Artykuł metodologiczny

Procedury identyfikacji inhibitorów wejścia SARS-CoV-2 jako potencjalnych leków przeciwwirusowych przy użyciu pseudowirusów opartych na MLV

DOI:

10.3791/69628

⸱

27 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centro de Biología Celular y Molecular de enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT AIP), 2Maestría en Ciencias Biomédicas, Universidad de Panama, 3Sistema Nacional de Investigación (SNI), SENACYT

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł opisuje metodologię generowania cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 przy użyciu systemu raportującego lucyferazę oraz jej zastosowanie do identyfikacji inhibitorów wejścia. Protokoły te zostały zademonstrowane przy użyciu dwóch różnych inhibitorów wejścia: rekombinowanego ludzkiego białka fuzyjnego ACE2-Fc oraz małopąsteczkowego związku arbidolu.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirus SARS-CoV-2 to nowy, zoonotyczny patogen, który od momentu pojawienia się w 2019 roku spowodował ogromne obciążenie chorobami i śmiertelnością na całym świecie. Bezpieczne i dostępne platformy do oceny przeniknięcia wirusa i potencjalnych związków przeciwwirusowych pozostają niezbędne do dalszego odkrywania leków przeciwko nowym wariantom. Artykuł ten opisuje wysoce zoptymalizowany protokół generowania pseudotypowanych cząstek opartych na wirusie białaczki mysiej (MLV), które ekspresują białko kolca SARS-CoV-2 i przenoszą gen reportera lucyferazy, umożliwiając badanie wejścia wirusa w warunkach poziomu 2 bezpieczeństwa biologicznego. Opisane metody opisują wykorzystanie zoptymalizowanych linii komórkowych, wysoką efektywność transfekcji przy użyciu opłacalnych odczynników, produkcję wysoce skutecznych pseudowirusów oraz miareczkowanie zakaźności w celu określenia minimalnego wkładu wirusa do testów przesiewowych. Reprezentatywne wyniki wykazują silną aktywność lucyferazy w komórkach zakażonych w porównaniu z kontrolą niezakażoną, podczas gdy kontrolne pseudowirusy bez kolców i VSV-G potwierdzają specyficzność testu. Ponadto system wspiera badania związków przesiewowych poprzez ilościowe określenie efektów hamujących na wejście wirusa oraz ocenę cytotoksyczności za pomocą testu żywotności MTT. Ogólnie rzecz biorąc, ten powtarzalny i skalowalny protokół stanowi niezawodną platformę do średnioprzepustowych i wysokoprzepustowych badań nowych inhibitorów wejścia wirusa, przyczyniając się do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe oraz postępu badań nad mechanizmami wejścia SARS-CoV-2.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pojawienie się ciężkiego ostrego zespołu oddechowego koronawirusa 2 (SARS-CoV-2) pod koniec 2019 roku doprowadziło do globalnej pandemii, która spowodowała miliony zgonów na całym świecie i nadal stanowi zagrożenie poprzez nowe warianty o zwiększonej zakaźności i potencjale ucieczki immunologicznej1. Jako wirus RNA z rodziny Coronaviridae, SARS-CoV-2 wykorzystuje glikoproteinę trimerycznego kolca (S) do pośredniczenia w wejściu komórki gospodarza poprzez wiązanie się z receptorem enzymu 2 (ACE2) konwertującego angiotensynę i aktywację proteolityczną przez TMPRSS2 oraz inne proteazygospodarza 2,3. Chociaż opracowano kilka opcji leczenia w celu łagodzenia objawów COVID-19, ciągły rozwój i szybki rozwój wariantów wirusowych podkreślają pilną potrzebę bezpiecznych i skalowalnych systemów do badania przenikania wirusa oraz oceny nowych związków przeciwwirusowych wymierzonych w ten wczesny etap zakażenia4.

Wirus SARS-CoV-2 pozostaje klasyfikowany jako środek bezpieczeństwa biologicznego poziomu5 w niektórych regionach ze względu na wysoki potencjał transmisji. Dlatego każde laboratorium replikacyjne wymaga posiadania obiektu o wysokiej izolacji BSL-3, co utrudnia większości laboratoriów w terenie prowadzenie badań naukowych z tym wirusem. Systemy oparte na pseudotypach wirusów, znane również jako pseudowirusy (PV), stanowią praktyczną alternatywę umożliwiającą badania wejścia wirusa w laboratoriach poziomu biosafety 2 (BSL-2), poszerzając dostępność dla globalnych badańnaukowych 6. Pseudotypowane cząstki zawierające białko kolczaste SARS-CoV-2 nie replikują się, co czyni je bezpiecznym zastępcą do oceny wejścia wirusa i przesiewu pod kątem inhibitorów małych cząsteczek7. Cząstki te mogą być zaprojektowane tak, aby przenosiły gen reportera lucyferazy lub fluorescencyjnego, umożliwiając szybkie i ilościowe wykrywanie infekcji poprzez pomiar sygnału reportera w zakażonych komórkach. Systemy oparte na wirusie białaczki mysiej (MLV) lub szkieletach lentiwirusa były szeroko wykorzystywane do badania wejścia SARS-CoV, MERS-CoV, SARS-CoV-2, wirusa Ebola, między innymi 8,9,10,11.

