Opóźnione i postępujące uszkodzenie jąder po ekspozycji u szczurów spowodowane drobnymi cząstkami stałymi (PM2.5)

Podsumowanie

Ekspozycja na PM2.5 powoduje opóźnione uszkodzenie jąder w modelach szczurów poprzez długotrwałe reakcje zapalne, zwiększoną apoptozę komórek rozrodczych, obniżenie poziomu Connexin-43/Occludin oraz sygnalizację zgodną z aktywacją szlaku JNK, co podkreśla jego długoterminowe zagrożenie dla męskiego zdrowia rozrodczego.

Streszczenie

Drobne cząstki stałe (PM2.5) są coraz częściej powiązane z zaburzeniami rozrodczości u mężczyzn. Jednak ponieważ większość badań pozostaje ostra—skoncentrowana, opóźniona, utrzymująca się lub postępująca, uszkodzenia jąder po ekspozycji—kluczowe dla długoterminowej oceny ryzyka—pozostają słabo poznane. Ustanowiliśmy model szczura o rozdzielczości czasowej, aby określić, czy uraz utrzymuje się, czy pogarsza po ekspozycji. Siedemdziesiąt dwa samce szczurów Sprague-Dawley zostało losowo podzielonych na dziewięć grup (kontrola; pojazd w wieku 24 godzin, 1, 2 i 4 miesiące; PM2.5 w tych samych momentach) i otrzymywał PM2.5 dośrodkowo w dawce 5 mg/kg/dzień przez 7 dni. Zmierzyliśmy ilość jakości plemników i indeksów narządów rozrodczych, badaliśmy histologię i ultrastrukturę jąder, mierzyliśmy poziom testosteronu w surowicy, FSH, LH i E2, profilowaliśmy zapalne mRNA cytokiny (IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ), oceniliśmy apoptozę komórek rozrodczych za pomocą TUNEL oraz oceniliśmy białka związane z połączeniami i stresem (Connexin-43, Occludin, JNK). Ekspozycja na PM2.5 powodowała trwałe spadki stężenia i motoryki plemników, a także zwiększoną liczbę nieprawidłowości oraz zaniku jąder i najądrza, które nie wróciły do zdrowia przez 4 miesiące po ekspozycji. Histologia wykazała postępujące przerzedzenie nabłonka mieńczego oraz degenerację ultrastrukturalną. Widoczne były również zaburzenia hormonalne – obniżony poziom testosteronu i zmienione gonadotropiny. Mechanistycznie ekspozycja na PM2.5 utrzymywała podwyższoną ekspresję IL-1β i IL-6, wspierała apoptozę komórek rozrodczych oraz obniżała poziom koneksyny-43 i okludyny, wykazując jednocześnie wzorce zgodne z aktywacją szlaku JNK. Razem te ustalenia wykazują opóźnioną i postępującą toksyczność jąder po zakończeniu ekspozycji na PM2.5 oraz sugerują, że zachowanie integralności złączy i celowanie w JNK może złagodzić długoterminowe szkody rozrodcze.

Wprowadzenie

PM2.5, złożona mieszanina drobnych cząstek o średnicy aerodynamicznej ≤2,5 μm, pochodzi z emisji przemysłowych, spalin pojazdów oraz spalania biomasy i stała się głównym globalnym zanieczyszczeniem środowiska¹. Badania epidemiologiczne łączą ekspozycję na PM2.5 z chorobami układu oddechowego i sercowo-naczyniowego², a także z zaburzeniami układu rozrodczego³. Wpływ na płodność mężczyzn budzi szczególne obawy ze względu na dowody, że zanieczyszczenie powietrza może obniżać jakość plemników⁴. Czynniki męskie przyczyniają się do ponad połowy przypadków niepłodności na świecie, a wiele badań odnotowuje znaczący spadek parametrów plemników w ostatnich dekadach⁵. Najnowsze globalne analizy potwierdzają również powszechne spadki jakości plemników w wielu regionach⁶. Chociaż czynniki takie jak palenie, alkohol, promieniowanie i narażenie na chemikalia są uznane za ryzykowne⁷, PM2.5 pojawił się jako dodatkowy toksyn rozrodczy wymierzony w jądra⁸.

