Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

Liisa Kübarsepp; Mait Rungi; Ülo Niinemets; Vivian Kuusk; Riccardo Scodeller; Tiina Tosens

doi:10.3791/69615

Artykuł metodologiczny

Charakteryzacja cech szparków szparkowych i naskórka za pomocą peelingów, oczyszczania oraz analizy obrazów opartej na AI

DOI:

10.3791/69615

⸱

27 marca 2026

Liisa Kübarsepp¹ , Mait Rungi² , Ülo Niinemets²^,³ , Vivian Kuusk² , Riccardo Scodeller² , Tiina Tosens²

¹Centre of Estonian Rural Research and Knowledge, ²Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, ³Estonian Academy of Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia porównawczą metodę oceny cech szparkowych i naskórkowych u dwóch odrębnych gatunków za pomocą peelingów naskórnych, technik oczyszczania oraz analizy obrazowej wspomaganej przez AI. Celem jest umożliwienie wysokoprzepustowej, powtarzalnej ilościowej identyfikacji struktur komórkowych leżących u podstaw funkcji szparków szparkowych dla zastosowań rolniczych oraz szerokich badań roślinnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładna charakterystyka morfologii szparki szparkowej oraz otaczających cech naskórka jest niezbędna do zrozumienia funkcji szparki. Przedstawiono protokół porównawczy z wykorzystaniem dwóch uzupełniających się technik – peelingów naskórnych i usuwania liści – aby ocenić rozmiar, kształt i gęstość komórek szparkowych i naskórnych u dwóch ekologicznie odrębnych gatunków dwukątnych: Fraxinus excelsior i Taraxacum officinale. Protokół obejmuje szczegółowe kroki przygotowania próbki, obrazowania i kwantyfikacji cech z wykorzystaniem kosztowo i efektywnych prac pomiarów ręcznych (czyszczenie tkanek i obieranie) oraz analizy obrazów wspomaganej AI, które mogą ułatwić zastosowania o wysokiej przepustowości. Oceniono trzy narzędzia segmentacji – model detekcji szparków szparkowych oparty na YOLOv8, ogólne narzędzie głębokiego uczenia do segmentacji komórek oraz klasyfikator oparty na pikselach – pod kątem ich dokładności i przydatności w różnych metodach. Istotne różnice w cechach szparkowych i naskórnych są konsekwentnie obserwowane pomiędzy technikami obierania i oczyszczania zarówno w analizach ręcznych, jak i AI. Narzędzia AI umożliwiły powtarzalną ilościowość, przy czym model detekcji szparków szparkowych oparty na YOLOv8 (StoManager1) najlepiej sprawdza się dla cech szparkowych, a ogólne narzędzie głębokiego uczenia do segmentacji komórek (Cellpose) dla segmentacji naskórka. Wykrywanie cech opartych na AI było bardzo spójne u T. officinale , ale ograniczone w F. excelsior; wyniki nadal różniły się od pomiarów ręcznych, co ilustruje, jak anatomia specyficzna dla gatunku i jakość obrazu wpływają na odpowiedniość metody. Wyniki te sugerują, że choć analiza wspomagana przez AI stanowi użyteczne ramy do kwantyfikacji cech szparkowych i naskórkowych, walidacja ekspertów i testy pilotażowe pozostają niezbędne przed szerszym lub wysokoprzepustowym zastosowaniem.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aparaty szparkowe to mikroskopijne pory w naskórku, które odgrywają kluczową rolę w regulacji wymiany gazowej i transpiracji roślin. Dlatego zrozumienie morfologicznych podstaw funkcjonowania szparków szparkowych jest kluczowe dla poprawy wydajności upraw¹. Podczas gdy większość badań nad strukturą i funkcją szparków szparkowych koncentruje się wyłącznie na morfologii szparki, pełne zrozumienie ich reakcji wymaga również charakteryzacji rozmiaru i kształtu otaczających komórek naskórka. Dokładne określenie tych cech jest kluczowe dla zrozumienia relacji struktura-funkcja leżących u podstaw wymiany gazowej i poprawy upraw.

Ponieważ poprawa upraw coraz bardziej opiera się na zaawansowanych metodach edycji genów, kluczowe jest zrozumienie kluczowych cech morfologicznych – takich jak szparki szparkowe – które wpływają na fotosyntezę, efektywność zużycia wody oraz przyrost węgla. Ta potrzeba jest szczególnie pilna w obliczu trwających zmian środowiskowych, gdy rośnie zapotrzebowanie na odporne uprawy, które zachowują zarówno zdolność fotosyntetyczną, jak i plony, w obliczu częstszych susz i fal upałów ^2,3. W związku z tym istnieje silna potrzeba ustandaryzowanych protokołów obrazowania i analizy. Peeling szparków szparkowych z użyciem lakieru/lakieru do paznokci to najprostsza metoda uzyskania odcisków na powierzchni liści, aby zmierzyć rozmiar, kształt i gęstość szparków szparkowych i naskórka ^4,5,6. Procedura jest szybka, nieniszcząca, co pozwala na szybkie przetwarzanie próbek. Metoda oczyszczania tkanek to alternatywne podejście umożliwiające jednoczesną charakterystykę sieci żył oraz potencjalnie bardziej kompleksową charakterystykę hydrauliki liści.

Chemiczne oczyszczanie zmiękcza i sprawia, że tkanki stają się optycznie przezroczyste, umożliwiając obrazowanie in situ komórek szparków szparkowych i naskórka bez zakłóceń mechanicznych. Oczyszczanie jest szeroko stosowane w różnych typach tkanek, w tym w próbkach suszonych lub delikatnych, i może być wykorzystywane nie tylko do obrazowania szparków szparkowych, ale także do wizualizacji sieci żyłkowych, obrazowania fluorescencyjnego oraz wewnętrznych struktur anatomicznych 7,8,9,10,11,12 , co pozwala na analizę cech szparkowych obok innych cech funkcjonalnych. Istnieją różne metody oczyszczania, obejmujące rozpuszczalniki organiczne, roztwory wodne, hiperhydratację lub osadzanie hydrożelu 13,14,15. Różnią się one czasem trwania, kompatybilnością obrazowania oraz dostępnością odczynników. Stosowany tutaj protokół jest prosty, opłacalny i nie wymaga specjalistycznych umiejętności. Obie techniki są tanie i szybkie w porównaniu do bardziej pracochłonnych metod, takich jak mikroskopia świetlna czy skaningowa mikroskopia elektronowa, które wymagają chemicznego utrwalania, osadzania i sekcjonowania próbek.

Tradycyjne metody analizy cech szparków szparkowych i naskórka często opierają się na ręcznej segmentacji obrazów mikroskopowych, co jest pracochłonne, czasochłonne i podlega błędom obserwatora, ograniczającym przepustowość i zmniejszającym efektywność pipeline'u analitycznego¹⁶. Ponadto cechy anatomiczne, takie jak trichomy i nieregularne ściany komórkowe, stanowią dodatkowe wyzwania dla spójnego ilościowego określania cech. Chociaż zautomatyzowane narzędzia do analizy obrazów dają duże obietnice dla wysokoprzepustowej ekstrakcji danych, zostały zoptymalizowane pod kątem konkretnych tkanek roślinnych i nie są łatwo przenosalne między typami liści i metodami przygotowania. Na przykład StoManager1 (Ilustracja uzupełniająca 1) zapewnia wysoką dokładność wykrywania szparków szparkowych przy użyciu modelu wykrywania obiektów opartego na YOLOv8, ale jest specjalnie trenowany pod kątem cech szparkowych. Cellpose (Ilustracja uzupełniająca 2) to duży, wstępnie wytrenowany, ogólny model segmentacji, który dobrze się sprawdza, gdy dane wejściowe przypominają jego modele wstępnie wytrenowane (np. cyto, cyto2), oparte pierwotnie na komórkach zwierzęcych i organellach. Ilastik (Ilustracja Uzupełniająca 3) to narzędzie klasyfikacyjne oparte na pikselach, oparte na adnotacjach zdefiniowanych przez użytkownika. Zarówno Cellpose, jak i Ilastik są przyjazne dla użytkownika, ale każdy z nich może wymagać ponownego trenowania lub dostrojenia, aby uwzględnić różnice w jakości obrazu, artefaktach tła i cechach specyficznych dla tkanek.

