Artykuł metodologiczny

Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

510 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69615

⸱

27 marca 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre of Estonian Rural Research and Knowledge, 2Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 3Estonian Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia porównawczą metodę oceny cech szparkowych i naskórkowych u dwóch odrębnych gatunków za pomocą peelingów naskórnych, technik oczyszczania oraz analizy obrazowej wspomaganej przez AI. Celem jest umożliwienie wysokoprzepustowej, powtarzalnej ilościowej identyfikacji struktur komórkowych leżących u podstaw funkcji szparków szparkowych dla zastosowań rolniczych oraz szerokich badań roślinnych.

Streszczenie

Dokładna charakterystyka morfologii szparki szparkowej oraz otaczających cech naskórka jest niezbędna do zrozumienia funkcji szparki. Przedstawiono protokół porównawczy z wykorzystaniem dwóch uzupełniających się technik – peelingów naskórnych i usuwania liści – aby ocenić rozmiar, kształt i gęstość komórek szparkowych i naskórnych u dwóch ekologicznie odrębnych gatunków dwukątnych: Fraxinus excelsior i Taraxacum officinale. Protokół obejmuje szczegółowe kroki przygotowania próbki, obrazowania i kwantyfikacji cech z wykorzystaniem kosztowo i efektywnych prac pomiarów ręcznych (czyszczenie tkanek i obieranie) oraz analizy obrazów wspomaganej AI, które mogą ułatwić zastosowania o wysokiej przepustowości. Oceniono trzy narzędzia segmentacji – model detekcji szparków szparkowych oparty na YOLOv8, ogólne narzędzie głębokiego uczenia do segmentacji komórek oraz klasyfikator oparty na pikselach – pod kątem ich dokładności i przydatności w różnych metodach. Istotne różnice w cechach szparkowych i naskórnych są konsekwentnie obserwowane pomiędzy technikami obierania i oczyszczania zarówno w analizach ręcznych, jak i AI. Narzędzia AI umożliwiły powtarzalną ilościowość, przy czym model detekcji szparków szparkowych oparty na YOLOv8 (StoManager1) najlepiej sprawdza się dla cech szparkowych, a ogólne narzędzie głębokiego uczenia do segmentacji komórek (Cellpose) dla segmentacji naskórka. Wykrywanie cech opartych na AI było bardzo spójne u T. officinale , ale ograniczone w F. excelsior; wyniki nadal różniły się od pomiarów ręcznych, co ilustruje, jak anatomia specyficzna dla gatunku i jakość obrazu wpływają na odpowiedniość metody. Wyniki te sugerują, że choć analiza wspomagana przez AI stanowi użyteczne ramy do kwantyfikacji cech szparkowych i naskórkowych, walidacja ekspertów i testy pilotażowe pozostają niezbędne przed szerszym lub wysokoprzepustowym zastosowaniem.

Wprowadzenie

Aparaty szparkowe to mikroskopijne pory w naskórku, które odgrywają kluczową rolę w regulacji wymiany gazowej i transpiracji roślin. Dlatego zrozumienie morfologicznych podstaw funkcjonowania szparków szparkowych jest kluczowe dla poprawy wydajności upraw1. Podczas gdy większość badań nad strukturą i funkcją szparków szparkowych koncentruje się wyłącznie na morfologii szparki, pełne zrozumienie ich reakcji wymaga również charakteryzacji rozmiaru i kształtu otaczających komórek naskórka. Dokładne określenie tych cech jest kluczowe dla zrozumienia relacji struktura-funkcja leżących u podstaw wymiany gazowej i poprawy upraw.

Ponieważ poprawa upraw coraz bardziej opiera się na zaawansowanych metodach edycji genów, kluczowe jest zrozumienie kluczowych cech morfologicznych – takich jak szparki szparkowe – które wpływają na fotosyntezę, efektywność zużycia wody oraz przyrost węgla. Ta potrzeba jest szczególnie pilna w obliczu trwających zmian środowiskowych, gdy rośnie zapotrzebowanie na odporne uprawy, które zachowują zarówno zdolność fotosyntetyczną, jak i plony, w obliczu częstszych susz i fal upałów 2,3. W związku z tym istnieje silna potrzeba ustandaryzowanych protokołów obrazowania i analizy. Peeling szparków szparkowych z użyciem lakieru/lakieru do paznokci to najprostsza metoda uzyskania odcisków na powierzchni liści, aby zmierzyć rozmiar, kształt i gęstość szparków szparkowych i naskórka 4,5,6. Procedura jest szybka, nieniszcząca, co pozwala na szybkie przetwarzanie próbek. Metoda oczyszczania tkanek to alternatywne podejście umożliwiające jednoczesną charakterystykę sieci żył oraz potencjalnie bardziej kompleksową charakterystykę hydrauliki liści.

Chemiczne oczyszczanie zmiękcza i sprawia, że tkanki stają się optycznie przezroczyste, umożliwiając obrazowanie in situ komórek szparków szparkowych i naskórka bez zakłóceń mechanicznych. Oczyszczanie jest szeroko stosowane w różnych typach tkanek, w tym w próbkach suszonych lub delikatnych, i może być wykorzystywane nie tylko do obrazowania szparków szparkowych, ale także do wizualizacji sieci żyłkowych, obrazowania fluorescencyjnego oraz wewnętrznych struktur anatomicznych 7,8,9,10,11,12 , co pozwala na analizę cech szparkowych obok innych cech funkcjonalnych. Istnieją różne metody oczyszczania, obejmujące rozpuszczalniki organiczne, roztwory wodne, hiperhydratację lub osadzanie hydrożelu 13,14,15. Różnią się one czasem trwania, kompatybilnością obrazowania oraz dostępnością odczynników. Stosowany tutaj protokół jest prosty, opłacalny i nie wymaga specjalistycznych umiejętności. Obie techniki są tanie i szybkie w porównaniu do bardziej pracochłonnych metod, takich jak mikroskopia świetlna czy skaningowa mikroskopia elektronowa, które wymagają chemicznego utrwalania, osadzania i sekcjonowania próbek.

Tradycyjne metody analizy cech szparków szparkowych i naskórka często opierają się na ręcznej segmentacji obrazów mikroskopowych, co jest pracochłonne, czasochłonne i podlega błędom obserwatora, ograniczającym przepustowość i zmniejszającym efektywność pipeline'u analitycznego16. Ponadto cechy anatomiczne, takie jak trichomy i nieregularne ściany komórkowe, stanowią dodatkowe wyzwania dla spójnego ilościowego określania cech. Chociaż zautomatyzowane narzędzia do analizy obrazów dają duże obietnice dla wysokoprzepustowej ekstrakcji danych, zostały zoptymalizowane pod kątem konkretnych tkanek roślinnych i nie są łatwo przenosalne między typami liści i metodami przygotowania. Na przykład StoManager1 (Ilustracja uzupełniająca 1) zapewnia wysoką dokładność wykrywania szparków szparkowych przy użyciu modelu wykrywania obiektów opartego na YOLOv8, ale jest specjalnie trenowany pod kątem cech szparkowych. Cellpose (Ilustracja uzupełniająca 2) to duży, wstępnie wytrenowany, ogólny model segmentacji, który dobrze się sprawdza, gdy dane wejściowe przypominają jego modele wstępnie wytrenowane (np. cyto, cyto2), oparte pierwotnie na komórkach zwierzęcych i organellach. Ilastik (Ilustracja Uzupełniająca 3) to narzędzie klasyfikacyjne oparte na pikselach, oparte na adnotacjach zdefiniowanych przez użytkownika. Zarówno Cellpose, jak i Ilastik są przyjazne dla użytkownika, ale każdy z nich może wymagać ponownego trenowania lub dostrojenia, aby uwzględnić różnice w jakości obrazu, artefaktach tła i cechach specyficznych dla tkanek.

Ponadto morfologia szparków szparkowych i naskórka wykazuje dużą zmienność w poszczególnych gatunkach17. Cechy takie jak gęstość i rozmiar szparków szparkowych są szczególnie zmienne, jednak zazwyczaj są odwrotnie powiązane i razem determinują różnice gatunkowe w kinetyce szparki. Większe szparki szparkowe mogą częściowo kompensować niższą gęstość, ale zazwyczaj wykazują wolniejszą kinetykę5, co może być niekorzystne podczas coraz częstszych fal upałów, gdzie szybkie reakcje szparków są kluczowe dla utrzymania asymilacji węgla i zapobiegania nadmiernej utracie wody. Łącznie ta zmienność utrudnia pomiar cech szparków szparkowych i może osłabić wiarygodność wybranego protokołu oraz odporność wyników opartych na AI.

