Indukcja ferroptozy w gliomach przez Calceolarioside A poprzez modulacje szlaku PI3K/Akt/Nrf2

Podsumowanie

To badanie bada potencjał terapeutyczny Calceolarioside A w gliomach, wykazując jego zdolność do hamowania sygnalizacji PI3K/Akt i promowania degradacji Nrf2, wywołując w ten sposób ferroptozę i hamując progresję nowotworową zarówno in vitro, jak i in vivo.

Streszczenie

Ten protokół pokazuje przepływ eksperymentalny stosowany do badania wpływu Calceolarioside A (CaA) na indukcję ferroptozy i modulacje szlaku Fosfoinozytydyloinozitol 3-kinazy (PI3K)/Białka Kinazy B (Akt)/Czynnika nuklearnego erytroidalnego 2-pokrewnego czynnika 2 (Nrf2) w modelach gliomatu. Procedury obejmują serię testów komórkowych na ludzkich liniach gliomatu U251 i U87, aby ocenić żywotność komórek, proliferację i chemowrażliwość po leczeniu CaA. Zmiany związane z ferroptozą są oceniane poprzez pomiar reaktywnych form tlenu (ROS), glutationu (GSH), malondialdehydu (MDA) oraz poziomów żelaza mobilnego, wraz z wykryciem ekspresji białek związanych z ferroptozą, takich jak glutation peroksydaza 4 (GPX4), podjednostka antyportera cysteiny/glutaminianu (xCT) oraz feroproteiny za pomocą zachodzącej blot. Aby ocenić zaangażowanie szlaku, protokół szczegółowo opisuje qRT-PCR, zachodzący blot oraz testy oparte na immunoprecypitacji dla ekspresji i ubikwitynacji Nrf2. Eksperymenty z nadekspresją Nrf2 są zawarte, aby potwierdzić jego rolę w regulacji ferroptozy. Protokół pokazuje również użycie modelu ksenotransplantacji myszy, gdzie komórki U87 są implantowane podskórnie, a następnie podaje się dootrzewnowo CaA, aby ocenić wzrost i toksyczność nowotworu in vivo. Przeprowadzana jest analiza histologiczna głównych narządów w celu oceny bezpieczeństwa układowego. Ponadto do przewidywania bezpośredniego wiązania między CaA a podjednostką PI3K p110α (PIK3CA) stosuje się dokowanie molekularne. Razem, te procedury zapewniają powtarzalną ramę do badania mechanizmów ferroptozy i skuteczności terapeutycznej związków naturalnych w badaniach nad gliomatem.

Wprowadzenie

Gliomy, szczególnie wysoko stopniowe glejaki o wielu komórkach, stanowią jedną z najbardziej śmiercionośnych postaci guzów mózgu, charakteryzujących się szybkim namnażaniem się, opornością na leczenie i złą prognozą¹. W ostatnich latach zbadano różne środki przeciwglejakowe, w tym tradycyjne chemioterapeutyki, takie jak temozolomid oraz szereg naturalnych związków, takich jak kurkumina², resweratrol³ i epigallokatechyna galatowa⁴. Środki te wywierają swoje działanie poprzez wiele mechanizmów, w tym indukowanie apoptozy, hamowanie angiogenesy i modyfikację ścieżek stresu oksydacyjnego. Jednak wiele z tych związków ma ograniczenia, takie jak niska biodostępność lub niekompletne zrozumienie mechanizmu działania. Podkreśla to krytyczną potrzebę opracowania kompleksowych metodologii, które nie tylko potwierdzają działanie przeciwnowotworowe, ale także systematycznie analizują podstawowe mechanizmy farmakologiczne. Opracowanie takich metodologii mechanizmu działania jest szczególnie ważne dla przyspieszenia rozwoju nowych środków przeciwglejakowych od odkrycia do walidacji przedklinicznej.

