Mapowanie modyfikacji histonów i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych w neuroendokrynnych liniach komórkowych raka płuc z wykorzystaniem CUT&RUN

Podsumowanie

Opisano zoptymalizowany protokół rozszczepienia pod celami i uwalnianie z użyciem nukleazy, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (CUT&RUN-seq) dla neuroendokrynnych linii komórkowych raka płuc z drobnymi komórkami. Umożliwia mapowanie różnych modyfikacji histonów oraz miejsc wiązania czynników transkrypcyjnych (np. E2F7) na poziomie genomu w celu badania deregulacji epigenetycznej i transkrypcyjnej w patobiologii SCLC.

Streszczenie

Białka remodelujące chromatynę oraz czynniki transkrypcyjne (TF) odgrywają kluczową rolę w biologii nowotworów drobnokomórkowego raka płuc (SCLC). Charakterystyka całego genomu modyfikacji posttranslacyjnych histonów (PTM) oraz miejsc wiązania TF jest kluczowa dla identyfikacji regulatorowych elementów DNA i szlaków genowych, które doprowadzą do głębszego mechanistycznego zrozumienia SCLC i wyznaczą cele do interwencji terapeutycznej. Rozszczepienie pod celami i uwalnianie z użyciem nukleazy, a następnie sekwencjonowanie nowej generacji (CUT&RUN-seq) to potężna metoda mapowania specyficznych modyfikacji histonów oraz określania profili wiązania DNA szerokiego zakresu białek in situ w genomie komórkowym. W CUT&RUN NUKLEAZA MIKROKOKOWA (MNaza) połączona z białkiem A/G jest rekrutowana za pomocą przeciwciał do miejsc genomowych białek związanych z chromatyną, gdzie fragmenty DNA są uwalniane z chromatyny objętej po aktywacji i rozszczepieniu MNazy. To lokalne trawienie generuje małe, specyficzne dla locus fragmenty DNA odpowiednie do sekwencjonowania.

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół profilowania modyfikacji histonowych H3K4me3 (związanych z aktywnymi lub otwartymi promotorami) oraz H3K4me1 (związanych z aktywnymi wzmacniaczami), a także czynnika transkrypcyjnego E2F7 w SCLC. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem neuroendokrynnych (NE) modeli komórek SCLC, które zazwyczaj charakteryzują się dużymi jądrami, rzadką cytoplazmą oraz wzrostem jako nieprzylegające agregaty w zawiesinach.

Wprowadzenie

Modyfikacje posttranslacyjne histonów (PTM) oraz czynniki transkrypcyjne (TF) są centralnymi regulatorami ekspresji genów. PTM histonowe, takie jak acetylacja, metylacja, fosforylacja i ubikwitynacja, głównie na ich ogonach N-końcowych, wpływają na strukturę chromatyny ^1,2. W nowotworach histonowe PTM często są dysregulowane, co prowadzi do nieprawidłowej aktywacji onkogenów lub wyciszenia genów supresorów nowotworowych³. TF wiążą specyficzne sekwencje DNA na promotorach lub wzmacniaczach, aby aktywować lub tłumić docelowe geny, często rekrutując enzymy modyfikujące histony koordynujące przebudowę chromatyny⁴. Enzymy, które zapisują, usuwają lub odczytują znaki histonowe, takie jak acetylotransferazy histonowe (HAT), deacetylazy histonowe (HDAC) i metylotransferazy (HMT), często są mutowane lub zaburzone w nowotworach, co czyni je atrakcyjnymi celami terapeutycznymi⁵.

W SCLC zmiany epigenetyczne oraz czynniki transkrypcyjne definiujące linię (LDTF) są kluczowymi czynnikami biologii nowotworów⁶. W przeciwieństwie do mutacji genetycznych, zmiany epigenetyczne, w tym metylacja DNA i modyfikacje histonów, regulują ekspresję genów bez zmiany podstawowej sekwencji DNA. Te modyfikacje mogą wyciszyć geny supresorów nowotworów lub aktywować onkogeny, napędzając agresywne zachowanie SCLC. Na przykład metylotransferaza histonowa KMT2D jest często mutowana z częstotliwością zmian 12,9% w dużej rzeczywistej kohorcie pacjentów SCLC⁷ i odpowiada za monometylację lizyny H3 (H3K4me1), objaw związany z aktywnymi obszarami wzmacniającymi genom. SCLC to choroba molekularnie heterogeniczna. SCLC klasyfikuje się na podtypy molekularne na podstawie różnicowej ekspresji czterech LDTF: homologu achaete-scute 1 (ASCL1), czynnika różnicowania neurogennego 1 (NEUROD1), białka yes powiązanego 1 (YAP1) oraz homeoboksa POU klasy 2 3 (POU2F3). Podtypy neuroendokrynne (NE), w tym ASCL1 i NEUROD1, stanowią około 70-80% przypadków SCLC⁸. Dlatego badanie rozkładu i profili różnych histonowych PTM oraz miejsc wiązania TF w różnych podtypach SCLC może wyjaśnić programy genowe specyficzne dla podtypu, które są podatne na interwencję terapeutyczną.

