Artykuł metodologiczny

Test seryjnych zabójstw z wykorzystaniem pomiaru żywotności komórek nowotworowych opartych na impedancji podłużnej – użyteczna metoda oceny wydajności limfocytów T

DOI:

10.3791/69623

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Clinical Pharmacology, LMU University Hospital, 2Department of General, Visceral and Transplantation Surgery, LMU University Hospital, 3German Cancer Consortium (DKTK), Partner Site Munich, a partnership between the DKFZ and the University Hospital of the LMU, 4German Center for Lung Research (DZL), 5Einheit für Klinische Pharmakologie (EKLiP), Helmholtz Zentrum München - German Research Center for Environmental Health Neuherberg

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia impedancję oparty na testie w czasie rzeczywistym, aby ilościowo określić zdolność i trwałość zabijania seryjnego zabijania komórek CAR T pod wpływem przewlekłej stymulacji antygenowej, wykorzystując metodę mycia płyt do ponownego wykorzystania w sposób ekonomiczny na ponowne wykorzystanie płyt testowych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia komórkami receptorów antygenowych chimerycznych (CAR) zrewolucjonizowała leczenie konkretnych nowotworów hematologicznych. Jednak znaczna część pacjentów doświadcza nawrotu z powodu utraty antygenów, obniżenia poziomu antygenu lub wyczerpania limfocytów T. Te wyzwania podkreślają potrzebę testów funkcjonalnych, które pozwolą ocenić zdolność zabijania i trwałość komórek CAR T pod wpływem przewlekłej stymulacji antygenem. Testy seryjnego zabijania, które mierzą zdolność komórek CAR T do wielokrotnego eliminowania celów nowotworowych, dostarczają cennych informacji na temat trwałości i siły odpowiedzi komórek CAR T.

Przedstawiamy tutaj test oparty na impedancji z wykorzystaniem systemu Real-Time Cell Analysis (RTCA), aby ilościowo określić seryjne zabójstwa in vitro za pośrednictwem komórek CAR T. Komórki nowotworowe są wielokrotnie zasiewane i pozwalane na specyficzne dla testu płytki E przed dodaniem komórek CAR T w określonych stosunkach efektor-cel (E:T). Platforma nieustannie monitoruje żywotność komórek nowotworowych bez oznakowania, rejestrując dynamiczną cytotoksyczność z wysoką rozdzielczością czasową. Podstawowe odczyty obejmują kinetykę indeksu komórkowego (CI), wskaźnik zabijania komórek nowotworowych oraz czas do osiągnięcia celu. Postępujący spadek zdolności zabijania obserwowany przy wielokrotnych kontaktach z celem nowotworowym stanowi wskaźnik dysfunkcji nabytej limfocyty T, często określanej jako wyczerpanie limfocytów T. Razem te wskaźniki pozwalają na precyzyjną ocenę funkcji komórek CAR T przy różnych stosunkach E:T oraz umożliwiają bezpośrednie porównanie między różnymi konstrukcjami lub współleczeniami komórek CAR T w czasie.

Aby zwiększyć efektywność kosztową, opracowaliśmy procedurę mycia płyt, która umożliwia ponowne użycie płytek E-z testu bez utraty wydajności testu czy integralności danych. Zoptymalizowany przepływ pracy zmniejsza koszty testowania, jednocześnie zachowując odporność analityczną. Takie podejście umożliwia przystępną cenowo i skalowalną ocenę przedkliniczną funkcji komórek CAR T, co ułatwia rozwój projektowania terapii komórkowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia receptorami T receptorami chimerycznymi (CAR) zrewolucjonizowała immunoterapię nowotworową, osiągając niezwykłe sukcesy kliniczne w leczeniu wielu nowotworów hematologicznych, takich jak przewlekła białaczka limfastyczna, ostra białaczka limfoblastyczna, chłoniak dużych komórek B oraz szpiczakmnogi 1,2,3,4,5. Od czasu pierwszych zatwierdzeń regulacyjnych liczba produktów CAR T i leczonych pacjentów stale rosła6. W zależności od konkretnego produktu i wskazań klinicznych, typowe dawki infuzji wynoszą około 2 × 106 do 5× 10 8komórek CAR+ T na pacjenta7. Wysokie dawki infuzji są niezbędne do skutecznego usunięcia guzów i długoterminowej kontroli choroby, ale wiążą się z wyzwaniami klinicznymi i praktycznymi. Duża liczba komórek może zwiększać ryzyko poważnych skutków ubocznych, takich jak zespół uwalniania cytokin (CRS) oraz zespół neurotoksyczności związanej z efektorami immunologicznych (ICANS), które mogą być zależne od dawki8. Ponadto produkcja wystarczającej liczby funkcjonalnych komórek CAR T jest trudna dla pacjentów z silnym wstępnym leczeniem lub limfodem, a proces może być logistycznie wymagający i kosztowny dla ośrodków leczenia9.