Jądra są bardzo wrażliwe na toksyny środowiskowe ze względu na swoją unikalną strukturę fizjologiczną i ciągłą aktywność plemników. Wcześniejsze badania wskazały, że ekspozycja na PM2.5 może powodować uszkodzenia jąder przez wiele szlaków, takich jak stres oksydacyjny, reakcje zapalne oraz zaburzenie bariery krwio-jądra⁹. Te ostre skutki charakteryzują się obniżoną jakością plemników, nieprawidłową histologią jąder oraz zaburzeniami hormonalnymi¹⁰. Jednak większość badań koncentruje się na natychmiastowych urazach, pozostawiając długoterminowe lub opóźnione skutki słabo scharakteryzowane.

Obecne modele ekspozycji na PM2.5 mają wrodzone ograniczenia: wdech całego ciała naśladuje naturalną ekspozycję, ale wymaga specjalistycznego sprzętu i nie ma precyzji dawki¹¹, podczas gdy instylacja śródtchawicowa zapewnia kontrolę dawki, ale jest inwazyjna i nie odtwarza fizjologicznego osadzania cząstek¹². Nasz model czasowo-rozdzielony wewnątrznosowy unika tych wad – jego nieinwazyjne podanie jest zgodne z wzorcami odkładania górnych oddechów, umożliwia precyzyjną kontrolę dawki i wspiera długoterminowe wielopunktowe próbkowanie w celu uchwycenia opóźnionego urazu, który przewyższa możliwości tradycyjnych modeli ostrych¹³.

Nasza dawka PM2.5 5 mg/kg/dzień pokrywa się z paradygmatami subostrej ekspozycji gryzoni, które udowodniono wywoływanie reakcji reprodukcyjnych, a poprzez konwersję powierzchni ciała przybliża ludzką równowartość dawki ~6 razy wyższą niż standardowe poziomy otoczenia w przyspieszaniu długotrwałych objawów toksyczności¹⁴. Uwzględnione są gatunki: choć szczury mają zachowaną fizjologię jąder z ludźmi, ich krótszy cykl plemnikowy może przyspieszyć postęp urazu obserwowany w naszych punktach^{czasowych 15}, a podawanie przez nos różni się od ludzkiego odkładania dolnych dróg oddechowych, choć potwierdzono ogólnoustrojowe rozprzestrzenianie toksyn do jąder.

Opóźnione skutki narażenia na toksyny środowiskowe są kluczowe dla oceny długoterminowych ryzyk rozrodczych, ponieważ mogą ujawnić nieodwracalne szkody, które nie są widoczne w krótkoterminowych obserwacjach¹⁶. Na przykład niektóre toksyny mogą powodować utajone uszkodzenia jąder, które stopniowo się objawiają lub pogarszają z czasem, nawet po zakończeniu ekspozycji, potencjalnie prowadząc do przewlekłej dysfunkcji rozrodczej¹⁷. Biorąc pod uwagę powszechność i trwałość PM2.5, kluczowe jest ustalenie, czy jego toksyczność rozrodcza utrzymuje się lub pogarsza po ekspozycji^.

Utrzymujące się zapalenie, stres oksydacyjny i zaburzenia mechanizmów naprawy są prawdopodobnymi czynnikami opóźnienia efektów. Wzrost wyrównania IL-1β, IL-6 i TNF-α wywołany przez PM2.5 może utrzymywać przewlekłe zapalenie, zakłócać spermatogenezę i wspierać apoptozę komórek rozrodczych¹⁹. Uszkodzenie białek styków kluczowych, takich jak Connexin-43 i Occludin, osłabia barierę krwio-jądra i może uniemożliwić funkcjonalną regenerację²⁰. Aktywacja szlaku kinazy N-końcowej c-Jun (JNK), mediatora stresu i sygnalizacji apoptotycznej, również została powiązana²¹.