W tych protokołach opisujemy generowanie PV opartych na MLV przy użyciu systemu trójplazmidowego, na podstawie badań przedstawionych przez Milleta i Whittakera8. Plazmidy używane obejmują plazmid opakujący geny rdzeniowe MLV gag-pol (pCMV-MLVgagpol), wektor transferowy kodujący gen reporterowy lucyferazę (pTG-Luc) oraz plazmid ekspresujący glikoproteinę kolczastego SARS-CoV-2 odpowiadającą oryginalnemu wariantowi Wuhan-Hu-1. Dodatkowo pseudowirusy są również generowane przy użyciu G-glikoproteiny wirusa wirusa szparki szparkowej (VSV-G), które później służą do przesiewania potencjalnych trafień. Pseudowirusy powstają w komórkach pochodzących z HEK293 i służą do infekowania bardzo podatnych komórek stabilnie wyrażających hACE2 i TMPRSS2. Wydajność transfekcji jest najpierw oceniana za pomocą plazmidu ekspresującego zielone fluorescencyjne białko (GFP). Następnie, stosując zoptymalizowane warunki transfekcji, PV generuje się przez współtransfekcję tych trzech plazmidów, a następnie miareczkowanie powstałych wirusów. Przy odpowiedniej ilości PV przeprowadza się test na płytkach z 96 dołkami w celu przesiewania związków zdolnych do powstrzymania przedostania się wirusów. Protokół ten wykorzystuje rozgałęzioną polietyliminę (PEI) jako opłacalny odczynnik transfekcyjny, co ułatwia wdrażanie procedur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wysokowydajna transfekcja komórek pochodzących z HEK293T przy użyciu rozgałęzionej polietyeiminy (PEI)

UWAGA: Wszystkie etapy w szafie bezpieczeństwa biologicznego wykonuj zgodnie ze standardową techniką aseptyczną oraz procedurami BSL-2. Do transfekcji i generowania wirusów z HEK293T wykorzystuj komórki pochodzące od . W tej metodzie komórki są transfekowane w 6-dołkowych płytkach poddanych hodowli komórkowym. Rozwiązanie zapasowe PEI jest przygotowywane zgodnie z wcześniejszym opisem Yanga i współpracowników (2017)12. Przed przeprowadzeniem potrójnej transfekcji w celu wygenerowania pseudowirusa zaleca się optymalizację najlepszego odsetku plazmidowego DNA PEI, aby zapewnić wysoką skuteczność transfekcji (ponad 70-80%). Optymalizacja ta powinna być przeprowadzona poprzez transfekcję plazmidu ekspresującego zielone fluorescencyjne białko (GFP), a następnie sprawdzenie proporcji komórek fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Do tej optymalizacji utrzymuj stałą zawartość plazmidowego DNA na poziomie 2,5 μg na dołek i testuj kilka ilości PEI w zakresie od 1 do 20 μL. Oto najlepsze warunki dla tych partii komórek i PEI, składających się z 5 μL roztworu PEI (1 mg/mL) oraz 2,5 μg plazmidu ekspresującego GFP na dołek w płytkach 6-dołkowa.

  1. Nasiono 7,5 x 10 5 komórek pochodzącychz HEK293 na dołek w 6-dołkowej płycie hodowli tkankowej, w całkowitej objętości 2 mL na dołek kompletnego medium (DMEM-C: Zmodyfikowane Medium Eagle's Dulbecco, uzupełnione 10% termicznie inaktywowanym surowicom płodu bydła (FBS), 20 mM 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazineethansulfonowym kwasem (HEPES), 100 IU/mL penicyliny, oraz 100 μg/mL streptomycyny) 24 godziny przed transfekcją.
    UWAGA: Podczas zasiewania komórek unikaj poruszania płytki tkankowej w ruchach kołowych, ponieważ może to powodować agregację komórek w centrum dołków, co prowadzi do nieregularnego rozmieszczenia komórek i w konsekwencji niższej efektywności transfekcji. Jedna płytka z 6 dołkami wystarcza na jeden eksperyment, w tym jeden dołek jako kontrolny organ komórkowy (nietransfekowany), a resztę płytki do testowania kilku proporcji DNA plazmidowego PEI.
  2. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez całą noc. Następnego dnia upewnij się, że komórki są w około 50-60% zbieżne.
  3. W dniu transfekcji przygotuj kompleksy DNA PEI-plazmidów w sterylnych probówkach mikrowirówek o pojemności 1,5 mL.
    1. Dla każdego dołku przygotuj probówkę z roztworem PEI zawierającą 5 μL zapasu PEI (1 mg/mL) w 50 μL zredukowanego medium surowicowego oraz jedną probówkę z roztworem DNA zawierającą 2,5 μg plazmidu ekspresującego GFP, w 50 μL tego samego medium.
    2. Jeśli ma być przetworzonych kilka studni, roztwory mogą być odpowiednio skalowane. Krótko wymieszaj każdą probówkę przez wir i obracaj przez 5 sekund. Inkubuj rurki w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut.
  4. W trakcie tej inkubacji ostrożnie usuwaj ośrodek z każdego dołku płyty 6-dołkowej, unikając zakłóceń monowarstwy komórki. Ostrożnie zamień ją na 1 mL/well pełnego pożywka transfekcyjnego (DMEM-T, to samo co DMEM-C, ale bez antybiotyków).
  5. Przygotuj kompleks transfekcji. Po 10-minutowej inkubacji dodaj 50 μl probówki z roztworem DNA do probówki z roztworem PEI. Szybko mieszaj, pipetując sześć razy w górę i w dół, a następnie inkubuj w RT dokładnie przez 3 minuty. Natychmiast przystąpimy do dodawania kompleksu kroplami do komórek w każdej odpowiadającej sobie.
  6. Uszczelnij krawędzie płyty parafilmem i wiruj w 1000 x g przez 30 minut w RT, bez hamulca, używając wirnika obrotowego i łydła płytowego.
  7. Po wirowaniu delikatnie usuń parafilm i inkubuj płytę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ przez 3 godziny.
  8. Po inkubacji delikatnie usuń medium transfekcyjne z każdego dołku i powoli zamień go 2 mL wcześniej podgrzanego DMEM-C na odwór.
  9. Inkubować komórki transfekowane w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 48 godzin.
  10. Ocena efektywności transfekcji na podstawie ekspresji GFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Częstotliwość fluorescencyjnych ogniw powinna przekraczać 70-80% (Rysunek 1). Jest to kluczowe dla efektywności kolejnej metody w sekcji 2.

