Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Osthole poprawia zapalenie stawów szczurów przez oś miR-34a/Bcl-2

92 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69624

⸱

15 maja 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, and Public Experimental Research Center, Xuzhou Medical University, 2Department of Joint Surgery, Shuyang Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Osthole (OST) to naturalny związek o rozległych właściwościach farmakologicznych. Badanie to sugeruje, że OST łagodzi skutki choroby zwyrodnieniowej stawów kolana (KOA) poprzez oś miR-34a/Bcl-2, co wykazano w badaniach in vivo i in vitro na szczurach, oraz dostarcza nowych pomysłów i kierunków dla medycyny patentowej i zastosowań klinicznych.

Streszczenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów kolana (KOA), znana również jako przerostowe lub zwyrodnieniowe zapalenie stawów, jest powszechnym zaburzeniem stawów. Obecne strategie leczenia klinicznego obejmują terapię farmakologiczną, interwencje fizyczne, zabiegi chirurgiczne oraz leczenie pomocnicze. Chociaż takie metody mogą do pewnego stopnia złagodzić objawy KOA, często wiążą się z ograniczeniami, takimi jak skutki uboczne, ograniczona skuteczność czy inwazja. Osthole (OST), naturalna pochodna kumaryny, była szeroko badana pod kątem właściwości leczniczych, szczególnie łagodzących ból stawów i poprawiających funkcje stawów. W tym badaniu zastosowano test CCK8, transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM), barwienie H&E oraz biochemiczną analizę surowicy, aby wykazać, że OST wywiera działanie ochronne na chondrocyty zarówno in vitro , jak i in vivo, bez istotnej zaobserwowanej toksyczności. Kolejne badania z użyciem TEM, barwienia pomarańczowym akrydyną, cytometrii przepływowej oraz western blottingu wykazały, że OST sprzyja autofagii i hamuje apoptozę w chondrocytach. Dalsze badania mechanistyczne za pomocą testów qRT-PCR i raportu lucyferazowego wykazały, że OST obniża poziom miR-34a, zwiększając ekspresję Bcl-2 i hamując apoptozę poprzez szlak miR-34a/Bcl-2. Podsumowując, wyniki te wskazują, że OST chroni chondrocyty zarówno w modelach komórkowych, jak i zwierzęcych, łagodząc stres wywołany LPS oraz zmniejszając stan zapalny i apoptozę u szczurów KOA. Obniżenie poziomu miR-34a i późniejszy wzrost ekspresji Bcl-2 przyczyniają się do jego działania antyapoptotycznego. Wyniki te stanowią teoretyczną podstawę dla rozwoju opatentowanych leków opartych na OST oraz ich potencjalnego klinicznego przełożenia w terapii KOA.

Wprowadzenie

Choroba zwyrodnieniowa stawów kolana (KOA) to powszechna choroba stawów, znana również jako przerostowe, przerostowe lub zniedowładnione zapalenie stawów kolanowych. Jest spowodowana degeneracją chrząstki stawowej oraz zmianami w strukturze wokół stawu. Według badań epidemiologicznych, choroba zwyrodnieniowa stawów kolana jest powszechną chorobą, zwłaszcza u osób starszych1. Jego częstość występowania jest ściśle związana z wiekiem, wagą, genetyką, urazami stawów i innymi czynnikami. Mogą również ucierpieć funkcje fizjologiczne, w tym ograniczona ruchomość stawów, osłabiona siła mięśni oraz nieprawidłowy chód. Obecnie w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów kolana najczęściej stosowane metody to terapia farmakologiczna, fizjoterapia, chirurgia oraz terapia adiuwantowa2. Leki często obejmują środki przeciwbólowe, niesteroidowe leki przeciwzapalne oraz leki na przewlekłe zapalenie stawów, które łagodzą ból i kontrolują stan zapalny. Fizjoterapia obejmuje gorące okłady, zimne okłady, masaż oraz specjalistyczne ćwiczenia rehabilitacyjne mające na celu poprawę funkcji motorycznych stawów i zmniejszenie bólu. Leczenie chirurgiczne może obejmować artroskopię, sztuczną wymianę stawów lub morfologiczną naprawę kości stawów w celu przywrócenia struktury i funkcji stawu. Ponadto szeroko stosowane są terapie uzupełniające, takie jak akupunktura, fizjoterapia i tradycyjna medycyna chińska.