Ponadto morfologia szparków szparkowych i naskórka wykazuje dużą zmienność w poszczególnych gatunkach¹⁷. Cechy takie jak gęstość i rozmiar szparków szparkowych są szczególnie zmienne, jednak zazwyczaj są odwrotnie powiązane i razem determinują różnice gatunkowe w kinetyce szparki. Większe szparki szparkowe mogą częściowo kompensować niższą gęstość, ale zazwyczaj wykazują wolniejszą kinetykę⁵, co może być niekorzystne podczas coraz częstszych fal upałów, gdzie szybkie reakcje szparków są kluczowe dla utrzymania asymilacji węgla i zapobiegania nadmiernej utracie wody. Łącznie ta zmienność utrudnia pomiar cech szparków szparkowych i może osłabić wiarygodność wybranego protokołu oraz odporność wyników opartych na AI.

Protokół ten integruje dwie klasyczne techniki przygotowawcze – peelingi naskórkowe i chemiczne oczyszczania – z nowoczesnymi narzędziami sztucznej inteligencji (AI) i uczenia maszynowego (ML) do segmentacji i pomiaru cech. Wykorzystując dwa powszechne gatunki dwukątnych o dwóch powszechnych gatunkach dwukątnych wymagających światła o kontrastujących strategiach ekologicznych (F. excelsior i T. officinale), zbadaliśmy zmienność cech szparkowych i naskórkowych, aby ocenić, jak trzy metody się porównują i gdzie mogą pojawić się potencjalne nieścisłości. Oceniono wydajność trzech narzędzi AI: StoManager1 (model głębokiego uczenia opartego na YOLOv8 do wykrywania szparków szparkowych), Cellpose (ogólne narzędzie do segmentacji głębokiego uczenia) oraz ilastik (klasyfikator pikselowy dla tkanek naskórkowych). To integracyjne podejście umożliwia powtarzalną, wysokoprzepustową ilościową ilościową identyfikację cech szparkowych i naskórkowych, oferując solidne i skalowalne ramy do analizy fenotypowej zarówno w badaniach ekologicznych, jak i rolniczych. Jednak cechy anatomiczne, takie jak gęste trichome, grube skórki czy niski kontrast między granicami komórek, mogą obniżać dokładność segmentacji i powinny być brane pod uwagę przy wyborze między metodami obierania a oczyszczania oraz przy stosowaniu ilościfikacji opartej na AI.

Z naszej wiedzy jest to pierwszy krok po kroku protokół porównujący bezpośrednio peeling naskórkowy i metody chemicznego oczyszczania w połączeniu z wieloma narzędziami segmentacyjnymi opartymi na AI, aby kwantyfikować cechy szparkowe i naskórki. Łącząc klasyczne techniki mikroskopii z dostępnymi workflowami ML, protokół zmniejsza stronniczość użytkownika, zwiększa przepustowość i ułatwia powtarzalne fenotypowanie między gatunkami. Dzięki temu podejście jest szeroko stosowane w ekologii, poprawie upraw oraz badaniach nad zmianami klimatu, a także stanowi podstawę do ciągłego rozszerzania narzędzi poprzez przeszkolenie modeli lub naukę transferową.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Nie były wymagane żadne specjalne pozwolenia ani zgody na zbieranie liści T. officinale i F. excelsior , ponieważ te niechronione gatunki były pobierane z publicznie dostępnych obszarów ogrodowych. Wszystkie próbki były zgodne z wytycznymi instytucjonalnymi i lokalnymi.

1. Zbieranie materiałów roślinnych

Wybierz zdrowe liście do analizy porównawczej. Do obecnego eksperymentu wybrano zdrowe, nasłonecznione dorosłe liście dwóch gatunków dwudzielnych o kontrastującym rozmieszczeniu szparków: drzewa hiposzumiczkowego F. excelsior, które ma szparki tylko na dolnej powierzchni liścia, oraz amfistomowego bylinowego ziela T. officinale.
Dla każdego typu/lokalizacji próbki weź 3-5 listów replikujących.
Odłącz liść czystymi nożyczkami lub żyletką. Natychmiast włóż przecięty liść do wody, aby zapobiec odwodnieniu.
Po zebraniu całkowicie zanurz ogonek w wodzie i przechowuj je w temperaturze 4°C.
Przejdź do sekcji 2 lub 3 protokołu w ciągu 48 godzin.

2. Przygotowanie i oglądanie peelingów z odcisków szparków szparkowych

UWAGA: Wszystkie odpady chemiczne powstałe podczas protokołu oczyszczania były traktowane zgodnie z instytucjonalnymi i lokalnymi przepisami bezpieczeństwa. Roztwory zawierające glutaraldehyd były zbierane oddzielnie i utylizowane jako niebezpieczne odpady chemiczne. Roztwory wodorotlenku sodu (NaOH) zostały zneutralizowane do pH 6-8 przed utylizacją, jeśli było to dozwolone. Rozcieńczone rozwody wybielacza i etanolu były wyrzucane do odpływu wraz z dużą ilością zimnej wody tam, gdzie pozwalały na to przepisy instytucjonalne i miejskie. Roztwory TBO zostały zebrane i utylizowane jako odpady chemiczne zgodnie z lokalnymi wytycznymi. Użytkownicy powinni skonsultować się z instytucjonalnym biurem bezpieczeństwa w celu uzyskania zatwierdzonych procedur utylizacji.

W razie potrzeby delikatnie opłucz wybraną powierzchnię liścia wodą, aby usunąć kurz lub zanieczyszczenia. Natychmiast wysusz powierzchnię liścia za pomocą papieru filtracyjnego lub miękkiego ręcznika papierowego, aby usunąć nadmiar wilgoci. Nie susz na powietrzu, ponieważ może to powodować kurczenie się tkanki, prowadząc do niedokładnych pomiarów rozmiaru szparków szparkowych i komórek naskórka.
Oznacz szkiełko mikroskopowe szczegółami próbki (np. gatunek, stronę liścia i datą przygotowania) za pomocą markera trwałego, aby zapewnić śledzenie każdej próbki podczas obrazowania, analizy i interpretacji danych oraz umożliwić właściwe przechowywanie próbki na przyszłe użycie.
W przypadku gatunków z niegruczołowymi (owłosionymi) trichomami usuń trichomy z powierzchni liścia żyletką przed przygotowaniem do obierki, ponieważ ich obecność może zasłaniać granice komórek i obniżać jakość obrazu (Rysunek 1).
Używając małego pędzelka, nałóż cienką, równą warstwę przezroczystego, niewyciągalnego lakieru do paznokci (unikaj formuł "rozciągających" lub "odklejających" preparatów) na docelowy obszar. Zawsze wybieraj środkową część liścia do przygotowania do obierania, unikając końca i podstawy.
Pozwól lakierowi do paznokci całkowicie wyschnąć (zazwyczaj 2-5 minut w temperaturze pokojowej). Długotrwałe ekspozycje mogą powodować przebarwienia tkanek (np. czerwony odcień na miękkich liściach), które mogą być widoczne podczas końcowej obierki, i zakłócać dalsze analizy wymagające jednolitego zabarwienia.
Po wyschnięciu naklej pasek przezroczystej taśmy na powierzchnię powłoki. Zacznij od jednej krawędzi lakieru i stopniowo nakładaj taśmę na powierzchnię, delikatnie dociskając, aby zapewnić dobrą przyczepność i uniknąć powstawania pęcherzyków lub zagnieceń powietrza. Noś rękawiczki nitrylowe, aby uniknąć odcisków palców.
Ostrożnie zdejmij taśmę razem z warstwą lakieru do paznokci (odcisk naskórny).
Przyłóż taśmę (z lepką stroną do dołu) na czystym szkiełku mikroskopu, unikając zagięć i nakładania się.
Przechowuj przygotowane preparaty w temperaturze pokojowej, chronione przed kurzem i bezpośrednim światłem słonecznym.
Zbadaj szkiełko pod mikroskopem świetlnym złożonym przy powiększeniu 400x. Zapisz obrazy zgodnie z przewodnikiem programowym wraz z odpowiednią skalą.