2. Generowanie pseudowirusowych cząstek o typach spike- i VSV-G o typach pseudowirusowych o typach przeciw SARS-CoV-2

UWAGA: Ta metoda wykorzystuje tę samą procedurę co sekcja 1, z tą różnicą, że zamiast plazmidu GFP, komórki będą współtransfekowane z trzema plazmidami potrzebnymi do generowania wirusów o pseudotypie, przy użyciu optymalnych warunków transfekcji, aby zapewnić wysoką efektywność transfekcji. Protokół wykorzystuje również komórki pochodzące z HEK293T w płytkach 6-dołkowe, co wystarcza do spełnienia następujących trzech wymaganych warunków: a) komórki nietransfekowane (jedna jamka), b) komórki transfekowane wyłącznie plazmidem opakującym MLV i wektorem transferowym raportu lucyferazy (jedna jamka; pseudowirusy bez kolców) oraz c) komórki transfekowane tymi dwoma plazmidami i plazmidem ekspresyjnym kolczastym w celu generowania wirusów pseudotypowanych SARS-CoV-2 (cztery dołki). Plazmid ekspresujący impulsy użyty tutaj koduje skok szczepu z Wuhan z grupy SARS-CoV-2 i zawiera modyfikacje sekwencji umożliwiające efektywną prezentację białka w PV. Pseudowirus bez kolców będzie potrzebny jako kontrolny później podczas infekcji, aby potwierdzić zależne od kolców wejście do komórek dopuszczających. Podobnie, VSV-G-PV są generowane według tego samego eksperymentalnego projektu, aby później służyć jako kontrprzesiewowy potencjalnych związków hamujących. Jeśli potrzebna jest większa objętość pseudowirusa, protokół może być skalowany do dwóch płytek 6-dołkownych, co może być również praktyczne dla etapu wirowania płytowego.

  1. Dzień przed transfekcją komórki pochodzące z nasion HEK293T w dwie płytki z 6 dołkami, jak opisano w sekcji 1. Jedną płytkę używaj do generowania kolczastych PV, a drugiej do VSV-G-PV.
  2. W dniu transfekcji przygotuj mieszanki transfekcyjne zgodnie z Tabelą 1, zgodnie z krokiem 1.3.
    UWAGA: Roztwór PEI jest przygotowywany zgodnie z wcześniejszymi raportami12. Plazmidy pCMV-MLVgagpol i pTG-Luc uzyskano od Milleta i Whittakera8. Plazmid pVSV-G został uzyskany na podstawie Gee i in. 2020,13. Wszystkie plazmidy powinny być przygotowane wcześniej jako wysokiej jakości preparaty, wolne od endotoksyn. Zaleca się stosowanie komercyjnie dostępnych zestawów maxiprep, z ostatnim etapem sterylnej filtracji przez niskowiążący filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 μm.
  3. Wymieszaj każdą probówkę zgodnie z rozpoczęciem 1 i inkubuj w RT przez 10 minut.
  4. Podczas tej inkubacji ostrożnie usuwaj pożywkę z każdej dołki z płytek 6-dołkow, unikając zakłóceń monowarstwy komórkowej. Powoli wymieniaj 1 ml wcześniej podgrzanego medium DMEM-T do każdego otworu, upewniając się, że podłoże spływa wzdłuż ściany otworu, a nie bezpośrednio na ogniwa.
  5. Przygotuj kompleksy transfekcyjne opisane w sekcji 1 i transfekcyjne komórki według wcześniej opisanego protokołu.
  6. Po 48-godzinnej inkubacji po transfekcji pobierz supernatanty, przelej je do 50 mL sterylnych rurek stożkowych i wiruj w 290 x g przez 7 minut w temperaturze 4 °C. Pobierz bezkomórkowy supernatant i przefiltruj go za pomocą sterylnego filtra z butelki o pojemności 0,45 μm. Przygotuj aliquoty o pojemności 1 mL i przechowuj je w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Pseudotypowane cząstki są stabilne w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy. Unikaj powtarzających się cykli zamarzania i rozmrażania, aby zachować zakaźność.
Dla SARS-CoV-2 z wybuchami PV (na odwiert)Dla VSV-G-PV (na odwiert)Dla punktów wolnych bez skoków (na odwiert)
Rozwiązanie PEI:
PEI (1 mg/ml)15 μL5 μL5 μL
Zmniejszona ilość surowicy45 μL45 μL45 μL
Roztwór DNA plazmidowego:2
pCMV-MLVgagpol0,79 μg0,79 μg0,79 μg
pTG-luc0,92 μg0,92 μg0,92 μg
pUNO1-spike0,79 μg--
pVSV-G-0,79 μg-
Zmniejszona ilość surowicydo 50 μLdo 50 μLDo 50 μL

Tabela 1: Przygotowanie mieszanek transfekcyjnych do generowania PV.