Pomimo rosnącej świadomości toksyczności rozrodczej PM2.5, istnieje znacząca luka w wiedzy dotyczącej dynamiki czasowej uszkodzenia jąder po zakończeniu ekspozycji. Konkretnie, nadal nie jest jasne, jak długo utrzymują się urazy jąder, czy nasilają się z czasem oraz jakie molekularne szlaki napędzają te opóźnione efekty²². Odpowiadanie na te pytania jest kluczowe dla opracowania ukierunkowanych strategii profilaktycznych i terapeutycznych, które łagodzą szkody reprodukcyjne wywołane przez PM2.5.

Pozostają istotne luki dotyczące czasu trwania, postępu oraz mechanizmów urazu jąder wywołanego PM2.5 po zakończeniu ekspozycji. Niniejsze badanie rozwiązuje te luki, oceniając punkty końcowe związane z rozrodem; histopatologię; profile hormonalne – w szczególności hormon folikulostymulujący (FSH), hormon luteinizujący (LH) oraz estradiol (E2); stan zapalny; apoptoza; oraz ekspresję białek barierowych w wielu punktach po ekspozycji. Wyniki te dostarczają wglądu w długoterminowe ryzyko rozrodcze PM2.5 i wspierają strategie zdrowia publicznego mające na celu ochronę płodności mężczyzn.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były przeprowadzane zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Kolegium Zdrowia Fujian (Wniosek o zatwierdzenie projektu: DW2024-01).

Bezpieczeństwo i odpady niebezpieczne
Toksyczne odczynniki, w tym formalina, czterotlenek osmu i chloroform, były obsługiwane w certyfikowanym okapie wyparowym, przy użyciu odpowiednich środków ochrony osobistej. Halogenowane odpady organiczne oraz roztwory zawierające osm były zbierane w wyznaczonych pojemnikach i utylizowane zgodnie z wymaganiami instytucjonalnymi. Pentobarbital sodowy był rejestrowany jako substancja kontrolowana, a ostre przedmioty były bezpiecznie obchodzone przez cały okres badania.

Materiał i obsługa PM2.5
Do dawkowania użyto standardowego materiału referencyjnego PM2.5. Zgodnie z ustalonymi procedurami przygotowania cząstek suchy, suchy proszek był zawieszany w sterylnym PBS w wymaganym stężeniu i sonikowany w kąpieli wodnej przez 10-15 minut tuż przed użyciem, bez powierzchniowo czynnego. Codziennie przygotowywano zawieszenia sprawne, na nowo. Poziomy endotoksyny oceniano za pomocą testu lizatu amebocytów limulus i były niewykrywalne. W razie potrzeby uwzględniano kontrolę polimyksyny B, aby wykluczyć efekty wywołane LPS.

Budowa modeli zwierzęcych in vivo
Siedemdziesiąt dwa samce szczurów Sprague-Dawley z SPF (2 miesiące, 190 ± 10 g) zostały umieszczone w warunkach standardowych i losowo podzielone na dziewięć grup (n = 8 na grupę), składających się z grupy kontrolnej, grup pojazdowych pobranych w wieku 24 godzin, 1, 2 i 4 miesięcy oraz grup wystawionych na PM2,5 w tych samych momentach. PM2.5 podawano donosowo w dawce 5 mg∙^kg-1∙^day-1 w dawce 10-20 μL na naris pod lekką znieczuleniem izofluranowym raz dziennie przez 7 dni. Po podaniu szczury były umieszczane na plecach przez 1-2 minuty, aby ułatwić wdychanie. Zwierzęta były utrzymywane do eutanazji w wyznaczonych punktach po ekspozycji, a masa ciała była rejestrowana do obliczeń współczynnika narządów. Punkty końcowe obejmowały współczynniki narządów, jakość plemników, histologię i ultrastrukturę, hormony rozrodcze w surowicy oraz testy molekularne.