Tradycyjną metodą identyfikacji histonowych PTM oraz miejsc wiązania białek regulacyjnych specyficznych dla sekwencji na poziomie całego genomu jest sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq)⁹. Jednak ChIP-seq wymaga dużej liczby komórek wejściowych i często zapewnia wysokie tło w całym genomie. W rezultacie ChIP-seq wymaga wysokiego poziomu wzbogacenia docelowego białka, aby odróżnić prawdziwy sygnał od szumu oraz wymaga głębokiego sekwencjonowania dla efektywnej analizy danych. Dodatkowo, sieci formaldehydowe stosowane w ChIP-seq mogą maskować epitopy i generować fałszywie dodatnie miejsca wiązania¹⁰. Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease and then next-generation sequencing (CUT&RUN-seq) to wysokorozdzielcza alternatywa do mapowania histonowych PTM i miejsc wiązania TF in situ w komórkach nienaruszonych. W tej metodzie komórki permeabilizowane są inkubowane przeciwciałem skierowanym na interesujące białko związane z chromatyną, po czym następuje wiązanie białka fuzyjnego A(G)-mikrokokowej nukleazy (MNazy). Następnie indukowane jest ukierunkowane trawienie DNA po obu stronach interesującego białka w warunkach wysokiego i niskosolnego, uwalniając specyficzne fragmenty DNA do oczyszczania. Oczyszczone fragmenty DNA są wykorzystywane do tworzenia bibliotek sekwencjonowania z kodami kreskowymi, które można łączyć do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości 11,12,13,14. W porównaniu do ChIP-seq, CUT&RUN wymaga znacznie mniejszej liczby komórek wejściowych, generuje mniej szumów tła, unika artefaktów sieciowania i wymaga mniejszej liczby odczytów sekwencjonowania – co czyni go szczególnie odpowiednim do badania dynamicznych stanów chromatyny w nowotworach w sposób opłacalny.

Technologia CUT&RUN została opracowana do badania lokalizacji genomowych białek oddziałujących na chromatynę, w tym modyfikacji histonów, miejsc wiązania TF oraz kompleksów związanych z chromatyną, co ujawnia epigenetyczne krajobrazy regulacyjne^11,12. Technika ta umożliwiła szczegółowe analizy architektury wzmacniacza-promotora, regulacji sieci transkrypcyjnej oraz dynamiki stanu chromatyny podczas rozwoju i postępu choroby¹⁵. W badaniach nad rakiem CUT&RUN umożliwia precyzyjne mapowanie znaków histonowych^16,17 oraz zajętości onkogennych czynników transkrypcyjnych, pomagając zidentyfikować programy regulacyjne specyficzne dla linii geneatycznych oraz potencjalne cele terapeutyczne^15,16. Ponadto CUT&RUN może być wykonywany in situ w komórkach, w tym CD8+ T^{cell 17}, a także na próbkach tkanek^18,19.

Aby wykryć genomową lokalizację PTM i miejsc wiązania czynników transkrypcyjnej E2F7 w podtypach SCLC, zastosowaliśmy CUT&RUN-seq do czterech modeli linii komórkowych SCLC NE: H146 i DMS79 (podtyp ASCL1), a także H446 i H82 (podtyp NEUROD1), z mutacjami KMT2D lub bez. Sprofilowaliśmy znak histonowy H3K4me1, modyfikację związaną z wzmacniaczem głównie katalizowaną przez KMT2D, oraz E2F7, który wykazano jako kofaktor ASCL120. Znak histonowy H3K4me3, związany z aktywnymi promotorami, pełnił funkcję kontroli dodatniej, natomiast IgG stanowił kontrolę ujemną.

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół CUT&RUN-seq dla linii komórkowych SCLC NE, oparty na następujących elementach: komercyjnie dostępnym zestawie CUT&RUN (patrz Tabela materiałów), oryginalnej pracy Skene i Henikoffa 11,12,13 oraz naszych własnych optymalizacjach laboratoryjnych.

Protokół

UWAGA: Ten protokół (Rysunek 1) zawiera instrukcje krok po kroku do wykonywania CUT&RUN-seq w liniach komórkowych SCLC NE, które zazwyczaj rosną jako agregaty nieprzylegające lub klastry pływające.

1. Hodowla komórek

1. Utrzymuj linie komórkowe DMS79 (podtyp ASCL1), H146 (podtyp ASCL1), H82 (podtyp NEUROD1) i H446 (podtyp NEUROD1) w 13 mL podmediów RPMI-1640 uzupełnionych o 10% surowicę bydła płodowego (FBS) oraz 1% penicylinę/streptomycynę (patrz Tabelę materiałów) w kolbkach o pojemności 75 mL. Hodować komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%_CO2.
   UWAGA: Wszystkie komórki użyte w tym badaniu zostały zakupione od ATCC i zostały uwierzytelnione za pomocą profilowania krótkich powtórzeń tandemowych.