Pomimo tych wyzwań, terapie CAR T ukierunkowane na CD19 osiągają 70%-90% wskaźników pełnej remisji u pacjentów z nawrotem lub opornymi nowotworami komórek B, wykazując transformacyjny wpływ kliniczny 10,11,12. Jednak terapia komórkami CAR T napotyka istotne wyzwania, które ograniczają jej długoterminową skuteczność. Kluczowe przeszkody to utrata antygenu lub obniżenie aktywności, niewystarczająca trwałość komórek T CAR oraz wyczerpanie funkcjonalne9. Wyczerpanie limfocytów T CAR – charakteryzujące się zmniejszoną zdolnością proliferacji, zaburzoną aktywnością przeciwnowotworową i słabą trwałością – stanowi istotną przyczynę braku odpowiedzi i nawrotu13. Wyczerpane limfocyty CAR T charakteryzują się obniżoną funkcją efektorów, utrzymującą się ekspresją receptorów hamujących oraz wadliwą produkcją cytokin spowodowaną przewlekłą ekspozycją na antygeny i immunosupresyjnymi mikrośrodowiskami guzowymi14. Badania kliniczne wykazały, że utrata funkcjonalnej trwałości komórek T CAR wiąże się ze zwiększonym ryzykiem nawrotu 11,15,16,17. Ponieważ przedłużona aktywność in vivo wydaje się być głównym czynnikiem predyktora sukcesu terapeutycznego, zrozumienie trwałości i trwałej zdolności zabijania produktów komórek CAR T jest ważnym celem zarówno w badaniach przedklinicznych, jak i translacyjnych. Szczególnie interesująca jest zdolność komórek CAR T do wielokrotnego rozpoznawania i lizy komórek nowotworowych przez dłuższy czas – tzw. "seryjne zabijanie" – ponieważ ta właściwość zapewnia funkcjonalną miarę trwałości i odporności na wyczerpanie18.

Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół przeprowadzania testów seryjnych zabijań z wykorzystaniem platformy impedancji xCELLigence Real-Time Cell Analysis (RTCA), w tym opcjonalną procedurę mycia umożliwiającą ponowne użycie płytek testowych, zwanych dalej płytkami E, co zwiększa efektywność kosztową bez obniżania wydajności testu. Uzasadnienie opracowania takiego protokołu wynika z ograniczeń konwencjonalnych testów cytotoksyczności, które zazwyczaj oferują jedynie statyczne odczyty końcowe. Powszechne podejścia, takie jak uwalnianie chromu-51, testy dehydrogenazy mleczanowej (LDH) czy testy żywotności oparte na cytometrii przepływowej, wymagają etykiet, wymagają pracochłonnych procesów i ograniczone do określonych punktówczasowych 18,19. Co ważniejsze, nie są w stanie łatwo uchwycić dynamicznej kinetyki zabijania przy długotrwałej stymulacji lub wielokrotnej ekspozycji na antygen, co jest bezpośrednio powiązane z utrzymywaniem komórek CAR T i funkcjonalnym wyczerpaniem18.

Platforma xCELLigence RTCA wypełnia te luki, zapewniając bezoznakowy, w czasie rzeczywistym kinetyczny monitoring żywotności celowych komórek za pomocą impedancji elektrycznej20. Przylegające komórki nowotworowe są zasiewane na złotych płytkach E pokrytych mikroelektrodami, gdzie ich przyczepność i proliferacja zwiększają zmierzoną impedancję, określaną jako Indeks Komórkowy (CI)21. Po zabiciu przez CAR T, komórki docelowe są zabijane i odłączane od nich, co prowadzi do szybkiego spadku impedancji20. Ten odczyt w czasie rzeczywistym pozwala na ciągłą ocenę cytotoksyczności przez wiele godzin lub dni bez potrzeby stosowania dodatkowych etykiet czy odczynników22. Ogniwa CAR T, jako nieprzyczepne, nie przyczyniają się do sygnału impedancji, co pozwala na czyste rozdzielenie odczytów efektora i celu23. Ponieważ dane są rejestrowane nieprzerwanie, naukowcy mogą prowadzić wielorundowe protokoły stymulacji, w których komórki CAR T są wielokrotnie przekazywane i eksponowane na świeże komórki nowotworowe, co pozwala na bezpośrednie pomiary ewolucji zdolności zabijania w czasie24. To naśladuje powtarzające się antygenowe kontakty, które komórki CAR T doświadczają in vivo , i zapewnia funkcjonalny odczyt ich zdolności cytotoksycznych.