3. Przygotowanie i oglądanie oczyszczonych sekcji

Wytnij kawałki liści o grubości około 1 cm². Wszystkie kroki wykonuj w rękawiczkach nitrylowych i pracując pod kapturem przeciwparowym.
Przenieś próbki do oznaczonej fiolki, przykryć je roztworem utrwalającym (4% aldehydu glutarowego w buforze fosforanowym 0,1 M, pH = 6,9) (UWAGA) i przechowywać w 4°C przez 24 godziny (Tabela 1, przygotowanie roztworu utrwalającego).
Usuń roztwór utrwalający pipetą i przykryj próbki wodą destylowaną. Wyjedź na 30 minut. Powtórz trzy razy (rysunek 2A-C).
Usuń wodę i przykryj próbki 1 M roztworu NaOH (rozpuszcz 20 g NaOH w 0,5 L wody destylowanej).
Podczas usuwania liści roztwór NaOH zmienia kolor na zielony. Wymień roztwór NaOH raz dziennie na świeży. Kontynuuj przez 3 do 4 dni, lub aż próbki przystaną się bladożółte, a roztwór NaOH pozostaje przezroczysty (rysunek 2D-F).
Usuń roztwór NaOH i pokryj próbki wybielaczem (5% NaClO). Odpowiedni jest komercyjny wybielacz domowy o takim stężeniu.
Inkubuj próbki w wybielacz przez 1-2 minuty. Próbki stają się białe i przezroczyste (rysunek 2G-I).
Usuń poprzedni roztwór i przykryj próbki wodą destylowaną na 2 minuty. Próbki odwodnij przez serię ethanolu z destylowanej wody destylowanej w następujący sposób: 75:25, 50:50, 25:75 oraz 100% etanolu.
Usuń etanol i pokryj próbki 3% alkoholowym roztworem błękitu toluidynowego O (TBO, rozpuścić 3 g TBO w 100 mL 100% etanolu). Wyjedź na noc.
Usuń roztwór barwiący i przykryj próbki 100% etanolem na 2 minuty. Powtórz ten krok, używając stopniowej serii etanolu z wodą destylowaną następująco: 25:75, 50:50, 75:25, a na końcu wodę destylowaną (rysunek 2J-L). Zobacz Rysunek 3, gdzie znajdziesz typowe błędy i kroki rozwiązywania problemów związane z procesem oczyszczania.
Trzymaj próbki w wodzie destylowanej w temperaturze 4°C aż do oglądania.
Przełóż próbki na szklaną szkiełkę, dodaj kroplę wody destylowanej i przykryj szklaną pokrywką, aby oglądać i obrazować mikroskopowo.
Zbadaj szkiełko pod mikroskopem świetlnym złożonym przy powiększeniu 400x. Zapisz obrazy zgodnie z przewodnikiem programowym wraz z odpowiednią skalą. Więcej informacji można znaleźć w tabeli materiałów .

4. Analiza i pomiary obrazów

Do przetwarzania i analizy obrazu używaj Fiji²³ (dystrybucja ImageJ, wersja 1.54p).
Za pomocą narzędzia Linia narysuj linię nad paskiem skali, następnie wybierz Analizuj > Ustaw skalę, zmodyfikuj znaną odległość na długość paska skali i zmień jednostkę długości na μm.
Przejdź do analizy > ustalania pomiarów. Upewnij się, że obszar i średnica fereta są zaznaczone .
Użyj narzędzia Polygon Selection Tool, aby wyznaczyć kontur interesującego obiektu. Zapisz pomiar, naciskając klawisz M .
Zmierz następujące cechy szparki szparkowej i naskórnej na Fidżi oraz oblicz zarówno oczyszczone próbki, jak i peelingi szparkowe (Rysunek 3).
Oblicz liczbę szparków szparkowych (Ns).
1. Określ średnią powierzchnię szparki szparkowej (As).
2. Określ średnią szerokość szparki szparkowej (Ws): używając minimalnej średnicy Fereta.
3. Oblicz gęstość szparków szparkowych (SD) według następującego wzoru:
  
  ; na jednostkę Ia (powierzchnię liścia wybranego do pomiarów, mm²).
4. Określ średnią powierzchnię komórek naskórka (Ae).
5. Określ gęstość komórek naskórka (ECD) za pomocą następującego wzoru:

5. Statystyki

Użyj testu HSD ANOVA i Tukey'a po raz do sprawdzenia różnic między grupami prób.
Wszystkie analizy statystyczne przeprowadz w R²¹.
Przeanalizuj łącznie 3 replikujące liście na gatunek i zobacz 3 oskórki z każdego liścia.