Morfologia narządów rozrodczych i ocena jakości plemników
Jądra i najądrza były przecinane pod głęboką znieczuleniem pentobarbitalowym, wyciskane i ważone w celu obliczenia współczynników narządów. Plemniki pobrano z najądrza ogona przez mielenie w wcześniej podgrzanym buforze w temperaturze 37 °C. Stężenie określono za pomocą hemocytometru. Ruchliwość oceniano poprzez badanie co najmniej 200 plemników na pięciu lub więcej niepokrywających się polach na wcześniej podgrzanych preparatach. Morfologię oceniono po utrwaleniu, rozmazaniu i barwieniu eozyn-nigrosyną lub Diff-Quik, przy czym na szczura przypadło co najmniej 200 plemników. Wszystkie oceny były zaślepiane, a techniczne repliki uśredniono, aby uzyskać jedną wartość na każde zwierzę.

Histologiczna i ultrastrukturalna analiza tkanki jądrowej
Jądra były utrwalane w 10% neutralnie buforowanej formalinie, przetwarzane przez stopień etanolu i ksylenu, osadzone w parafinie oraz przecięte w 5 μm do barwienia HE. Przekroje barwione oceniano za pomocą systematycznego losowego pobierania próbek, z wyłączeniami dla cięć skośnych, artefaktów lub słabego fiksowania. Średnice rurek obliczano na podstawie osi ortogonalnych, a grubość nabłonka mierzono w równomiernie rozmieszczonych punktach. Analizy zostały zaślepione, a na szczura oceniono co najmniej 10 kanalików.

W przypadku TEM małe bloki tkanek były utrwalane w glutaraldehydzie, post-fiksowane w czterotlenku osmu, odwodniane, infiltrowane żywicą i polimeryzowane. Ultracienkie przekroje były barwione octanem uranilowym i cytrynianem ołowiu oraz obrazowane przy napięciu 60-120 kV przy stałych ustawieniach. QC obejmowało ocenę integralności błon i mitochondriów oraz unikanie artefaktów ekstrakcyjnych.

Test immunosorbentny związany z enzymami (ELISA)
Krew pobierano z aorty brzusznej pod znieczuleniem, w ustalonym oknie porannym, aby kontrolować zmienność okołodobową. Po zakrzepnięciu i wirowaniu surowica została alicytatowana i przechowywana w temperaturze −80 °C. Testosteron, FSH, LH i E2 zostały ilościowo zidentyfikowane za pomocą zwalidowanej platformy immunoaseje. Próbki były uruchamiane w duplikatach z odpowiednimi kontrolami, a precyzja testu była zgodna ze specyfikacją platformy. Próbki hemolizowane lub lipemiczne zostały wykluczone.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)
Całkowite RNA zostało wyekstrahowane z tkanki jąder za pomocą fenol-chloroformu i oczyszczone poprzez wytrącanie izopropanolu oraz płukanie etanolem. Jakość RNA została zweryfikowana spektrofotometrycznie. zsyntetyzowano cDNA, a RT-qPCR wykonano z chemią barwnikową w standardowych warunkach cyklicznych, po czym przeprowadzono analizę krzywej stopienia. Poziomy ekspresji zostały znormalizowane do GAPDH metodą 2^−ΔΔCq .

Analiza zachodniej plamy
Lizaty białkowe przygotowywano w buforze RIPA z inhibitorami proteazy, ilościowo określano za pomocą testu BCA i denaturowano w buforze obciążającym. Transfer SDS-PAGE i PVDF przeprowadzono w warunkach kontrolowanych. Błony były blokowane, inkubowane pierwotnymi przeciwciałami przeciwciałami do Connexin-43, Okludyny, JNK i GAPDH, a następnie nałożone na przeciwciała wtórne sprzężone z HRP. Pasma wykrywano za pomocą chemiluminescencji, a densytometria obejmowała odejmowanie tła, normalizację do GAPDH oraz skalowanie do grupy kontrolnej.