Ten test seryjnego zabijania opartego na impedancji jest idealnie dostosowany do badaczy oceniających funkcję komórek CAR T w warunkach przedklinicznych, w tym optymalizację konstrukcji, porównania funkcjonalne i testy mocy. Protokół ten wymaga systemu xCELLigence RTCA oraz użycia E-Plate 96. Chociaż jest szeroko stosowany w modelach nowotworów adherentnych, nie nadaje się bezpośrednio do hodowli zawieszonych bez strategii unieruchomienia lub unieruchamiania. Ponieważ same pomiary impedancji odzwierciedlają jedynie przyczepność i żywotność komórek docelowych, zaleca się uzupełniające analizy, takie jak cytometria przepływowa czy testy cytokinowe, aby w pełni scharakteryzować aktywację, proliferację i dynamikę wyczerpania komórek CAR T. Protokół zawiera wyznaczone kroki umożliwiające pobieranie komórek i supernatantów do tych dodatkowych odczytów, umożliwiając bardziej kompleksową ocenę funkcjonalności komórek CAR T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ten protokół został zoptymalizowany pod E-Plate 96 i wymaga systemu xCELLigence RTCA. Przylegające komórki nowotworowe są zasiewane z wyprzedzeniem przez noc, aby osiągnąć fazę wzrostu logarytmicznego w momencie dodawania komórek T CAR. W zależności od linii komórkowej nowotworu i gęstości zasiew, ten odstęp może zostać skrócony do 6–9 godzin, co pozwala na dodanie efektorów tego samego dnia. Jeśli ten drugi workflow zostanie wykonany, nominalny harmonogram dzień po dniu opisany w protokole zostaje zmieniony, a użytkownicy powinni odpowiednio dostosować harmonogram. Kohodowle utrzymują się przez 48 godzin przed przeniesieniem komórek CAR T na świeżo położone komórki nowotworowe, co wymaga dwóch pozycji płytek na instrumencie xCELLigence oraz naprzemiennego nakładania płytek nowotworowych i dodawania efektorów co drugi dzień. Limfytyki CAR T powinny być generowane zgodnie z instytucjonalnymi standardami operacyjnymi lub ustalonymi protokołami. Krótko mówiąc, limfocyty T krwi obwodowej są izolowane według zatwierdzonych standardów etycznych, transdukowane w odpowiednich warunkach biobezpieczeństwa i oceniane pod kątem efektywności transdukcji oraz żywotności za pomocą cytometrii przepływowej lub równoważnych testów QC. Testów xCELLigence nie należy przeprowadzać, gdy wydajność transdukcji CAR jest poniżej 20%, ponieważ niższa efektywność może prowadzić do zwiększonego tła i niespecyficznego zabijania przez komórki nieprzekształcone, co może zniekształcać krzywe wzrostu guza. Cała obsługa komórek powinna odbywać się w warunkach sterylnych w laminarnym okapu. Nośniki mogą być używane zgodnie ze standardami laboratorium lub zgodnie z zaleceniami dostawcy. O ile nie zaznaczono inaczej, komórki inkubowane są w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO₂. Choć jest zoptymalizowana pod kątem komórek CAR T, metoda ta może być również stosowana do innych efektorowych komórek i celów przylegających na zawiesiny.