6. Analiza wspomagana przez AI

Wybierz narzędzia uczenia maszynowego do segmentacji.
1. Wybierz odpowiednie narzędzia segmentacji oparte na uczeniu maszynowym na podstawie docelowej struktury (szparki szparkowe lub komórki naskórka), jakości obrazu oraz celów analizy.
2. Stosuj specyficzny dla szparków szparkowy model głębokiego uczenia do automatycznego wykrywania i pomiaru cech szparkowych oraz ogólne narzędzia do głębokiego uczenia lub segmentacji pikselowej do segmentacji komórek naskórka.
3. Zapoznaj się z sekcją Narzędzia i oprogramowanie uczenia maszynowego, aby poznać konkretne implementacje oprogramowania (plik uzupełniający).
4. Przeprowadzić testy pilotażowe na podzbiorze obrazów przed analizą na dużą skalę, aby ocenić wydajność segmentacji i zidentyfikować potencjalne źródła fałszywie pozytywnych wyników.
Przygotuj środowisko obliczeniowe.
1. Użyj stacji roboczej wyposażonej w procesor 8-12 rdzeni, co najmniej 32 GB RAM oraz kartę graficzną NVIDIA CUDA, z minimalną liczbą 24 GB VRAM.
2. Używaj wyświetlacza o wysokiej rozdzielczości (najlepiej 4K), aby ułatwić adnotacje i wizualną inspekcję.
3. Instaluj wszystkie wybrane narzędzia programistyczne zgodnie z instrukcjami deweloperów i zapisuj wersje oprogramowania, aby zapewnić powtarzalność.
Przygotuj obrazy do analizy uczenia maszynowego.
1. Importuj obrazy mikroskopowe w formacie TIFF lub PNG, używając 8- lub 16-bitowych obrazów w skali szarości, jeśli to możliwe.
2. Upewnij się, że każdy obraz zawiera widoczny pasek skali lub został skalibrowany przestrzennie przed analizą.
3. Wybierz obszary zainteresowania z minimalną ilością zanieczyszczeń, fałdów lub pęcherzyków powietrza, równym oświetleniem oraz wyraźnie określonymi granicami komórek.
4. Wyłącz obrazy z rozmytymi krawędziami, silnymi cieniami lub niskim kontrastem, ponieważ obniżają one dokładność segmentacji.
Wykonaj segmentację szparków szparkowych.
1. Załaduj obrazy do specyficznego dla szparków szparkowych modelu głębokiego uczenia (sekcja 1 pliku uzupełniającego).
2. Konfiguruj parametry detekcji, w tym limity rozmiaru obiektu i progi ufności, zgodnie z gatunkiem i rozdzielczością obrazu.
3. Uruchom automatyczne wykrywanie w celu segmentacji kompleksów szparkowych i wyodrębnienia wskaźników wyjściowych, takich jak liczba szparki, powierzchnia i średnice Fereta.
4. Eksport masek segmentacyjnych i tabel pomiarowych do analizy dalszej. Wizualnie sprawdź nakładki segmentacyjne i ręcznie wyklucz nieprawidłowo wykryte obiekty, jeśli jest to konieczne.
Wykonaj segmentację komórek naskórka.
1. Załaduj obrazy do uniwersalnego narzędzia do segmentacji głębokiego uczenia lub klasyfikatora opartego na pikselach (sekcja pliku uzupełniający 2 - 4).
2. Trenuj lub dostosowuj model, używając reprezentatywnych obrazów z ręcznie adnotowanymi przykładami komórek naskórka, granic komórek i tła.
3. Uruchom segmentację, aby wygenerować maski obiektów i eksportować maski do postprodukcji w ImageJ/Fiji lub równoważnym oprogramowaniu do analizy obrazów.
4. Zastosuj filtrowanie oparte na rozmiarze lub kwantylowym, aby usunąć małe obiekty fałszywie pozytywne i zweryfikować dokładność segmentacji poprzez wizualną inspekcję przed wyodrębnieniem parametrów komórek naskórkowych, takich jak powierzchnia komórek i gęstość komórek.
Dokumentuj parametry i wykonuj kontrolę jakości.
1. Zapisz wszystkie wersje oprogramowania, ustawienia parametrów, progi filtrowania oraz specyfikacje sprzętowe używane podczas analizy.
2. Zachowaj reprezentatywne nakładki segmentacyjne, aby dokumentować jakość segmentacji.
3. Wizualnie zweryfikować wyniki automatycznej segmentacji przed analizą statystyczną lub raportowaniem danych.
Przygotowanie obrazu do całego przetwarzania ML
1. Obrazowanie próbkowe
  UWAGA: Ponieważ segmentacja oparta na ML opiera się na gradientach intensywności, ciągłości krawędzi i spójnej geometrii obiektu, a nie na kontekście biologicznym, wstępne przetwarzanie obrazu i wybór regionów decydują o wydajności modelu i strukturze błędów.
  1. Wykonaj zdjęcia wysokiej rozdzielczości powierzchni oczyszczonych lub odklejonych liści z widocznym paskiem skali. Aby uzyskać dobre procesy uczenia maszynowego, upewnij się, że mierzalne obiekty są ostre, ciągłe i o wysokim kontraście na całym obrazie.
2. Dobór regionu i jakość obrazu
  UWAGA: Po przejęciu obrazu w Sekcji 6.7.1 obrazy są wizualnie sprawdzane, a tam, gdzie pozwala na to skala, wybierane są obszary zainteresowania wolne od artefaktów do segmentacji w dalszej fazie. Wybierz obszary zainteresowania z minimalnymi artefaktami (np. zanieczyszczenia, fałdy, pęcherzyki powietrza, nierównomierne oświetlenie). W modelach szparkowych (np. StoManager1) priorytetowo traktuj wyraźną widoczność porów oraz dobrze zdefiniowaną sylwetkę komórek strażniczych. Dla modeli epidermalnych (np. Cellpose, ilastik) należy zapewnić stabilne gradienty intensywności wzdłuż konturów komórek; nieciągłe lub niskokontrastowe krawędzie znacznie obniżają wydajność segmentacji. Obrazy o słabo określonych granicach powinny być wykluczone lub ponownie przetwarzane przed segmentacją.
3. Format pliku
  Zapisuj pliki w formacie TIFF lub PNG (zalecana do segmentacji w skali szarości 8- lub 16-bitowej).
4. Opcjonalne ulepszanie obrazu
  1. Zwiększ kontrast lub odejmij tło w ImageJ/Fiji, jeśli granice są słabe.
  2. Skup się na geometrii krawędzi, ponieważ mogą one tworzyć fałszywe gradienty interpretowane jako granice komórek.
  3. Stosuj takie korekty konsekwentnie na wszystkich obrazach w zbiorze danych.
    UWAGA: Szczególną uwagę należy zwrócić na geometrię krawędzi, ponieważ cienie, halo lub nierówne gradienty tła mogą tworzyć sztuczne przejścia intensywności, które modele ML mogą błędnie interpretować jako granice komórek.
StoManager1 (wersja GUI v1.0.0)
UWAGA: StoManager1 umożliwia automatyczne, wysokoprzepustowe wykrywanie, pomiar i analizę szparków szparkowych liści roślin za pomocą splotowych sieci neuronowych (YOLOv8-seg-x). Narzędzie kwantyfikuje kluczowe metryki szparków szparkowych (powierzchnię, gęstość, stosunek komórek porów do komórek ochronnych, indeksy agregacji itp.) na podstawie różnych typów obrazów, co zmniejsza wysiłek ręczny i uprzedzenia oraz ułatwia szeroko zakrojone badania ekologiczne i fizjologiczne. Dostępna jest przyjazna dla użytkownika aplikacja Windows, która nie wymaga umiejętności programistycznych poza opcjonalnym przetwarzaniem (Supplementary file Section 1)²³.
1. Uruchamianie StoManager1: instalacja i konfiguracja
  1. Dostęp do nich przez GitHub (https://github.com/JiaxinWang123/StoManager1) lub samodzielną aplikację Windows ((Supplementary file section 1)(https://zenodo.org/doi/10.5281/zenodo.7686022)²³.
  2. Zapewnienie kompatybilności wersji bibliotek (zależności Pythona); Konflikty mogą wystąpić, jeśli zainstalowane jest inne oprogramowanie ML/obrazowe.
2. Uruchom StoManager1 przez interfejs graficzny lub wiersz poleceń.
3. Wybierz katalog wejściowy zawierający obrazy liści.
4. Wybór modeli; Sprawdź model YOLOv8-seg-x, aby uzyskać bardziej szczegółowe metryki oparte na segmentacji. Zachowaj to niezaznaczone dla modelu bounding box (YOLOv3), mniej metryk.
5. Strojenie parametrów; Dostosowuj progi detekcji, rozdzielczość obrazu, dylatację maski oraz limity rozmiaru obiektu w zależności od metody obrazowania/gatunku. Prosimy o stosowanie domyślnych parametrów, gdy niektóre obiekty szparków szparkowych pozostają niewykryte, głównie (1) obniżenie progu pewności wykrywania, aby odzyskać więcej prawdziwych szparków szparkowych przy jednoczesnym sprawdzeniu fałszywie pozytywnych wykryć; oraz (2) zwiększenie rozdzielczości obrazu, ponieważ większa wartość może poprawić wykrywanie małych szparków szparkowych kosztem większego obciążenia obliczeniowego.
6. Segmentacja biegów:
  1. Kliknij " Start Process", aby wykryć, segmentować i zmierzyć szparki szparkowe oraz całe szparki.
  2. Kliknij " Analiza statystyczna", aby przetworzyć statystyki na poziomie grupy.
7. Zbieraj wyniki. Wyjście jest zapisywane do YOUR_OUTPUT_PATH/Predict-output/Output_csv/ (tryb segmentacji) lub bezpośrednio do YOUR_OUTPUT_PATH (tryb bounding box). Pliki CSV zawierają metryki poszczególne i podsumowujące; generowane są także maski i obrazy wyników.
8. Uruchomić przetwarzanie wsadowe.
9. Po zakończeniu zbieraj wyjście: maski segmentacyjne oraz pliki wyników CSV dla obrazu. Wyniki na zdjęciach obejmują: liczbę szparków szparkowych i powierzchnię szparki, średnicę Fereta (maksymalnie/min), metryki komórek ochronnych, indeksy agregacji/równomierności/dywergencji oraz stosunki komórek porowych do ochronnych.
10. Przeglądaj wyniki w Excelu, R lub Pythonie dla dalszych statystyk i wizualizacji.
11. kontrola jakości; Wizualnie sprawdź maski i nakładki. Usuń obiekty odstawające według rozmiaru, kształtu lub ręcznej kuracji, jeśli jest to konieczne (patrz niżej).
  UWAGA: Szczegółowe protokoły i kroki postprodukcji dla Cellpose i ilastik są dostępne w pliku uzupełniającym. Aby uzyskać optymalną wydajność przy dużych zbiorach danych i złożonych obrazach, zalecamy system z procesorem 8-12 rdzeni, co najmniej 32 GB RAM oraz kartą graficzną NVIDIA CUDA, z minimalną łącznością 24 GB VRAM. Zaleca się również duży, wysokorozdzielczy wyświetlacz (najlepiej 4K) dla efektywnej adnotacji i wizualizacji.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Porównanie efektów między obieraniem a oczyszczaniem

Zarówno T. officinale , jak i F. excelsior wykazywały zmienność cech szparkowych i naskórnych w zależności od tego, czy próbki zostały oczyszczone czy oszukane (Rysunek 4). Usunięte próbki zazwyczaj zapewniały ostrzejsze granice komórek oraz wyraźniejszą wizualizację kształtu komórek ochronnych oraz otworu porów, choć nakładające się warstwy tkanek czasami zasłaniały mniejsze szparki szparkowe i były przesunięciem rozmiaru w górę. U F. excelsior średnia powierzchnia i szerokość szparków były istotnie wyższe w próbkach oczyszczonych niż w skórkach, podczas gdy u T. officinale nie zaobserwowano istotnych różnic. Gęstość szparków szparkowych była istotnie wyższa w obieranych próbkach F. excelsior, podczas gdy u T. officinale nie wykryto efektu metody. Powierzchnia komórek naskórka nie różniła się między metodami u żadnego z gatunków, ale gęstość komórek naskórka była nieco wyższa w próbkach obramowanych F. excelsior.