Jednak chociaż te metody przynoszą pewną ulgę w objawach i stanie zwyrodnieniowym stawów kolan, nadal istnieją pewne ograniczenia. Leczenie farmakologiczne może powodować niepożądane reakcje i problemy z uzależnieniem; Fizjoterapia wymaga ciągłego procesu rehabilitacji, a wyniki różnią się w zależności od indywidualnych różnic; Leczenie chirurgiczne jest ryzykowne, proces rekonwalescencji długi i wymaga starannego rozważenia; I chociaż terapia adiuwantowa cieszy się szerokim zainteresowaniem i zastosowaniem, wciąż istnieją ograniczone naukowe poparcia na temat jej skuteczności, należy dogłębnie zbadać mechanizmy regulacyjne terapii adiuwantowej. W terapii adiuwantowej tradycyjne chińskie medycyny w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów kolan były szeroko stosowane w wielu dziedzinach i okazały się przydatne. Muszą istnieć pewne elementy tradycyjnej medycyny chińskiej, które nie są jeszcze dobrze znane, ale zostały potwierdzone przez długoterminową praktykę i badania kontrolne. Obecnie wiele chińskich medycyn zgromadziło bogate doświadczenie w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów kolan, takich jak Cibotium barometz3, Ligusticum wallichii Franchat4, Angelica pubescens5 i inne. Te zioła mają działanie przeciwbólowe i przeciwzapalne, które skutecznie łagodzą ból i zmniejszają stan zapalny.

OST to związek podobny do kumaryny, szeroko stosowany w medycynie jako naturalny ekstrakt ziołowy6. Posiada wiele właściwości farmakologicznych i jest poparta licznymi badaniami. Badania wykazały, że cnidium wykazuje wiele właściwości farmakologicznych, w tym przeciwnowotworowe, przeciwzapalne, hiperglikemię, agregację płytek krwi oraz neuroprotekcję, a także ma potencjalne efekty terapeutyczne na wiele innych chorób7. Zgłoszono, że OST może wspierać apoptozę komórek nowotworowych poprzez regulację autofagii, która hamuje apoptozę komórek raka jajnika poprzez autofagię pośredniczoną przez LC3 oraz pirostozę zależną od GSDME8; OST indukuje apoptozę komórek HT-29 poprzez stres retikulum endoplazmatyczny i autofagię komórek9; OST promuje apoptozę raka jelita grubego poprzez hamowanie sygnalizacji AMPK/Akt, indukując autofagię komórkową, ROS i ferroptozę10; OST może hamować rozwój raka jelita grubego poprzez regulację autofagii i mitochondrialnej transdukcji sygnału11. Jednocześnie OST jest szczególnie istotna w łagodzeniu bólu stawów i poprawie funkcji stawów, głównie poprzez zmniejszenie reakcji zapalnej i łagodzenie bólu stawów. A jego składniki aktywne mogą ograniczać uwalnianie substancji zapalnych i hamować degenerację chrząstki stawowej spowodowaną artretyzmem. W porównaniu z powszechnymi lekami zachodnimi, OST jest bezpieczniejsza i ma niską toksyczność, a długotrwałe stosowanie nie powoduje oporności na leki. Zgłoszono, że dziura ostowa zwiększa osteogenezę w osteoblastach poprzez podnoszenie czynnika transkrypcyjnego osterix poprzez sygnalizację cAMP/CREB in vitro oraz in vivo12; OST hamuje rozwój choroby zwyrodnieniowej stawów kolana poprzez wzmacnianie autofagii aktywowanej przez szlak AMPK/ULK113; Lakton Cnidium hamuje różnicowanie osteoklastu poprzez szlak sygnalizacyjny p38 MAPK i PI3K-Akt oraz c-Fos/NFATc114; Cnidium lakton zapobiega utracie kości w modelu szczura z ovariektomią poprzez szlak sygnalizacyjny estrogen-α/BMP-2/Smad15; OST poprawia osteoporozę poprzez zwiększenie autofagii komórek macierzystych mezenchymalnych16. Jednak obserwacje i analizy wskazały, że większość badań pozostawała w fenotypie lub nie ujawniła mechanizmu regulacji szlaku sygnalizacyjnego uczestnictwa w udziale leków na poziomie molekularnym, co było również jednym z powodów, dla których związki wyodrębniane z tradycyjnej medycyny chińskiej są trudne do szerokiego zaakceptowania. Dlatego niezwykle istotne jest dalsze badanie mechanizmu regulacji biologicznej Osthole na poziomie molekularnym dla jego medycyny patentowej i zastosowania klinicznego.