1. Przygotowanie i zapomnienie (dzień 1)

  1. Przygotowanie talerza
    1. Dodaj 50 μL pożywki nowotworowej na dno każdego dołka płytki E 96.
      UWAGA: Uważaj, aby nie porysować dna studni, ponieważ może to uszkodzić płytę.
    2. Umieść płytkę E w inkubatorze, ustawiając ją na tym samym szczelinie maszyny, która służy do pomiarów.
    3. Inkubuj płytkę E przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby osiągnąć odpowiednią temperaturę testu i pH.
  2. Konfiguracja instrumentów
    1. Tymczasem uruchom RTCA Software Pro (wersja 2.6.1) i wybierz ścieżkę do zapisania eksperymentu.
    2. Wpisz nazwę eksperymentu w polu "RTCA Operator" i zapisz plik.
    3. Wybierz studnie do pomiaru.
    4. Przypisz nazwy komórek w zakładce Komórki , a typy leczenia w zakładce Leczenie .
  3. Harmonogram pomiarów
    1. Ustal harmonogram według następujących kroków:
      Nazwa kroku = Puste ; Sweepy = 1 ; Przedział = 1 ; Czas trwania = 0:00
      Nazwa kroku = Komórki nowotworowe ; Sweepy = 250-300 ; Interwał = 15 min; Czas trwania = minimum 24 godziny
      Nazwa kroku = Leczenie ; Sweeps = do 2500 ; Interwał = 5 min; Czas trwania = minimum 72 h
    2. Naciśnij Apply i upewnij się, że Auto nie jest wybrane dla żadnego kroku.
  4. Krok blankowania
    1. Po 30-minutowej inkubacji płytki E w temperaturze 37 °C naciśnij PLAY/RUN , aby rozpocząć krok pusty.
    2. Poczekaj, aż oprogramowanie oznaczy krok WYKONANY (około 1-2 minuty).
    3. Odblokuj kołyskę i zdejmij płytkę E tylko wtedy, gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia siewu komórek.

2. Runda 1: Siewanie komórek nowotworowych (dzień 1)

  1. Rozsiewanie komórek nowotworowych
    1. Przygotuj zawiesinę komórek nowotworowych w 50 μL odpowiedniego medium na dołek.
    2. Wyjmij płytkę E z inkubatora i zasiewaj komórki w potrójnych egzemplarzach.
  2. Pomiar początkowy
    1. Natychmiast zwróć płytkę E do maszyny i zablokuj podstawkę.
    2. Poczekaj 5-10 minut przed pierwszym pomiarem, aby wyrównać temperaturę i pH płytki E, a następnie kliknij przycisk PLAY/RUN , aby rozpocząć pomiar (Krok 2 harmonogramu = Komórki nowotworowe).
    3. Inkubuj płytkę E przez noc, aby umożliwić przyleganie komórek. Monitoruj nieznormalizowany indeks komórkowy (CI). Gdy CI wchodzi w fazę wzrostu logarytmicznego, przechodź do kolejnego etapu. Ta faza zależy od użytej linii komórkowej i może być wpływana przez liczbę zasianych komórek. Komórki BxPC3 (ATCC CRL-1687) zostały zasiewane w ilości 20 000 komórek na odwiert, z logarytmicznym wzrostem zwykle osiąganym po 6-18 godzinach.