Aby wspierać ten cel, coraz więcej badań integruje zaawansowane narzędzia obliczeniowe i eksperymentalne, aby zwiększyć rozdzielczość mechanizmu działania^5,6. Projektowanie leków oparte na strukturze i modele sztucznej inteligencji (AI) -- takie jak AlphaFold3 i dokowanie molekularne -- ułatwiają identyfikację obiecujących interakcji leków z celami terapeutycznymi z niespotykaną dotąd szybkością i dokładnością^7,8. Narzędzia te uzupełniają metody eksperymentalne, przewidując powinności wiązania i identyfikując potencjalne molekularne cele przed walidacją w laboratorium. Jednocześnie pojawienie się funkcjonalnych testów opartych na ścieżkach, obrazowania na żywych komórkach i wysokiej rozdzielczości technik proteomicznych pozwala badaczom na ocenę wpływu nowych związków na komórki w wielu osiach regulacyjnych, w tym reakcje na stres oksydacyjny, kaskady przekaźnikowe sygnałów i tryby śmierci komórkowej, takie jak ferroptoza^9,10,11.

Wśród ścieżek sygnałowych zaangażowanych w biologię glejów, ścieżki Fosfoinosytydyloinozitol 3-kinazy (PI3K)/Białka Kinazy B (Akt) i Czynnik 2 związany z erytroidem (Nrf2) są szczególnie interesujące ze względu na ich role w wzroście guza, homeostazie redoks i oporności na terapię^12,13. Sygnalizowanie PI3K/Akt wspomaga przetrwanie, namnażanie się i adaptację metaboliczną w komórkach glejakowych, podczas gdy Nrf2 pełni funkcję głównego regulatora odpowiedzi antyoksydacyjnej, hamując śmierć komórek przez ferroptozę¹⁴. Trwała aktywność tych ścieżek przyczynia się do unikania leczenia, co czyni je atrakcyjnymi celami dla interwencji farmakologicznej¹⁵. Konwencjonalne metody badania ścieżek obejmują western blotting dla białek całkowitych i fosforylowanych, a także qRT-PCR dla analizy ekspresji genów. Jednak głębokie analizowanie sygnalizowania Nrf2 wymaga dodatkowych testów oceniających stabilność białka, translokację do jądra i modyfikacje potranslacyjne, takie jak ubikwitynacja. Te wielowymiarowe strategie wykrywania są niezbędne do zrozumienia, jak określone związki zakłócają lub wzmacniają regulację redoks i kontrolę ferroptozą.

Kalceolariozyd A (CaA), pochodna kwasu hydroksycynamonowego, oferuje podwójny mechanizm, jednocześnie hamując sygnalizowanie PI3K/Akt i wspierając degradację proteasomalną Nrf2, zwiększając w ten sposób wrażliwość na ferroptozę. Ta strategia dwukierunkowego działania może poprawić reproduktywalność i głębokość mechanizmu działania w porównaniu z istniejącymi środkami takimi jak erastyna czy RSL3, które działają poniżej mechanizmów obrony antyoksydacyjnej. Ten protokół przedstawia zintegrowane podejście eksperymentalne do badania mechanizmu farmakologicznego CaA, który obejmuje dokowanie molekularne w celu zidentyfikowania miejsc wiązania PI3K, immunoblotting i immunoprecypitację do wykrywania ekspresji i ubikwitynacji Nrf2 oraz markerów ferroptozy takich jak reaktywne formy tlenu (ROS), glutation (GSH) i malondialdehyd (MDA). Ponadto, model myszy z przeszczepem obcym jest używany do oceny skuteczności terapeutycznej i bezpieczeństwa systemowego CaA. Ta kompleksowa metoda zapewnia reproduktywalną i informacyjną platformę do badania mechanizmu działania środków przeciwnowotworowych, ze szczególnym uwzględnieniem integracji modulacja ścieżek sygnałowych i regulacji śmierci komórkowej.

Protokół

Hodowla komórek i leczenie
Mysie komórki neuronalne HT22 oraz ludzkie linie komórek gliomatu U87 i U251 były hodowane w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium uzupełnionej o 10% fetalnego surowicy wołowej i 4 mM L-glutaminy, w warunkach zwiększonej wilgotności, w 37 °C z 5% CO₂. Aby zapewnić jednorodność eksperymentalną, wszystkie traktowania komórek zostały standaryzowane i opisane poniżej. Ta sekcja opisuje konkretne warunki użyte w każdej grupie leczenia oraz odpowiadające im dalsze analizy.