Protokół ten integruje dwie klasyczne techniki przygotowawcze – peelingi naskórkowe i chemiczne oczyszczania – z nowoczesnymi narzędziami sztucznej inteligencji (AI) i uczenia maszynowego (ML) do segmentacji i pomiaru cech. Wykorzystując dwa powszechne gatunki dwukątnych o dwóch powszechnych gatunkach dwukątnych wymagających światła o kontrastujących strategiach ekologicznych (F. excelsior i T. officinale), zbadaliśmy zmienność cech szparkowych i naskórkowych, aby ocenić, jak trzy metody się porównują i gdzie mogą pojawić się potencjalne nieścisłości. Oceniono wydajność trzech narzędzi AI: StoManager1 (model głębokiego uczenia opartego na YOLOv8 do wykrywania szparków szparkowych), Cellpose (ogólne narzędzie do segmentacji głębokiego uczenia) oraz ilastik (klasyfikator pikselowy dla tkanek naskórkowych). To integracyjne podejście umożliwia powtarzalną, wysokoprzepustową ilościową ilościową identyfikację cech szparkowych i naskórkowych, oferując solidne i skalowalne ramy do analizy fenotypowej zarówno w badaniach ekologicznych, jak i rolniczych. Jednak cechy anatomiczne, takie jak gęste trichome, grube skórki czy niski kontrast między granicami komórek, mogą obniżać dokładność segmentacji i powinny być brane pod uwagę przy wyborze między metodami obierania a oczyszczania oraz przy stosowaniu ilościfikacji opartej na AI.

Z naszej wiedzy jest to pierwszy krok po kroku protokół porównujący bezpośrednio peeling naskórkowy i metody chemicznego oczyszczania w połączeniu z wieloma narzędziami segmentacyjnymi opartymi na AI, aby kwantyfikować cechy szparkowe i naskórki. Łącząc klasyczne techniki mikroskopii z dostępnymi workflowami ML, protokół zmniejsza stronniczość użytkownika, zwiększa przepustowość i ułatwia powtarzalne fenotypowanie między gatunkami. Dzięki temu podejście jest szeroko stosowane w ekologii, poprawie upraw oraz badaniach nad zmianami klimatu, a także stanowi podstawę do ciągłego rozszerzania narzędzi poprzez przeszkolenie modeli lub naukę transferową.

Protokół

UWAGA: Nie wymagano żadnych specjalnych zezwoleń ani zgód na pobranie liści T. officinale oraz F. excelsior, ponieważ te niechronione gatunki pobrano z ogólnodostępnych obszarów ogrodowych. Pobieranie wszystkich próbek odbyło się zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i lokalnymi.

1. Gromadzenie materiału roślinnego

  1. Wybierz zdrowe liście do analizy porównawczej. W niniejszym doświadczeniu wybrano zdrowe, wystawione na działanie słońca dojrzałe liście dwóch gatunków dwuliściennych o kontrastowym rozmieszczeniu aparatów szparkowych: drzewa hipostomatycznego F. excelsior, które posiada szparki tylko na dolnej powierzchni liścia, oraz wieloletniego byliny amfistomatycznej T. officinale.
  2. Dla każdego typu/lokalizacji próbki pobierz 3-5 powtórzeń liści.
  3. Oddziel liść, używając czystych nożyczek lub żyletki. Odcięty liść natychmiast umieść w wodzie, aby zapobiec odwodnieniu.
  4. Po zbiorze całkowicie zanurz ogonki liściowe w wodzie i przechowuj je w temperaturze 4°C.
  5. Przejdź do sekcji 2 lub 3 protokołu w ciągu 48 h.

2. Przygotowanie i obserwacja odlewów aparatów szparkowych

UWAGA: Wszystkie odpady chemiczne powstałe podczas protokołu oczyszczania były utylizowane zgodnie z instytucjonalnymi i lokalnymi przepisami bezpieczeństwa. Roztwory zawierające glutaraldehyd były zbierane oddzielnie i utylizowane jako niebezpieczne odpady chemiczne. Roztwory wodorotlenku sodu (NaOH) były neutralizowane do pH 6-8 przed utylizacją, tam gdzie było to dozwolone. Rozcieńczone roztwory wybielacza i etanolu były wylewane do odpływu z obfitymi ilościami zimnej wody w miejscach, w których dopuszczały to przepisy instytucjonalne i miejskie. Roztwory TBO były zbierane i utylizowane jako odpady chemiczne zgodnie z lokalnymi wytycznymi. Użytkownicy powinni skonsultować się z biurem bezpieczeństwa swojej instytucji w celu ustalenia zatwierdzonych procedur utylizacji.

  1. W razie potrzeby delikatnie opłucz wybraną powierzchnię liścia wodą, aby usunąć kurz lub zanieczyszczenia. Natychmiast osusz powierzchnię liścia za pomocą papieru filtracyjnego lub miękkiego ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar wilgoci. Nie pozostawiaj do wyschnięcia na powietrzu, ponieważ może to spowodować skurczenie się tkanki, co doprowadzi do niedokładnych pomiarów wielkości aparatów szparkowych i komórek epidermy.
  2. Oznacz preparat na szkiełku przedmiotowym szczegółami próbki (np. gatunkiem, stroną liścia i datą przygotowania) za pomocą niezmywalnego markera, aby zapewnić identyfikowalność każdej próbki podczas obrazowania, analizy i interpretacji danych, a także umożliwić właściwe przechowywanie próbek do przyszłego użytku.
  3. W przypadku gatunków z niegruczołowymi (włochatymi) trichomami, przed przygotowaniem odlewu usuń trichomy z powierzchni liścia za pomocą żyletki, ponieważ ich obecność może przesłaniać granice komórek i obniżać jakość obrazu (Rysunek 1).
  4. Za pomocą małego pędzla nałóż cienką, równą warstwę przezroczystego, nierozciągliwego lakieru do paznokci (unikaj formuł typu „stretch” lub „peel-off”) na wybrany obszar. Do przygotowania odlewu zawsze wybieraj środkową część liścia, unikając jego wierzchołka i nasady.
  5. Pozostaw lakier do całkowitego wyschnięcia (zazwyczaj 2-5 min. w temperaturze pokojowej). Przedłużona ekspozycja może spowodować odbarwienie tkanki (np. czerwony odcień na miękkich liściach), co może być widoczne w końcowym odlewie i zakłócać dalsze analizy wymagające jednolitego ubarwienia.
  6. Po wyschnięciu naklej pasek przezroczystej taśmy na pokrytą obszaru. Zacznij od jednej krawędzi lakieru i stopniowo przykładaj taśmę do powierzchni, delikatnie dociskając, aby zapewnić dobrą adhezję i uniknąć pęcherzyków powietrza lub zagięć. Używaj rękawiczek nitrylowych, aby uniknąć odcisków palców.
  7. Ostrożnie odklej taśmę wraz z warstwą lakieru (odlew epidermy).
  8. Umieść taśmę (stroną klejącą dołu) na czystym szkiełku przedmiotowym, unikając zagięć lub nakładania się warstw.
  9. Przygotowane preparaty przechowuj w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed kurzem i bezpośrednim światłem słonecznym.
  10. Zbadaj preparat pod złożonym mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 40x. Zapisz obrazy zgodnie z instrukcją oprogramowania, wraz z odpowiednią skalą.

3. Przygotowanie i oglądanie przejaśnionych przekrojów

  1. Wyciąć fragmenty liści o powierzchni około 1 cm2. Wszystkie etapy należy przeprowadzać w rękawicach nitrylowych, pracując pod dygestorium.
  2. Przenieść próbki do opisanej probówki, zalać roztworem utrwalającym (4% aldehyd glutarowy w 0,1 M buforze fosforanowym, pH = 6,9) (OSTROŻNIE) i przechowywać w temperaturze 4°C przez 24 h (Tabela 1, w celu przygotowania roztworu utrwalającego).
  3. Usunąć roztwór utrwalający za pomocą pipety i zalać próbki wodą destylowaną. Pozostawić na 30 min. Powtórzyć czynność trzykrotnie (Rysunek 2A-C).
  4. Usunąć wodę i zalać próbki 1 M roztworem NaOH (rozpuścić 20 g NaOH w 0,5 L wody destylowanej).
  5. Podczas przejaśniania liści roztwór NaOH zmieni kolor na zielony. Wymieniać roztwór NaOH na świeży raz dziennie. Kontynuować czynność przez 3 do 4 dni lub do momentu, aż próbki staną się bladożółte, a roztwór NaOH pozostanie przejrzysty (Rysunek 2D-F).
  6. Usunąć roztwór NaOH i zalać próbki wybielaczem (5% NaClO). Odpowiedni będzie komercyjny wybielacz domowy o takim stężeniu.
  7. Inkubować próbki w wybielaczu przez 1-2 min. Próbki staną się białe i półprzezroczyste (Rysunek 2G-I).
  8. Usunąć poprzedni roztwór i zalać próbki wodą destylowaną na 2 min. Odwodnić próbki, stosując szereg stopniowania w wodzie destylowanej i etanolu w następujący sposób: 75:25, 50:50, 25:75 oraz 100% etanolu.
  9. Usunąć etanol i zalać próbki 3% alkoholowym roztworem błękitu toluidyny O (TBO, rozpuścić 3 g TBO w 10 mL 10% etanolu). Pozostawić na noc.
  10. Usunąć roztwór barwiący i zalać próbki 10% etanolem na 2 min. Powtórzyć ten krok, stosując szereg stopniowania w wodzie destylowanej i etanolu w następujący sposób: 25:75, 50:50, 75:25 i na koniec wodą destylowaną (Rysunek 2J-L). W celu zapoznania się z typowymi błędami i krokami rozwiązywania problemów związanych z procesem przejaśniania należy odnieść się do Rysunku 3.
  11. Przechowywać próbki w wodzie destylowanej w temperaturze 4°C do czasu obserwacji.
  12. Przenieść próbki na szkiełko przedmiotowe, dodać kroplę wody destylowanej i przykryć szkiełkiem nakrywką w celu obserwacji mikroskopowej i obrazowania.
  13. Zbadać preparat pod złożonym mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 40x. Zapisać obrazy zgodnie z instrukcją oprogramowania, wraz z odpowiednią skalą. Dalsze informacje znajdują się w Tabeli materiałów.

