Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie glikolizy w mikrogleju pierwotnym za pomocą testu strumienia zewnętrznego

253 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69638

⸱

10 kwietnia 2026

 , 
1Division of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Memorial University of Newfoundland

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje opłacalny sposób przeprowadzenia testu stresowego glikolizy w celu ilościowego przeprogramowania metabolizmu w pierwotnym mikrogleju myszy. Po izolacji i stymulacji zapalnej mierzy się tempo zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) przy użyciu świeżo przygotowanych, pH-skorygowanych odczynników, a następnie następuje normalizacja białek, umożliwiająca dokładną i powtarzalną ocenę zmian glikolitycznych.

Streszczenie

Mikroglej, rezydujące komórki makrofagów ośrodkowego układu nerwowego, dynamicznie zmieniają swoje programy metaboliczne w odpowiedzi na sygnały fizjologiczne i patologiczne. Zrozumienie tych zmian metabolicznych jest kluczowe dla wyjaśnienia ich roli w stanie zapalnym. Przedstawiamy szczegółowy protokół oceny profilu glikolitycznego pierwotnego mikrogleju wyizolowanego z noworodkowych kor mózgowych myszy za pomocą testu stresowego glikolizy na analizatorze strumienia zewnętrznego. Test ten umożliwia pomiar w czasie rzeczywistym ECAR, wskaźnika aktywności glikolitycznej związanej z niskim pH, takiego jak mleczan. Nasze podejście polega na leczeniu mikrogleju hodowlanego w różnych warunkach, aby zbadać, jak szlaki metaboliczne są zmieniane w odpowiedzi na różne bodźce, w tym bodźce prozapalne. Unikalnie nasze laboratorium przygotowuje świeże roztwory zapasowe różnych odczynników, w tym glukozy, oligomycyny i 2-deoksyglukozy (2DG), aby celować w różne aspekty szlaku, z precyzyjną regulacją pH dla każdego reagenta, aby zapewnić eksperymentalną dokładność i powtarzalność. Ta metoda stanowi solidną podstawę do badania glikolizy w mikrogleju pierwotnym i dostarcza wglądu w ich stany funkcjonalne w warunkach zapalnych lub związanych z chorobą.

Wprowadzenie

Komórki ośrodkowego układu nerwowego zmieniają sposób produkcji energii w odpowiedzi na normalne i chorobowe warunki 1,2. Wśród głównych szlaków metabolicznych glikoliza i fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS) są kluczowymi szlakami regulującymi funkcje komórek odpornościowych – poddają się one w celu przeprowadzenia silnej i natychmiastowej reakcji na choroby prozapalne i przeciwzapalne, odpowiednio 3,4. W ten sposób komórki odpornościowe mogą przełączać się między szlakami metabolicznymi w odpowiedzi na sygnały zapalne i stany funkcjonalne5. Mikroglej, podobnie jak ich odpowiedniki szpikowe, są metabolicznie powiązane ze swoimi funkcjami i szybko adaptują się do różnych szlaków jako alternatywne paliwo metaboliczne, wykazując elastyczność metaboliczną 6,7. Mikroglej przechodzi szybkie przeprogramowanie metaboliczne podczas stanu zapalnego, a zwiększona glikoliza stanowi kluczowy znak metaboliczny stanów prozapalnych8. Dlatego testy identyfikujące zależność komórek od fenotypu metabolicznego pozwalają nam badać ich stany funkcjonalne w różnych warunkach. W obecnym protokole naszym celem jest ustalenie, czy mikroglej pierwotny opiera się na zwiększonej glikolizie podczas stanów prozapalnych. W tym celu rutynowo wykonujemy testy stresowe glikolizy. Chociaż analizator Seahorse XFe24 (analizator strumienia zewnątrzkomórkowego) był szeroko stosowany do pomiaru ECAR w uwiecznionych liniach komórkowych i przekształconych komórkach, mikroglej pierwotny stawia unikalne wyzwania techniczne, w tym ograniczone wydajności komórek, zmienne właściwości przylegania oraz wysoką wrażliwość na warunki hodowlane, co może zakłócać pomiary metaboliczne. Ponadto zapewnia pomiar ECAR w czasie rzeczywistym, umożliwiając precyzyjną ocenę glikolizy wywołanej mleczanem w wielu punktach czasowych, której nie można uchwycić wyłącznie za końcowe testy mleczanowe. Profilowanie metaboliczne oparte na przepływie zewnątrzkomórkowym zostało szeroko zastosowane w badaniach nad metabolizmem do charakteryzacji bioenergetyki komórek, co czyni ten protokół doskonale przygotowanym do badań nad zmianami metabolicznymi w komórkach podczas aktywacji, modelowania chorób lub testów lekowych. Czytelnicy mogą ocenić przydatność na podstawie potrzeby dynamicznych, wysokorozdzielczych pomiarów glikolizacji w komórkach pierwotnych.