2. Permeabilizacja komórek

UWAGA: Prawidłowa permeabilizacja komórek jest niezbędna, aby umożliwić swobodne dyfundowanie przeciwciał, pAG-MNazy oraz strawionych fragmentów białka-DNA do komórek. Przed rozpoczęciem protokołu CUT&RUN na nowej linii komórkowej należy przeprowadzić optymalizacje w celu określenia idealnego stężenia cyfrytoniny dla efektywnej permeabilizacji. Najniższe stężenie, aby osiągnąć ponad 95% permeabilizacji (95% komórek "martwych"), powinno być stosowane w protokole CUT&RUN.

1. Umieść 5% zapas digitoniny, inhibitor proteazy i spermydynę na lodzie i pozwól im całkowicie się rozmrozić.
2. Przygotuj bufor płukania zgodnie z Tabelą 1 i trzymaj go na lodzie.
3. Przygotuj roztwór roboczy 0,05% digitoniny, mieszając 10 μL 5% bulionu z 990 μL buforu płukającego. Dokładnie wymieszaj przez wirowanie i trzymaj na lodzie.
4. Generuj serię rozcieńczeń cygitoniny (0,05%, 0,01%, 0,001% i 0,0001%)"poprzez sekwencyjnie rozcieńczanie poprzedniego roztworu do końcowej objętości 1 mL każdej probówki. Wiruj każde rozcieńczenie, zanim przejdziesz do kolejnego. Jednocześnie przygotuj kontrolę z stężeniem dimetylosulfotlenku (DMSO) o stężeniu 0,05% w buforze płukania (łącznie 100 μL; patrz Tabela 2).
   UWAGA: Digitonina i DMSO to niebezpieczne substancje chemiczne. Obchodz się z nimi ostrożnie i wyrzucaj wszystkie odpady do odpowiednio oznaczonego pojemnika na odpady niebezpieczne z zamkniętymi pokrywkami.
5. Trzymaj wszystkie rozpustki rozcieńczające digitoninę i kontrolę DMSO na lodzie do czasu ich użycia.
6. Określ liczbę potrzebnych komórek, mnożąc liczbę warunków permeabilizacji przez liczbę komórek potrzebnych na test. Dodaj dodatkowe 20%, aby zrekompensować zmienność pipetowania (np. przy pięciu warunkach po 5×10^{po 5} komórek, przygotować około 1,2 x 5 x 5 komórek po⁵ komórek).
7. Pobierz wymaganą liczbę hodowanych komórek przez wirowanie w 600 × g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (RT). Ponownie zawiesij pellet w 600 μL 1× PBS (100 μL na stan plus 20% więcej).
8. Wystarczy 100 μL komórek PBS resuspended w pięciu mikrowirówkach o pojemności 1,5 mL – jednej dla każdego stężenia digitoniny i jednej dla kontroli DMSO.
9. Wiruj probówki przy 600 × g przez 3 minuty w RT.
10. Ostrożnie usuń supernatant i ponownie zawiesij każdy pellet w 50 μL odpowiedniego buforu dygamentu lub DMSO.
11. Inkubuj próbki w RT przez 10 minut.
12. Wymieszaj 10 μL obtraktowanych komórek z 10 μL trypan blue i załaduj 10 uL mieszanki na szkiełko do liczenia komórek.
13. Użyj licznika komórek, aby ilościowo określić żywotne komórki (niebarwione) i nieżyjące, przetrwałe komórki dodatnie (zabarwione na niebiesko).
14. Zidentyfikuj najniższe stężenie cyfrytoniny, które generuje największy odsetek komórek trypanowego niebieskiego dodatniego. Wykorzystaj tę koncentrację w dalszym eksperymencie CUT&RUN. Potwierdź, że kontrola DMSO utrzymuje żywotność typową dla zdrowej hodowli komórek.

3. CUT&RUN seq

UWAGA: Odczynniki w tym protokole są skalowane na 5 reakcji, z dodatkowymi dodatkami, aby zrekompensować straty pipetowania. Listę materiałów i sprzętu można znaleźć w Tabeli Materiałów. Zaleca się co najmniej dwie niezależne replikacje biologiczne dla każdego eksperymentu CUT&RUN.