3. Runda 1: Leczenie limfocytami T CAR (dzień 2)

  1. Przygotowanie i zasiewanie limfocytów T
    1. Przygotuj wymaganą liczbę limfocytów CAR T w 100 μL/dołkę w ludzkim medium limfocytów T bez cytokin ekspansji (np. IL-2, IL-7, IL-15 itd.).
      UWAGA: Wydajność transdukcji CAR jest mierzona raz na początku eksperymentu. Pożądany stosunek efektora do celu (E:T) jest ustalany na podstawie liczby komórek CAR⁺ T względem początkowo pokrytych komórek nowotworowych. Na przykład, dla stosunku E:T 1:1 z 50% komórek CAR⁺ T i 20 000 komórek nowotworowych BxPC3, należy położyć łącznie 40 000 komórek T. Stosunek E:T odnosi się więc do warunku początkowego na początku testu seryjnego zabójstwa; o ile nie zostaną przeprowadzone dodatkowe pomiary, zmiany E:T podczas późniejszych rund pozostają nieznane. Zmiany w proliferacji lub przeżyciu limfocytów T w czasie, a tym samym w stosunku E:T, są traktowane jako część odczytu seryjnego zabijania. Jeśli komórki T są dzielone między rundami, E:T jest przeliczany proporcjonalnie (np. podział 1:1 po rundzie 3 zmniejsza początkowe 2:1 E:T do 1:1 w rundzie 4). Jeśli interesujące są dynamiki E:T między rundami, opcjonalnie można dołożyć dodatkowe studnie do pośrednich pomiarów procentu CAR lub funkcji efektora. Usunięcie kulek stymulujących limfocyty T anty-CD3/CD28 za pomocą rozdzielenia magnetycznego może pomóc zmniejszyć nieokreślone zabijanie. Zaleca się również stosowanie limfocytów T w fazie wzrostu logarytmicznego (zazwyczaj między 5 a 20 dniami po stymulacji) oraz rozszerzanie komórek cytokinami co najmniej dwa dni przed badaniem, a nie dzień wcześniej.
    2. Dostosuj wydajność transdukcji CAR w grupach eksperymentalnych do najniższego wspólnego procentu, mieszając z nieprzetworzonymi komórkami T, na podstawie analizy efektywności transdukcji.
      UWAGA: Jeśli wszystkie grupy mają równą efektywność transdukcji, nie jest potrzebna żadna regulacja. Jeśli procenty CAR⁺ się różnią, liczba limfocytów T do płyty oblicza się tak, aby każda grupa zaczynała od tej samej efektywnej liczby komórek CAR⁺ i komórek CAR. Robi się to przez pomnożenie pożądanej liczby komórek CAR⁺ (na podstawie stosunku E:T i zasiewania guza) przez 100 i podzielenie przez zmierzony procent CAR⁺ dla każdej grupy, a następnie dodanie nieprzekształconych komórek T, jeśli jest to konieczne, aby dopasować łączną liczbę komórek T. Na przykład, jeśli jedna grupa ma 50% limfocytów CAR⁺ T, pokrywa się 40 000 limfocytów T (20 000 limfocytów T + 20 000 limfocytów T-), podczas gdy grupa z 60% limfocytów T pokryłaby 33 333 limfocyty T, co daje 20 000 komórek CAR⁺, dodając 6 667 nieprzekształconych limfocytów T, aby dopasować całkowitą liczbę limfocytów T pierwszej grupy (łącznie 40 000).
    3. Opcjonalnie, jeśli ma być badane leczenie cytokiną lub związkiem, należy dodać 20 μL roztworu składającego się z ludzkiego pożywki limfocytów T oraz pożądanej cytokiny lub związku w stężeniu 11x większem niż planowane stężenie końcowe. Ta objętość jest dodawana do standardowych 200 μL już obecnych w każdej dołce (50 μL na zaślepanie, 50 μL na zasiewanie komórek nowotworowych oraz do 100 μL na dodawanie komórek T). Według producenta, E-Plate 96 obsługuje maksymalną objętość 243 μL ± 5 μL na odwiert, co czyni całkowitą objętość 220 μL akceptowalną dla takich opcjonalnych zabiegów.
  2. Siewnictwo i pomiary limfocytów T
    1. Usuń płytkę E, odblokowując kołyskę tylko wtedy, gdy jest gotowy do dodania komórek T.
    2. Seed przygotowywał limfocyty T bezpośrednio na komórkach nowotworowych.
    3. Zablokuj kołyskę wewnątrz urządzenia pomiarowego i przerwij krok 2 w oprogramowaniu RTCA.
      UWAGA: Jeśli krok 2 nie zostanie przerwany, system będzie kontynuował pomiar poprzedniego kroku i zatrzyma się dopiero po jego zakończeniu, co skutkuje utratą punktów danych.
    4. Poczekaj, aż Krok 2 zostanie oznaczony jako WYKONANY.
    5. Kliknij przycisk PLAY/RUN, aby rozpocząć krok 3 (Treatment) i potwierdź komunikat, klikając OK.
      UWAGA: Pozwolienie na 15-30 minut równowagi po obsłudze (np. po siewie lub przeniesieniu komórek) przed rozpoczęciem kolejnego kroku pomiaru (przed krokiem 3.2.5) pomaga zminimalizować początkowe odchylenia spowodowane wahaniami temperatury lub pH na krzywych wzrostu.

4. Runda 2: Siewanie komórek nowotworowych (dzień 3)

  1. Przygotuj nową 96-dołkową płytkę xCELLigence E-Plate, zgodnie z krokami 1.1 i 1.4.
  2. Siej świeże komórki nowotworowe, jak opisano w kroku 2.
  3. Inkubuj płytkę E przez noc, aby umożliwić przyleganie komórek.

5. Runda 2: Transfer komórek T CAR na drugą tablicę E (dzień 4)

  1. Przenieś zawartość każdego odwiertu do odpowiadającej jej studni płyty 96-dołkowej o dnie U za pomocą pipety wielokanałowej. Uważaj, aby nie dotykać elektrod na dole płytki E.
  2. Wirówka w temperaturze pokojowej, 400 × g przez 5 minut.
  3. Ostrożnie zasysaj supernatant i zachowaj go do testu immunosorbentu enzymatycznego (ELISA), jeśli zajdzie taka potrzeba.
  4. Ponownie zawiesij pellet komórkowy w 100 μL świeżego medium bez cytokin ekspansji.
    UWAGA (opcjonalnie): Komórki T mogą być teraz dzielone (np. 50 μL = 1:2) i wykorzystywane do dalszych analiz, takich jak cytometria przepływowa. Rozszczepione limfocyty T korygują się pod kątem ich proliferacji podczas testu zabijającego xCELLigence. Pomaga zmniejszyć liczbę cykli, aż do momentu, gdy wyczerpanie staje się widoczne. Zaleca się przetestowanie proporcji podziału między 2 a 4.
  5. Dodaj 100 μL/well T do płytki E guza z drugiej rundy (50 μL przy rozdzieleniu 1:2), zapewniając pełne uzupełnienie medium i, jeśli to możliwe, cytokiny/związku.

