Regulacja szlaku AKT/Wnt/β-katenin oraz indukcja kuproptozy przez kurkuminę w glejaku

Podsumowanie

Kurkumina (CUM) hamuje postęp glejaka (GBM) poprzez wywoływanie kuproptozy poprzez tłumienie osi AKT/Wnt/β-katenina. Protokół ten bada molekularny mechanizm, dzięki któremu CUM hamuje postęp złośliwego w GBM oraz opisuje metody oceny, jak CUM indukuje kuproptozę poprzez modulację tego szlaku.

Streszczenie

Kurkumina (CUM) może regulować złośliwe zachowanie glejaka (GBM). Badanie to sprawdza, czy CUM hamuje progresję GBM poprzez indukowanie koproptozy za pomocą szlaku sygnalizacyjnego AKT/Wnt/β-katenina. Optymalne stężenia kurkuminy ustalono, stosując test MTT. Komórki A172 i U251 były leczone CUM, inhibitorem AKT MK-2206, inhibitorem Wnt LGK974 oraz Elsm-Cu (Elesklomol + CuCl₂). Proliferację, migrację, inwazję i apoptozę komórek oceniano odpowiednio za pomocą barwienia aminoesterów sukcinimidylinowych karboksyfluorescein, testów scratch, testów transwellowych oraz cytometrii przepływowej. Do oceny mitochondrialnego stresu oksydacyjnego i kuproptozy zastosowano fluorescencję MitoSOX, analizę metaboliczną Seahorse, immunofluorescencję, wykrywanie Cu²⁺ oraz western blotting. Oś AKT/Wnt/β-katenin została przeanalizowana za pomocą zestawu reportera TCF/LEF1 oraz western blottingu. Opracowano model ksenoprzeszczepu GBM, a CUM podawano przez gavage przez pięć tygodni. Oceniono wpływ CUM na wzrost guza, kuproptozę oraz ekspresję białek szlaku AKT/Wnt/β-katenin. Komórki były leczone 10 μM i 20 μM CUM in vitro. Leczenie CUM zmniejszało proliferację, migrację i inwazję, jednocześnie sprzyjając stresowi oksydacyjnemu i kuproptozie. CUM również tłumił aktywność sygnalizacji Wnt/β-kateniny. Hamowanie szlaków zwiększyło poziom reaktywnych rodzajów tlenu (3,7-krotnie) i Cu²⁺ (3,1-krotnie) oraz zmniejszyło ekspresję dihydrolipoamidowej acetylotransferazy, co ograniczało zachowania złośliwe. U nagich myszy CUM istotnie zmniejszało wzrost guza, promowało kuproptozę i hamowało aktywację osi AKT/Wnt/β-katenina. Nasze wyniki wskazują, że CUM tłumi sygnalizację AKT/Wnt/β-kateniny, sprzyja kuproptozie i zakłóca postęp GBM.

Wprowadzenie

Glejak jest najczęstszym pierwotnym wewnątrzczaszkowym złośliwym guzem w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN)^1. Glejak stopnia 4 zazwyczaj odnosi się do glejaka (GBM), z niskim rokowaniem². GBM to wysoce inwazyjny guz mózgu, odpowiadający za prawie 50% nowotworów w OUN, z medianą przeżycia poniżej 1 roku^{i 3}. Jest znany z wysokiej zachorowalności na nowotwory i wysokiego wskaźnika nawrotów ^4,5. Obecnie strategie leczenia GBM opierają się głównie na operacjach, uzupełnionych radioterapią, chemioterapią i innymi kompleksowymi metodami leczenia⁶. Chociaż nowe strategie terapeutyczne, takie jak immunoterapia, bioterapia i nanomedycyna, osiągnęły znaczące wyniki w badaniach przedklinicznych ^7,8, ogólny wskaźnik przeżycia przez 5 lat pozostaje jedynie na poziomie 4,3^%. Najczęściej stosowanym schematem chemioterapii jest znany schemat Stuppa; jednak u pacjentów z GBM z niemetylowanym MGMT ogólny wskaźnik przeżycia nie jest istotnie wydłużony¹⁰. Dlatego eksplorowanie nowych strategii leczenia ma kluczowe znaczenie dla wydłużenia okresu przeżycia pacjentów. Badania te zakładają, że mechanizm przeciwnowotworowy kurkuminy (CUM) na GBM wiąże się z kuproptozą.