1. Dzień 1
   1. Przygotowanie bufora CUT&RUN
      1. Przygotuj bufor płukania, łącząc bufor pre-wash, inhibitor proteazy 25x oraz 1 milion spermydyny, zgodnie z tabelą 3.
      2. Przygotuj bufor permeabilizacyjny komórek, dodając 5% digitoniny do buforu płukania zgodnie z Tabelą 3.
      3. Przygotuj bufor przeciwciał, dodając 0,4 μL EDTA do 100 μL buforu permeabilizacyjnego komórek z odpowiednim stężeniem digitoniny, jak opisano w Tabeli 3. Włóż przygotowany bufor na lód.
      4. Pozostały bufor permeabilizacyjny komórek przechowuj w temperaturze 4 °C do użycia w drugim dniu.
   2. Aktywacja koralików Concanavalin A (ConA)
      1. Delikatnie ponownie zawiesić zawieszenie koralików ConA, aby zapewnić równomierne rozłożenie.
      2. Przelej 55 μL zawiesiny kulek (11 μL na próbkę) do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
      3. Umieść rurkę na magnetycznym stojaku o pojemności 1,5 mL, aż kulki całkowicie się oddzielą, a następnie pipetuj do usunięcia supernatantu.
      4. Natychmiast przemyj koraliki dwukrotnie 500 μL lodowatego bufora aktywacyjnego kulek (100 μL na próbkę). Ponownie zawiesz kulki delikatnie pipetując przy każdym praniu i użyj magnetycznego stojaka do usuwania supernatantu między praniami.
      5. Po końcowym myciu usuń supernatant i delikatnie ponownie zawiesij aktywowane kulki w 55 μL (11 μL na próbkę) lodowatego buforu aktywacyjnego Bead Activation Buffer.
      6. Wystarczy 10 μL kulek zawieszonych w każdej rurce zestawu 8-paskowego zestawu i trzymać je na lodzie.
   3. Zbieranie komórek i wiążenie ich z aktywowanymi kulkami
      UWAGA: Żywotność komórek jest ważna dla stosunku sygnału do tła. Jednak żywotność linii komórek SCLC NE może być zmienna (70%-90%) ze względu na inherentnie wysoki wskaźnik wymiany komórek oraz preferencję wzrostu jako średnio-duże agregaty w zawiesinach.
      1. Usuń komórki z inkubatora 37 °C i zbadaj je pod mikroskopem, aby zapewnić jakość.
      2. Przełóż zawiesinę ogniwa do stożkowej rurki o pojemności 50 mL i wiruj w 1 000-1 200 × g przez 5 minut w stanie RT.
      3. Aspiruj podłoże z stożkowej rurki i przepłucz granulkę komórki 20 mL 1× PBS.
      4. Ponownie wiruję w wirówce, aspiruję PBS i trawimy granulat z Accutazą przez 3-5 minut w temperaturze 37°C, w zależności od wielkości granula.
      5. Zakończ trawienie, dodając 5 mL PBS + 10% FBS. Uzyskaj zawiesinę pojedynczą, delikatnie pipetując w górę i w dół pipetą serologiczną.
      6. Wiruj ogniwa w 1 000-1 200 × g przez 5 minut, odrzuć supernatant i ponownie zawiesij pellet komórkowy w 5 mL PBS.
      7. Policz komórki początkowe, potwierdzaj żywotność i integralność komórek.
      8. Oblicz całkowitą liczbę potrzebnych komórek, mnożąc liczbę reakcji przez liczbę komórek na reakcję (5×10⁵). Dodaj 20% nadmiaru, aby zrekompensować błędy pipetowania (np. 1,2 × 6 × 5 × 10⁵ dla 6 reakcji). Przenieś obliczone zawiesiny do probówek o pojemności 1,5 mL. Wirówka przy 600 x g, 3 minuty w RT.
         UWAGA: Przygotuj co najmniej jedną dodatkową reakcję jako zapas.
      9. Ponownie zawiesz komórki w buforze RT Wash Buffer o gęstości 5×10^{5 komórek} na reakcję (łącznie sześć reakcji), używając 100 μL na reakcję, delikatnie, ale dokładnie pipetuj, aby zapewnić równomierną zawieszinę. Wirówka w 600 x g przez 3 minuty w RT. Pipeta usuwa supernatant.
      10. Powtórz krok mycia (Krok 9) jeszcze raz.
      11. Należy 100 μL wypłukanych komórek do każdej rurki w zestawie 8-paskowym zawierającym 10 μL aktywowanych kulek CoA. Delikatnie pipetuj do mieszania i szybko obróć w mini wirówce, aby zebrać zawiesinę (kulki nie powinny się osiadać).