4. Analiza obrazu i pomiary

  1. Użyj programu Fiji23 (ImageJ distribution, wersja 1.54p) do przetwarzania i analizy obrazów.
  2. Używając narzędzia Linia, narysuj linię wzdłuż paska skali, a następnie wybierz Analiza > Ustawienie skalizmodyfikuj znaną odległość na długość paska skali i zmień jednostkę długości na µm.
  3. Przejdź do Analizuj > Ustawienie pomiarówUpewnij się, że Pole powierzchni i średnica Fereta opcje zostały zaznaczone.
  4. Użyj Wybór wielokąta Narzędzie do obrysowania analizowanego obiektu. Zapisz pomiar, naciskając przycisk M klucz
  5. Zmierz następujące cechy aparatów szparkowych i naskórka w programie Fiji i oblicz je zarówno dla próbek przejrzystych, jak i odwarstwień naskórka ze szparkami (Rycina 3).
  6. Oblicz liczbę szparek (Ns).
    1. Wyznacz średnią powierzchnię aparatów szparkowych (As).
    2. Wyznacz średnią szerokość szparek (Ws): przy użyciu minimalnej średnicy Fereta.
    3. Oblicz gęstość aparatów szparkowych (SD), korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-1
      ; na jednostkę Ia (obszar liścia wybrany do pomiarów, mm²2).
    4. Wyznacz średnią powierzchnię komórek naskórka (Ae).
    5. Wyznacz gęstość komórek naskórka (ECD), korzystając z następującego wzoru:
      figure-protocol-2

5. Statystyka

  1. Użyj analizy ANOVA oraz testu post-hoc Tukeya (HSD) w celu zweryfikowania różnic między grupami próbek.
  2. Przeprowadź wszystkie analizy statystyczne w programie R21.
  3. Przeanalizuj łącznie 3 powtórne liście na gatunek i obejrzyj 3 fragmenty naskórka z każdego liścia.