Analiza statystyczna
Dane zostały zgłoszone jako średnie ± SD. Zastosowano jednokierunkową ANOVA z testem post hoc Tukeya lub testem t-Studenta, gdzie to było stosowne, a dane nieparametryczne analizowano testem Mann-Whitney U . Wartość p < 0,05 uznano za istotną.

Ukończenie i oczyszczenie
Wszystkie niebezpieczne odpady chemiczne zostały zarejestrowane i odpowiednio utylizowane. Surowe dane, w tym wyjścia instrumentów i pliki analityczne, były archiwizowane wraz z odpowiednimi notatkami, aby zapewnić możliwość śledzenia.

Wyniki

Utrzymujące się pogorszenie funkcji rozrodczych u samców u szczurów, charakteryzujące się obniżoną jakością plemników i upośledzonym rozwojem narządów rozrodczych spowodowanym ekspozycją na PM2.5

Aby zbadać wpływ PM2.5 na funkcje rozrodcze u mężczyzn, jakość plemników, współczynniki narządów rozrodczych oraz powiązane wskaźniki, przeanalizowano u dziewięciu grup samców szczurów. Analizy przeprowadzono względem 24-godzinnego punktu po ekspozycji. Chociaż nie uwzględniono punktu...

Dyskusja

Krótkotrwała ekspozycja na PM2.5 została poprzedzona postępującym, po-ekspozycjowym pogorszeniem funkcji rozrodczych mężczyzn w ciągu 1-4 miesięcy. Wyniki te potwierdzają zależność od czasu toksyczność reprodukcyjną, która utrzymuje się po zakończeniu dawkowania, oraz przedłużają wcześniejsze obserwacje zaburzeń rozrodczych związanych z PM2.5²³.