   

6. Kontynuacja testu seryjnego zabójstwa (dni 5–10 i dalej)

  1. Powtarzaj kroki 4 i 5, aby powtórzyć kolejne rundy zabijania w razie potrzeby z 48-godzinnymi interwałami.
  2. Monitoruj aktywność zabijającą i trwałość limfocytów T na każdym etapie, korzystając z odczytów xCELLigence oraz dodatkowych testów, takich jak ELISA lub cytometria przepływowa.

7. Zbieranie danych i obsługa tablic E

  1. Po upływie żądanego czasu pomiaru naciśnij STOP w programie.
  2. Eksportuj dane znormalizowane do punktu dodawania komórek efektorowych i nieuśrednione, aby umożliwić dokładne wykresy średniej ± SEM w oprogramowaniu analitycznym (R, GraphPad Prism itp.). Jeśli chcesz, wyeksportuj uśredniony zbiór danych.
  3. Odblokuj i zdejmij tabliczkę E. Udostępnij eksperyment w oprogramowaniu.
  4. Oczyść lub przechować płytkę E w inkubatorze do dalszych analiz (np. supernatant do ELISA lub pobranie komórek do cytometrii przepływowej).

8. Opcjonalnie: Mycie na tablicy E do ponownego użycia

UWAGA: Ten opcjonalny krok pozwala na ponowne użycie płytek xCELLigence E-plate, aby zmniejszyć koszty eksperymentalne. Ponowne użycie zaleca się tylko wtedy, gdy właściwości elektryczne płytki E pozostają stabilne w trakcie eksperymentów oraz do momentu, gdy poszczególne odwierty mieszczą się w akceptowalnym zakresie bazowym. Przestrzegaj wszystkich procedur bezpieczeństwa, zwłaszcza przy obsłudze wodorotlenku sodu (NaOH). Wizualnie sprawdź płytki E po myciu, aby wykryć potencjalne usterki elektrod.