      12. Inkubuj zawiesinę z komórek kulek przez 10 minut w RT, aby komórki mogły się związać z kulkami.
      13. Umieść rurki na stojaku z magnesami w rurkach 0,2 mL, pozwól zawiesinie się oczyścić i pipetuj do usunięcia supernatantu. Zachowaj 10 μL supernatantu, aby potwierdzić, że komórki są związane z kulkami. Usuń pozostały nadmiar i szybko przejdź do kolejnego kroku.
      14. Usuń rurki z magnesu. Natychmiast dodaj 50 μL lodowatego buforu przeciwciał do każdej reakcji i delikatnie pipetuj, aby ponownie zawiesować kulki.
      15. Wymieszaj 10 μL zarówno supernatantu, jak i 10 μL zawiesiny ogniwa/kulki (ponownie zawieszonej w buforze przeciwciał) z 10 μL trypanowego niebieskiego i załaduj mieszankę na ślizg licznika komórek.
      16. Analizuj za pomocą licznika komórek. Potwierdzam, że supernatant prawie nie zawiera koralików ani komórek, a mieszanka koralików i komórek zawiera komórki przepuszczalne otoczone koralikami.
          UWAGA: Ważne jest, aby sprawdzić zgodność wiązania kulek CoA z Cells.
   4. Permeabilizacja i wiązanie przeciwciał
      UWAGA: Sukces CUT&RUN zależy krytycznie od powinowactwa przeciwciała do celu oraz jego specyficzności w określonych warunkach eksperymentalnych. Zalecamy następujące rozwiązanie: 1. Stosowanie komercyjnych przeciwciał zweryfikowanych pod kątem CUT&RUN, gdy są dostępne. 2. Dla celów bez przeciwciał walidowanych przez CUT&RUN rozważ te zweryfikowane pod kątem immunofluorescencji (IF), ponieważ przeciwciała IF rozpoznają epitopy w ich natywnym kontekście komórkowym, podobnie jak wiążenie in situ przeciwciał do celu w komórkach permeabilizowanych w CUT&RUN. 3. Zbadaj równolegle 3-5 przeciwciał, aby wybrać najskuteczniejsze do konkretnego zastosowania.
      1. Szybko obróć panel K-MetStat i pipetować, aby ponownie zawiesić. Dodaj 2 μL panelu K-MetStat do reakcji przeznaczonych na przeciwciała kontrolujące H3K4me3 dodatnie i IgG z ujemną kontrolą. Pipeta do mieszania i szybkie rurki wirujące (opcjonalnie).
      2. Do każdej reakcji dodaj po 0,5 μg przeciwciał H3K4me3, H3K4me1 i IgG oraz 0,6 μg poliklonalnych przeciwciał E2F7 z różnych źródeł do każdej reakcji (Tabela 4). Oznacz rurki z 8 paskami.
      3. Delikatnie pipetuj, aby odpowiednio wymieszać każdą probówkę. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C na nutatorze z podniesionymi korekcjami rur. Nie obracaj ani nie odwracaj rur.
2. Dzień 2
   1. Wiązanie pAG-MNazy z przeciwciałem
      UWAGA: Osiadanie kulek przez noc jest normalne i nie wpływa na efekty. Jeśli koraliki po inkubacji przez noc staną się grudkowate lub lepkie, ponownie je zawiesić poprzez delikatne pipetowanie. Aby poprawić spójność i przepustowość, zaleca się pipetowanie wielokanałowe. Przy użyciu rurek 8-paskowych zdejmuj i wymieniaj bufory po jednym pasku, aby zapobiec wysychaniu kulek ConA.
      1. Postaw stojak magnetyczny na lod.
      2. Wyjmij probówki z 8-paskowej inkubacji 4 °C i szybko zawiruj, aby zebrać płyn.
      3. Umieść rurki na stojaku magnetycznym, aż zawiesina się rozproszy. Ostrożnie pipetuj i usuń supernatant.
      4. Trzymaj rurki na stojaku magnetycznym. Przemyj probówki dwukrotnie 200 μL buforu permeabilizacyjnego z zimnych komórek. Pipeta do usunięcia supernatantu.
      5. Usuń rurki ze stojaka magnetycznego i natychmiast dodaj 50 μL buforu permeabilizacyjnego z zimnych komórek do każdej reakcji. Delikatne pipetowanie, aby ponownie zawiesić komórki/kulki.
      6. Dodaj 2,5 μL pAG-MNazy do każdej reakcji i dobrze wymieszaj przez delikatne pipetowanie.