3. Titracja cząstek pseudotypowanych przez SARS-CoV-2 i VSV-G

UWAGA: Ten krok jest niezbędny, aby potwierdzić, że produkowane cząstki pseudotypowane są zakaźne oraz określić minimalną efektywną objętość wymaganą do dalszych zastosowań, takich jak badania związkowe. Dawkowanie powinno być wykonywane przy każdej nowej partii pseudowirusa. W tym celu komórki wysoce podatne na zakażenie SARS-CoV-2 (komórki HSI) są infekowane coraz mniejszą ilością wirusów o pseudotypie. Wejście pseudowirusów, pośredniczone przez interakcję ACE2 z człowiekiem lub VSV-G z innymi receptorami komórkowymi, jest monitorowane 72 godziny później poprzez wykrycie aktywności lucyferazy w teście luminescencji.

  1. Dzień przed transdukcją należy zasiać 2,5 x 10 4komórek HSI na dołek w 96-dołkowej płycie do hodowli tkankowej, w 50 μL kompletnego nośnika (DMEM-C). Przygotuj trzy dołki na każdą ilość pseudowirusa do testowania, a także dołki na infekcję, także z pseudowirusami bez kolców oraz dla komórek niezakażonych. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez noc.
  2. W dniu transdukcji rozmroz jedną aliquotę z każdej partii pseudowirusa, aby przetestować ją na lodzie i delikatnie wymieszać przez inwersję. Uwzględnij także jeden aliquot kontroli bez kolców. Do każdego dołka dodano bezpośrednio kilka ilości preparatu pseudowirusa (100, 50, 25, 12,5, 6,2, 3,1, 1,5 i 0,8 μL). Dostosuj objętość wszystkich studni do 150 μL za pomocą DMEM-C.
  3. Uszczelnij płytę parafilmem i wiruj w wirówce przy 2500 × g przez 45 minut w trybie RT, bez hamulca.
  4. Usuń uszczelnienie parafilmowe i inkubuj płytkę przez 72 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO₂.
  5. Po inkubacji przygotuj się do testu lucyferazowego zgodnie z instrukcjami producenta. Rozmrażaj podłoże lucyferazowe (przechowywane w -80 °C) oraz 5x bufor lizy z testu lucyferazowego (przechowywane w -20 °C) i wyrównuj w RT (10-15 min).
  6. Rozcieńcz bufor lizy testu lucyferazowego do 1x sterylnej wody. Przygotuj co najmniej 3 mL.
  7. Powoli i ostrożnie zasysaj i odrzucaj supernatant każdej dołki za pomocą pipety wielokanałowej.
  8. Dodaj 30 μL bufora lizyzowego 1x do każdej studni za pomocą pipety wielokanałowej. Umieść płytkę w potrząsaczce na 10 minut przy 150 obr./min, przy RT. Weryfikuj pełną lizę pod mikroskopem odwróconym (wszystkie komórki powinny być zlikwidowane i nie być rozpoznawalne wzrokowo).
    UWAGA: Przygotuj wcześniej czytnik mikropłyt, aby natychmiast po dodaniu podłoża wykrywać luminescencję, aby zapewnić spójność i uniknąć zaniku sygnału.
  9. Przelej lizaty na nieprzezroczystą, białą płytkę z 96 dołkami.
  10. Dodaj 50 μL podłoża lucyferazowego do każdego dołka i wymieszaj krótko, poruszając płytką w ruchu okrężnym. Umieść płytkę w luminometrze i zmierz luminescencję.
  11. Analizuj uzyskane dane.
    1. Sprawdź, czy sterowanie daje oczekiwane wartości luminescencji. Upewnij się, że komórki niezainfekowane dają bardzo niskie wartości luminescencji tła.
      UWAGA: Komórki zakażone pseudowirusem bez kolców powinny podawać wartości na poziomie komórek niezakażonych, a komórki zakażone malejącą ilością pseudowirusa prezentującego kolce powinny wykazywać wysokie, zależne od dawki wartości luminescencji (Rysunek 2). Wartości luminescencji generowane przez VSV-G-PV są zazwyczaj znacznie wyższe niż w spike-PV, około jednego lub dwóch rzędów wielkości.
    2. Przy kolejnych badaniach wybierz ilość pseudowirusa, która generuje sygnał co najmniej sto do tysiąckrotnie większy niż u komórek niezakażonych.