6. Analiza wspomagana przez AI

  1. Wybór narzędzi uczenia maszynowego do segmentacji.
    1. Wybierz odpowiednie narzędzia segmentacji oparte na uczeniu maszynowym w zależności od docelowej struktury (aparaty szparkowe lub komórki epidermy), jakości obrazu i celów analizy.
    2. Użyj modelu głębokiego uczenia specyficznego dla aparatów szparkowych do zautomatyzowanej detekcji i pomiaru cech szparkowych oraz użyj generalnych narzędzi głębokiego uczenia lub segmentacji opartej na pikselach do segmentacji komórek epidermy.
    3. Informacje o konkretnych implementacjach oprogramowania znajdują się w sekcji Narzędzia i oprogramowanie do uczenia maszynowego (plik uzupełniający).
    4. Przeprowadź testy pilotażowe na podzbiorze obrazów przed analizą na dużą skalę, aby ocenić wydajność segmentacji i zidentyfikować potencjalne źródła wyników fałszywie dodatnich.
  2. Przygotowanie środowiska obliczeniowego.
    1. Użyj stacji roboczej wyposażonej w procesor 8-12 rdzeniowy, co najmniej 32 GB RAM oraz procesor GPU NVIDIA z obsługą CUDA i minimum 24 GB VRAM.
    2. Użyj wyświetlacza o wysokiej rozdzielczości (najlepiej 4K), aby ułatwić adnotację i inspekcję wizualną.
    3. Zainstaluj wszystkie wybrane narzędzia programowe zgodnie z instrukcjami programistów i zapisz wersje oprogramowania, aby zapewnić powtarzalność.
  3. Przygotowanie obrazów do analizy uczenia maszynowego.
    1. Importuj obrazy mikroskopowe w formacie TIFF lub PNG, stosując w miarę możliwości obrazy w skali szarości 8 lub 16-bitowe.
    2. Upewnij się, że każdy obraz zawiera widoczny pasek skali lub został skalibrowany przestrzennie przed analizą.
    3. Wybierz obszary zainteresowania z minimalną ilością zanieczyszczeń, zagięć lub pęcherzyków powietrza, z równomiernym oświetleniem i wyraźnie zdefiniowanymi granicami komórek.
    4. Wyklucz obrazy z rozmytymi krawędziami, silnymi cieniami lub niskim kontrastem, ponieważ obniżają one dokładność segmentacji.
  4. Wykonanie segmentacji aparatów szparkowych.
    1. Wczytaj obrazy do modelu głębokiego uczenia specyficznego dla aparatów szparkowych (plik uzupełniający, sekcja 1).
    2. Skonfiguruj parametry detekcji, w tym limity rozmiarów obiektów i progi ufności, zgodnie z gatunkiem i rozdzielczością obrazu.
    3. Uruchom zautomatyzowaną detekcję, aby segmentować kompleksy szparkowe i wyodrębnić mierniki wyjściowe, takie jak liczba szparek, powierzchnia i średnice Fereta.
    4. Wyeksportuj maski segmentacji i tabele pomiarowe do dalszej analizy. Dokonaj wizualnej inspekcji nakładek segmentacji i w razie potrzeby ręcznie wyklucz błędnie wykryte obiekty.
  5. Wykonanie segmentacji komórek epidermy.
    1. Wczytaj obrazy do generalnego narzędzia segmentacji głębokiego uczenia lub klasyfikatora opartego na pikselach (plik uzupełniający, sekcje 2-4).
    2. Wytrenuj lub dostrój model, używając reprezentatywnych obrazów z ręcznie naniesionymi przykładami komórek epidermy, granic komórek i tła.
    3. Uruchom segmentację, aby wygenerować maski obiektów, i wyeksportuj maski do dalszego przetwarzania w ImageJ/Fiji lub równoważnym oprogramowaniu do analizy obrazu.
    4. Zastosuj filtrowanie oparte na rozmiarze lub kwantylach, aby usunąć małe obiekty fałszywie dodatnie, i zweryfikuj dokładność segmentacji poprzez inspekcję wizualną przed wyodrębnieniem mierników komórek epidermy, takich jak powierzchnia komórki i gęstość komórek.
  6. Dokumentowanie parametrów i kontrola jakości.
    1. Zapisz wszystkie wersje oprogramowania, ustawienia parametrów, progi filtrowania i specyfikacje sprzętowe użyte podczas analizy.
    2. Zachowaj reprezentatywne nakładki segmentacji, aby udokumentować jakość segmentacji.
    3. Wizualnie zweryfikuj wyniki zautomatyzowanej segmentacji przed analizą statystyczną lub raportowaniem danych.
  7. Przygotowanie obrazów do wszystkich procesów ML
    1. Obrazowanie próbek
      ​UWAGA: Ponieważ segmentacja oparta na ML polega na gradientach intensywności, ciągłości krawędzi i spójnej geometrii obiektów, a nie na kontekście biologicznym, wstępne przetwarzanie obrazów i wybór obszaru mają krytyczny wpływ na wydajność modelu i strukturę błędów.
      1. Przechwyć obrazy o wysokiej rozdzielczości oczyszczonych lub obranych powierzchni liści z widocznym paskiem skali. Aby zapewnić prawidłowy przebieg analizy ML, upewnij się, że mierzalne obiekty są ostre, ciągłe i mają wysoki kontrast w całym obrazie.
    2. Wybór obszaru i jakość obrazu
      ​UWAGA: Po pozyskaniu obrazów w sekcji 6.7.1, obrazy są poddawane inspekcji wizualnej i, jeśli skala obrazu na to pozwala, ręcznie wybierane są wolne od artefaktów obszary zainteresowania do dalszej segmentacji. Wybieraj obszary zainteresowania z minimalną liczbą artefaktów (np. zanieczyszczenia, zagięcia, pęcherzyki powietrza, nierównomierne oświetlenie). W przypadku modeli szparkowych (np. StoManager1) priorytetem jest wyraźna widoczność porów i dobrze zdefiniowany kontur komórek szparkowych. Dla modeli epidermy (np. Cellpose, ilastik) zapewnij stabilne gradienty intensywności wzdłuż konturów komórek; nieciągłe lub niskokontrastowe krawędzie znacznie obniżają wydajność segmentacji. Obrazy ze słabo zdefiniowanymi granicami powinny zostać wykluczone lub ponownie przetworzone przed segmentacją.
    3. Format pliku
      ​Zapisuj pliki w formacie TIFF lub PNG (do segmentacji zalecana skala szarości 8- lub 16-bitowa).
    4. Opcjonalne ulepszanie obrazu
      1. Zwiększ kontrast lub odejmij tło w ImageJ/Fiji, jeśli granice są słabo widoczne.
      2. Zwróć uwagę na geometrię krawędzi, ponieważ mogą one tworzyć fałszywe gradienty interpretowane jako granice komórek.
      3. Stosuj takie korekty konsekwentnie we wszystkich obrazach w obrębie zestawu danych.
        UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na geometrię krawędzi, ponieważ cienie, halo lub nierównomierne gradienty tła mogą tworzyć sztuczne przejścia intensywności, które modele ML mogą błędnie zinterpretować jako granice komórek.
  8. StoManager1 (wersja GUI v1.0.0)
    UWAGA: StoManager1 umożliwia zautomatyzowaną, wysokoprzepustową detekcję, pomiar i analizę aparatów szparkowych liści roślin z wykorzystaniem splotowych sieci neuronowych (YOLOv8-seg-x). Narzędzie kwantyfikuje kluczowe mierniki szparkowe (powierzchnia, gęstość, stosunek pora/komórka szparkowa, indeksy agregacji itp.) z różnych typów obrazów, ograniczając wysiłek ręczny i stronniczość oraz ułatwiając wielkoskalowe badania ekologiczne i fizjologiczne. Dostępna jest przyjazna dla użytkownika aplikacja na system Windows, która nie wymaga umiejętności programowania, z wyjątkiem opcjonalnego przetwarzania końcowego (plik uzupełniający, Sekcja 1)23.
    1. Uruchomienie StoManager1: instalacja i konfiguracja
      1. Dostęp poprzez GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) lub samodzielną aplikację na system Windows ((plik uzupełniający, sekcja 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.768602)23.
      2. Upewnij się, że wersje bibliotek są kompatybilne (zależności Pythona); mogą wystąpić konflikty, jeśli zainstalowane jest inne oprogramowanie ML/do analizy obrazu.
    2. Uruchom StoManager1 poprzez GUI lub interfejs wiersza poleceń.
    3. Wybierz katalog wejściowy zawierający obrazy liści.
    4. Wybór modelu; Zaznacz model YOLOv8-seg-x dla bardziej szczegółowych mierników opartych na segmentacji. Pozostaw go niezaznaczonym dla modelu ramki ograniczającej (YOLOv3), który dostarcza mniej mierników.
    5. Dostrajanie parametrów; Dostosuj progi detekcji, rozdzielczość obrazu, dylatację maski i limity rozmiarów obiektów zgodnie z potrzebami dla danej metody obrazowania/gatunku. W przypadku, gdy niektóre obiekty szparkowe pozostają niewykryte, należy przede wszystkim (1) obniżyć próg ufności detekcji, aby odzyskać więcej prawdziwych szparek, kontrolując jednocześnie występowanie wyników fałszywie dodatnich; oraz (2) zwiększyć rozdzielczość obrazu, ponieważ większa wartość może poprawić detekcję małych szparek kosztem większych wymagań obliczeniowych.
    6. Uruchomienie segmentacji:
      1. Kliknij „ Start Process”, aby wykryć, segmentować i zmierzyć szparki oraz całe kompleksy szparkowe.
      2. Kliknij „ Statistical Analysis”, aby przetworzyć statystyki na poziomie grup.
    7. Zebranie wyników. Wyniki są zapisywane w YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (tryb segmentacji) lub bezpośrednio w YOUR_OUTPUT_PATH (tryb ramki ograniczającej). Pliki CSV zawierają mierniki dla poszczególnych obiektów oraz podsumowania; generowane są również maski i obrazy wynikowe.
    8. Uruchom przetwarzanie wsadowe.
    9. Po zakończeniu zbierz dane wyjściowe: maski segmentacji i pliki wyników CSV dla każdego obrazu. Wyniki dla obrazu obejmują: liczbę szparek i powierzchnię szparkową, średnicę Fereta (max/min), mierniki komórek szparkowych, indeksy agregacji/równomierności/dywergencji oraz stosunki pora/komórka szparkowa.
    10. Przejrzyj wyniki za pomocą programu Excel, R lub Python w celu przeprowadzenia dalszych analiz statystycznych i wizualizacji.
    11. Kontrola jakości; Wizualnie sprawdź maski i nakładki. Usuń obiekty odstające ze względu na rozmiar, kształt lub poprzez ręczną kuratelę, jeśli jest to konieczne (patrz poniżej).
      UWAGA: Szczegółowe protokoły i kroki przetwarzania końcowego dla programów Cellpose i ilastik znajdują się w pliku uzupełniającym. Dla uzyskania optymalnej wydajności przy dużych zestawach danych i złożonych obrazach zalecamy system z procesorem 8-12 rdzeniowym, co najmniej 32 GB RAM i procesorem GPU NVIDIA z obsługą CUDA i minimum 24 GB VRAM. Do wydajnej adnotacji i wizualizacji silnie zalecany jest również duży wyświetlacz o wysokiej rozdzielczości (najlepiej 4K).

Wyniki

Porównanie wyników między obieraniem a klarowaniem

Zarówno T. officinale, jak i F. excelsior wykazały zmienność cech szparkowych i epidermalnych w zależności od tego, czy próbki zostały poddane przejaśnianiu, czy oddzieleniu naskórka (Rysunek 4). Próbki przejaśniane zazwyczaj oferowały ostrzejsze granice komórek i wyraźniejszą wizualizację kształtu komórek szparkowych oraz szczeliny szparkowej, choć nakładające się warstwy tkanek okazjonalnie przesłaniały mniejsze szparki i zawyżały szacunki wielkości. W przypadku F. excelsior średnia powierzchnia i szerokość szparki były znacząco większe w próbkach przejaśnianych niż w preparatach z naskórka, podczas gdy w T. officinale nie zaobserwowano istotnych różnic. Gęstość szparek była znacząco wyższa w preparatach z naskórka F. excelsior, natomiast w T. officinale nie stwierdzono wpływu metody. Powierzchnia komórek epidermalnych nie różniła się między metodami u żadnego z gatunków, ale gęstość komórek epidermalnych była nieco wyższa w preparatach z naskórka F. excelsior.

Ogólnie rzecz biorąc, różnice zależne od metody były specyficzne dla danej cechy i gatunku, co sugeruje, że obieranie stanowi wiarygodną opcję w pomiarach szparek, szczególnie gdy różnią się one rozmiarem (np. w rozwijających się liściach), podczas gdy cechy epidermy pozostały w dużej mierze niezmienione (Rysunek 5).

Wyniki AI i ich korelacja z metodami peelingu i oczyszczania

Model specyficzny dla aparatów szparkowych StoManager1 wykrywał szparki bardziej niezawodnie na obrazach z preparatów z naskórka (Rysunek 6), natomiast jego wydajność znacznie spadła w przypadku próbek przejaśnionych (Rysunek 7). Aby dalej ocenić wydajność StoManager1 w zależności od metod przygotowania, porównaliśmy wykrywanie cech szparek u T. officinale i F. excelsior z wykorzystaniem zarówno naskórków, jak i obrazów z próbek przejaśnionych (Rysunek 8). U T. officinale model niezawodnie wykrywał obecność i gęstość szparek we wszystkich metodach przygotowania. Jednak uzyskane wartości różniły się znacząco od pomiarów ręcznych (Tabela 2 oraz Rysunki 5 i 8). Większość cech szparek różniła się istotnie (p < 0.05) między próbkami z naskórka a przejaśnionymi (Rysunek 8), co wskazuje, że potoki detekcji AI są bardzo wrażliwe na metody przygotowania i wymagają starnej walidacji przed zastosowaniem na szeroką skalę. W przeciwieństwie do tego, u F. excelsior detekcja była ograniczona do powierzchni abaksjalnej ze względu na brak szparek adaksjalnych, a w próbkach przejaśnionych detekcja była niespójna, z częstymi wynikami fałszywie dodatnimi (Rysunek 8). Wyniki te podkreślają silny wpływ gatunkowych cech anatomicznych i jakości obrazu na skuteczność analiz opartych na AI. Ogólne narzędzia ML, takie jak Cellpose (Rysunek 9A) i Ilastik (Rysunek 9B), segmentowały komórki epidermy skuteczniej na obrazach z naskórka niż na obrazach z próbek przejaśnionych. Jednak oba narzędzia generowały liczne wyniki fałszywie dodatnie przy obu technikach przygotowania (zdzieraniu naskórka i przejaśnianiu), zwłaszcza w warunkach niskiego kontrastu lub gdy kontury komórek były rozmyte. W takich przypadkach niewyraźne kontury szparek lub komórek epidermy były często nadsegmentowane na wiele maleńkich obiektów błędnie zaklasyfikowanych jako pojedyncze komórki epidermy (patrz Rysunek 10). W konsekwencji niezbędne jest przetwarzanie wstępne, nie tylko usuwanie wartości odstających, ale także filtrowanie według górnych kwantyli, aby zachować niezawodnie zidentyfikowane komórki.