miRNA to małe RNA, które reguluje funkcję biologiczną poprzez hamowanie ekspresji genów docelowych. Wiele tradycyjnych chińskich medycyn jest znanych z tego, że wywiera swoje biologiczne działanie poprzez regulację miRNA. Podobnie, OST również zgłaszano, że wpływa na ekspresję miRNA. Po pierwsze, OST pełni rolę biologiczną przeciwnowotworową poprzez miRNA. Zgłoszono, że OST hamował proliferację komórek i indukował apoptozę komórek poprzez obniżenie ekspresji CPEB2 poprzez zwiększanie regulacji miR-424 w raku endometrium17; OST tłumi proliferację i przyspiesza apoptozę ludzkich komórek glejaka poprzez wzrost i obniżenie poziomu miR-16 oraz obniżenie MMP-9-18; OST wykazuje działanie przeciwnowotworowe w retinoblastomie poprzez hamowanie szlaku PI3K/AKT/mTOR oraz regulację osi19 hsa_circ_0007534/miR-214-3p. Po drugie, OST może również wpływać na procesy fizjologiczne narządów ciała poprzez regulację miRNA, która łagodzi remodelację naczyń płucnych poprzez modulację metaboliczną reprogramowania lipidów wymiR-22–3p20; OST chroni szczury przed niedokrwieniem mięśnia sercowego/uszkodzeniem reperfuzyjnym poprzez obniżanie miR-30a i promowanie autofagii21; OST chroni kardiomiocyty H9c2 przed uszkodzeniami wywołanymi trastuzumabem poprzez wzmacnianie autofagii poprzez szlak sygnalizacyjny p38MAPK/mTOR22. Po trzecie, OST może pełnić rolę neuroprotekcyjną dzięki miRNA, która stymulowała różnicowanie komórek macierzystych nerwowych w neurony w modelu komórkowym choroby Alzheimera poprzez zwiększenie poziomu miR-9 oraz ratowała funkcjonalne uszkodzenia neuronów hipokampa u myszy transgenicznych APP/PS123; OST obniża poziom beta-amyloidu poprzez zwiększenie poziomu miR-107 w chorobie Alzheimera 24. Nie zgłoszono jednak, że miRNA może być regulowane przez OST w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów kolan. Literatura wykazała, że miR-34a wzmacnia apoptozę chondrocytów i ułatwia rozwój choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez ukierunkowanie na DLL1 oraz regulację szlaku PI3K/AKT25. Długie niekodujące RNA MEG3 reguluje postęp choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez regulację osi miR-34a/Klotho26; Obniżenie poziomu miR-34a sprzyja proliferacji i hamuje apoptozę komórek chrząstki zwykostnierdzostawiowej szczurów poprzez aktywację szlaku PI3K/Akt27. Czy zatem KOA można traktować za pomocą OST zgodnie z regulacją miR-34a? Dlatego przypuszcza się, że OST może leczyć chorobę zwyrodnieniową stawów kolana poprzez regulację miRNA.

Podsumowując, OST to naturalny związek o rozległych właściwościach farmakologicznych28. Wcześniej grupa badawcza potwierdziła, że OST może poprawić chorobę zwyrodnieniową stawów kolana u szczurów, jednak transdukcja sygnału komórkowego oraz mechanizmy molekularne leżące u podstaw tego biologicznego efektu nie zostały w pełni wyjaśnione. W tym artykule, poprzez dalsze badania szlaków sygnalizacji miRNA, autofagii i apoptozy w OST, ma się wyjaśnić mechanizm OST w leczeniu choroby zwyrodnieniowej stawów kolana oraz przedstawić nowe pomysły i kierunki dotyczące jego medycyny patentowej i zastosowania klinicznego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Leczenia Zwierząt Uniwersytetu Medycznego w Xuzhou. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Model zwierzęcy