      7. Inkubuj reakcje przez 10 minut w RT.
      8. Szybko obróć rurki, odłóż je z powrotem na stojak magnetyczny, aż zawiesina się rozproszy. Pipeta do usunięcia supernatantu.
      9. Trzymając rurki na stojaku magnetycznym, myj je dwukrotnie 200 μL buforu permeabilizacyjnego zimnych komórek. Pipeta do usunięcia supernatantu.
      10. Usuń rurki ze stojaka magnetycznego, delikatnie ponownie zawiesz w 50 μL buforu permeabilizacyjnego zimnych komórek. Umieść rurki na lodzie.
   2. Ukierunkowane trawienie i uwalnianie chromatyny
      UWAGA: Wykonaj trawienie zależne od Ca²⁺ w temperaturze 0 °C, aby zminimalizować niezamierzone rozszczepienie DNA¹² przez MNazę. Uwzględnij DNA z impulsem, takie jak Escherichia coli (E. coli), tak aby stanowiło około 0,5-5% (idealnie ~1%) całkowitego sekwencjonowania (¹³). DNA spike-in jest wykorzystywane do normalizacji głębokości sekwencjonowania i jest szczególnie istotne przy porównywaniu próbek w serii, na przykład przy ocenie globalnych zmian modyfikacji histonów po hamowaniu lub genetycznym usuwaniu enzymów modyfikujących histony.
      1. Dodaj 1 μL 100 mM chlorku wapnia do każdej reakcji w 8-tubkowym pasku (od kroku 3.2.1.10) podczas chłodzenia. Delikatnie pipetuj, aby całkowicie zawiesić kulki i zapewnić sprawne trawienie.
      2. Inkubuj rurki na nutatorze w temperaturze 4 °C przez 2 godziny, z uniesionymi końcami na zakrupkach.
      3. W nowej probówce 1,5 mL przygotuj mieszankę Stop Buffer. Dla każdej reakcji połącz 33 μL bufora stopowego z 1 μL DNA spike-in E. coli (0,5 ng). Delikatnie wymieszaj wir.
      4. Dodaj 33 μL bufora stopowego do każdej reakcji po 2-godzinnej inkubacji. Mieszaj delikatnym pipetowaniem.
      5. Inkubuj reakcje w termocyklerze w temperaturze 37 °C przez 10 minut.
      6. Szybkie wirowanie rurek, aby zebrać zawartość na dnie, a następnie umieścić je na półce magnetycznej, aż roztwór stanie się przezroczysty.
      7. Ostrożnie przelej około 84 μL supernatantu, który zawiera DNA uwolnione przez CUT&RUN, do świeżych probówek 1,5 mL.
   3. Oczyszczanie DNA za pomocą zestawu do oczyszczania DNA (patrz Tabela materiałów)
      UWAGA: Przed pierwszym użyciem dodaj 6,9 mL izopropanolu do buforu wiążącego DNA oraz 20 mL ≥ 95% etanolu do buforu DNA Wash.
      1. Do każdego pobranego supernatantu dodaj 420 μL buforu wiążącego DNA. Krótko przemieszaj wir, żeby dokładnie wymieszać.
      2. Włóż kolumnę do czyszczenia DNA do probówek.
      3. Załaduj każdą próbkę do odpowiadającej kolumny.
      4. Wirówka przy 16 000 × g przez 30 sekund w RT. Usuń przepływ i zwróć kolumnę do probówki zbierającej.
      5. Dodaj 200 μL buforu DNA do każdej kolumny i wiruj w 16 000 x g przez 30 sekund w RT. Usuń przepływ i włóż kolumnę do probówki zbiorczej.
      6. Powtórz proces prania raz.
      7. Ponownie wiruj przy 16 000 x g przez 30 sekund w RT, aby całkowicie usunąć pozostałości buforu płukania.
      8. Przełóż kolumny do oznaczonych probówek 1,5 mL.
      9. Nałóż 12 μL Buforu Elution bezpośrednio na błonę w centrum kolumny.
      10. Inkubuj przez 5 minut w RT, a następnie wiruj w 16 000 × g przez 1 minutę w RT, aby wyludzić DNA.
          UWAGA: To jest bezpieczny punkt postoju. Przechowuj wydzielone DNA w temperaturze -20 °C na potrzeby dalszego przetwarzania.
   4. Analiza ilościowa DNA metodą CUT&RUN, a rozkład rozmiarów fragmentów
      UWAGA: Ilościowo zlokalizuj DNA za pomocą fluorometru z zestawem dsDNA High Sensitivity Astest Kit, który zapewnia dokładniejsze pomiary dwuniciowego DNA niż metody oparte na absorpcji.