Glukoza jest metabolizowana do pirorozianu poprzez glikolizę, a następnie przekształcana w mleczan w cytoplazmie lub w CO₂ i wodę w mitochondriach. Przekształcenie glukozy w mleczan prowadzi do uwalniania protonów do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, co skutkuje zakwaszeniem ośrodka. Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego określa tę zakwaszenie jako ECAR9. W teście stresowym glikolizy komórki najpierw inkubują się w medium wolnym od glukozy i pirosurow, a ich bazowy ECAR jest rejestrowany. Pierwszy zastrzyk dostarcza nasyconą ilość glukozy, którą komórki metabolizują poprzez glikolizę do pirorurianu, produkując ATP, NADH, wodę i protony. Zwiększone uwalnianie protonów podnosi ECAR, co odzwierciedla 'glikolizę'. Następnie dodaje się oligomycynę, aby hamować syntezę ATP mitochondrialnej, zmuszając komórki do polegania wyłącznie na glikolizie. Ta zmiana gradientu protonowego dodatkowo zwiększa ECAR i jest mierzona jako maksymalna pojemność glikolityczna komórki. Na koniec wprowadzono 2DG, analog glukozy. Konkurencyjnie hamuje heksokinazę, blokując glikolizę i obniżając ECAR. Ten spadek potwierdza, że wcześniejsze ECAR było zależne od glikolizy. Różnica między maksymalną pojemnością glikolityczną a poziomem glikolizy definiuje rezerwę glikolityczną. Początkowy ECAR przed dodaniem glukozy oznacza nieglikolityczną zakwaszanie z innych procesów komórkowych (Rysunek 1).

Przeprowadziliśmy test stresowy glikolizy za pomocą analizatora strumienia zewnętrznego. Surowe wartości ECAR zostały wyeksportowane do Excela do analizy. Dla każdego schorzenia zidentyfikowaliśmy punkty czasowe odpowiadające bazalnemu ECAR (przed dodatkiem glukozy), glikolizie (po wstrzyknięciu glukozy) oraz pojemności glikolitycznej (po leczeniu oligomycyną). Wartości ECAR z odpowiednich punktów czasowych w każdej fazie oraz w czterech technicznych replikach zostały uśrednione, a glikoliza obliczona jako wzrost ECAR po dodaniu glukozy. Pojemność glikolityczna została obliczona jako wzrost ECAR po dodaniu oligomycyny. Rezerwa glikolityczna została obliczona jako spadek ECAR po wstrzyku 2DG. Te wartości średnie zostały następnie wykorzystane do porównania odpowiedzi metabolicznych między grupami.

Z kolei do oceny tempa zużycia tlenu (OCR) i funkcji mitochondrialnych standardowym podejściem jest test obciążeniowy mitochondrialny (Agilent), który mierzy parametry takie jak oddech podstawowy, oddech powiązany z ATP, wyciek protonow, maksymalny oddech, wolna pojemność oddechowa oraz oddychanie niemitochondrialne. Pomiary te uzyskuje się poprzez kolejne wstrzyknięcie specyficznych inhibitorów mitochondrialnych, oligomycyny (inhibitor syntazy ATP), FCCP (karbonylcyjanowy-4 (trifluorometoksy)fenylhydrazonu), rozłącznika sterującego maksymalnym oddychaniem, oraz rotenonu/antymycyny A (złożonych inhibitorów I/III), co pozwala na ilościową ocenę zdrowia mitochondriów i bioenergetyki 10,11,12,13 . Testy ECAR i OCR są więc wykonywane w różnych warunkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i uzyskały zgodę Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami na Memorial University of Newfoundland zgodnie z protokołem numer 22-01-DK.