Leczenie CaA:
Komórki HT22 były traktowane rosnącymi stężeniami CaA (0, 0,1, 0,5, 1, 10, 50, 100, 250 i 500 μM) przez 72 h. Komórki gliomatu U87 i U251 były traktowane CaA w stężeniach 5, 20 lub 50 μM przez 24 h w większości eksperymentów, lub w 50 μM przez 0, 6, 12 lub 18 h w badaniach przebiegu czasowego. Te traktowania zostały użyte w następujących analizach: western blotting dla podjednostki przenośnika cysteiny/glutaminianu (xCT), peroksydazy glutationowej 4 (GPX4), ferotytyny (FTH1), glutaminazy i PI3K/Akt/mammalian target of Rapamycin (mTOR)/ eukaryotic Initiation Factor 4B (EIF4B) (poziomy całkowite i fosforylowane); real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) dla Nrf2 i białka podobnego do Kelch ECH-associated protein 1 (Keap1); pomiar ROS przy użyciu 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA); ilościowe oznaczanie GSH i MDA; wykrywanie Fe²⁺ na bazie FerroOrange; 5-etynylowa-2′-deoksyurydyna (EdU) assay proliferacji; assay formowania kolonii; assay wiabilności komórek 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT).

Współtraktowanie Liproxstatin-1 (Lip1):
Komórki były wstępnie traktowane 50 nM Lip1 przez 2 h przed dodaniem 50 μM CaA. Te warunki zostały użyte w assay MTT (0, 24, 48, 72 h); assay formowania kolonii; assay EdU; assay apoptozy Annexin V/PI (z/bez 20 nM cisplatyny).

Współtraktowanie MG132:
Komórki były traktowane 10 μM MG132 samodzielnie lub w połączeniu z 50 μM CaA przez 24 h. To zostało zastosowane do western blotting dla stabilizacji białka Nrf2 (poziomy całkowite i jądrowe); assay immunoprecypitacyjnych (IP) dla ubiquitinowanego Nrf2 i Keap1.

Współtraktowanie cisplatyną:
Komórki były traktowane 20 nM cisplatyną samodzielnie lub w połączeniu z 20 μM CaA przez 24 h. Te traktowania zostały użyte w assay apoptozy Annexin V/propidium iodide (PI).

Nrf2 nadekspresja:
Komórki były transfekcjonowane 2,5 μg nadekspresyjnego plazmidu Nrf2 lub pustym wektorem za pomocą agenta transfekcjonującego przez 18 h, a następnie traktowane 50 μM CaA przez 24 h. Ta kondycja została użyta w western blotting dla xCT, GPX4, FTH1 i glutaminazy; assay ROS, MDA, GSH; barwienie FerroOrange dla wewnątrzkomórkowego żelaza.

Diagram przepływu pracy (Dodatkowa Figura S1) podsumowuje powyższe warunki eksperymentalne i odpowiadające im analizy. Ta figura wizualnie łączy każdy protokół traktowania z jego specyficznymi dalszymi assayami dla lepszej jasności i powtarzalności.

Ocenianie wiabilności komórek
Wiabilność komórek została oceniona za pomocą konwencjonalnej metody kolorymetrycznej MTT, jak wcześniej opisano¹⁶. Komórki HT22, U251 i U87 zostały zasiano do 96-dołkowych płytek hodowlanych i inkubowane przez noc, aby umożliwić przyczepianie. Po zakończeniu okresu traktowania, 15 μL roztworu MTT zostało wprowadzone do każdego dołka, a płytki inkubowano przez 4 h w 37 °C. Następnie medium zostało odrzucone, a 150 μL dimetylosulfonianu (DMSO) zostało dodane, aby rozpuścić uformowane kryształy formazanu. Absorbancja została następnie odczytana na długości fali 490 nm za pomocą czytnika płytek mikroskopicznych. Wyższe wartości absorbancji wskazują na większą wiabilność komórek, podczas gdy zmniejszenie absorbancji sugeruje efekty cytotoksyczne.

Assay inkorporacji EdU
Aby ocenić syntezę DNA i proliferację komórek, assay inkorporacji EdU został przeprowadzony za pomocą zestawu EdU Imaging Kit, jak wcześniej opisano¹⁷. Krótko mówiąc, komórki gliomatu U251 i U87 zostały zasiane do 24-dołkowych płytek. Po traktowaniu, komórki były inkubowane z EdU (końcowe stężenie 10 μM) i uprawiane przez dodatkowe 24 h. Po inkubacji, komórki zostały utrwalane za pomocą 4% paraformaldehydu, a następnie permeabilizowane za pomocą 0,5% Triton X-100 i barwione zgodnie z instrukcjami zestawu. Procent komórek pozytywnych na EdU (proliferujących) został zliczony mikroskopowo fluorescencyjnie i znormalizowany do całkowitej liczby jąder barwionych 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).