Ogólnie różnice zależne od metody były specyficzne dla cech i gatunków, co sugeruje, że łuszczenie jest wiarygodną opcją pomiarów szparków szparkowych, szczególnie gdy szparki szparkowe różnią się wielkością (np. w rozwijających się liściach), podczas gdy cechy naskórka były w dużej mierze niezmienione (Rysunek 5).

Wyniki AI i ich rezonowanie z metodami obrażania i oczyszczania

Model specyficzny dla szparków szparkowych StoManager1 wykrywał szparki szparkowe bardziej wiarygodnie na zdjęciach odklejonych (Rysunek 6), podczas gdy wydajność znacznie spadła na próbkach usuniętych (Rysunek 7). Aby dokładniej ocenić wydajność StoManager1 w różnych metodach przygotowania, porównaliśmy wykrywanie cech szparkowych u T. officinale i F. excelsior , wykorzystując zarówno oskórki, jak i oczyszczone obrazy (Rysunek 8). W T. officinale model niezawodnie wykrywał obecność i gęstość szparków szparkowych we wszystkich metodach przygotowania. Jednak uzyskane wartości znacznie różniły się od pomiarów ręcznych (Tabela 2 oraz Rysunki 5 i 8). Większość cech szparkowych różniła się znacząco (s. < 0,05) między próbkami odklejonymi a czystymi (rysunek 8), co wskazuje, że potoki wykrywające AI są bardzo wrażliwe na metody przygotowania i wymagają dokładnej weryfikacji przed zastosowaniem na dużą skalę. Dla porównania, u F. excelsior wykrywalność ograniczała się do powierzchni odbłokowej z powodu braku szparków szparkowych adaksialnych, a w próbkach oczyszczonych wykrywalność była niespójna, z częstymi fałszywie pozytywnymi wynikami (Rysunek 8). Wyniki te podkreślają silny wpływ specyficznych dla gatunku cech anatomicznych i jakości obrazów na skuteczność analiz opartych na AI. Uniwersalne narzędzia ML, takie jak Cellpose (rysunek 9A) i Ilastik (rysunek 9B), segmentowały komórki naskórkowe skuteczniej na zdjęciach odklejonych niż na czystych. Jednak oba narzędzia generowały liczne fałszywe alarmy przy użyciu obu technik przygotowawczych (obieranie i oczyszczanie), zwłaszcza w warunkach niskiego kontrastu lub gdy kontury komórek były rozmyte. W takich przypadkach niewyraźne kontury szparki szparkowej lub naskórka często były nadmiernie segmentowane na wiele maleńkich obiektów błędnie klasyfikowanych jako pojedyncze komórki naskórka (patrz rysunek 10). W związku z tym niezbędne jest postprocessing, nie tylko usuwanie odstających wartości, ale także filtrowanie przez wyższe kwantyle, aby zachować wiarygodnie zidentyfikowane komórki.

Rysunek 1: Peelingi szparkowe liści F. carica przed i po usunięciu trichomów za pomocą żyletki. Duże trichomy mogą zostawiać odciski na skórce, tworząc kieszenie powietrzne, które powodują nierówne powierzchnie i utrudniają spójne ustawianie ostrości (widoczne jako duże szare kropki). F. carica została uwzględniona jako wyjątek, aby rozszerzyć protokół na liście włosate. (A) Przy powiększeniu 200x obraz przed usunięciem trichomu jest częściowo zasłonięty przez odciski trichome. (B) Jakość obrazu poprawia się po usunięciu trychomów. (C) Przy powiększeniu 400x przed usunięciem trichomu obraz jest w większości zasłonięty przez odciski trichome. (D) Niedrożność jest minimalna w obrazie po usunięciu trichomu żyletką. Pręty skalowe 100 μm (A, B) i 50 μm (C, D). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Kolejne etapy protokołu clearingu. Reprezentatywne obrazy T. officinale, F. excelsior i F. carica ilustrują kolejne etapy protokołu oczyszczania. (A-C) Świeże liście. (D-F) wychodzi po uzgodnieniu z NaOH. (G-I) odchodzi po wybielaniu NaClO. (J-L) odchodzi po zabarwieniu toluidynowym niebieskim O. Ten wizualny środek pokazuje oczekiwany wygląd próbki przed przejściem do kolejnego kroku i podkreśla zmienność protokołu między gatunkami. F. carica została uwzględniona jako gatunek odstępny, aby wykazać zastosowanie protokołu w szerszym zakresie morfologii liści i żyłkowania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Przykładowe pomiary cech szparkowych i naskórka. Zmierzone cechy są przedstawione na obrazie następująco: As = powierzchnia szparki szparkowej; Ls = długość szparki; Ws = szerokość aparatu szparkowego; Ae = powierzchnia komórek naskórka. Gęstość szparków szparkowych i gęstość komórek naskórka zostały obliczone w wyznaczonym obszarze, zgodnie z protokołem. Obraz z powiększeniem 400x. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Porównanie obrazów uzyskanych protokołem czyszczenia i protokołem peelingu. Reprezentatywne obrazy T. officinale i F. excelsior porównujące obrazy oczyszczania i oskórków szparkowych pokazujące widoczność i zmienność rozmiaru i gęstości komórek szparków szparkowych oraz naskórka. Skala jest 50 μm, a zdjęcia są wykonywane z powiększeniem 400x. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Różnice w wynikach ręcznego pomiaru cech między protokołem oczyszczania a obierania. Wykresy pudełkowe pokazujące różnice w cechach szparkowych i naskórkowych między metodami oczyszczania i peelingu naskórka u T. officinale i F. excelsior. (A) Średnia powierzchnia szparki szparkowej, (B) średnia szerokość szparki szparkowej, (C), gęstość szparki szparkowej (D), średnia powierzchnia komórek naskórka oraz (E) gęstość komórek naskórka. Gwiazdki wskazują poziomy istotności statystycznej (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Istotność statystyczna oceniano za pomocą jednokierunkowej metody ANOVA, a następnie testu HSD Tukeya po hoc. Wielkość próby na grupę: n = 3-5. Skróty: As = obszar szparkowy; Ws = szerokość aparatu szparkowego; SD = gęstość szparków szparkowych; Ae = powierzchnia komórek naskórka; ECD = gęstość komórek naskórka. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Przykład wyników segmentacji z użyciem modelu detekcji szparków szparkowych na próbce oskórki. Wyniki segmentacji StoManager1 dla oderwanej próbki T. officinale (dolna strona dojrzałego liścia wystawionego na cień), wykazujące dobrą dokładność wykrywania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 7: Przykład wyniku segmentacji z użyciem modelu detekcji szparków szparkowych na oczyszczonej próbce. Wynik segmentacji StoManager1 dla oczyszczonej próbki T. officinale (dolna strona dojrzałego liścia wystawionego na cień) wykazał niższą dokładność wykrywania w porównaniu z próbkami odklejonymi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 8: Różnice w wynikach pomiaru cech wspomaganych przez AI między protokołem oczyszczania a obierania. Wykresy pudełkowe pokazujące pomiary cech anatomicznych szparki szparkowej pochodzące z AI na podstawie obrazów przetworzonych przez StoManager1 u T. officinale i F. excelsior. Cechy obejmują powierzchnię szparków szparkowych (As), szerokość szparki szparkowej (Ws), długość szparków szparkowych (Ls) oraz gęstość szparków szparkowych (Ds). Jednostki są jak na Rysunku 5. Istotność statystyczna oceniano za pomocą jednokierunkowej metody ANOVA, a następnie testu HSD Tukeya po hoc. Gwiazdki wskazują poziomy istotności statystycznej (P < 0,05; *P < 0,01; **P < 0,001). Wielkość próby na grupę: n = 3-5. Skróty: As = obszar szparkowy; Ws = szerokość aparatu szparkowego; Ls = długość aparatu szparkowego; Ds = gęstość szparków szparkowych. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 9: Zrzuty ekranu pokazujące segmentację za pomocą uniwersalnego narzędzia deep learning i klasyfikatora opartego na pikselach. Segmentacje próbek F. excelsior (powierzchnia liścia apuksjalnego) za pomocą (A) uniwersalnego narzędzia głębokiego uczenia (Cellpose (cyto2)) oraz (B) klasyfikatora opartego na pikselach (ilastik). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 10: Maska segmentacji ilastyku dla oderwanej próbki F. excelsior (strona odbłokowa liścia), wykazująca liczne fałszywie pozytywne wyniki. Maleńkie kropki są błędnie klasyfikowane jako odrębne komórki naskórka. Podczas postprodukcji wymagana jest ręczna (wizualna) inspekcja, aby ustalić progi oparte na rozmiarze i skutecznie filtrować fałszywie pozytywne wyniki. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rozwiązanie	Przygotowania	Ostatni tom
Podstawa bufora 1	7,12 g (Na₂HPO₄ *2H₂O) w 200 mL dystansu. H₂O	200 mL
Podstawa bufora 2	7,12 g Na₂HPO₄ *2H₂O) na 200 mL dist. H₂O	200 mL
Bufor fosforanowy	Wymieszaj 36 mL bazy 1, 14 mL bazy 2 + 50 ml dystansu. H₂O	100 mL
Roztwór utrwalający	Wymieszaj 9,25 mL 5% glutaraldehydu z 12,5 mL buforu fosforanowego i 28,25 mL dist. H₂O	50 mL