1. Przygotowania przed rozpoczęciem eksperymentów

  1. Przygotuj roztwór sekcji, dodając 10 mM HEPES do 1x HBSS bez Ca2+ i Mg2+.
  2. Przygotuj roztwór trawienny (na 2–3 mózgi), łącząc 1 ml 2,5% trypsyny (10x bulionu, nierozcieńczony), 2 ml roztworu sekcji oraz 200 μL DNazy I (1 mg/mL).
  3. Przygotuj mieszane medium glejowe poprzez suplementację DMEM o 10% FBS, 1x Glutamax i 1x antybiotyk/lek przeciwmykotykowy.
  4. Przygotuj podłoże mikroglejowe, uzupełniając DMEM o 10% FBS, 1x Glutamax, 1x MEM NEAA, 1x pirorurianian sodu oraz 1x penicylinę/streptomycynę.

2. Powłoka dla mieszanych kultur glejowych (Rysunek 2A)

  1. Pierwszego dnia:
    1. Pobierz szczenięta poporodowego (P0)-P2 od myszy C57BL/6C, wyekstrahuj korę za pomocą mikroskopu stereograficznego i usuń opony. Następnie rozciął korę na drobne kawałki w roztworze rozcinającym i przeniósł je do stożkowej probówki o pojemności 15 mL. Pozwól tkankom osiąść na dnie rurki.
    2. Przelej roztwór do rozwarstwienia i zastąp go 3 mL roztworu trawiennego na każde 2–3 mózgi. Delikatnie trituratuj za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 mL, aby rozdzielić tkankę.
    3. Umieść rurki na wirniku w inkubatorze w temperaturze 37 °C i mieszaj przez tryturację za pomocą pipety serologicznej o pojemności 2 mL co 8 minut, co daje łącznie około 24 minuty.
    4. Po trawieniu tkanek wiruj komórki w dawce 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Następnie odrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulkę w 5 mL mieszanego glejowego środka.
    5. Używając igły 18 G w strzykawce 5 mL, trituruj komórki, a następnie przepuszczaj je przez sitko z nylonu o pojemności 70 μm. Ponownie wiruj pobrane komórki w dawce 300 x g przez 5 minut w RT.
    6. Najpierw ponownie zawiesijcie pellet w 1 mL mieszanego ośrodka glejowego i triturujcie wielokrotnie, aby usunąć zlepianie komórek, a następnie ponownie zawiesijcie w większej objętości, co daje do 12 mL w każdej kolbie T75 (zaleca się 2–3 kory mózgowe na kolkę)
      UWAGA: Nie jest wymagane pokrycie kolby poli-D-lizyną lub innym odczynnikiem.
  2. Drugiego dnia zmień cały materiał i dodaj świeże, mieszane nośniki glejowe.
  3. Trzeciego dnia zamień około 2/3 podłoża na świeże, mieszane materiały glejowe. Pozwól komórkom rosnąć przez dodatkowe siedem dni, łącznie przez 10 dni.
    UWAGA: W tym momencie można zaobserwować warstwę astrocytów.
  4. W dniu 6 zamień 2/3 materiału na świeże, mieszane media glejowe. Potwierdź obecność zbiegu warstwy astrocytów.

3. Uzyskanie czystego mikrogleju pierwotnego (rysunek 2A)

UWAGA: Około 10. dnia widoczne są małe, okrągłe komórki unoszące się na warstwie astrocytów; są to głównie mikrogleje (Rysunek 2B).