Dorosłe samce i samice szczurów Sprague-Dawley (SD) o wadze 250–300 g zostały zakupione w Centrum Eksperymentalnych Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Xuzhou. Szczury hodowano w specjalnym, wolnym od patogenów pomieszczeniu. Procedury eksperymentów na zwierzętach, w tym leczenie, opieka i wybór punktów końcowych, były zgodne z wytycznymi "Animal Research: Reporting In Vivo Experiments". Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono z randomizacją. Szczury SD zostały podzielone na cztery grupy (n = 8 na grupę): Grupa normalna (bez operacji, karmienie normalne) (grupa normalna), grupa pozorowana (operacja pozorowa: nacięcie skóry i mięśni bez przecięcia więzadła krzyżowego przedniego [ACLT], następnie poddanie soli fizjologicznej), grupa KOA/NC (operacja ACLT + wylew z soli fizjologicznej), grupa KOA/OST (operacja ACLT + wylew OST). Model KOA kolana szczura został skonstruowany metodą przecięcia więzadła krzyżowego przedniego (ACLT), jak opisanowcześniej 29. Grupa z solą fizjologiczną otrzymała sól fizjologiczną przez gavage, a grupa OST przez gavage przez 4 tygodnie. Dawka OST to 50 mg/kg masy ciała (rozpuszczona w PEG 400 i rozcieńczona solą fizjologiczną), a częstotliwość podawania to raz dziennie przez 4 tygodnie w podsekcji Szczury. Następnie szczury były uśpione do analizy (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). Tkanki były natychmiast zamrażane w ciekłym azocie lub utrwalane w 4% paraformaldehydzie.

2. Hodowla komórkowa

Linia komórkowa ludzkich chondrocytów (C28/I2) została pozyskana z American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Komórki zostały wyhodowane zgodnie z wytycznymi ATCC i użyte w ciągu 6 miesięcy.

Warunki hodowla: Medium DMEM/F-12 uzupełnione o 10% surowicy płodowej bydła i 1% penicylin-streptomycyny, inkubowane w 37 °C w inkubatorze nawilżającym 5%CO2 .

Zabiegi: Komórki zostały zasiane w ilości 1 × 106 komórek /dołek w płytkach 6-dołkowe; po 24 godzinach adhezji traktowano je samodzielnie LPS (1 μg/mL) lub OST (100 μM) przez 24 godziny.

3. Testy żywotności komórek

Komórki chondrocytów były współinkubowane z OST lub LPS w różnych stężeniach w płytkach 96-dołkowych. Test CCK8 odzwierciedla żywotność komórek poprzez wykrywanie absorbancji (OD450 nm) za pomocą czytnika mikropłyt, przy czym wyższe wartości OD wskazują na bardziej żywotne komórki.

Gradient stężenia OST: 0, 25, 50, 100, 200, 400 μM (inkubowany przez 24 godziny). Test CCK8 wykazał żywotność komórek >90% we wszystkich stężeniach, potwierdzając nietoksyczność związku.

Gradient stężenia LPS: 0, 0,1, 0,5, 1, 2 μg/mL (inkubowany przez 24 godziny). Grupa LPS o pojemności 1 μg/mL miała ~50% żywotności komórek (w porównaniu do grupy Ctrl), dlatego to stężenie wybrano do kolejnych eksperymentów.

4. Barwienie hematoksyliny i eozyny (H&E) oraz barwienie Safanin O

Tkanki były osadzane w parafinie, odwoskowane, nawilżane i barwione odczynnikami H&E oraz Safranin O/Fast Green zgodnie z zaleceniami producenta. Warunki barwienia: stężenie robocze AO wynosiło 1 μg/mL; komórki inkubowano w temperaturze 37 °C przez 5 minut w ciemności.

Metoda ilościowa: Wskaźnik pozytywności AVO został obliczony poprzez liczenie komórek zawierających pomarańczowe punkty w 5 losowych polach (powiększenie ×400) na próbkę za pomocą oprogramowania ImageJ. Następnie fragmenty były rejestrowane pod mikroskopem BX43 (powiększenie ×400).

5. Cytometria przepływowa

Komórki zostały pobrane i ponownie zawiesinowane w roztworze Annexin-V FITC/PI do analizy apoptozy. Warunki inkubacji: Komórki były ponownie zawieszane w temperaturze 1× 106 komórek /mL w roztworze Annexin-V FITC/PI (KeyGEN) i inkubowane w temperaturze pokojowej przez 15 minut w ciemności.