Tabela 1: Przepis na roztwór utrwalający²⁴. Skład rozwiązań użytych w tym badaniu.

Gatunki	Strona	Metoda	Mężczyzna (As)	AI (AS)	Mężczyzna (Ws)	AI (Ws)	Mężczyzna (Ls)	AI (Ls)
Fraxinus	Auksialny	Peel	177.43	9.32	12.71	2.85	17.58	3.58
Taraxacum	Auksialny	Oczyszczone	408.09	18.84	20.1	4.19	26.14	5.39
Taraxacum	Auksialny	Peel	262.54	13.93	15.18	3.47	22.2	4.68
Taraxacum	Adaksialny	Oczyszczone	414.48	14.91	20.11	3.44	26.09	5.71
Taraxacum	Adaksialny	Peel	258.72	11.37	15.72	3.3	21.15	4.08

Tabela 2: Wskazujące porównania dotyczące pomiarów ręcznych i AI. ML (StoManager1) skalował wyniki. Człowiek i AI wskazują odpowiednio wyniki ręcznie i AI (StoManager1). Jednostki są jak na Rysunku 5. Pomiary ręczne i AI różnią się znacząco. Niektóre porównania nie są dostępne z różnych powodów, w tym brakujących szparków szparkowych (np. adaksialny F. excelsior) lub niewykrycia (np. szparki były trudniejsze do wykrycia w próbkach wyczyszczonych ze względu na bardziej rozmyte kontury komórek).

Rysunek uzupełniający 1: Przykłady typowych błędów występujących podczas usuwania liści, które wpływają na wyniki. Zdjęcia pokazane do celów diagnostycznych: (A) nierówne barwienia spowodowane niepełnym nawodnieniem próbki w sekcji 3.10; (B) uszkodzenia mechaniczne wynikające z nieprawidłowego obchodzenia się z bardzo delikatną próbką przetworzoną chemicznie; (C) zielony odcień w centrum próbki spowodowany niepełnym usunięciem chlorofilu podczas sekcji 3.5. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Ilustracja uzupełniająca 2: Przykład interfejsu użytkownika StoManager1. Zrzut ekranu interfejsu użytkownika StoManager1 pokazujący ustawienia wejściowe i tabelę wyników (po lewej) oraz widoki mikrografu z oryginalnymi zdjęciami (w prawym górnym rogu) i nakładką wykrywania szparków szparkowych (dolny prawy – powierzchnia adaksialna odklejonej próbki T. officinale ). Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Ilustracja uzupełniająca 3: Przykład interfejsu użytkownika Cellpose. Zrzut ekranu segmentacji Cellpose w trakcie GUI z regulowanymi parametrami (np. wybór modelu – zalecany wstępnie wytrenowany model cyto2 lub niestandardowy model, kalibracja progów i średnicy komórek). Nadzorowane ręczne adnotacje komórek naskórka podkreślają każdą komórkę unikalnym kolorem, aby ułatwić kalibrację modelu. Nakładka pokazuje segmentację peelingu naskórka odbłokowego F. excelsior . Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Rysunek uzupełniający 4: Proces segmentacji ilastyku. Nakładka ilustruje klasyfikację opartą na pikselach na obrazie peelingu naskórka z auksjalnego naskórka. (A) Zrzut ekranu segmentacji ilastyku w trakcie trwania, pokazujący nadzorowane treningi z ręcznie oznaczonymi klasami: komórki naskórkowe (żółte), kontury komórek (niebieskie) oraz tło nienaskórkowe, takie jak trichomy (czerwone). (B) Zrzut ekranu pokazujący tylko klasę naskórka (żółty), ilustrując, jak klasyfikator izoluje poszczególne komórki naskórka. Zwróć uwagę na obecność wielu fałszywie pozytywnych "maleńkich" wykryć, szczególnie w obszarach o niskim kontraście lub nierównym oświetleniu. (C) Zrzut ekranu pokazujący tylko klasę konturową (niebieski), ilustrując, jak klasyfikator izoluje granice komórek od otaczającej tkanki naskórka. Należy zauważyć, że niektóre kontury są nieciągłe i że występuje wiele fałszywie pozytywnych "drobnych" detekcji, szczególnie w obszarach o niskim kontraście lub nierównym oświetleniu. (D) Zrzut ekranu pokazujący klasę tła. Maska podkreśla kompleksy szparkowe, trichomy gruczołowe oraz różne zanieczyszczenia (czerwone), wyłączając jednocześnie ciała komórek naskórka. W regionach naskórka widocznych jest wiele małych, fałszywie pozytywnych "drobnych" wykryć, wynikających z artefaktów w skali szarości i błędnej klasyfikacji tekstury. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Ilustracja uzupełniająca 5: Ustawienia treningu cellpose. Przykład ustawień treningowych Cellpose (GUI) dla czystej próbki T. officinale (obie powierzchnie liści), pokazujące domyślne parametry modelu przed korektą. Wybierany jest wcześniej wytrenowany model cyto2, z częstotliwością uczenia się 0,1 i 100 epoch treningowych (wartości domyślnych), które decydują odpowiednio o szybkości aktualizacji wag modelu oraz liczbie przejść. Domyślne wartości te są często modyfikowane (np. tempo uczenia = 0,15; epoki = 12), aby skrócić czas treningu i dostosować model do morfologii naskórka roślin; Jednak niższe liczby epok mogą obniżać wydajność wykrywania i zwiększać liczbę fałszywych alarmów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Ilustracja uzupełniająca 6: Maska "etykietują" cellpose. Zastosowanie maski Cellpose "etykiety" dla odklejonej próbki F. excelsior (powierzchnia liścia apaksjalnego), pokazując wynik nadzorowanego treningu, w którym każdemu segmentowanemu obiektowi przypisuje się unikalny identyfikator. Dominują komórki naskórne (oznaczone e), a wykrywane są także pary komórek strażniczych szparkowych (oznaczone g). Fałszywie pozytywne wyniki występują, gdy trichomy są błędnie klasyfikowane jako komórki naskórka (lewy górny górny róg) lub szparki szparkowe (dolna centralna), a także fałszywie negatywne, gdy komórki naskórkowe pozostają nieoznaczone na różnych fragmentach obrazu. Ten typ maski służy do dalszej kwantyfikacji i udoskonalania modeli nadzorowanych. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Ilustracja uzupełniająca 7: Ilościowa identyfikacja segmentowanych komórek naskórka na ImageJ/Fidżi. Zrzuty ekranu pokazujące kwantyfikację komórek naskórkowych segmentowanych po klasyfikacji pikseli ilastyku dla oderwanej próbki F. excelsior (powierzchnia liścia odstępu). (A) W wyeksportowanej masce każdy wykryty klaster pikseli odpowiada pojedynczej cząstce, co umożliwia automatyczne wyodrębnianie metryk na poziomie obiektu (np. powierzchnia, obwód, średnice Fereta). Okno Wyniki (na dole) wyświetla surowe pomiary tysięcy obiektów; Zwróć uwagę na wyjątkowo dużą liczbę małych cząstek powstałych w wyniku "małego" szumu kropkowego i fragmentarnych konturów, co wskazuje na obecność licznych fałszywie pozytywnych wyników. Te artefakty wymagają późniejszego biologicznie uświadomionego filtrowania, aby wyizolować prawdziwe komórki naskórka przed dalszą analizą statystyczną. (B) Filtrowanie powierzchniowe obiektów naskórnych o segmentach ilastiku w ImageJ/Fidżi. Małe fragmenty i szum są eliminowane przez zastosowanie minimalnego progu powierzchni 150-350 μm², co zmniejsza liczbę wykrytych cząstek o około rząd wielkości (dziesięciokrotnie) w porównaniu do niefiltrowanej maski w panelu A. Chociaż ten etap filtracji w znacznym stopniu usuwa drobne fałszywe pozytywy, niedoskonała klasyfikacja pozostaje nieaktualna: fragmentaryczne kontury i pozostałe elementy nienaskórkowe pozostają i wymagają dodatkowego doprecyzowania, takiego jak progi kołowości lub biologicznie poinformowane badania po przesiewaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Dodatkowy rysunek 8: Post-processing maski Cellpose "etykietuje" w ImageJ/Fiji. Używając wtyczki Labels to ROIs dla odklejonej próbki F. excelsior (powierzchnia liścia apaksialnego), każdy segmentowany obiekt w masce jest przekształcany w obszar zainteresowania (ROI), umożliwiając indywidualną inspekcję i pomiar komórek naskórka oraz kompleksów komórek strażniczych szparków. ROI są nakładane na oryginalną mikrografię (po lewej), natomiast okno Wyniki (w prawym dolnym rogu) wyświetla metryki na poziomie komórek (np. powierzchnia, średnice Feret, obwód). Ten etap umożliwia biologicznie poinformowaną kurację, pozwalając użytkownikom sprawdzić, czy każdy zwrot z inwestycji odpowiada prawdziwej komórce naskórkowej oraz odrzucić artefakty takie jak trichomy czy błędnie segmentowane szparki szparkowe, które pozostają po filtracji progowej, co pozwala na dalsze kroki analizy. Kliknij tutaj, aby pobrać tę figurkę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzyskać spójne pomiary szparki, należy pobierać oskórki z centralnej warstwy szparkowej dla standaryzowanych wyników, unikając przy tym dużych żyłek, ponieważ gęstość szparków wykazuje silne zróżnicowanie wewnątrz liścia, malejące w kierunku podstawy liścia, końcówki i brzegów^25,26. Świeże liście dają najbardziej niezawodne opanowania, pod warunkiem użycia niekurczącego się, przezroczystego lakieru do paznokci oraz wysokiej jakości przezroczystej taśmy, aby uniknąć zniekształceń lub artefaktów. Opóźnienia powyżej ~12 godzin zmniejszają klarowność konturu przez odwodnienie. Ponieważ peelingi są tymczasowo zamocowane i mogą zatrzymywać powietrze, zaleca się wczesne obrazowanie, ale jakość pozostaje akceptowalna także po miesiącu.