  1. Potrząsaj kolbą z częstotliwością 250 obr./min przez 2 godziny w 37 °C. Zbierz całe medium zawierające pływające ogniwa do stożkowej rurki o pojemności 15 mL i wiruj w 300 x g przez 10 minut.
  2. Ponownie zawiesz pellet w ośrodku mikroglejowym i nałóż około 250 000 komórek na dołek w mikropłytkach hodowli komórkowej analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.
    UWAGA: Z trzech kolb T75 uzyskuje się około 3–4 miliony komórek na mL; powlekanie płytek hodowli komórkowych poli-D-lizyną lub innymi odczynnikami nie jest wymagane.
  3. Inkubuj mikropłytę przy 5% CO2 przez 30–45 minut. Następnie ponownie zmień podłoże, aby uzyskać czystą posiew mikrogleju i usunąć wszelkie oligodendrocyty, które mogą jeszcze pływać. Komórki są gotowe do leczenia już następnego dnia (rysunek 2C).
  4. Wyklucz cztery dołki oznaczone jako kontrolki "tło" z siedzenia komórek: po jednym w każdym wierszu (Rysunek 3C). Te studnie są wykorzystywane do analizy.
    UWAGA: Wypełnij nieużywane studnie wodą sterylną lub PBS, aby zapobiec parowaniu ośrodka, i nakładaj komórki w losowym wzorze zamiast w stałych rzędach czy kolumnach, aby zminimalizować zmienność płyt.

4. Leczenie pierwotnego mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych

  1. W 11. dniu traktuj komórki 100 ng/mL lipopolisacharydem (LPS) przez 24 godziny. Losowo zrób odwierty kontrolowane i leczone LPS, aby wykluczyć jakiekolwiek efekty pozycyjne.
    UWAGA: Czas trwania leczenia może się różnić w zależności od warunków eksperymentalnych i wymaga wcześniejszej optymalizacji.

5. Przygotowanie do testu strumienia zewnątrzkomórkowego dzień przed przeprowadzeniem eksperymentu

  1. W dniu 11 dodaj 1 mL buforu kalibarskiego do płyty kalibracyjnej (format 24-dołkowy; zestaw do analizy strumienia zewnętrznego) we wszystkich otworach. Trzymaj talerz na noc w temperaturze 37 °C bezCO2.
    UWAGA: Płyta kalibracyjna składa się z 4 studni wtryskowych. W teście stresowym glikolizy glukoza dodaje się do portu A, oligomycyna do portu B, a 2DG do portu C (patrz rysunek 4A).
  2. Przygotuj roztwory glukozy i zapasów 2DG
    1. Glukoza – rozpuścić 90 mg glukozy w 2 mL podłoża do analizy strumienia zewnętrznego (Tabela materiałów). Początkowo rozpuszczaj w około 1,9 mL, tak aby po skorygowaniu pH następnego dnia o 1N NaOH końcowa objętość nie przekraczała 2 mL, co jest kluczowe dla utrzymania trzonowości.
    2. 2DG – rozpuścić 328 mg w 2 mL materiału do analizy strumienia zewnętrznego.
      UWAGA: Przechowuj zarówno glukozę, jak i 2DG w temperaturze 4 °C przez noc
  3. Zachowaj 30-40 mL materiału do testów w stożkowej probówce 50 mL i przechowuj w temperaturze 4 °C, aby wykonać testy następnego dnia.