4. Przesiewowe badania związków pod kątem hamowania wejścia pseudowirusa za pomocą spike-PV

  1. Zasiać 2,5 x 10 4komórek HSI na odwiert w 50 μL kompletnego medium (DMEM-C) na płytce z 96 dołkami, jak opisano w sekcji 3. Inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂.
    1. Rozważmy projekt płyty, który zawiera kolumny od 1 do 11 dla związków plus pseudowirusa oraz kolumnę 12 dla kontroli. W kolumnie 12 przydziel cztery dołki do kontroli wirusów (tylko pseudowirus) oraz cztery dołki dla komórek niezakażonych, nieleczonych.
  2. Następnego dnia przygotuj serie rozcieńczeń (1:3) związków do testowania, zaczynając od 50 μM (końcowe stężenia podczas infekcji: 50, 16,6, 5,5, 1,8, 0,6, 0,2 i 0,06 μM), w DMEM-C zawierającym 0,5% DMSO.
    1. Dla wygody przygotować rozcieńczenia na osobnej 96-dołkowej "płycie rozcieńczeniowej", gdzie najpierw wykonuje się seryjne rozcieńczenia, a następnie przenosi się (50 μL) na płytkę zawierającą komórki.
    2. Jeśli liczba związków jest bardzo duża, rzędu setek lub więcej, zredukuj tę pierwszą serię rozcieńczeń do około 4 punktów, używając pojedynczej wnęki na punkt rozcieńczenia, i rozważ wstępne przesiewanie. Następnie ponownie testuj potencjalne trafienia za pomocą 7-punktowych rozcieńczeń szeregowych, 1:3, z trzema replikacjami, zaczynając od tego samego stężenia 50 μM.
  3. Gdy rozcieńczenia związków są gotowe, delikatnie aspiruj ośrodek komórek za pomocą pipety wielokanałowej i dodaj 50 μL rozcieńczeń związków do odpowiednich dołków. Inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO₂. Dla sterowania w kolumnie 12 dodaj tylko DMEM-C.
  4. Bez usuwania związków należy dodać do każdego dołka ustaloną ilość pseudotypowanego pseudowirusa SARS-CoV-2 w objętości 50 μL kompletnego nośnika, zawierającego związki w tych samych stężeniach. Uszczelnij płyty parafilmem.
  5. Wiruj płytę w 2500 × g przez 45 minut w RT bez hamulca, następnie usuń parafilm i inkubuj w 37 °C, 5%CO2 przez 72 godziny.
  6. Należy przejść do ilościowej zakaźności opartej na lucyferazie, jak opisano w sekcji 3.
  7. Przeprowadz analizę danych.
    1. Eksportuj wartości luminescencji do arkusza kalkulacyjnego, aby sformatować dane i następnie zaimportować do oprogramowania do analizy i wykresów danych.
    2. Przygotuj wykresy słupkowe przedstawiające średnią każdego punktu koncentracji, w tym błąd standardowy słupków średnich. Na wykresie można również nakreślić wartości uzyskane z pozytywnych (same PV) i ujemnych (komórek niezakażonych).
      UWAGA: Wyniki testu są uznawane za ważne, jeśli 1) komórki niezakażone wykazują bardzo niskie wartości, 2) kontrolne grupy PV wykazują wysokie wartości, 3) pozytywna kontrola hamowania (np. arbidol lub hACE2-Fc) wykazuje hamowanie infekcji w zależności od dawki (Rysunek 3A, B).
    3. Następnie obserwuj wartości wytwarzane przez nieznane związki, aby ocenić, czy występuje hamowanie i czy występuje efekt zależny od dawki. Jeśli tak, poddaj te związki dalszym analizom potwierdzającym.
      UWAGA: Aby potwierdzić potencjalne trafienia, postępuj zgodnie z kolejnymi krokami. Najpierw ponownie przetestuj potencjalne trafienia złożone, zgodnie z sugestią kroku 4.2. Jeśli efekt odpowiedzi dawkowej zostanie potwierdzony, wykonaj przesiew licznika, używając tej samej serii rozcieńczenia, ale zakażając VSV-G-PV. Test ten jest ważny, aby sprawdzić, czy hamowanie wejścia jest specyficzne dla interakcji spike-ACE2, a nie wynika z interferencji na innym etapie produkcji lucyferazy w zakażonych komórkach (Rysunek 3A, B). W tym przypadku pozytywny związek nie powinien wykazywać aktywności hamującej wobec VSV-G-PV. Jeśli tak jest, należy zbadać tę samą serię stężeń pod kątem cytotoksyczności za pomocą testu żywotności komórek (test MTT, pokazany w sekcji 5). Podsumowując, potencjalny trafiony związek powinien wykazywać hamowanie SARS-CoV-2-spike-PV, brak lub mniej hamowanie VSV-G-PV oraz brak lub przynajmniej znacznie słabsze hamowanie żywotności komórek. Dostosowanie krzywej dawka-odpowiedź na podstawie danych luminescencji pozwoli oszacować pół-maksymalne stężenie hamujące (IC50) dla hamowania PV oraz pół-maksymalne stężenie cytotoksyczne (CC50) na podstawie testu żywotności. Stosunek CC50 / IC50 służy do obliczania indeksu selektywności (SI), który jest ważnym wskaźnikiem potencjalnej użyteczności związku dodatniego. Do analizy krzywych dawka-odpowiedź oraz szacowania IC50 i CC50 opisano bardzo szczegółowe procedury14.