      1. Użyj 1 μL każdej próbki do określenia stężenia CUT&RUN DNA za pomocą zestawu dsDNA High Sensitivity Astest Kit (patrz Tabela materiałów).
      2. Wykorzystaj dodatkowy 1 μL DNA do oceny obecności i rozkładu wielkości rozszczepionych fragmentów. Wykonaj analizę fragmentów za pomocą zestawu DNA o wysokiej czułości (patrz Tabela materiałów) zgodnie z wytycznymi producenta (opcjonalnie).
         UWAGA: Na tym etapie można łatwo wykryć bardzo obfite białka wiążące, takie jak modyfikacje posttranslacyjne histonów (PTM). Jednak czynniki transkrypcyjne o niskiej obfitości mogą być trudniejsze do wykrycia.
   5. Konstrukcja biblioteki, analiza fragmentów i sekwencjonowanie
      UWAGA: Całkowite CUT&RUN, ≤5 ng DNA, określone przez kwantyfikację dsDNA High Sensitivity Assay Kit, zostało użyte do budowy bibliotek sekwencjonowania nowej generacji (NGS) CUT&RUN. Aby zminimalizować zużycie dimerów adaptera, zmniejsz zużycie adaptera z Illumina do 1 μL dla ligacji adaptera. Liczbę cykli PCR podczas budowy biblioteki można dostosować w zależności od ilości wejścia, wydajności biblioteki oraz szybkości duplikacji. Różne metody doboru wielkości wielkości kulek magnetycznych (patrz Tabela materiałów) mogą być stosowane w zależności od PTM lub czynników transkrypcji typu PTM lub czynników transkrypcji do celów histonowych.
      1. Budowa biblioteki została zbudowana przy użyciu zestawu przygotowawczego CUT&RUN (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta zestawu, z drobnymi modyfikacjami. Krótko mówiąc, 5 ng DNA CUT&RUN zostało użyte jako zalecane wejście do przygotowania biblioteki. Dla DNA poniżej 5 ng używaj jak najwięcej do przygotowania biblioteki. Dla każdej próbki zastosowano podwójne zapalniki indeksowe i5 i i7, aby zapewnić skuteczne sekwencjonowanie multipleksowane.
         UWAGA: To jest bezpieczny punkt postoju. DNA może być przechowywane w temperaturze -20°C do dalszego przetwarzania.
      2. Zmierz stężenie biblioteki CUT&RUN fluorometrem oraz zestawem dsDNA High Sensitivity Astest Kit. Rozkład rozmiarów bibliotek CUT&RUN NGS został określony za pomocą zestawu DNA o wysokiej czułości (patrz Tabela materiałów) na podstawie przewodnika zestawu DNA o wysokiej czułości lub porównywalnego instrumentu do elektroforezy kapilarnej TapeStation (patrz Tabela materiałów).
         UWAGA: Rozcieńcz bibliotekę CUT&RUN, aby stężenie mieszczące się było w zakresie detekcji zestawu dsDNA High Sensitivity Astest Kit oraz High Sensitivity DNA Kit.
      3. Biblioteki pul (40-46) oparte na równych indeksach molekularnych i unikalnych. Po oczyszczeniu DNA Wybór rozmiaru kulek magnetycznych, sekwencjonowanie parowe (długość odczytu 100 bp) dla bibliotek połączonych zostało przeprowadzone na systemie Illumina NovaSeq 6000 dla połowy S-Prime (SP) przy szacowanej głębokości odczytu 10 milionów odczytów na bibliotekę.
   6. Analiza danych CUT&RUN
      1. Analizuj dane CUT&RUN za pomocą niestandardowego potoku (rysunek 5A). Oceń jakość odczytu za pomocą FastQC. Usuń sekwencje adapterów z początku odczytów za pomocą Cutadapt. Align odczytuje pary na końcu z genomem człowieka (hg38) oraz genomem referencyjnym E. coli z Bowtie2. Użyj Samtools, aby usunąć niemapowane odczyty. Usuń zduplikowane odczyty za pomocą Picarda i generuj pliki bedGraph za pomocą Bedtools. Tworz pliki bigWig (bw) za pomocą DeepTools. Wizualizuj dane za pomocą IGV i DeepTools. Normalizuj całkowitą liczbę odczytów do liczby odczytów E. coli z wybuchem. Wykonaj wywołanie szczytowe za pomocą SEACR (Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN)¹⁹.