6. Zewnętrzny test przepływu (dzień 12)

  1. Dwunastego dnia podgrzej gotową glukozę, 2DG, oraz alicytowane medium testowe do 37 °C. Dostosuj pH glukozy i 2DG, a także podłoża alicytowanego do 7,4, dodając 1N NaOH stopniowo (np. 5 μL, a następnie 10 μL).
  2. Krótko zacznij wirowanie, aby równomiernie wymieszać, aż pH przekroczy 7.
    UWAGA: zaleca się stosowanie pasków wskaźnikowych pH dla stałego monitorowania pH.
  3. Dodaj 2 μL roztworu zapasowego 10 mM oligomycyny do 2 mL medium testowego o skorygowanym pH.
    1. Przygotowanie roztworu bulwarowego 10 mM oligomycyny: Rekonfunduj fiolkę 10 mg oligomycyny w 1 ml sterylnego DMSO, tworząc stężenie 10 mg/mL, i przechowywaj w temperaturze -80 °C do dalszego użycia.
  4. Wyjmij komórki z inkubatora (od kroku 4) i zbierz medium do mikrowirówek o pojemności 1,5 mL, a następnie wiruj w 300 x g przez 5 minut.
  5. Zbierz supernatant (wyrzuć pellet, aby pozbyć się komórek/zanieczyszczeń) i przechowuj go w temperaturze -80 °C do pomiarów mleczanu, o czym mowa w kroku 8.
  6. Delikatnie umyj komórki 1 mL medium do testów o korekcji pH, aby nie oderwać się od nich.
  7. Usuń podłoże testowe i dodaj 500 μL podłoża o pH skorygowanym i inkubuj w temperaturze 37 °C (bezCO2) przez 45 minut do 1 godziny.
  8. Tymczasem dodaj wszystkie wymagane inhibitory do płytki kalibracyjnej analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego w odpowiednich portach – 55 μL glukozy do portu A w lewym górnym rogu we wszystkich otworach, 60 μL oligomycyny w porcie B w prawym górnym rogu oraz 65 μL 2DG w portach C do dolnych lewych studni (w tym studni tła) (patrz Rysunek 4A).
    UWAGA: Wzrost objętości na każdym etapie jest konieczny, aby utrzymać trzonowość, ponieważ objętość rośnie wraz z wcześniejszym dodaniem glukozy i oligomycyny.
  9. Po dodaniu inhibitorów ustaw test stresowy glikolizy za pomocą oprogramowania Agilent Seahorse Wave (patrz Rysunek 3). Następnie uruchamiam płytkę kalibracyjną po wywołaniu wywołania.
    UWAGA: Przed umieszczeniem płytki w maszynie zdejmij górną pokrywę z płyty oraz różową osłonę między płytkami. Podczas tego etapu zostaną przebadane czujniki pH iO2 oraz sprawdzone są kontroli jakości.
  10. Po zakończeniu kalibracji maszyna poprosi o rozładowanie płyty kalibracyjnej i załadowanie płyty hodowlanej.
    1. Krok I: Wybierz szablon testu (Rysunek 3A)
      1. Otwórz oprogramowanie Wave i w sekcji Szablony wybierz odpowiedni szablon testu dla eksperymentu.
      2. W takim przypadku wybierz "XF Glycolysis Stress Test" na analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego.
    2. Krok II: Zdefiniuj grupy i strategie iniekcji (Rysunek 3B)
      1. Przejdź do zakładki Definicje Grup i utwórz grupy eksperymentalne (np. Tło, Sterowanie i LPS).
      2. Zdefiniuj strategię iniekcji , wybierając związki do wstrzykiwania w każdym porcie (np. glukoza, oligomycyna, 2DG do testu wytrzymałości glikolizy; te ustawienia są domyślnie ustawione przez oprogramowanie i odpowiednio sprawdzaj).
    3. Krok III: Przypisanie grup do mapy płyt (Rysunek 3C)
      1. Otwórz widok Mapa płyt i przypisz studnie każdej grupie, przeciągając nazwy grup (np. Tło =, Control = zielony, LPS = czerwony) na układ płyty.
      2. Upewnij się, że otwory puste/tło są wyznaczone do dokładnej normalizacji.
    4. Krok IV: Ustaw protokół (rysunek 3D)
      1. W zakładce Protokół zaprogramuj cykle pomiarowe i zastrzyki. Typowa sekwencja testu stresowego glikolizy obejmuje zakwaszenie nieglikolityczne, wstrzyknięcie glukozy (port A) → pomiar glikolizy, wstrzyknięcie oligomycyny (port B) → pomiar pojemności glikolitycznej, wstrzyknięcie 2-DG (port C) → pomiar rezerwy glikolizowej
      2. Określ liczbę cykli pomiarowych po każdym wstrzyku i dostosuj czas (np. 3 cykle mieszania po 3 minuty, 2 minuty oczekiwania, pomiar przez 3 minuty).
        UWAGA: W naszych eksperymentach używamy domyślnych ustawień oprogramowania.
      3. Przed przeprowadzeniem testu przejrzyj całkowity czas testu .
    5. Krok V: Normalizacja (Rysunek 3E)
      1. Normalizuj dane za pomocą wartości stężeń białek uzyskanych z testu kwasu bicynchoninowego (BCA) w oprogramowaniu Wave , korzystając z wbudowanej opcji normalizacji (np. według zawartości białka, liczby komórek lub innych dostępnych metod). Pomiary stężenia białka pokazano w Tabeli 1.
        UWAGA: Protokół izolacji białka do testu BCA po pomiarze ECAR opisany jest w następującym kroku 7.