  1. Usuń całą zawartość tabliczki E, nie dotykając jej spodu.
  2. Przepłucz każdą studnię trzy razy wodą dejonizowaną o stężeniu 200 μL.
  3. Dodaj 200 μL 0,1 M NaOH do każdego otworu.
    UWAGA: NaOH jest. Upewnij się, że przestrzegane są lokalne wytyczne bezpieczeństwa. Noś rękawiczki, płaszcz i gogle ochronne. Trzymaj 1 M NaOH w szafce bezpieczeństwa. Wyrzucaj odpady NaOH do zlewu z płynącą wodą, aby zapewnić odpowiednie rozcieńczenie. Nigdy nie mieszaj skoncentrowanych kwasów i zasad. Nie dodawaj wody do kwasu; Tylko kwas do wody.
  4. Inkubuj płytkę E w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  5. Przepłucz każdą studnię co najmniej trzy razy wodą dejonizowaną, aby usunąć wszelkie pozostałości NaOH.
  6. Osusz płytkę E, delikatnie stukając nią w chusteczkę, a następnie susz na powietrzu.
  7. Sterylizuj płytkę E pod światłem UV wewnątrz szafki zabezpieczającej się na co najmniej godzinę lub pod urządzeniem do napromieniowania UV.
    UWAGA: Ustaw płytkę E tak, aby odwierty były skierowane prosto do góry. Światło UV nie przenika przez plastikowe dno studni.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne wykonanie protokołu daje powtarzalne odczyty oparte na impedancji, które odzwierciedlają żywotność komórek nowotworowych oraz cytotoksyczność komórek CAR T w czasie. Wzrost komórek i cytotoksyczność oceniano za pomocą komercyjnego systemu RTCA. Dane wyrażano jako znormalizowany indeks komórek (NCI), obliczany przez podzielenie CI w każdym punkcie czasowym przez CI w wybranym czasie normalizacji. Czas normalizacji jest ustawiany bezpośrednio przed dodaniem komórek efektorowych. Czas do uzyskania zgody definiuje s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę oceny cytotoksyczności pośredniczonej przez komórki CAR T w wielu rundach ekspozycji na antygeny z wykorzystaniem platformy xCELLigence RTCA. Dzięki umożliwieniu podłużnego pomiaru żywotności komórek nowotworowych za pomocą impedancji, podejście to rejestruje powtarzające się odpowiedzi cytotoksyczne – zwane seryjnym zabijaniem – w formacie wolnym od etykiet i ciągłym. Protokół został zaprojektowany do monitorowania, jak funkcja efektorów limfocytów T zmienia się w czasie w odpowiedzi na kolej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SK otrzymał honoraria od Plectonic, TCR2 Inc., Miltenyi, Galapagos, Cymab, Novartis, Regeneron, BMS oraz GSK. SK jest wynalazcą kilku patentów w dziedzinie immunoonkologii. SK otrzymało opłaty licencyjne od TCR2 Inc i Carina Biotech. SK otrzymał wsparcie badawcze od TCR2 Inc., Tabby Therapeutics, Catalym GmbH, Plectonic GmbH oraz Arcus Bioscience za prace niezwiązane z manuskryptem. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TT, SM i NTTN otrzymały granty od Else-Kröner Fresenius Stiftung (IOLIN). NTTN otrzymało dodatkowe dotacje od Friedrich-Baur-Stiftung oraz German Cancer Aid (AvantCAR.de). MPT jest wspierane przez Fundację Moniki Kutzner oraz Europejską Radę Badawczą (MSCA Fellowship 101106951). SK jest wspierany przez międzynarodowy program doktorancki 'i-Target: immunotargeting raka' (finansowany przez Elitarną Sieć Bawarii), Bawarskie Centrum Badań nad Rakiem (BZKF) (TANGO do Południowej Korei), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, numer grantu: KO5055-2-1 i KO5055/3-1), Sojusz Badawczy Czerniaka (grant numer 409510), Marie Sklodowska-Curie Training Network for Optimizing Adoptive T Cell Therapy of Cancer (finansowany przez program Horizon 2020 Unii Europejskiej; grant 955575), Marie Sklodowska-Curie Training Network do śledzenia i kontroli terapeutycznych komórek odpornościowych w nowotworach (finansowanych przez program Horizon UE, grant 101168810), Else Kröner-Fresenius-Stiftung (IOLIN), German Cancer Aid (AvantCAR.de), Wilhelm-Sander-Stiftung, Ernst Jung Stiftung, Institutional Strategy LMU Monachium (w ramach Niemieckiej Inicjatywy Doskonałości), Go-Bio-Initiative, m4-Award Bawarskiego Ministerstwa Gospodarczych, Bundesministerium für Bildung und Forschung, EUROSTAR-Programm, Europejska Rada Badawcza (Starting Grant 756017, PoC Grant 101100460 oraz CoG 101124203), przez SFB-TRR 338/1 2021-452881907, Fundacja Fritz-Bender, Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung, Fundacja Hector, Bawarska Fundacja Badawcza (BAYCELLATOR), Fundacja Moniki-Kutzner, Fundacja Bruno i Helene Jöster (360° CAR), Fundacja Dr. Rurainski oraz Fundacja Brigitte i Dr. Konstanze Wegener

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BxPC3ATCCCRL-1687
Tablica E 96Agilent 300600910
RTCA Software Pro (Basic)  Agilent Nie maWersja 2.6.1
xCELLigence RTCA MP - (Wiele tablic)Agilent Nie ma