Wyniki

Typowe lub "klasyczne" linie komórkowe SCLC NE charakteryzują się dużymi jądrami, skąpą cytoplazmą oraz wzrostem jako nieprzylegające agregaty lub zwarte sferoidy w zawiesie. Linie komórkowe o wysokiej wartości ASCL1, takie jak NCI-H146 i DMS79, oraz linie komórkowe o wysokiej wartości NEUROD1, takie jak NCI-H82 i H446, wykazują klasyczny fenotyp SCLC: komórki małych i średnich z niewielką cytoplazmą, drobno ziarnistą chromatyną i tendencją do wzrostu głównie jako nieprzylegające agregaty lub zwarte sferoidy. Chociaż mod...

Dyskusja

Zaburzenia epigenetyczne i LDTF są kluczowymi czynnikami biologii nowotworów SCLC⁶. Określenie genomowego rozkładu specyficznych modyfikacji histonowych i białek wiążących DNA w SCLC może ujawnić potencjalne mechanizmy nabytej oporności terapeutycznej i plastyczności fenotypowej. CUT&RUN-seq to potężna metoda mapowania interakcji białek histon-DNA oraz nie-histonowych z wysokorozdzielczością¹⁴ z komórek i tkanek. Protokół ten stanowi skuteczną i niskokosztową alternatywę dl...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
odczynnik
RPMI-1640 media	Gibco ThermoFisher Scientific	11875093	Pożywka hodowla komórkowa
Serum bydła płodu (FBS)	Neuromika	FBS002-HI	Składnik pożywki hodowli komórkowej
1% penicylina-sstreptomycyna	Gibco ThermoFisher Scientific	15140122	Antybiotyki, aby zapobiec zakażeniu hodowli komórkowych bakteryjnie
Roztwór Trypan Blue 0,4%	Gibco ThermoFisher Scientific	15250061	Trypan Blue Staining został użyty do oceny przepuszczalności za pomocą zautomatyzowanego licznika komórek.
Roche cOmplete, koktajl inhibitorów Proease bez EDTA	Roche	11873580001	Inhibitor proteazy. Składniki bufora płukania
5% Digitonin	EpiCypher	21-1004	Komponenty buforowe  a przepis na bufor można znaleźć w arkuszu buforowym
Bufor aktywacyjny kulek	EpiCypher	21-1001	Komponenty buforowe  a przepis na bufor można znaleźć w arkuszu buforowym
Koraliki Concanavalin A (ConA)	EpiCypher	21-1401	Mikrosfery paramagnetyczne sprzężone z ConA to magnetyczne kulki pokryte lektyną, które umożliwiają wiązanie błony lipidowej
CUT& RUN Kit	CUTANA ChIC EpiCypher	14-1048	Odczynniki dla CUT& Generowanie DNA w RUN
Zestaw do oczyszczania DNA	CUTANA  EpiCypher	14-0050	Wyodrębnić DNA z uwolnionych fragmentów docelowego DNA w supernantcie w reactIon
CUT& RUN Library Prep Kit	CUTANA EpiCypher	14-001	Wygeneruj CUT& Biblioteki sekwencjonowania nowej generacji (NGS) RUN
Oczyszczanie DNA Magnetyczne Koraliki	Agencourt AMPure XP Beckman Coulter	A63880	Czyszczenie produktów PCR i wybór rozmiarów (np. usunięcie dimera i podkładu z adaptera)
E. coli Spike-in DNA	EpiCypher	18-1401	Używany jako egzogenny spike-in do kalibracji odczytów sekwencjonowania na serii próbek— na przykład choroby leczone kontra nieleczone
pAG-MNase	EpiCypher	15-1016	Po wiązaniu się z pierwotnym przeciwciałem enzym rozszczepia docelowy fragment DNA po obu stronach związanego białka, gdy zostanie aktywowany przez wapń
PBS PH7.4 1x	Gibco (Thermo Fisher Scientific)	10010-049	Komórki płuczące
Bufor przed płukaniem	EpiCypher	21-1002	Komponenty buforowe  a przepis na bufor można znaleźć w arkuszu buforowym
dsDNA Wysoka czułość  Zestaw do testowania	QubitTM Thermo Fisher Scientific	Q32854	CUT& Ilościowość DNA RUN
Bufor Stop	EpiCypher	21-1003	Komponenty buforowe  a przepis na bufor można znaleźć w arkuszu buforowym
Zestaw DNA o wysokiej czułości	Agilent Technoligies	5067-4626	CUT& Analiza quatyfikacji DNA i NGS w RUN oraz rozkładu rozmiarów fragmentów
materiałowy
Rurki PCR o pojemności 0,2 mL z 8 paskami	EpiCypher	10-0009k	Lampy dla CUT& Reakcje RUN, kompatybilne z lampami 0,2 ml Magnetic Separation Rack
Slajdy LUNA 8-kanałowe	Logos BioSystems INC	L72001	Slajdy do liczenia komórek i Sprawdzanie żywotności i integralności komórek
Wielokanałowy rezerwuar odczynnikowy	Fisher Scientific	14-387-072	Pojemnik buforowy do mycia
DynaMagTM-2 (szafa separacji magnetycznej), lampy 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	12321D	Kulki ConA były izolowane od bufora magazynowego za pomocą magnetycznego stojaka separacyjnego, a następnie aktywowane przez ponowną zawiesinę w buforze aktywacyjnym w rurce mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
Magnetyczny Rack Separacyjny, lampy 0,2 mL	EpiCypher	10-0008	Stand to separate  Komórki wiążące kulki, przeciwciała, pAG/MNazę z reakcji oraz bufory płuczące
Eppendor Research plus pipeta 8-kanałowa, 0,5-10 uL	Eppendorf	3125000010	Próbki probówek 8-paskowych aspiracji  Aby przyspieszyć przepływ pracy, porównywalny wielokanałowy pipettor
Eppendorf Refrence 2 8-kanałowa pipeta, 30-300 uL	Eppendorf	4926000050	Aspiracja i kroki płukania przyspieszają przepływ pracy, porównywalny wielokanałowy pipettor
Sprzęt
Mieszacz Scientific Industries Vortex-Genie 2, o zmiennej prędkości, 120V	Fisher Scientific	50-728-002	Min-centrifuga i wirowanie
LUNA FX7 Automatyczny licznik komórek	Logos BioSystems INC	L70001	Licznik komórek
Mieszacz nutacyjny	VWR	82007-202	Kroki inkubacji kulek (inkubacja przeciwciał przez noc, reakcja trawienia pAG-MNazy).
Eppendorf 6331 Nexus Gradient MasterCycler Termiczny Cycler	Eppendorf	6331	CUT& Budowa bibliotek RUN nowej generacji
Fluorometr Qubit 4	Thermo Fisher Scientific	Q33226	Ilościowa identyfikacja DNA.
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939A	Analiza wielkości fragmentów, stężenia dla CUT& RUN DNA i CUT& CUT& Biblioteki RUN,  porównywalny instrument do elektroforezy kapilarnej (np. Agilent TapeStation)
Agilent TapeStation	Agilent Technologies	G2992AA	Analiza wielkości fragmentów, stężenia dla CUT& RUN DNA i CUT& CUT& Biblioteki RUN
System Illumina NovaSeq 6000	Illumina, San Diego, CA, USA		Sekwencjonowanie połączonych CUT & RUN libraries