7. Zbieranie komórek do kwantyfikacji i normalizacji danych

  1. Po zakończeniu testu strumienia zewnętrznego należy usunąć płytkę hodowlową i natychmiast przystąpić do ekstrakcji białka lub przechowywać płytkę w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji białka.
    UWAGA: Testy białkowe pozwalają normalizować wartości w różnych warunkach leczenia (są jedną z metod normalizacji danych, a nie jedyną).
  2. Aby natychmiast izolować białko, usuń podłoże testowe z dołków i przepłucz raz 500 μL RT PBS (1x) (zaleca się delikatne jednorazowe płukanie, aby zminimalizować zakłócenia monowarstwy komórkowej).
  3. Aby zebrać komórki, które mogą się odłączyć podczas tego procesu, raz odwiruj płytkę przy 300 × g przez 5 minut, wyrzuć PBS i ponownie zawiesij powstały pellet w buforze RIVA, aby zapewnić dokładne pomiary całkowitych białek.
  4. Do każdego odwiertu dodaj około 75–100 μL buforu RIPA i umieść płytę na wstrząsie (niska-średnia rotacja) na 30 minut (RT). Następnie przelej zawartość do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
    UWAGA: Tryturuj i dobrze wymieszaj w dołkach przed przeniesieniem buforu RIPA do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  5. Inkubuj rurkę mikrowirówki na rotatorze przez około 30 minut w RT, aby prawidłowo przeprowadzić lizę komórek. W tym czasie schłodz wirówkę do 4 °C.
  6. Wiruj lizat komórkowy w ilości 16 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Usuń granulat, ponieważ będzie zawierał zanieczyszczenia komórkowe.
  7. Pobierz supernatant do ilościowego określenia białka za pomocą testu BCA (lub innej preferowanej metody). Albo natychmiast przystąpić, albo przechować lizaty po usunięciu całego materiału testowego w temperaturze -20 °C (do przechowywania krótkoterminowego) lub do -80 °C (do przechowywania długoterminowego).
  8. Po ponownym uruchomieniu próbek w temperaturze -20 °C lub -80 °C, rozmroz je na lodzie przez około 20–30 minut, krótko wiruj/obrót i kontynuuj standardowy protokół BCA.
  9. Alternatywnie, można liczyć komórki w dołku za pomocą hemocytometru lub cytometru przepływowego i włączyć je do strategii normalizacji. W takim przypadku należy natychmiast po zakończeniu testu i usunięciu podłoża do testu dodać około 100–200 μL trypsyny (podgrzanej do 37 °C) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zbieraj komórki, dodając 100–200 μL 10% FBS, aby zneutralizować działanie trypsyny.
    1. Wiruj komórki w 300 x g przez 5 minut, usuń supernatant i ponownie zawiesij pellet w około 1 mL 10% FBS przed liczeniem za pomocą hemocytometru. Alternatywnie, komórki można utrwalić 4% PFA przez 15 minut przed przystąpieniem do liczenia komórek opartego na cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Jeśli od razu przystąpi się do liczenia komórek, fiksacja oparta na PFA nie jest wymagana.
  10. Normalizuj wartości ECAR z stężeniem białka od kroku 7.8 lub liczbą komórek od kroku 7.9.1 w każdym dołku, używając oprogramowania Wave , jak w kroku 6.10.5.1. Otrzymane wartości są znormalizowanymi wartościami testu stresowego glikolizy.
  11. Wygeneruj wyniki i wykres, używając opcji "Eksport", następnie opcji "Graph Pad Prism" oraz "Excel sheet" dla każdego punktu danych do ilościowego określenia.
    UWAGA: W płytce hodowli komórkowej wybór czterech wyznaczonych pustych dołków jest elastyczny i może być ustawiony przez eksperymentatora. Domyślny układ pustych elementów przedstawiono na rysunku 3C.