figure-results-1
Rysunek 1: Preparaty z naskórka szparkowego liści F. carica przed i po usunięciu trichomów za pomocą żyletki. Duże trichomy mogą pozostawiać odciski na preparacie, tworząc pęcherzyki powietrza, co prowadzi do powstania nierównych powierzchni i utrudnia stabilne ustawienie ostrości (widoczne jako duże szare kropki). F. carica została uwzględniona jako przykład nietypowy, aby rozszerzyć protokół na liście owłosione. (A) Przy powiększeniu 20x obraz przed usunięciem trichomów jest częściowo przesłonięty przez ich odciski. (B) Jakość obrazu poprawia się po usunięciu trichomów. (C) Przy powiększeniu 40x obraz przed usunięciem trichomów jest w znacznym stopniu przesłonięty przez odciski trichomów. (D) Przeszkody są minimalne na obrazie po usunięciu trichomów za pomocą żyletki. Paski skali: 10 µm (A, B) i 50 µm (C, D). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Kolejne etapy protokołu przejaśniania. Reprezentatywne obrazy gatunków T. officinale, F. excelsior oraz F. carica ilustrują następujące po sobie etapy protokołu przejaśniania. (A-C) Świeże liście. (D-F) Liście po przejaśnianiu za pomocą NaOH. (G-I) Liście po wybielaniu za pomocą NaClO. (J-L) Liście po barwieniu błękitem toluidynowym O. Pomoc wizualna ta przedstawia oczekiwany wygląd próbki przed przejściem do następnego kroku i podkreśla zmienność protokołu w zależności od gatunku. F. carica została dołączona jako gatunek nietypowy, aby zademonstrować zastosowalność protokołu dla szerszego zakresu morfologii liści i użylenia. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykładowe pomiary cech aparatów szparkowych i epidermy. Zmierzone cechy są zilustrowane na obrazie w następujący sposób: As = powierzchnia szparki; Ls = długość szparki; Ws = szerokość szparki; Ae = powierzchnia komórki epidermy. Gęstość aparatów szparkowych oraz gęstość komórek epidermy obliczono w obszarze zaznaczonym, zgodnie z opisem w protokole. Obraz przy powiększeniu 40x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4Porównanie obrazów uzyskanych z zastosowaniem protokołu klarowania oraz protokołu peelingowania. Reprezentatywne obrazy T. officinale i *F. excelsior* porównanie obrazów po przejaśnianiu i obrazów preparatów z naskórka szparkowego, wykazujące widoczność oraz zmienność szparek, a także wielkość i gęstość komórek naskórka. Pasek skali 50 µmi wykonuje się zdjęcia przy powiększeniu 40x. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

figure-results-5
Rysunek 5: Różnice w wynikach ręcznego pomiaru cech między protokołem przejaśniania a obierania. Wykresy pudełkowe przedstawiające różnice w cechach aparatów szparkowych i epidermy między metodą przejaśniania a metodą obierania naskórka u T. officinale i F. excelsior. (A) średnia powierzchnia szparki (B) średnia szerokość szparki (C) gęstość szparek (D) średnia powierzchnia komórki epidermy oraz (E) gęstość komórek epidermy. Gwiazdki wskazują poziomy istotności statystycznej (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,01). Istotność statystyczną oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post-hoc Tukeya HSD. Wielkość próby w grupie: n = 3-5. Skróty: As = powierzchnia szparki; Ws = szerokość szparki; SD = gęstość szparek; Ae = powierzchnia komórki epidermy; ECD = gęstość komórek epidermy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Przykład wyników segmentacji z wykorzystaniem modelu detekcji aparatów szparkowych w próbce naskórka. Wynik segmentacji StoManager1 dla próbki naskórka T. officinale (dolna strona dojrzałego liścia wystawionego na cień), wykazujący wysoką dokładność detekcji. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

figure-results-7
Rycina 7: Przykład wyniku segmentacji przy użyciu modelu detekcji aparatów szparkowych w próbce przejaśnionej. Wynik segmentacji StoManager1 dla przejaśnionej próbki T. officinale (dolna strona dojrzałego liścia wystawionego na cień), wykazujący obniżoną dokładność detekcji w porównaniu z próbkami po obraniu z naskórka. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-8
Rysunek 8: Różnice w wynikach pomiarów cech wspomaganych przez AI pomiędzy protokołem przejaśniania a protokołem złuszczania.Wykresy pudełkowe przedstawiające pomiary cech anatomicznych aparatów szparkowych wykonane przez AI na podstawie obrazów przetworzonych przez StoManager1 u T. officinale i F. excelsior. Cechy obejmują pole szparki (As), szerokość szparki (Ws), długość szparki (Ls) oraz gęstość szparek (Ds). Jednostki są takie same jak na Rysunku 5. Istotność statystyczną oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy ANOVA, a następnie testu post-hoc Tukeya HSD. Gwiazdki oznaczają poziomy istotności statystycznej (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,01). Wielkość próby w grupie: n = 3-5. Skróty: As = pole szparki; Ws = szerokość szparki; Ls = długość szparki; Ds = gęstość szparek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Zrzuty ekranu przedstawiające segmentację za pomocą ogólnoustosunkowego narzędzia uczenia głębokiego oraz klasyfikatora opartego na pikselach. Segmentacje obranej próbki F. excelsior (dolna powierzchnia liścia) wykonane przy użyciu (A) ogólnoustosunkowego narzędzia uczenia głębokiego (Cellpose (cyto2)) oraz (B) klasyfikatora opartego na pikselach (ilastik). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-10
Rycina 10: Maska segmentacji Ilastik dla obranej próbki F. excelsior (strona abaksjalna liścia), wykazująca liczne wyniki fałszywie dodatnie. Małe kropki zostały błędnie zaklasyfikowane jako odrębne komórki epidermy. Podczas postprocesowania wymagana jest ręczna (wizualna) inspekcja w celu ustawienia progów opartych na rozmiarze, aby skutecznie odfiltrować wyniki fałszywie dodatnie. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

RoztwórPrzygotowanieObjętość końcowa
Baza buforu 17,12 g (Na2HPO (histopatologia)4 *2H2O) w 20 ml destylowanej wody2O20 ml
Baza do buforu 27,12 g Na2HPO (mikroskopia wysokiej rozdzielczości)4 *2H2O) w 20 ml destylowanej wody2O20 ml
Bufor fosforanowy Wymieszać 36 ml bazy 1, 14 ml bazy 2 + 50 ml  z dyst.H2O10 mL
Roztwór utrwalającyWymieszać 9,25 ml 5% glutaraldehydu z 12,5 ml buforu fosforanowego i 28,25 ml wody destylowanej.2O50 ml

Tabela 1: Skład roztworu utrwalającego24. Skład roztworów użytych w niniejszym badaniu.

GatunkiBocznyMetodaMężczyzna (As)Sztuczna inteligencja (SI)Człowiek (Ws)Sztuczna inteligencja (Ws)Człowiek (Ls)Sztuczna inteligencja (AI) (Ls)
JesionGrzbietowyObierz177.439.3212.712.8517.583.58
MniszekGrzbietowyOczyszczony408.0918.8420.14.1926.145.39
MniszekGrzbietowyObierz262.5413.9315.183.4722.24.68
MniszekAdaksjalnyWyczyszczono414.4814.9120.113.4426.095.71
MniszekAdaksjalnyObierz258.7211.3715.723.321.154.08

Tabela 2: Wskazujące porównania pomiarów ręcznych i AI. Wyniki skalowane przez ML (StoManager1). Man i AI oznaczają odpowiednio wyniki pomiarów ręcznych i AI (StoManager1). Jednostki są zgodne z Rysunkiem 5. Pomiary ręczne i AI różnią się znacząco. Niektóre porównania są niedostępne z różnych powodów, w tym z powodu braku aparatów szparkowych (np. strona adaksjalna F. excelsior) lub niepowodzenia detekcji (np. aparaty szparkowe były trudniejsze do wykrycia w próbkach przejaśnionych ze względu na bardziej rozmyte kontury komórek).