5. Test żywotności komórek oparty na MTT

  1. Zasiać 2,5 x 10 4komórek HSI na dołek w 50 μL DMEM-C w płytce z 96 dołkami. Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO₂. Upewnij się, że komórki następnego dnia mają około 50% konfluencji. Przygotuj wystarczającą liczbę dołków, uwzględniając różne stężenia związku do oceny, nieobtraktowane komórki oraz puste doły zawierające tylko podłoże, w trzech egzemplarzach. Testuj potencjalne związki trafione w tych samych stężeniach, co w testie hamowania wejścia PV.
  2. Po inkubacji ostrożnie usuń podłoże i zastąp je 100 μL kompletnego nośnika zawierającego różne stężenia związku, aby ocenić, w stężeniu 0,5% DMSO.
  3. Wiruj płytę w 2 500 × g przez 45 minut w RT bez hamulca i inkubuj przez 72 godziny w 37 °C, 5% CO₂. Ten krok jest uwzględniony, aby obsługiwać ogniwa dokładnie tak, jak w poprzedniej sekcji, z wyjątkiem dodania PV.
  4. Przygotuj roztwór MTT 0,5 mg/mL z użyciem DMEM. Sterylizuj przez filtrowanie przez 0,2 μm i pozostawaj w ciemności.
    UWAGA: 3-(4,5-Dimetyl-2-tiazolyl)-2,5-difenyl-2H-tetrazolowy bromek (MTT) jest światłoczuły. Powinno być zamrożone, w ciemności.
  5. Ostrożnie usuń podłoże z każdego dołka i zastąp go 100 μL roztworu MTT. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, 5%CO2.
  6. Podczas tej inkubacji przygotuj roztwór rozpuszczalny zawierający 40 mM HCl w alkoholu izopropylowym.
  7. Ostrożnie usuń roztwór MTT za pomocą pipety wielokanałowej, nie naruszając kryształów formazanu na dnie każdego dołka.
  8. Dodaj 100 μL roztworu rozpuszczalizacyjnego do każdej studni. Owiń talerz folią aluminiową i umieść na potrząsaczce płyt przy 150 obr./min na 15 minut.
  9. Rekordowa absorpcja na poziomie 570 nm i 630 nm.
  10. Przeprowadz analizę danych.
    1. Korzystając z surowych wartości gęstości optycznej, odejmij wartości uzyskane przy 630 nm od tych uzyskanych przy 570 nm dla każdego otworu. Następnie uśrednić skorygowane wartości nieprzetworzonych dołków komórkowych. Uznaj te nieleczone komórki za w 100% żywotne.
    2. Następnie normalizuj wartości komórek objętych leczeniem względem dołków komórek nieobrobionych, stosując wzór:
      Opłacalność (%) = figure-protocol-1
  11. Procenty żywotności wyznaczają jako słupki reprezentujące średnią replikacji ±± błędu standardowego średniej. Przeprowadz dalszą analizę statystyczną w celu porównania grup przy użyciu procedur wdrożonych w oprogramowaniu do analizy danych i wykresów, porównując żywotności przy różnych stężeniach z kontrolą komórek nieleczonych.
  12. Porównaj średnie dla każdego punktu stężenia z komórkami traktowanymi wyłącznie DMSO za pomocą nieparametrycznych Kruskal-Wallisa z Dunn po teście (różnice są istotne przy wartościach p < 0,05). Aby narysować krzywą dawka-odpowiedź i oszacować CC50 na podstawie wartości przedawkowania, sprawdź procedurę zgłoszoną elsewere14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgłoszono kilka metod transfekcji, które generują PV, w tym fosforan wapnia15, metody lipidowe16 oraz PEI, zarówno liniowe, jak i rozgałęzione. Artykuł pokazuje, że transfekcja komórek pochodzących od HEK293T z rozgałęzionymi PEI umożliwia wysoką efektywność transfekcji (Rysunek 1), zwykle porównywalną z metodami transfekcji z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych środków transfekcyjnych opartych na lipidach (dane nie pokazane). Przedstawiono r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta wszechstronność systemu MLV do generowania pseudotypów dla innych wirusów została opisana przez inne ważne wirusy, takie jak wirus Ebola18, MERS-CoV8, SARS-CoV19, wirus La Crosse20, Hantawirus20, wirus Wisna21, Arenawirus22, wirus grypy23 i inne. Te pseudotypy okazały się bardzo