Assay formowania kolonii
Do assay formowania kolonii, komórki gliomatu U251 i U87 został

Wyniki

Tłumienie proliferacji i zwiększona wrażliwość chemioterapii komórek U251 i U87 in vitro przez CaA
Rysunek 1A przedstawia strukturę CaA. Po raz pierwszy oceniliśmy cytotoksyczne działanie CaA za pomocą testu MTT na normalnych mysich komórkach neuronowych HT22 i komórkach glialu ludzkiego U251 i U87. W porównaniu z nietraktowanymi komórkami (0 µM CaA), CaA miało minimalny wpływ na żywotność komórek HT22 w stężeniach poniżej 100 µM przez 72 godziny (

Dyskusja

CaA wykazuje przekonujące działanie przeciwnowotworowe w przypadku guza mózgu poprzez unikalne modyfikowanie dwóch krytycznych osi przeżycia: szlaku PI3K/Akt/mTOR oraz mechanizmu obrony Nrf2-ferroptozy. Szlak PI3K/Akt jest często nadmiernie aktywowany w wielomorfnym guzie mózgu (GBM, zmieniony w do ~88-90% przypadków) z powodu utraty PTEN lub aktywacji RTK, co prowadzi do proliferacji i oporności na terapię²⁶. Jednak, atakowanie tego szlaku samo w sobie przyniosło ograniczoną apoptozę w GBM, ponie...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agilent 2100 Bioanalyzer			system elektroforezy kapilarnej
Annexin V-FITC Apoptosis Kit	Roche Diagnostics	11858777001	N/A
AutoDock Tools 1.5.7 (AutoDock Vina)			oprogramowanie do przygotowania dokowania molekularnego (algorytm dokowania)
Calceolarioside A (CaA)	Sigma-Aldrich	SMB00246	N/A
Chem3D			oprogramowanie do modelowania molekularnego
cDNA Synthesis Kit	Vazyme Biotech	R223	N/A
DCFH-DA	Sigma-Aldrich	D6883	N/A
DMEM	Thermo Fisher Scientific	11965092	N/A
DMSO	Merck	D8418	N/A
FerroOrange probe	Dojindo	F374	N/A
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F2442	N/A
Flow cytometer	BD Biosciences	FACSAriaIII Flow Cytometry	Przyrząd do analizowania komórek barwionych Annexin V
Fluorescence microscope	Olympus	IX73	Przyrząd do obserwacji fluorescencji FerroOrange i DCFH-DA
FTH1 antibody	Abcam	ab75973	AB_1310150
GAPDH antibody	Abcam	ab8245	AB_2107448
GLS antibody	Abcam	ab93434	AB_10563527
GPX4 antibody	Abcam	ab125066	AB_10972289
HT22 murine neuronal cell line	AddexBio	C0011008	CVCL_0321
jetPRIME transfection reagent	Polyplus-transfection	114-07	reagent do transfekcji oparty na polimerach
Keap1 antibody	Abcam	ab139729	AB_2732852
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	25030081	N/A
LigPlot+			narzędzie do mapowania interakcji 2D
Lipofectamine 3000	Thermo Fisher Scientific		reagent do transfekcji oparty na lipidach
Liproxstatin-1	Selleck	S7699	N/A
MG132	Selleck	S2619	N/A
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	H1M	Przyrząd do pomiaru absorbancji w badaniu MTT (przy 490 nm)
MTT	Sigma-Aldrich	M5655	N/A
NanoDrop			spektrofotometr UV-Vis do pomiaru mikrowolumenów
Nrf2 antibody	Abcam	ab62352	AB_945626
Nude BALB/c mice	Vital River, China	N/A	IMSR_CRL:028
OptiMeM reduced serum medium
PyMOL			oprogramowanie do wizualizacji molekularnej
QuantStudio 5 Real-Time PCR System
SYBR Green Master Mix	Vazyme Biotech	Q711	N/A
TRIzol Reagent	Thermo Fisher	15596026	N/A
U251 human glioma cell line	CLS Cell Lines Service	300385	CVCL_0021
U87 human glioma cell line	ATCC	HTB-14	CVCL_0022
Ubiquitin antibody	Abcam	ab7780	AB_306981
xCT/SLC7A11 antibody	Abcam	ab175186	AB_2715513