Istnieją różne metody oczyszczania dla konkretnych typów tkanek, celów obrazowych oraz kwestii bezpieczeństwa¹³^, ¹⁴^, ¹⁵. Oczyszczanie chemiczne przeprowadzono za pomocą wodnego protokołu opartego na NaOH ze względu na dostępność, niską toksyczność i szeroką skuteczność we wszystkich typach liści. Ponieważ odpowiedzi tkanek różnią się między gatunkami, konieczne są testy i optymalizacja. Liście twardzonofilne mogą wymagać ≥2 tygodni, a pozostała zielona tkanka może zakłócać barwienie i zaciemniać cechy anatomiczne (Ilustracja uzupełniająca 1C). Dla szybszego oczyszczania stężenie NaOH można zwiększyć do 2,5 M lub 5 M. Miękkie liście stają się delikatne po wybielaniu (Sekcja 3.7; Dodatkowy rysunek 1B), oraz nadmierna ekspozycja na podchloryn sodu (NaClO) mogą rozkładać tkanki lub powodować rozdzielanie warstw naskórka. Podczas gdy 30 sekund do 2 minut wybielania wystarcza na większość miękkich liści, twardsze gatunki mogą wymagać nawet 1 godziny^{i 27} minut. Chociaż oczyszczanie jest wolniejsze niż przygotowanie do obierek, wymaga ~5 dni i nie wymaga specjalistycznego szkolenia, można go dostosować do różnorodnych gatunków. Oczyszczone i barwione próbki można przechowywać w wodzie destylowanej w temperaturze 4°C, a zalecane jest stałe montaż dla długoterminowej konserwacji^15,27.

Specyficzny dla szparków szparkowy StoManager1 niezawodnie wykrywał kompleksy szparkowe na większości typów obrazów (Ilustracja uzupełniająca 2), a wyniki detekcji są zazwyczaj zgodne z ręczną adnotacją dla metod opartych na peelingu. Jednak pomiary powierzchni szparków szparkowych różniły się systematycznie od pomiarów ręcznych (Tabela 2), co wymagało kalibracji na podstawie niewielkiego ręcznie mierzonego podzbioru (np. 10-20 szparków szparkowych na gatunek) przed analizą na dużą skalę. StoManager1 znacznie zwiększa przepustowość, a w niestandardowych przypadkach wymagana jest ręczna weryfikacja.

Równoczesna segmentacja szparków szparkowych i naskórka jest trudna, ponieważ optymalna ostrość różni się, a heterogeniczność morfologii i klarowności błony powoduje błąd segmentacji. Podobnie trening na dużych zbiorach obrazów (np. powierzchnie adaxialne/abaksjalne, odklejone/wyczyszczone) tracą specyficzność. Nie istnieje wstępnie wytrenowany model Cellpose dla naskórka roślin; Standardowe modele "cyto" i "cyto2", trenowane głównie na komórkach zwierzęcych, osiągają gorsze wyniki na obrazach naskórka. Dlatego dla niezawodności wymagane jest szkolenie indywidualne (Uzupełniająca sekcja 2). Nawet po treningu nadmierna segmentacja i fałszywe alarmy pozostają częste, szczególnie na obrazach o niskim kontraście lub niewyczyszczonych (Ilustracja uzupełniająca 3).

W ilastyku (Sekcja uzupełniająca 3, rysunek uzupełniający 4) maski obiektowe powinny być generowane dla klas komórek docelowych (np. klasa 1 dla naskórka), zachowując maski klasowe do audytu i ręcznej korekty. Przetwarzanie wsadowe i późniejsze workflowy ImageJ/Fiji mogą zaoszczędzić czas i zmniejszyć błędy ręczne. Konsekwentne filtrowanie według powierzchni, odchylenia standardowego lub kwantyli jest niezbędne do tłumienia szumu i fałszywych detekcji. Po przefiltrowaniu mediana powierzchni komórek i liczba komórek zbliżają się do wartości ręcznych. Benchmarking z ręcznymi pomiarami i alternatywnymi narzędziami ML (Weka, RootPainter) pozostaje niezbędny do strojenia parametrów i oceny jakości segmentacji. Przetwarzanie wsadowe w ML jest bardzo wymagające zasobów. Stabilne trenowanie i segmentacja wsad na dużą skalę wymagają karty graficznej obsługującej NVIDIA CUDA oraz ≥32 GB RAM. W systemach średniej klasy (np. 16 GB RAM z zintegrowaną grafiką) nadzorowane szkolenie zazwyczaj zajmuje ~5-10 minut na obrazy <10 i często zawiesza się, gdy używano wielu klas adnotacji lub heterogenicznych typów obrazów. CUDA zwiększyła prędkość przetwarzania o ~10-20 razy w porównaniu do wykonania CPU lub zintegrowanej GPU.