Aby zwiększyć powtarzalność, ustandaryzowaliśmy cztery elementy. Po pierwsze, regularność ekspozycji utrzymywano poprzez norma...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1% czterotlenku osmu	TCI, Chiny	O0308	Do analizy po fiksacji w TEM tkanki jądrowej
10% neutralna formalina buforowana	Solarbio, Chiny	PC0020	Do utrwalania próbek tkanki jąder w barwieniu HE
2,5% glutaraldehydu	Solarbio, Chiny	G1102	Do utrwalania próbek tkanki jąder w analizie TEM
75% etanolu	Acros Organics, USA	61509-0040	Do oczyszczania wytrąconego RNA w RT - qPCR
Automatyczny obrazownik chemiluminescencji	Bio-Rad, USA	ChemiDoc	Wykorzystywany do automatycznego obrazowania sygnałów chemiluminescencyjnych w western blottingu.
Zestaw do testowania białka BCA	Solarbio, Chiny	PC0020	Do określenia całkowitego stężenia białka w analizie Western blot
Bufor blokujący	Nieokreślona	T7131A	Stosowane w analizie Western blot do eliminacji wiązań niespecyficznych
Chloroform	Acros Organics, USA	327270010	Stosowane w separacji RNA podczas RT - qPCR
Connexin - 43	Abcam, USA	AB11370	Wykrywa ekspresję i rozmieszczenie kluczowego białka barierowego krwi – jąder, aby pomóc ocenić integralność bariery
Zestaw ECL	Biosharp, Chiny	BL520B	Do wizualizacji pasm białek w analizie zachodnich blotek
Zestawy ELISA (na testosteron, FSH, LH, E2)	Abcam, Wielka Brytania	ab108666; ab108702; ab108651; ab108667	Do wykrywania hormonów rozrodczych w surowicy
Eosin	Solarbio, Chiny	G1002	Stosowany w barwieniu tkanki jąder HE
Żywica epoksydowa	Solarbio, Chiny	GP2001	Do osadzania próbek tkanki jąder w analizie TEM
GAPDH	Abcam, USA	ab128915	Ocenia apoptozę komórek jąder wywołaną przez PM2.5 i dostarcza morfologicznej podstawy do badania jej wpływu na apoptozę komórek jąder
Hematoksylyna	Solarbio, Chiny	G1077	Stosowany w barwieniu tkanki jąder HE
System obrazowania	Nikon, Japonia	Nikon DS-U3	Wykorzystywane do obrazowania próbek pod mikroskopem.
Izopropanol	Acros Organics, USA	AC447080025	Stosowane w wytrącaniu RNA podczas RT - qPCR
JNK	Abcam, USA	ab124956	Analizuje molekularny mechanizm uszkodzenia jąder spowodowanego przez PM2.5 oraz identyfikuje typy komórek, w których jest aktywowany
Czytnik mikropłyt	URZĄDZENIA MOLEKULARNE, USA	SpectraMax iD3	Wykorzystywane do wykrywania sygnałów na mikropłytkach (np. absorpcja, fluorescencja).
Oklumenyna	Abcam, USA	ab31721	Rozumie stopień uszkodzenia krwi i bariery jąder oraz bada interakcje między odpowiednimi białkami
Mikroskop optyczny	Chongqing Opto – Instrument elektroniczny, Chiny	BDS200	Wykorzystywany do ogólnej obserwacji mikroskopowej optycznej.
Mikrotom patologiczny	Shanghai Kaiyu Instrument, Chiny	RM2016	Używany do cięcia fragmentów tkanek patologicznych.
Pentobarbital sodowy	Solarbio, Chiny	G1102	Stosowany do zastrzyków dootrzewnowych u szczurów przed pobraniem krwi
Standardowe materiały referencyjne PM2.5	Narodowy Instytut Metrologii, Chiny	GBW13643	Dla ekspozycji na PM2.5 w grupie eksperymentalnej
Membrana poliwinylidendifluorku (PVDF)	Thermo Fisher, USA	88585	Stosowane w analizie Western blot do transferu białek
Zestaw odczynników PrimeScript RT	TAKARA, Japonia	RR037Q	Do syntezy cDNA w RT - qPCR
System PCR w czasie rzeczywistym	Roche, Szwajcaria	LightCycler 480	Wykorzystywany do reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym do analizy ekspresji genów.
Bufor lizy RIPA	TAKARA, Japonia	RR9161	Do ekstrakcji białek w analizie Western blot
Shaker	Thermo, USA	MAXQ-4000	Używany do wstrząsania próbek w eksperymentach.
SPSS	IBM, USA	28	Do analizy danych
Sól fizjologiczna sterylna	Solarbio, Chiny	S8160	Stosowane w grupowym traktowaniu pojazdów
Zestaw TB Green Premix Ex Taq II	TAKARA, Japonia	RR820S	Stosowane w RT - qPCR
Transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)	Hitachi, Japonia	HT7800/HT7700	Wykorzystywany do ultrastrukturalnej obserwacji na skali nano.
Odczynnik Trizol	Ambion, Chiny	15596018	Do ekstrakcji całkowitego RNA w RT - qPCR
Ultramikrotom	Leica, Niemcy	Leica UC7	Używany do cięcia ultracienkich sekcji do TEM.
Uniwersalny System Transferu Białek / Maszyna Do Filtrowania Transferu Białek	Bio-Rad, USA	Trans-Blot Turbo	Wykorzystywany do transferu białka w western blottingu.
Pionowy mikroskop optyczny	Nikon, Japonia	Nikon Eclipse E100	Wykorzystywany do pionowej obserwacji optycznej mikroskopowej.
Octan uranilu	Merck, Niemcy	201030	Do barwienia ultracienkich przekrojów w analizie TEM tkanki jąder