Rysunek uzupełniający 1: Przykłady częstych błędów popełnianych podczas przejaśniania liści, które wpływają na wyniki. Obrazy przedstawione w celach rozwiązywania problemów: (A) nierównomierne barwienie wynikające z niepełnej rehydratacji próbki podczas etapu 3.10; (B) uszkodzenia mechaniczne będące wynikiem niewłaściwego obchodzenia się z chemicznie przetworzoną, bardzo kruchą próbką; (C) zielonkawy odcień w centrum próbki spowodowany niepełnym usunięciem chlorofilu podczas etapu 3.5. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 2: Przykład interfejsu użytkownika StoManager1. Zrzut ekranu interfejsu użytkownika StoManager1 przedstawiający konfigurację wejściową i tabelę wyników (po lewej) oraz widoki mikrografii z obrazami oryginalnymi (prawy górny róg) i nałożoną warstwą detekcji aparatów szparkowych (prawy dolny róg, powierzchnia adaksjalna obranej próbki T. officinale).Aby pobrać ten rysunek, kliknij tutaj.

Rysunek uzupełniający 3: Przykład interfejsu użytkownika Cellpose. Zrzut ekranu z przebiegu segmentacji w programie Cellpose za pomocą interfejsu graficznego (GUI) z regulowanymi parametrami (np. wybór modelu – zalecany wstępnie wytrenowany model cyto2 lub model wytrenowany własnym sposobem, progi oraz kalibracja średnicy komórek). Nadzorowana manualna adnotacja komórek epidermy wyróżnia każdą komórkę unikalnym kolorem w celu przeprowadzenia kalibracji modelu. Nałożona warstwa pokazuje segmentację preparatu z epidermy abaksjalnej F. excelsior. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 4: Proces segmentacji w programie Ilastik. Nałożenie warstw ilustruje klasyfikację opartą na pikselach na obrazie preparatu z naskórka abaksjalnego F. excelsior. (A) Zrzut ekranu z przebiegu segmentacji w programie Ilastik, przedstawiający uczenie nadzorowane z ręcznie oznaczonymi klasami: komórki naskórka (żółty), kontury komórek (niebieski) oraz tło poza naskórkiem, takie jak trichomy (czerwony). (B) Zrzut ekranu pokazujący tylko klasę naskórka (żółty), ilustrujący sposób, w jaki klasyfikator izoluje poszczególne komórki naskórka. Należy zwrócić uwagę na obecność wielu fałszywie dodatnich „drobnych” detekcji, szczególnie w obszarach o niskim kontraście lub nierównomiernym oświetleniu. (C) Zrzut ekranu pokazujący tylko klasę konturów (niebieski), ilustrujący sposób, w jaki klasyfikator izoluje granice komórek od otaczającej tkanki naskórkowej. Należy zauważyć, że niektóre kontury są nieciągłe i występują liczne fałszywie dodatnie „drobne” detekcje, zwłaszcza w obszarach o niskim kontraście lub nierównomiernym oświetleniu. (D) Zrzut ekranu pokazujący klasę tła. Maska wyróżnia kompleksy szparkowe, trichomy gruczołowe oraz różne zanieczyszczenia (czerwony), wykluczając ciała komórek naskórka. W obrębie obszarów naskórka widoczne są liczne małe fałszywie dodatnie „drobne” detekcje, wynikające z artefaktów skali szarości i błędnej klasyfikacji opartej na teksturze. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 5: Ustawienia trenowania Cellpose. Przykład ustawień trenowania Cellpose (GUI) dla oczyszczonej próbki T. officinale (obie strony liścia), przedstawiający domyślne parametry modelu przed dostrojeniem. Wybrano wstępnie wytrenowany model cyto2 z tempem uczenia (learning rate) wynoszącym 0.1 oraz 10 epokami trenowania (wartości domyślne), które określają odpowiednio szybkość aktualizacji wag modelu oraz liczbę przejść treningowych. Wartości domyślne te są często modyfikowane (np. learning rate = 0.15; epoki = 12), aby skrócić czas trenowania i dostosować model do morfologii epidermy roślinnej; jednak mniejsza liczba epok może obniżyć wydajność detekcji i zwiększyć liczbę wyników fałszywie dodatnich. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 6: Maska „etykiet” (labels) Cellpose. Zastosowanie maski „etykiet” Cellpose dla próbki zdartej tkanki F. excelsior (abaksjalna powierzchnia liścia), przedstawiające wynik nadzorowanego uczenia, w którym każdemu segmentowanemu obiektowi przypisany jest unikalny identyfikator. Dominują komórki epidermy (oznaczone e), natomiast wykryto również pary komórek szparkowych (oznaczone g). Widoczne są wyniki fałszywie dodatnie w miejscach, gdzie trichomy zostały błędnie sklasyfikowane jako komórki epidermy (lewa góra) lub szparki (środek na dole), a także wyniki fałszywie ujemne w obszarach obrazu, w których komórki epidermy pozostały nieoznaczone. Ten typ maski jest wykorzystywany do dalszej kwantyfikacji i doprecyzowania modeli nadzorowanych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 7: Kwantyfikacja segmentowanych komórek epidermy w programie ImageJ/Fiji. Zrzuty ekranu przedstawiające kwantyfikację segmentowanych komórek epidermy po klasyfikacji pikseli w programie ilastik dla próbki obranej F. excelsior (dolna powierzchnia liścia). (A) W wyeksportowanej masce każdy wykryty klaster pikseli odpowiada pojedynczej cząsteczce, co umożliwia automatyczną ekstrakcję metryk na poziomie obiektów (np. pola powierzchni, obwodu, średnic Fereta). Okno Wyników (na dole) wyświetla surowe pomiary dla tysięcy obiektów; należy zwrócić uwagę na wyjątkowo wysoką liczbę małych cząsteczek wynikającą z szumu w postaci „drobnych” kropek oraz fragmentarycznych konturów, co wskazuje na obecność licznych wyników fałszywie dodatnich. Artefakty te wymagają późniejszego filtrowania w oparciu o wiedzę biologiczną w celu wyizolowania prawdziwych komórek epidermy przed dalszą analizą statystyczną. (B) Filtrowanie obiektów epidermy segmentowanych w programie ilastik na podstawie pola powierzchni w programie ImageJ/Fiji. Małe fragmenty i szumy są wykluczane poprzez zastosowanie minimalnego progu pola powierzchni wynoszącego 150-350 µm², co redukuje liczbę wykrytych cząsteczek około dziesięciokrotnie w stosunku do niefiltrowanej maski na panelu A. Chociaż ten etap filtrowania w znacznym stopniu usuwa drobne wyniki fałszywie dodatnie, nadal występuje niedoskonała klasyfikacja: fragmenty konturów i pozostałe elementy nieepidermalne nadal występują i wymagają dodatniego dopracowania, np. poprzez progi kolistości lub post-screening w oparciu o wiedzę biologiczną. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 8: Postprocesing danych z programu Cellpose "etykiety" maska w programie ImageJ/Fiji. Przez korzystując z wtyczki Labels to ROIs dla obrazu z usuniętym tłem *F. excelsior* próbka (spód liścia); każdy posegmentowany obiekt w masce zostaje przekształcony w obszar zainteresowania (ROI), co umożliwia indywidualną inspekcję i pomiar komórek epidermy oraz kompleksów komórek szparkowych. Obszary ROI są nałożone na oryginalny mikrograf (po lewej), natomiast okno wyników (na dole po prawej) wyświetla parametry na poziomie komórkowym (np. pole powierzchni, średnice Fereta, obwód). Krok ten umożliwia kuratelę opartą na wiedzy biologicznej, pozwalając użytkownikom na zweryfikowanie, czy każdy obszar ROI odpowiada rzeczywistej komórce epidermy, oraz na odrzucenie artefaktów, takich jak trichomy lub błędnie posegmentowane szparki, które pozostały po filtrowaniu progowym, co dostarcza istotnych danych dla kolejnych etapów analizy. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Dyskusja

Aby uzyskać spójne pomiary szparki, należy pobierać oskórki z centralnej warstwy szparkowej dla standaryzowanych wyników, unikając przy tym dużych żyłek, ponieważ gęstość szparków wykazuje silne zróżnicowanie wewnątrz liścia, malejące w kierunku podstawy liścia, końcówki i brzegów25,26. Świeże liście dają najbardziej niezawodne opanowania, pod warunkiem użycia niekurczącego się, przezroczystego lakieru do paznokci oraz wysokiej jakości przezroczystej taśmy, aby uniknąć zniekształceń lub artefaktów. Opóźnienia powyżej ~12 godzin zmniejszają klarowność konturu przez odwodnienie. Ponieważ peelingi są tymczasowo zamocowane i mogą zatrzymywać powietrze, zaleca się wczesne obrazowanie, ale jakość pozostaje akceptowalna także po miesiącu.