Różnice w wydajności między Cellpose, ilastik i StoManager1 wynikają z ich odrębnych reprezentacji cech. Cellpose przewiduje pola wektorowo-przepływowe w kierunku centrów obiektów i jest wrażliwa na aureole optyczne oraz nagłe granice załamania, które zakłócają przepływ i generują skupiska fałszywych alarmów w oczyszczonym F. excelsior. Ilastik, jako klasyfikator pikseli prowadzony przez człowieka, przecina wysokoreliefowe ściany komórkowe lub halo nawierzchni, chyba że wyraźnie oznaczono jako tło. StoManager1 wykrywa kompleksy szparkowe za pomocą wzorców kształtów na poziomie obiektu (parowane komórki strażnicze z centralnym porem) i dobrze sprawdza się na preparatach oskórki, w tym F. excelsior²⁸; jednak rozmycie wywołane halo wpływa na widoczność porów podczas oczyszczania, powodując fałszywe negatywy, a nie błędną klasyfikację (sekcje 1 i 3 pliku uzupełniającego). W związku z tym Cellpose i StoManager1 działają jako automatyczne segmentery, podczas gdy ilastik pełni funkcję klasyfikatora sterowanego przez człowieka (Supplementary filesection 1-3)²⁸^.

Architektura komórek specyficznych dla gatunku moduluje wydajność AI. W T. officinale gładkie, eliptyczne marginesy komórek ochronnych odpowiadają rozkładowi treningowemu StoManager1, umożliwiając wykrywanie na odklejonych próbkach (Ilustracja uzupełniająca 2), podczas gdy narzędzia ogólne często myliły komórki strażnicze i nawierzchniowe. U F. excelsior zagłębione szparki szparkowe i komórki nawierzchni o wysokim reliefie prowadzą do fałszywych negatywów na czystych obrazach. Te rozbieżności odzwierciedlają geometrię obrazowania zależną od gatunku i przygotowania. Systematyczne różnice między pomiarami ręcznymi a opartymi na AI wynikają z dwóch źródeł: braku kodowania skali z obrazu przez AI oraz artefaktów optycznych wywołanych przez przygotowanie. Strategie łagodzące obejmują wizualną triażę rozmyć i aureoliek powstałych w przygotowaniu tkanek, preferencyjne stosowanie peelingów w warunkach opisanych powyżej, ręczną kalibrację z korektą liniową na niewielkim podzbiorze szparków szparkowych (manualnie = a + b × AI). Dodatkowe strategie obejmują uzupełnianie specyficzne dla taksonu oraz projektowanie klas pomocniczych do treningu (jednak własne wytrenowane modele prawdopodobnie pozostaną niższe niż modele wstępnie wytrenowane na dużych, zróżnicowanych zbiorach danych) oraz filtrowanie górnych kwantyli po segmentacji.

Ponieważ błędy segmentacji AI są systematyczne, nielosowe, niezbędne jest postprocessing. Diagnostyka o jakości obrazu może opierać się na prostym drzewie decyzyjnym. Zacznij od sprawdzenia kontrastu i ostrości naskórka: jeśli ostre, przejdź do fałszywie pozytywnych wyników; Jeśli są rozmyte, spodziewaj się drobnych artefaktów wysokiej częstotliwości i dostosuj filtry. Jeśli fałszywie pozytywne wyniki (np. kropki, zanieczyszczenia) są minimalne, zwykle wystarczy filtrowanie odstających ±2-3 SD. Jeśli dominują drobne artefakty, stosuj filtrowanie oparte na kwantyle. Następnie porównaj rozkłady cech (np. mediana Ae) z oczekiwaniami biologicznymi lub danymi ręcznymi. Doprecyzuj progi w razie potrzeby – utrzymywanie tylko górnych 10-50% kwantyli w zbiorach danych bogatych w artefakty zapewnia istotne wyniki (Ilustracje uzupełniające 7 i 8). Ze względu na wysokie wskaźniki fałszywie pozytywnych wyników generowanych przez narzędzia ML naskórka, wiarygodne oszacowania gęstości szparków szparkowych nie mogły być automatycznie oszacowane, podczas gdy StoManager1 zapewniał precyzyjne pomiary szparki^{szparkowej 28}, gdy granice były wyraźne (patrz Rysunki 6 i 7). Dla mediany naskórkowej Ae okazała się odporna, mniej wrażliwa na małe fałszywe pozytywne wyniki niż średnia.

Wybór metody wpływał na wykrywanie cech. Peeling przewyższał usuwanie gęstości szparków szparkowych dzięki całkowitemu odsłonięciu szparków (Rysunek 3), podczas gdy usuwanie często zasłaniało mniejsze szparki w tkankach warstwowych lub pigmentowanych, mimo że czasem lepiej zachowywało kształt szparków^{szparkowych 27}. Wśród narzędzi AI StoManager1 konsekwentnie zapewniał solidne pomiary szparków szparkowych przy minimalnym selekcji, szczególnie na preparatach peelingowych²³, a peeling poprawiał także pomiary naskórka poprzez zwiększenie prawidłowo zidentyfikowanych komórek i pokrycia obrazów². Przyszłe korzyści najprawdopodobniej przyniosą duże, taksonomicznie zróżnicowane, wcześniej wytrenowane modele integrujące się z zautomatyzowanymi pipeline'ami obrazowania dla ekofizjologii i poprawy upraw.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy doceniają Program Unii Europejskiej H2020 (projekt GAIN4CROPS, Zgromadzenie Generalne nr 862087). Centrum Doskonałości AgroRoślinPrzyszła Agroekologia i nowe uprawy w przyszłych klimatach (Ministerstwo Edukacji i Badań Estonii), Estońska Rada Badawcza (PRG 3201 i PRG 2207 oraz TARISTU24-TK28).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dezynfekujący płyn do czyszczenia NaClO < 5%	Domestos, Wielka Brytania	H000023244	Oparzenia skóry
Disodowy fosforan wodoru (Na₂HPO₄^. 2H₂O)	PENTA, CZ	10028-24-7	NA
Etanol, abs. 100% a.r.	Chem-Lab NV, BE	CL00.0505.1000	Wysoce łatwopalny
Fiolka szklana 2 mL	VWR Life Science, USA	548-0045
Roztwór glutaraldehydu 50%	VWR Life Science, USA	23H2856331	Śmiertelne przy wdychaniu. Toksyczny po połknięciu. Noś rękawiczki ochronne, odzież i inne ubrania; okulary.
Szkiełka mikroskopowe	Normax, PT	5470308A	NA
Lakier do pielęgnacji paznokci szybko schnący	BK (INEZA), porucznik	LT-02244	NA
Nikon Eclipse E600 i Nikon DS0Fi1 5 MP	Nikon Corporation, JP	https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-e600	NA
Pipeta i końcówki pipety	Thermo Scientific, FI	KJ16047	NA
Ostrza stalowe jednokraczne	Instrumenty oksfordzkie	51-1625-0182	NA
Dihydrofosforan sodu (NaH₂PO₄^. 2H₂O) czysty	PENTA, CZ	13472-35-0	NA
Czyste pellety wodorotlenku sodu (NaOH)	Merck KGaA, DE	1310-73-2	Poważne oparzenia.
Taśma papierowa przezroczysta	FOROFIS, LV	91231	NA
Toluidynowy błękit, klasa ogólnego przeznaczenia	ThermoFisher Scientific, GB	2045836	NA