8. Pomiary mleczanu z supernatantów hodowli

  1. Stopniowo rozmrażaj nadmiarowe alikwoty na lodzie, które zostały zebrane 12. dnia i przechowywane w temperaturze −80 °C od kroku 6,5.
  2. Określ stężenia L-mleczanu za pomocą zestawu testowego L-Laktian w trybie fluorometrycznym, zgodnie z protokołem producenta.
    Uwaga: Tryb fluorometryczny jest znacznie bardziej czuły niż test kolorymetryczny.
  3. Przygotuj standardy poprzez szeregowe rozcieńczanie dostarczonego standardu mleczanowego w celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej w zakresie od 0 do 0,1 nmol/well.
  4. Dodaj próbki i standardy do przezroczystej mikropłytki z 96 dołkami w duplikacie, a następnie do każdego dołka dodaj mieszaninę reakcji zawierającą mieszankę enzymów mleczanowych i sondę fluorescencyjną.
  5. Inkubuj w RT przez 30 minut chroniony przed światłem. Zmierz intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikropłyt fluorescencyjnych z długościami fal wzbudzenia/emisji ustawionymi na 535/587 nm.
  6. Oblicz stężenia mleczanu w próbkach na podstawie krzywej standardowej i wyraź je jako pM. Poziomy mleczanu z nadmiarów nieleczonych (kontrolnych) oraz pierwotnych mikrogleju leczonych LPS przedstawiono w Tabeli 2.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Test stresu glikolizy oparty na przepływie zewnątrzkomórkowym skutecznie mierzy profil glikolizowy pierwotnego mikrogleju. Test mierzy glikolizę bazalną, czyli glikolizę po wstrzyknięciu glukozy, zdolność glikolityczną po wstrzyknięciu oligomycyny oraz hamowanie glikolizy po wstrzyku 2DG. W naszym eksperymencie porównaliśmy mikroglej pierwotnego kontrolowanego (nieleczonego) i LPS. Zaobserwowaliśmy niewielkie zmiany morfologiczne między mikroglejem kontrolnym a LPS po 24 godzinach (Rysunek <...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Odpowiedź mikrogleju podczas neurozapalenia towarzyszy głęboka przekształcenie metaboliczne, które pozwala tym komórkom spełniać energiczne i biosyntetyczne wymagania ich stanu funkcjonalnego. Test stresowy glikolizy oparty na przepływie zewnątrzkomórkowym oferuje czułą i w czasie rzeczywistym metodę pomiaru przepływu glikolizowego, umożliwiając analizę, jak mikroglej pierwotny adaptuje swój metabolizm w warunkach prozapalnych. W tym badaniu wykorzystaliśmy pierwotne mikroglej mysie i oceniliśmy ich aktywność glikolitową...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnego konfliktu interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Prace są finansowane z grantu projektowego CIHR dla DKK. RTI dla dr. Craiga Moore'a dotyczący analizatora Seahorse XFe24 jest wysoko cenione.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rozwiązanie HEPES 1MSigma AldrichH0887
1X HBSSGibco    14175-079
2,5% trypsynyGibco    15090-046
2DGMillipore sigma D6134
Antybiotyk/Przeciwmykotyk & nbsp;Gibco15240-062
D – (+)Glukoza, bezwodnia Thermoscientific   A16828.36
DMEMGibco  11965-092
DNaza IMillipore sigma 11284932001- Roche
FBSFisherbrandFB12999102
GlutamaxGibco    35050-061
Zestaw L-LactateAbcamab65330
LPS Sigma Aldrich  L4391
MEM NEAA Gibco    11140-050
Oligomycyna AMillipore sigma 495455
Penicylina/StreptomycynaGibco    15240-062
Paski wskaźnikowe pHFisherbrand13-640-516
Seahorse XFe24Agilent TechnologiesNie maNazwa ogólna: Extracellular flux analyzer
Mikropłytki do hodowli komórek Seahorse 24 V7 PSAgilent Seahorse100777-004Nazwa ogólna: mikropłyty z kulturą komórek strumienia zewnętrznego
Badanie konika morskiego XF bufora kalibantowego (pH 7,4)Agilent Seahorse   100840-000Nazwa ogólna: Bufor falweru strumienia zewnętrznego
Badanie konika morskiego XF DMEM (pH 7,4)Agilent Seahorse     103575-100Nazwa ogólna: Zewnątrzkomórkowe medium do testów strumienia
Zestaw do analizy strumienia zewnętrznego SeahorseAgilent Seahorse 102342-100Nazwa ogólna: Płyta kalibracyjna strumienia zewnętrznego  
Pirotrowęglan sodu & nbsp;Gibco    11360-070