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
  2. Grupp, S. A., et al. Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia. N Engl J Med. 368 (16), 1509-1518 (2013).
  3. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene ciloleucel CAR T-cell therapy in refractory large B-cell lymphoma. N Engl J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  4. Brudno, J. N., et al. T cells genetically modified to express an anti-B-cell maturation antigen chimeric antigen receptor cause remissions of poor-prognosis relapsed multiple myeloma. J Clin Oncol. 36 (22), 2267-2280 (2018).
  5. Gauthier, J., et al. Phase 1 study of CD19 CAR T-cell therapy harboring a fully human scFv in CAR-naïve adult patients with B-ALL. Blood Adv. 9 (8), 1861-1872 (2025).
  6. Mitra, A., et al. From bench to bedside: The history and progress of CAR T-cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  7. Rotte, A., et al. Dose-response correlation for CAR-T cells: A systematic review of clinical studies. J Immunother Cancer. 10 (12), e005678(2022).
  8. Foster, M., et al. Cross-study safety analysis of risk factors in CAR T-cell clinical trials: An FDA database pilot project. Mol Ther Oncolytics. 27, 182-194 (2022).
  9. Sterner, R. C., Sterner, R. M. CAR-T cell therapy: Current limitations and potential strategies. Blood Cancer J. 11 (4), 69(2021).
  10. Turtle, C. J., et al. CD19 CAR-T cells of defined CD4+:CD8+ composition in adult B-cell ALL patients. J Clin Invest. 126 (6), 2123-2138 (2016).
  11. Maude, S. L., et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia. N Engl J Med. 378 (5), 439-448 (2018).
  12. Cappell, K. M., et al. Long-term follow-up of anti-CD19 chimeric antigen receptor T-cell therapy. J Clin Oncol. 38 (32), 3805-3815 (2020).
  13. Zugasti, I., et al. cell therapy for cancer: Current challenges and future directions. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 210(2025).
  14. Tao, Z., et al. Impact of T-cell characteristics on CAR-T cell therapy in hematological malignancies. Blood Cancer J. 14 (1), 213(2024).
  15. Wittibschlager, V., et al. T-cell persistence correlates with improved outcome in patients with B-cell lymphoma. Int J Mol Sci. 24 (6), 5688(2023).
  16. Myers, R. M., et al. Humanized CD19-targeted chimeric antigen receptor (CAR) T cells in CAR-naive and CAR-exposed children and young adults with relapsed or refractory acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol. 39 (27), 3044-3055 (2021).
  17. Gardner, R. A., et al. Intent-to-treat leukemia remission by CD19 CAR T cells of defined formulation and dose in children and young adults. Blood. 129 (25), 3322-3331 (2017).
  18. Kiesgen, S., Messinger, J. C., Chintala, N. K., Tano, Z., Adusumilli, P. S. Comparative analysis of assays to measure CAR T-cell-mediated cytotoxicity. Nat Protoc. 16 (3), 1331-1342 (2021).
  19. Peper, J. K., et al. An impedance-based cytotoxicity assay for real-time and label-free assessment of T-cell-mediated killing of adherent cells. J Immunol Methods. 405, 192-198 (2014).
  20. Cerignoli, F., et al. In vitro immunotherapy potency assays using real-time cell analysis. PLoS One. 13 (3), e0193498(2018).
  21. Xing, J. Z., Zhu, L., Gabos, S., Xie, L. Microelectronic cell sensor assay for detection of cytotoxicity and prediction of acute toxicity. Toxicol In Vitro. 20 (6), 995-1004 (2006).
  22. Lee, E. H. J., et al. Antigen-dependent IL-12 signaling in CAR T cells promotes regional to systemic disease targeting. Nat Commun. 14 (1), 4737(2023).
  23. Lisby, A. N., Carlson, R. D., Baybutt, T. R., Weindorfer, M., Snook, A. E. Evaluation of CAR-T cell cytotoxicity: Real-time impedance-based analysis. Methods Cell Biol. 167, 81-98 (2022).
  24. Sahoo, P., et al. Mathematical deconvolution of CAR T-cell proliferation and exhaustion from real-time killing assay data. J R Soc Interface. 17 (162), 20190734(2020).
  25. Li, N., Zhang, W. Calculation principles of Agilent xCELLigence RTCA software. , Agilent Technologies. (2022).
  26. Pampusch, M. S., Skinner, P. J. Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype. J Vis Exp. (157), e60400(2020).
  27. Brezinger-Dayan, K., et al. Impact of cryopreservation on CAR T production and clinical response. Front Oncol. 12, 1024362(2022).
  28. Foulke, J. G., et al. Optimizing ex vivo CAR-T-cell-mediated cytotoxicity assay through multimodality imaging. Cancers (Basel). 16 (14), (2024).
  29. Cadinanos-Garai, A., et al. High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing. Mol Ther. 33 (5), 2291-2309 (2025).
  30. Stefanowicz-Hajduk, J., Adamska, A., Bartoszewski, R., Ochocka, J. R. Reuse of E-Plate cell sensor arrays in the xCELLigence real-time cell analyzer. Biotechniques. 61 (3), 117-122 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Analiza oparta na impedancjikom rki CAR Tanaliza kom rkowa w czasie rzeczywistymwyczerpanie limfocyt w Tpomiar cytotoksyczno cistosunek efektor celponowne wykorzystanie e p ytekkinetyka indeksu kom rkowego

Powiązane artykuły