Zakres degeneracji chrz...

Dyskusja

Protokół ten stanowi ustandaryzowane ramy dla indukcji i oceny dwóch szeroko stosowanych modeli chirurgicznych OA. Modele te są szczególnie cenne, ponieważ wiernie odwzorowują cechy patofizjologiczne ludzkiego OA pourazowego, oferując tym samym silne znaczenie translacyjne. Model DMM obejmuje przecięcie więzadła przyśrodkowej łąkotkowej, natomiast model MMT zakłada bezpośrednie zerwanie łąkotki przyśrodkowej. W naszym laboratorium procedura DMM jest rutynowo wykonywana u myszy, ponieważ łąkotka przyśrodkowa jest trudna d...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
System analizy chodu	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-FP202
Liposic			Maść okulistyczna
Myszy	Instytut Modelowych Zwierząt w Nankinie	c57/bl6
System testowania bólu	Shanghai Xin Ruan Information Technology Co., Ltd	XR-XZD	elektroniczny anestezjometr von Freya
Szczur	Instytut Modelowych Zwierząt w Nankinie	S/D