Strategia bramkowania: Forward scatter (FSC) kontra Do wykluczenia odpadów komórkowych stosowano bramki rozpraszania bocznego (SSC); Komórki FITC⁺/PI⁻ z Załącznika-V zostały zdefiniowane jako wczesne apoptotyczne, a komórki FitC⁺/PI⁺ z Załącznika-V jako późne apoptotyczne. Wykres bramkowy jest zawarty w Pliku Uzupełniającym 1 (surowe dane cytometrii przepływowej). Komórki były zbierane za pomocą cytometru przepływowego. Dane zostały przeanalizowane za pomocą oprogramowania Flow Jo.

6. Transfekcja plazmidów i mimika

MiR-34a mimika (34a-mimika), niespecyficzna kontrolna mimika (NC) została pozyskana z komercyjnego źródła. Komórki były transfekcowane plazmidami za pomocą LipofektaminyTM 3000 zgodnie z instrukcjami producenta.

7. Zabarwienie pomarańczowym akrydynem

Autofagia była zwykle oceniana za pomocą barwienia pomarańczowego akrydyną w komórkach. Po leczeniu komórek LPS lub OST w określonych stężeniach przez 24 godziny, były inkubowane AO (1 μg/mL) w temperaturze 37 °C przez 5 minut w ciemności. Obrazy zostały wykonane za pomocą mikroskopu konfokalnego laserowego. Wskaźnik pozytywności AVO obliczono poprzez liczenie komórek zawierających pomarańczowe punkty w 5 losowych polach (powiększenie ×400) na próbkę za pomocą oprogramowania ImageJ. Dane podawane są jako średnia ± SD z trzech niezależnych eksperymentów.

8. Obserwacje mikroskopem transmisyjnym elektronowym

Próbki zostały utrwalone w 2,5% glutaraldehydu i 1% czterotlenku osmu, następnie odwodnione, płukane i impregnowane. Po polimeryzacji próbki były cięte na sekcje o grubości 70 nm za pomocą ultramikrotomu. Ultrastrukturę komórek obserwowano za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

9. Immunoblotting

Przeciwciało monoklonalne myszy (ABS) przeciwko Bcl-2 (#68103), przeciwciało poliklonalne królika przeciwko LC3 (#14600-1-AP), IL-6 (21865-1-AP) oraz przeciwciało monoklonalne myszy przeciwko β-Actin (#66009-1-lg) zostały zakupione od Proteintech. Komercyjnie uzyskano wtórne Abs sprzężone z IRDye 800CW koziego (poliklonalnego) anty-IgG (H+L) lub IRDye 800CW koziego (poliklonalnego) anty-mysiego IgG (H+L). Komórki były lizowane w teście lizy całej komórki, oddzielonej elektroforezą w żelu SDS-poliakrylamidowym. Białka wykryto przy użyciu pierwotnych Abs i odpowiadających im wtórnych Abs. Obciążenie białkiem wynosiło 30 μg na tor; rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych: Bcl-2 (1:1000), LC3 (1:1500), β-tubulina (1:5000); przeciwciała wtórne (IRDye 800CW) zastosowano w stosunku 1:10 000, IL-6 (1:800). Następnie pasma białkowe zostały uchwycone przez ulepszony system ultrazmodernizowanego chemiluminescencyjnego laserowego skanowania. Pasma białkowe były ilościowo określane przez oprogramowanie ImageJ.

10. Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Całkowite RNA zostały wyizolowane z komórek za pomocą odczynnika Trizol. cDNA uzyskane z całkowitych RNA zostały zsyntetyzowane przy użyciu zestawu regent cDNA i przeanalizowane metodami SYBR Green. cDNA uzyskane z miRNA zostały zsyntetyzowane przy użyciu zestawu cDNA pierwszej nici miRcute plus miRNA i przeanalizowane przez zestaw qPCR miRcute plus miRNA. Wszystkie procedury były wykonywane zgodnie z protokołem producenta. Wyrażenie transkryptu docelowego zostało obliczone metodą 2-△△CT . GADPH i U6 były używane jako kontrola ładowania mRNA i miRNA, odpowiednio. Sekwencja prymarów jest wymieniona w Tabeli 1.