przydatne w wielu zastosowaniach, w tym w badaniu t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Sistema Nacional de Investigación (SNI) oraz Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT, Panamá) za wsparcie finansowe w ramach kontraktu SENACYT nr 031-2022 oraz kontraktu SNI nr 050-2023. Jesteśmy również bardzo wdzięczni dr. Gary'emu Whittakerowi za przekazanie plazmidów pCMV-MLVgagpol i pTG-Luc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 & mikro; m Filtry strzykawkowe o niskiej zawartości wiążących białko Thermo Scientific720-1320Filtry strzykawkowe (0,2 μ m,13 mm, PES, bezpłodny)
0,25% Trypsin-EDTA 1X roztwórGibco25200-056Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowa
0,45 & mikro; m PVDF Filtry Butelkowe & nbsp;Avantor514-1045Systemy filtracji próżniowej na pokrywkach od butelek (PVDF, 250 ml, 50 mm, 0,45 i mikro; m)
1,5 mL rurki sterylnych mikrowirówekEppendorf30123611Sejf  Lampy
100 x roztwór streptomycyny penicylinyCorning30-002-CIRoztwór penicylina i streptomycyna, 100x
5 X buforu lizyjowego z testu lucyferazy;PromegaE2650część systemu testów lucyferazy jasnych i jasnych (Promega Bright-Glo Luciferase Assay Assay)
50 mL stożkowe rurkiCorning  35207050 mL rurka do wirówki PP o wysokiej klarowności, stożkowaty dno, sterylna
Płytki do hodowli tkanek z 6 dołkamiThermo Scientific140675Wielonaczynia poddane hodowli komórkowej
Płytki do hodowli tkanek z 96 dołkamiThermo Scientific168055Nunc™ MicroWell™ 96-studnia, mikropłytka z płaskim dnem obrobiona delta z nanoklonem
Arbidol chlorowodorekSigma-AldrichSML0860
Rozgałęziona polietylimina, 25 kDaSigma-Aldrich408727
Konfokalny mikroskop laserowy   (FV 3000)Olympus Co.SKU: FV3000
Dimetylsulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD8418
DMEM (Zmodyfikowane medium Dulbecco) z: wysoką glukozą, L-glutaminą, fenolową czerwienią, pirotrowianem sodu)Gibco11995-065
Serum bydła płodu (FBS)Gibco26140-079Dezaktywowany termicznie (56 stopni; C, 30 min)
Komórki pochodzące z HEK293T (Linia komórkowa Lenti-X 293T)Takara Bio632180Wysoce transfektywalny subklon linii komórkowej HEK293 i wspierający wysoki poziom ekspresji białek wirusowych
Bufor HEPESGibco15630-080
Komórki o wysokiej podatności na infekcję (293T-ACE2. TMPRSS2 (mCherry) Linia komórkowa)Zasoby BEINR-55293HEK293T linia komórkowa zmodyfikowana do stabilnej ekspresji ACE2 i TMPRSS2
Kwas solny  Sigma-AldrichH1758-500ML
Mikroskop z odwróconym kontrastem fazowym Olympus Co. SKU: 2404040005
IzopropanolSigma-AldrichI9516-500ML
Podłoże lucyferazowePromegaE2650część systemu testów jasno-glo lucyferazy
Czytnik mikropłyt z detekcją luminescencjiAgilent BioTekBTH1MG
MTT [3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolowy bromek]Sigma-AldrichM2128
Nieprzezroczyste białe płyty z 96 dołkamiCorning391796-dołkowa mikropłyta z płaskim polistyrenem TC z 96-dołkami
ParafilmBemisPM999
plazmid pcDNA3-EGFPAddgene13031pcDNA3-EGFP był darem od Douga Golenbocka (plazmid addgene # 13031 ; http://n2t.net/addgene:13031 ; RRID:Addgene_13031)
plazmid pCMV-MLVgagpol--Uprzejmie przekazane przez dr. Gary'ego Whittakera 
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym bez Ca2+ i Mg2+ (PBS)Corning21-040-CVSól fizjologiczna z buforem fosforanow, 1X bez wapnia i magnezu
Promega PureYield Plasmid Maxiprep SystemPromegaA2393
Plazmid pTG-Luc--Uprzejmie przekazane przez dr. Gary'ego Whittakera 
plazmid kolców pUNO1-SARS-CoV-2 (Wuhan)InvivogenP1-spike
plazmid pVSV-GAddgene138479pVSV-G był darem od Akitsu Hotty (plazmid addgene # 138479 ; http://n2t.net/addgene:138479 ; RRID:Addgene_138479)
Rekombinowane ludzkie białko fuzyjne ACE2-FcInvivogenFC-HaCE2
Zredukowane medium surowicowe (Opti-MEM)Gibco31985-070Opti-MEM Medium Zredukowane Serum