Istnieją różne metody oczyszczania dla konkretnych typów tkanek, celów obrazowych oraz kwestii bezpieczeństwa13, 14, 15. Oczyszczanie chemiczne przeprowadzono za pomocą wodnego protokołu opartego na NaOH ze względu na dostępność, niską toksyczność i szeroką skuteczność we wszystkich typach liści. Ponieważ odpowiedzi tkanek różnią się między gatunkami, konieczne są testy i optymalizacja. Liście twardzonofilne mogą wymagać ≥2 tygodni, a pozostała zielona tkanka może zakłócać barwienie i zaciemniać cechy anatomiczne (Ilustracja uzupełniająca 1C). Dla szybszego oczyszczania stężenie NaOH można zwiększyć do 2,5 M lub 5 M. Miękkie liście stają się delikatne po wybielaniu (Sekcja 3.7; Dodatkowy rysunek 1B), oraz nadmierna ekspozycja na podchloryn sodu (NaClO) mogą rozkładać tkanki lub powodować rozdzielanie warstw naskórka. Podczas gdy 30 sekund do 2 minut wybielania wystarcza na większość miękkich liści, twardsze gatunki mogą wymagać nawet 1 godzinyi 27 minut. Chociaż oczyszczanie jest wolniejsze niż przygotowanie do obierek, wymaga ~5 dni i nie wymaga specjalistycznego szkolenia, można go dostosować do różnorodnych gatunków. Oczyszczone i barwione próbki można przechowywać w wodzie destylowanej w temperaturze 4°C, a zalecane jest stałe montaż dla długoterminowej konserwacji15,27.

Specyficzny dla szparków szparkowy StoManager1 niezawodnie wykrywał kompleksy szparkowe na większości typów obrazów (Ilustracja uzupełniająca 2), a wyniki detekcji są zazwyczaj zgodne z ręczną adnotacją dla metod opartych na peelingu. Jednak pomiary powierzchni szparków szparkowych różniły się systematycznie od pomiarów ręcznych (Tabela 2), co wymagało kalibracji na podstawie niewielkiego ręcznie mierzonego podzbioru (np. 10-20 szparków szparkowych na gatunek) przed analizą na dużą skalę. StoManager1 znacznie zwiększa przepustowość, a w niestandardowych przypadkach wymagana jest ręczna weryfikacja.

Równoczesna segmentacja szparków szparkowych i naskórka jest trudna, ponieważ optymalna ostrość różni się, a heterogeniczność morfologii i klarowności błony powoduje błąd segmentacji. Podobnie trening na dużych zbiorach obrazów (np. powierzchnie adaxialne/abaksjalne, odklejone/wyczyszczone) tracą specyficzność. Nie istnieje wstępnie wytrenowany model Cellpose dla naskórka roślin; Standardowe modele "cyto" i "cyto2", trenowane głównie na komórkach zwierzęcych, osiągają gorsze wyniki na obrazach naskórka. Dlatego dla niezawodności wymagane jest szkolenie indywidualne (Uzupełniająca sekcja 2). Nawet po treningu nadmierna segmentacja i fałszywe alarmy pozostają częste, szczególnie na obrazach o niskim kontraście lub niewyczyszczonych (Ilustracja uzupełniająca 3).

W ilastyku (Sekcja uzupełniająca 3, rysunek uzupełniający 4) maski obiektowe powinny być generowane dla klas komórek docelowych (np. klasa 1 dla naskórka), zachowując maski klasowe do audytu i ręcznej korekty. Przetwarzanie wsadowe i późniejsze workflowy ImageJ/Fiji mogą zaoszczędzić czas i zmniejszyć błędy ręczne. Konsekwentne filtrowanie według powierzchni, odchylenia standardowego lub kwantyli jest niezbędne do tłumienia szumu i fałszywych detekcji. Po przefiltrowaniu mediana powierzchni komórek i liczba komórek zbliżają się do wartości ręcznych. Benchmarking z ręcznymi pomiarami i alternatywnymi narzędziami ML (Weka, RootPainter) pozostaje niezbędny do strojenia parametrów i oceny jakości segmentacji. Przetwarzanie wsadowe w ML jest bardzo wymagające zasobów. Stabilne trenowanie i segmentacja wsad na dużą skalę wymagają karty graficznej obsługującej NVIDIA CUDA oraz ≥32 GB RAM. W systemach średniej klasy (np. 16 GB RAM z zintegrowaną grafiką) nadzorowane szkolenie zazwyczaj zajmuje ~5-10 minut na obrazy <10 i często zawiesza się, gdy używano wielu klas adnotacji lub heterogenicznych typów obrazów. CUDA zwiększyła prędkość przetwarzania o ~10-20 razy w porównaniu do wykonania CPU lub zintegrowanej GPU.

Różnice w wydajności między Cellpose, ilastik i StoManager1 wynikają z ich odrębnych reprezentacji cech. Cellpose przewiduje pola wektorowo-przepływowe w kierunku centrów obiektów i jest wrażliwa na aureole optyczne oraz nagłe granice załamania, które zakłócają przepływ i generują skupiska fałszywych alarmów w oczyszczonym F. excelsior. Ilastik, jako klasyfikator pikseli prowadzony przez człowieka, przecina wysokoreliefowe ściany komórkowe lub halo nawierzchni, chyba że wyraźnie oznaczono jako tło. StoManager1 wykrywa kompleksy szparkowe za pomocą wzorców kształtów na poziomie obiektu (parowane komórki strażnicze z centralnym porem) i dobrze sprawdza się na preparatach oskórki, w tym F. excelsior28; jednak rozmycie wywołane halo wpływa na widoczność porów podczas oczyszczania, powodując fałszywe negatywy, a nie błędną klasyfikację (sekcje 1 i 3 pliku uzupełniającego). W związku z tym Cellpose i StoManager1 działają jako automatyczne segmentery, podczas gdy ilastik pełni funkcję klasyfikatora sterowanego przez człowieka (Supplementary filesection 1-3)28.

Architektura komórek specyficznych dla gatunku moduluje wydajność AI. W T. officinale gładkie, eliptyczne marginesy komórek ochronnych odpowiadają rozkładowi treningowemu StoManager1, umożliwiając wykrywanie na odklejonych próbkach (Ilustracja uzupełniająca 2), podczas gdy narzędzia ogólne często myliły komórki strażnicze i nawierzchniowe. U F. excelsior zagłębione szparki szparkowe i komórki nawierzchni o wysokim reliefie prowadzą do fałszywych negatywów na czystych obrazach. Te rozbieżności odzwierciedlają geometrię obrazowania zależną od gatunku i przygotowania. Systematyczne różnice między pomiarami ręcznymi a opartymi na AI wynikają z dwóch źródeł: braku kodowania skali z obrazu przez AI oraz artefaktów optycznych wywołanych przez przygotowanie. Strategie łagodzące obejmują wizualną triażę rozmyć i aureoliek powstałych w przygotowaniu tkanek, preferencyjne stosowanie peelingów w warunkach opisanych powyżej, ręczną kalibrację z korektą liniową na niewielkim podzbiorze szparków szparkowych (manualnie = a + b × AI). Dodatkowe strategie obejmują uzupełnianie specyficzne dla taksonu oraz projektowanie klas pomocniczych do treningu (jednak własne wytrenowane modele prawdopodobnie pozostaną niższe niż modele wstępnie wytrenowane na dużych, zróżnicowanych zbiorach danych) oraz filtrowanie górnych kwantyli po segmentacji.

Ponieważ błędy segmentacji AI są systematyczne, nielosowe, niezbędne jest postprocessing. Diagnostyka o jakości obrazu może opierać się na prostym drzewie decyzyjnym. Zacznij od sprawdzenia kontrastu i ostrości naskórka: jeśli ostre, przejdź do fałszywie pozytywnych wyników; Jeśli są rozmyte, spodziewaj się drobnych artefaktów wysokiej częstotliwości i dostosuj filtry. Jeśli fałszywie pozytywne wyniki (np. kropki, zanieczyszczenia) są minimalne, zwykle wystarczy filtrowanie odstających ±2-3 SD. Jeśli dominują drobne artefakty, stosuj filtrowanie oparte na kwantyle. Następnie porównaj rozkłady cech (np. mediana Ae) z oczekiwaniami biologicznymi lub danymi ręcznymi. Doprecyzuj progi w razie potrzeby – utrzymywanie tylko górnych 10-50% kwantyli w zbiorach danych bogatych w artefakty zapewnia istotne wyniki (Ilustracje uzupełniające 7 i 8). Ze względu na wysokie wskaźniki fałszywie pozytywnych wyników generowanych przez narzędzia ML naskórka, wiarygodne oszacowania gęstości szparków szparkowych nie mogły być automatycznie oszacowane, podczas gdy StoManager1 zapewniał precyzyjne pomiary szparkiszparkowej 28, gdy granice były wyraźne (patrz Rysunki 6 i 7). Dla mediany naskórkowej Ae okazała się odporna, mniej wrażliwa na małe fałszywe pozytywne wyniki niż średnia.