11. Testy reportera lucyferazy

Plazmid reporterowy typu dzikiego psiCHECK2-Bcl-2-3′UTR (WT) oraz psiCHECK2-Bcl-2-3′UTR z mutantem w miejscu wiązania miR-34a (Mut). Reporterzy i mimik miR-34a zostali współtransfektowani do komórek chondrocytów za pomocą LipofektaminyTM 3000. Komórki były pobierane i lizowane po 24 godzinach transfekcji. Intensywność lucyferazy była następnie mierzona za pomocą zestawu Dual-LumiTM Luciferase Reporter Gene Assay zgodnie z instrukcjami producenta.

12. Testy analizy chodu

System MGT-PR był używany do obserwowania ruchów kończyn szczurów w każdej grupie. Przed testami szczury mogły się przystosować do środowiska pasa startowego. Dane dotyczące chodu podczas swobodnego chodzenia zostały zarejestrowane, a dla każdego szczura zarejestrowano trzy kolejne ważne próby chodzenia. Analizowane parametry obejmowały długość kroku, czas zamachu oraz koordynację między prawą a lewą kończyną tylną.

13. Analiza statystyczna

Eksperymenty przeprowadzono w trzech egzemplarzach i niezależnie powtórzono co najmniej trzy razy. Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 9. Dane wykazano jako średnią ± SD. Różnice statystyczne oceniano za pomocą jednokierunkowego testu ANOVA (test po-hoc Tukeya) dla wielu porównań lub dwustronnego testu Student's t dla dwóch porównań eksperymentalnych grup. Różnice uznano za istotne przy p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komórki chondrocytów chronione OST zarówno in vitro, jak i in vivo
Jako produkt naturalny, profil bezpieczeństwa OST wymaga dokładnej analizy. Badanie to najpierw oceniło cytotoksyczność na chondrocytach in vitro za pomocą testu CCK8. Wyniki wskazywały, że OST nie wykazuje toksyczności wobec chondrocytów nawet przy stężeniu 400 μM (Rysunek 1A). Aby zbadać przeciwzapalne i antyapoptotyczne działanie OST na chondrocyty, śmierć komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przede wszystkim OST chroniła chondrocyty przed stresem wywołanym LPS in vitro oraz łagodziła stan zapalny i apoptozę u szczurów KOA in vivo. Te efekty ochronne wiązały się ze spadkiem wyregulowania miR-34a oraz zwiększonym wzrostem ekspresji Bcl-2, co odpowiada proponowanej roli osi miR-34a/Bcl-2 w pośredniczeniu działania OST.

W tym badaniu stwierdzono, że OST sprzyja autofagii komórek chondrocytów i zmniejsza apoptozę zarówno in vitro , jak i in vivo. Pow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych finansowych konfliktów interesów.

Podziękowania

Badania te zostały sfinansowane przez Kluczowe Laboratorium Nowych Leków i Medycyny Klinicznej Uniwersytetu Jiangsu (XZSYSKF2021037). Eksperymenty opisane w tym artykule zostały częściowo przeprowadzone w Publicznym Centrum Badań Eksperymentalnych oraz w Centrum Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu Medycznego Xuzhou. Podziękowania składamy Fuxing Dong, Kejia Zhang, Jinxia Kuai i Min Zhang za entuzjastyczną pomoc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% czterotlenku osmuRuixin Technology
2,5% glutaraldehyduTechnologia Zhongjingkeyi
Akrydynowy pomarańczSigmaAmresco 0360
Rozwiązanie Annexin-V FITC/PIKeyGENKGA107
Bcl-2Proteintech#68103
Zestaw do liczenia komórek-8VICMED39.VC5001L
ChemiluminescencjaOdyseja CLX
Mikroskop konfokalnyLeicaSTELLARIS 5
DMEM/F-12HyClone12.SH30023-01
Zestaw do analizy genu Dual-LumiTM Reporter LuciferaseBeyotimeRG088
FastKing cDNA regent kitTIANGENKR116-03
Cytometr przepływowyBDFACS Canto II
Linia komórkowa ludzkich chondrocytówKolekcja Amerykańskiej Kultury TypowejYTLK280144
LC3Proteintech#14600-1-AP
LipofektaminaTM 3000InvitrogenL3000015
LipopolisacharydySigma29.L2880
Badanie lizyKeyGENKGP704-100
Czytnik mikropłytBioTekSynergy 2
zestaw cDNA pierwszej nici miRcute plus miRNATIANGENKR211-02‌
zestaw qPCR miRcute plus miRNATIANGENFP411-02
OstholeMedchemexpressO815127-25g
Elektroforeza żelowa SDS-poliakrylamidowaNCM BiotechP2012
SerumClark BioscienceFB15015
SYBR GreenTIANGENFP217-01‌
Mikroskopia transmisyjna elektronowaFEITecnai G2
ultra-mikrotomLeciaUC7
Pionowy mikroskop fluorescencyjnyOlympusBX43
β-AktynaProteintech#66009-1-LG