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, J., et al. SARS-CoV-2 and emerging variants: Unmasking structure, function, infection, and immune escape mechanisms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 869832(2022).
  2. Jackson, C. B., Farzan, M., Chen, B., Choe, H. Mechanisms of SARS-CoV-2 entry into cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (1), 3-20 (2022).
  3. Le, K., Kannappan, S., Kim, T., Lee, J. H., Lee, H. -R., Kim, K. K. Structural understanding of SARS-CoV-2 virus entry to host cells. Front Mol Biosci. 10, 1288686(2023).
  4. Ayoub, P. G., et al. Improved SARS-CoV-2 spike glycoproteins for pseudotyping lentiviral vectors. Front Virol. 1, 793320(2021).
  5. Lippi, G., et al. Biosafety measures for preventing infection from COVID-19 in clinical laboratories:IFCC Taskforce Recommendations. Clin Chem Lab Med. 58 (7), 1053-1062 (2020).
  6. Cruz-Cardenas, J. A., et al. A pseudovirus-based platform to measure neutralizing antibodies in Mexico using SARS-CoV-2 as proof-of-concept. Sci Rep. 12 (1), 17966(2022).
  7. Rizatdinova, S. N., Ershova, A. E., Astrakhantseva, I. V. Pseudotyped viruses: A useful platform for pre-clinical studies conducted in a BSL-2 laboratory setting. Biomolecules. 15 (1), 135(2025).
  8. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Murine leukemia virus (MLV)-based coronavirus spike-pseudotyped particle production and infection. Bio Protoc. 6 (23), e2035(2016).
  9. Millet, J. K., et al. Production of pseudotyped particles to study highly pathogenic coronaviruses in a biosafety level 2 setting. J Vis Exp. (145), e59010(2019).
  10. Eichler, M., Aksi, E., Pfeilschifter, J., Imre, G. Application of pseudotyped virus particles to monitor Ebola virus and SARS-CoV-2 viral entry in human cell lines. STAR Protoc. 2 (4), 100818(2021).
  11. Thomas, J., et al. Development of a pseudo-typed virus particle based method to determine the efficacy of virucidal agents. Sci Rep. 14 (1), 2174(2024).
  12. Yang, S., Zhou, X., Li, R., Fu, X., Sun, P. Optimized PEI-based transfection method for transient transfection and lentiviral production:PEI-based transfection for lentiviral production. Curr Protoc Chem Biol. 9 (3), 147-157 (2017).
  13. Gee, P., et al. Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping. Nat Commun. 11 (1), 1334(2020).
  14. Ferrara, F., Temperton, N. Pseudotype neutralization assays:From laboratory bench to data analysis. Methods Protoc. 1 (1), 8(2018).
  15. Soneoka, Y., et al. A transient three-plasmid expression system for the production of high titer retroviral vectors. Nucleic Acids Res. 23 (4), 628-633 (1995).
  16. Chen, Y., Miller, W. M., Aiyar, A. Transduction efficiency of pantropic retroviral vectors is controlled by the envelope plasmid to vector plasmid ratio. Biotechnol Prog. 21 (1), 274-282 (2005).
  17. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
  18. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses:Identification of receptor-deficient cell lines. J Virol. 72 (4), 3155-3160 (1998).
  19. Giroglou, T., et al. Retroviral vectors pseudotyped with severe acute respiratory syndrome coronavirus S protein. J Virol. 78 (17), 9007-9015 (2004).
  20. Ma, M., Kersten, D. B., Kamrud, K. I., Wool-Lewis, R. J., Schmaljohn, C., González-Scarano, F. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan bunyaviruses:A system for analysis of cell tropism. Virus Res. 64 (1), 23-32 (1999).
  21. Bruett, L., Clements, J. E. Functional murine leukemia virus vectors pseudotyped with the visna virus envelope show expanded visna virus cell tropism. J Virol. 75 (23), 11464-11473 (2001).
  22. Radoshitzky, S. R., et al. Transferrin receptor 1 is a cellular receptor for New World haemorrhagic fever arenaviruses. Nature. 446 (7131), 92-96 (2007).
  23. Wang, W., et al. Establishment of retroviral pseudotypes with influenza hemagglutinins from H1, H3, and H5 subtypes for sensitive and specific detection of neutralizing antibodies. J Virol Methods. 153 (2), 111-119 (2008).
  24. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 53(2021).
  25. Sholukh, A. M., et al. Evaluation of cell-based and surrogate SARS-CoV-2 neutralization assays. J Clin Microbiol. 59 (10), e0052721(2021).
  26. Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiol Res. 258, 126993(2022).
  27. Johnson, M. C., et al. Optimized pseudotyping conditions for the SARS-CoV-2 spike glycoprotein. J Virol. 94 (21), e01062-e01120 (2020).
  28. Xiaojie, S., Yu, L., Lei, Y., Guang, Y., Min, Q. Neutralizing antibodies targeting SARS-CoV-2 spike protein. Stem Cell Res. 50, 102125(2021).
  29. Cao, L., et al. De novo design of picomolar SARS-CoV-2 miniprotein inhibitors. Science. 370 (6515), 426-431 (2020).
  30. Monteil, V., et al. Inhibition of SARS-CoV-2 infections in engineered human tissues using clinical-grade soluble human ACE2. Cell. 181 (4), 905-913.e7 (2020).
  31. Ahmad, I., Pawara, R., Surana, S., Patel, H. The repurposed ACE2 inhibitors:SARS-CoV-2 entry blockers of COVID-19. Top Curr Chem. 379 (6), 40(2021).
  32. Alqaaf, M., et al. Discovering natural products as potential inhibitors of SARS-CoV-2 spike proteins. Sci Rep. 15 (1), 200(2025).
  33. Chan, C. C. -Y., et al. Identification of novel small-molecule inhibitors of SARS-CoV-2 by chemical genetics. Acta Pharm Sin B. 14 (9), 4028-4044 (2024).
  34. Lei, C., et al. Neutralization of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus by recombinant ACE2-Ig. Nat Commun. 11 (1), 2070(2020).
  35. Wang, X., et al. The anti-influenza virus drug, arbidol is an efficient inhibitor of SARS-CoV-2 in vitro. Cell Discov. 6 (1), 28(2020).
  36. Kang, Y., Shi, Y., Xu, S. Arbidol:The current demand, strategies, and antiviral mechanisms. Immun Inflamm Dis. 11 (8), e984(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Test z pseudowirusamiprzesiewowe badanie przeciwwirusowepseudowirusy MLVbia ko Spikereporter lucyferazywysokoprzepustowe badanie przesiewowetransfekcja kom rekmechanizmy wnikania wirus w

Powiązane artykuły