Wybór metody wpływał na wykrywanie cech. Peeling przewyższał usuwanie gęstości szparków szparkowych dzięki całkowitemu odsłonięciu szparków (Rysunek 3), podczas gdy usuwanie często zasłaniało mniejsze szparki w tkankach warstwowych lub pigmentowanych, mimo że czasem lepiej zachowywało kształt szparkówszparkowych 27. Wśród narzędzi AI StoManager1 konsekwentnie zapewniał solidne pomiary szparków szparkowych przy minimalnym selekcji, szczególnie na preparatach peelingowych23, a peeling poprawiał także pomiary naskórka poprzez zwiększenie prawidłowo zidentyfikowanych komórek i pokrycia obrazów2. Przyszłe korzyści najprawdopodobniej przyniosą duże, taksonomicznie zróżnicowane, wcześniej wytrenowane modele integrujące się z zautomatyzowanymi pipeline'ami obrazowania dla ekofizjologii i poprawy upraw.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy doceniają Program Unii Europejskiej H2020 (projekt GAIN4CROPS, Zgromadzenie Generalne nr 862087). Centrum Doskonałości AgroRoślinPrzyszła Agroekologia i nowe uprawy w przyszłych klimatach (Ministerstwo Edukacji i Badań Estonii), Estońska Rada Badawcza (PRG 3201 i PRG 2207 oraz TARISTU24-TK28).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dezynfekujący płyn do czyszczenia NaClO < 5%Domestos, Wielka BrytaniaH000023244  Oparzenia skóry  
Disodowy fosforan wodoru (Na2HPO4. 2H2O) PENTA, CZ10028-24-7NA
Etanol, abs. 100% a.r.Chem-Lab NV, BECL00.0505.1000  Wysoce łatwopalny 
Fiolka szklana 2 mLVWR Life Science, USA548-0045
Roztwór glutaraldehydu 50%VWR Life Science, USA23H2856331Śmiertelne przy wdychaniu. Toksyczny po połknięciu. Noś rękawiczki ochronne,   odzież i inne ubrania; okulary.
Szkiełka mikroskopoweNormax, PT5470308ANA
Lakier do pielęgnacji paznokci szybko schnącyBfigure-materials-1K (INEZA), porucznikLT-02244NA
Nikon Eclipse E600 i Nikon DS0Fi1 5 MPNikon Corporation, JPhttps://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600NA
Pipeta i końcówki pipetyThermo Scientific, FIKJ16047NA
Ostrza stalowe jednokraczneInstrumenty oksfordzkie51-1625-0182NA
Dihydrofosforan sodu (NaH2PO4 . 2H2O) czystyPENTA, CZ13472-35-0NA
Czyste pellety wodorotlenku sodu (NaOH)Merck KGaA, DE1310-73-2Poważne oparzenia.
Taśma papierowa przezroczystaFOROFIS, LV91231NA
Toluidynowy błękit, klasa ogólnego przeznaczeniaThermoFisher Scientific, GB2045836NA

Bibliografia

  1. Lawson, T., Blatt, M. R. Stomatal size, speed, and responsiveness impact on photosynthesis and water use efficiency. Plant Physiol. 164 (4), 1556-1570 (2014).
  2. Smith, E. N., et al. Improving photosynthetic efficiency toward food security: Strategies, advances, and perspectives. Mol Plant. 16 (10), 1547-1563 (2023).
  3. Flexas, J., et al. What can we learn from the ecophysiology of plants inhabiting extreme environments? from "sherplants" to "shercrops.". J Exp Botany. 76 (17), 4831-4848 (2025).
  4. Wu, S., Zhao, B. Using clear nail polish to make Arabidopsis epidermal impressions for measuring the change of stomatal aperture size in immune response. Plant Pattern Recognit Recept.: Methods Protoc. 1578, 243-248 (2017).
  5. Kübarsepp, L., Laanisto, L., Niinemets, Ü, Talts, E., Tosens, T. Are stomata in ferns and allies sluggish? Stomatal responses to CO, humidity and light and their scaling with size and density. New Phytol. 225 (1), 183-195 (2020).
  6. Pathoumthong, P., Zhang, Z., Roy, S. J., El Habti, A. Rapid non-destructive method to phenotype stomatal traits. Plant Methods. 19 (1), 36(2023).
  7. Warner, C. A., Biedrzycki, M. L., Jacobs, S. S., Wisser, R. J., Caplan, J. L., Sherrier, D. J. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with fluorescence microscopy. Plant Physiol. 166 (4), 1684-1687 (2014).
  8. Petruzzellis, F., et al. Plasticity of functional traits of tree of heaven is higher in exotic than in native habitats. Trees. 33 (2), 411-420 (2019).
  9. Kurihara, D., Mizuta, Y., Nagahara, S., Sato, Y., Higashiyama, T. Optical clearing of plant tissues for fluorescence imaging. J Vis Exp. (179), e63428(2022).
  10. Hériché, M., Arnould, C., Wipf, D., Courty, P. E. Imaging plant tissues: advances and promising clearing practices. Trends Plant Sci. 27 (6), 601-615 (2022).
  11. Ensikat, H. J., Malekhosseini, M., Rust, J., Weigend, M. Visualisation of calcium oxalate crystal macropatterns in plant leaves using an improved fast preparation method. J Microsc. 290 (3), 168-177 (2023).
  12. Li, Y. M., Fei, T., Zhang, H. X., Xie, Z. S., Li, B. Observation of the development of leaf vein and stomata and identification of candidate transcription factors related to vein/stoma development in grapevine leaf (Vitis vinifera L.). Sci Hortic. 307, 111-518 (2023).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Ariel, P. A beginner's guide to tissue clearing. Int J Biochem Cell Biol. 84, 35-39 (2017).
  15. García-Gutiérrez, E., Ortega-Escalona, F., Angeles, G. A novel, rapid technique for clearing leaf tissues. Appl Plant Sci. 8 (9), e11391(2020).
  16. Sai, N., et al. StomaAI: an efficient and user-friendly tool for measurement of stomatal pores and density using deep computer vision. New Phytol. 238 (2), 904-915 (2023).
  17. Liu, C., Sack, L., Li, Y., Zhang, J., Yu, K., Zhang, Q., He, N., Yu, G. Relationships of stomatal morphology to the environment across plant communities. Nat Commun. 14, 42136(2023).
  18. Lawson, T., Vialet-Chabrand, S. Speedy stomata, photosynthesis and plant water use efficiency. New Phytolt. 221 (1), 93-98 (2019).
  19. Stein, R. A., Sheldon, N. D., Smith, S. Y. comparing methodologies for stomatal analyses in the context of elevated modern CO2. Life. 14 (1), 78(2024).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. R Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2025).
  22. Gibbs, J. A., Burgess, A. J. Application of deep learning for the analysis of stomata: a review of current methods and future directions. J Exp Bot. 75 (21), 6704-6718 (2024).
  23. Wang, J., Renninger, H. J., Ma, Q., Jin, S. Measuring stomatal and guard cell metrics for plant physiology and growth using StoManager1. Plant Physiol. 195 (1), 378-394 (2024).
  24. Rikisahedew, J. J., Niinemets, Ü, Scodeller, R., Tosens, T. Assessing structural traits in Triticum aestivum and Zea mays for C and C photosynthetic differentiation using free-hand and semi-thin sections. J Vis Exp. (209), e66843(2024).
  25. Poole, I., Weyers, J. D. B., Lawson, T., Raven, J. A. Variations in stomatal density and index: implications for palaeo climatic reconstructions. Plant Cell Environ. 19 (6), 705-712 (1996).
  26. Smith, S., Weyers, J. D. B., Berry, W. G. Variation in stomatal characteristics over the lower surface of Commelina communis leaves. Plant Cell Environ. 12 (6), 653-659 (1989).
  27. Niewiadomski, I., et al. A comprehensive illustrated protocol for clearing, mounting, and imaging leaf venation networks. Appl Plant Sci. 13 (2), (2025).
  28. Wang, J., Renninger, H. J., Ma, Q. Labeled temperate hardwood tree stomatal image datasets from seven taxa of Populus and 17 hardwood species. Sci Data. 11 (1), (2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Cechy aparat w szparkowychodlepy epidermyprzeja nianie li cianaliza obraz w AImorfologia aparat w szparkowychsegmentacja kom rekkwantyfikacja cechnarz dzia g bokiego uczeniadetekcja aparat w szparkowych

Powiązane artykuły