Bibliografia

  1. Kan, H. S., et al. Non-surgical treatment of knee osteoarthritis. Hong Kong Med J. 25 (2), 127-133 (2019).
  2. Dantas, L. O., Salvini, T. F., McAlindon, T. E. Knee osteoarthritis: Key treatments and implications for physical therapy. Braz J Phys Ther. 25 (2), 135-146 (2021).
  3. Chen, G. Y., et al. Network pharmacology-based strategy to investigate the mechanisms of Cibotium barometz in treating osteoarthritis. Evid Based Complement Alternat Med. 2022, 1-15 (2022).
  4. Li, H., et al. Intra-articular injection of a nanosuspension of tetramethylpyrazine dihydroxynaphthalenate for stronger and longer-lasting effects against osteoarthritis. J Biomed Nanotechnol. 17 (6), 1199-1207 (2021).
  5. Qiang, R., et al. Carbon quantum dots derived from herbal medicine as therapeutic nanoagents for rheumatoid arthritis with ultrahigh lubrication and anti-inflammation. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (32), 38653-38664 (2023).
  6. Sun, M., Sun, M., Zhang, J. Osthole: An overview of its sources, biological activities, and modification development. Med Chem Res. 30 (10), 1767-1794 (2021).
  7. Yang, S., et al. Osthole: An up-to-date review of its anticancer potential and mechanisms of action. Front Pharmacol. 13, 945627(2022).
  8. Liang, J., et al. Osthole inhibits ovarian carcinoma cells through LC3-mediated autophagy and GSDME-dependent pyroptosis except for apoptosis. Eur J Pharmacol. 874, 172990(2020).
  9. Zhou, X. H., Kang, J., Zhong, Z. D., Cheng, Y. Osthole induces apoptosis of HT-29 cells via endoplasmic reticulum stress and autophagy. Oncol Lett. 22 (4), 726(2021).
  10. Zhou, X., Kang, J., Zhang, L., Cheng, Y. Osthole inhibits malignant phenotypes and induces ferroptosis in KRAS-mutant colorectal cancer cells via suppressing AMPK/Akt signaling. Cancer Chemother Pharmacol. 92 (2), 119-134 (2023).
  11. Song, J., et al. Osthole impairs mitochondrial metabolism and the autophagic flux in colorectal cancer. Phytomedicine. 125, 155383(2024).
  12. Zhang, Z. R., et al. Osthole enhances osteogenesis in osteoblasts by elevating transcription factor Osterix via cAMP/CREB signaling in vitro and in vivo. Nutrients. 9 (6), 588(2017).
  13. Ma, T., et al. Osthole suppresses knee osteoarthritis development by enhancing autophagy activated via the AMPK/ULK1 pathway. Molecules. 27 (23), 8624(2022).
  14. Liang, J. Y., Wu, W. L., Chen, Y. X., Liu, H. The efficacy and potential mechanism of cnidium lactone to inhibit osteoclast differentiation. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 47 (1), 3087-3093 (2019).
  15. Wang, Z., Bao, H. W., Xu, Y. J. Cnidium lactone prevents bone loss in an ovariectomized rat model through the estrogen-α/BMP-2/Smad signaling pathway. J Cell Biochem. 121 (10), 4567-4576 (2020).
  16. Zheng, X., et al. Osthole improves therapy for osteoporosis through increasing autophagy of mesenchymal stem cells. Exp Anim. 68 (4), 347-355 (2019).
  17. Lu, K., Lin, J., Jiang, J. Osthole inhibits cell proliferation and induces apoptosis through decreasing CPEB2 expression via upregulating miR-424 in endometrial carcinoma. J Recept Signal Transduct. 40 (1), 89-96 (2020).
  18. Lin, K. A. I., et al. Osthole suppresses proliferation and accelerates apoptosis of human glioma cells via upregulation of microRNA-16 and downregulation of MMP-9. Mol Med Rep. 12 (3), 4592-4597 (2015).