Bibliografia

  1. Prinz, M., Jung, S., Priller, J. Microglia biology: One century of evolving concepts. Cell. 179, 292-311 (2019).
  2. Tay, T. L., et al. Unique microglia recovery population revealed by single-cell RNAseq following neurodegeneration. Acta Neuropathol. Commun. 6, 87(2018).
  3. Wang, Z., et al. Glycolysis and oxidative phosphorylation play critical roles in natural killer cell receptor-mediated natural killer cell functions. Front. Immunol. 11, 202(2020).
  4. Soto-Heredero, G., Gómezde Las Heras, M. M., Gabandé-Rodríguez, E., Oller, J., Mittelbrunn, M. Glycolysis-a key player in the inflammatory response. FEBS J. 287, 3350-3369 (2020).
  5. O'Neill, L. A., Kishton, R. J., Rathmell, J. A guide to immunometabolism for immunologists. Nat. Rev. Immunol. 16, 553-565 (2016).
  6. Bernier, L. P., et al. Microglial metabolic flexibility supports immune surveillance of the brain parenchyma. Nat. Commun. 11, 1559(2020).
  7. Bernier, L. P., York, E. M., MacVicar, B. A. Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function. Trends Neurosci. 43, 854-869 (2020).
  8. Geric, I., et al. Metabolic reprogramming during microglia activation. Immunometabolism. 1, e190002(2019).
  9. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol. Cells. 47, 100095(2024).
  10. Zhang, Z., et al. Glutamine metabolism modulates microglial NLRP3 inflammasome activity through mitophagy in Alzheimer’s disease. J. Neuroinflammation. 21, 261(2024).
  11. Wang, L., et al. Glucose transporter 1 critically controls microglial activation through facilitating glycolysis. Mol. Neurodegener. 14, 2(2019).
  12. Lu, J., Zhou, W., Dou, F., Wang, C., Yu, Z. TRPV1 sustains microglial metabolic reprogramming in Alzheimer's disease. EMBO Rep. 22, e52013(2021).
  13. Orihuela, R., McPherson, C. A., Harry, G. J. Microglial M1/M2 polarization and metabolic states. Br. J. Pharmacol. 173, 649-665 (2016).
  14. Cheng, J., et al. Early glycolytic reprogramming controls microglial inflammatory activation. J. Neuroinflammation. 18, 129(2021).
  15. Kaushik, D. K., et al. Enhanced glycolytic metabolism supports transmigration of brain-infiltrating macrophages in multiple sclerosis. J. Clin. Invest. 129, 3277-3292 (2019).
  16. Hu, Y., et al. mTOR-mediated metabolic reprogramming shapes distinct microglia functions in response to lipopolysaccharide and. Glia. 68, 1031-1045 (2020).
  17. Montilla, A., Zabala, A., Matute, C., Domercq, M. Functional and metabolic characterization of microglia culture in a defined medium. Front. Cell. Neurosci. 14, 22(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Glikoliza w mikroglejutest stresu glikolitycznegometabolizm mikroglejupomiar ECARm zg noworodka myszybod ce prozapalnemetabolizm glukozyszlaki metaboliczne
Badanie glikolizy w mikrogleju pierwotnym za pomocą testu strumienia zewnętrznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.