  19. Lv, X., et al. Osthole exhibits an anti-tumor effect in retinoblastoma through inhibiting the PI3K/AKT/mTOR pathway via regulating the hsa_circ_0007534/miR-214-3p axis. Pharm Biol. 60 (1), 417-426 (2022).
  20. Niu, Z., et al. Osthole alleviates pulmonary vascular remodeling by modulating microRNA-22-3p mediated lipid metabolic reprogramming. Phytomedicine. 96, 153840(2022).
  21. Lu, W. Osthole down-regulates miR-30a and promotes autophagy to protect rats against myocardial ischemia/reperfusion injury. Turk J Thorac Cardiovasc Surg. 27 (2), 178-184 (2019).
  22. Hou, H., Yang, Y., Chen, R., Guo, Z. Osthole protects H9c2 cardiomyocytes against trastuzumab-induced damage by enhancing autophagy through the p38MAPK/mTOR signaling pathway. Toxicol In Vitro. 93, 105704(2023).
  23. Li, S. H., et al. Osthole stimulated neural stem cells differentiation into neurons in an Alzheimer’s disease cell model via upregulation of microRNA-9 and rescued functional impairment of hippocampal neurons in APP/PS1 transgenic mice. Front Neurosci. 11, 340(2017).
  24. Jiao, Y., et al. Osthole decreases beta amyloid levels through upregulation of miR-107 in Alzheimer’s disease. Neuropharmacology. 108, 332-344 (2016).
  25. Zhang, W., et al. miR-34a enhances chondrocyte apoptosis, senescence and facilitates development of osteoarthritis by targeting DLL1 and regulating PI3K/AKT pathway. Cell Physiol Biochem. 48 (3), 1304-1316 (2018).
  26. Xiong, G., et al. Long non-coding RNA MEG3 regulates the progress of osteoarthritis by regulating the miR-34a/Klotho axis. Ann Transl Med. 10 (8), 454(2022).
  27. Tao, H., Cheng, L., Yang, R. Downregulation of miR-34a promotes proliferation and inhibits apoptosis of rat osteoarthritic cartilage cells by activating PI3K/Akt pathway. Clin Interv Aging. 15, 373-385 (2020).
  28. Zafar, S., et al. Osthole: A multifunctional natural compound with potential anticancer, antioxidant and anti-inflammatory activities. Mini Rev Med Chem. 21 (18), 2747-2763 (2021).
  29. Zhang, H., Zheng, W., Li, D., Zheng, J. miR-146a-5p promotes chondrocyte apoptosis and inhibits autophagy of osteoarthritis by targeting NUMB. Cartilage. 12 (10), 1467S-1477S (2021).
  30. Lu, R., et al. Oroxin B alleviates osteoarthritis through anti-inflammation and inhibition of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway and enhancement of autophagy. Front Endocrinol. 13, 1060721(2022).
  31. Lv, X., et al. miR-34a-5p was involved in chronic intermittent hypoxia-induced autophagy of human coronary artery endothelial cells via Bcl-2/beclin 1 signal transduction pathway. J Cell Biochem. 120 (11), 18871-18882 (2019).
  32. Ma, L., et al. Knee osteoarthritis therapy: Recent advances in intra-articular drug delivery systems. Drug Des Devel Ther. 16, 1311-1347 (2022).
  33. Zhang, W., et al. GelMA hydrogel as a promising delivery system for osthole in the treatment of rheumatoid arthritis: targeting the miR-1224-3p/AGO1 axis. Int J Mol Sci. 24 (17), 13210(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

leczenie ostholemchoroba zwyrodnieniowa stawu kolanowegoochrona chondrocyt windukcja autofagiihamowanie apoptozytransmisyjna mikroskopia elektronowacytometria przep ywowaWestern blotqRT PCR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.