Nieprawidłowy metabolizm miedzi lub uszkodzenia komórek wywołane przez miedź mogą prowadzić do serii chorób¹¹. W konwencjonalnych warunkach redoksów redukowany Cu⁺ może być utleniany do Cu²⁺. Tsvetkov i in. odkryli wcześniej nieodkryty mechanizm śmierci komórkowej wywołanej przez miedź, zwany kuproptozą. Jony Cu²⁺ wiążą się z asylowanymi związkami, a następnie ekspresja białek klastrowych Fe-S zostaje obniżona, co powoduje śmierć komórek^12,13. Szerokie badania potwierdziły, że kuproptoza jest ściśle powiązana z procesem patofizjologicznym guzów^14,15. LNCRNNA i geny związane z kuproptozą stanowią potencjalne biomarkery dla prognozowania i leczenia GBM¹⁶. BCMD może uwalniać Cu²⁺, wywoływać kuproptozę i wywoływać immunogenną śmierć komórek w leczeniu GBM¹⁷. Dlatego uważamy, że kuproptoza może być nowym celem terapii GBM. Jednak większość istniejących schematów opiera się na syntetycznych nośnikach, takich jak Elesclomol-Cu, lub bezpośredniej indukcji jonów miedzi o wysokim stężeniu. Chociaż ta egzogenna, drastyczna interwencja może udowodnić koncepcję kuproptozy, jej perspektywy transformacji klinicznej są ograniczone ze względu na brak fizjologicznej korelacji i celowania. Dlatego poszukiwanie naturalnych lub małocząsteczkowych związków, które endogennie i precyzyjnie regulują kuproptozę GBM oraz wyjaśniają mechanizm sygnalizacji upstream, stało się kluczowym pomostem między tym nowym mechanizmem a leczeniem klinicznym.

Medycyna chińska jest powszechnie uważana za cenne źródło badań nad lekami przeciwnowotworowymi. CUM to substancja polifenolowa pozyskiwana z tradycyjnej medycyny chińskiej – kurkumy. Współczesna farmakologia potwierdziła, że ma on właściwości przeciwutleniające, przeciwzapalne i przeciwnowotworowe. CUM ma wiele działań przeciwnowotworowych. Może zmniejszyć aktywność komórek GBM poprzez promowanie apoptozy, zaburzenia szlaków wielocząsteczkowych i inne mechanizmy¹⁸. Eksperymenty in vitro wykazały, że niska dawka CUM w połączeniu z napromieniowaniem może synergicznie wzmacniać proliferację antyGBM. Ponadto CUM może regulować podstawowe szlaki związane z GBM, w tym MAPK²⁰. W porównaniu z tradycyjną chemioterapią temozolomidową (TMZ), CUM wykazuje unikalne korzyści terapeutyczne. Skuteczność temozolomidu jest często ograniczona przez silne mechanizmy naprawy DNA w GBM, co prowadzi do oporności na leki; mechanizm, dzięki którego CUM indukuje kuproptozę poprzez celowanie w metabolizm mitochondrialny^21,22, jest niezależny od TMZ. CUM może nie tylko regulować procesy metaboliczne związane z kuproptozą, ale także jednocześnie zakłócać wiele kluczowych szlaków sygnalizacyjnych związanych z postępem GBM, dając potencjalne możliwości przezwyciężenia ograniczeń pojedynczych terapii i opracowania strategii leczenia łącznego. Zakres stężeń CUM użyty w tym badaniu (10-20 μM) jest zgodny z efektywnymi stężeniami zgłaszanymi w przedklinicznych badaniach leczenia²³. Chociaż wrodzona niska biodostępność CUM w ustach oraz jego efektywność dostarczania przez barierę krew-mózg są kluczowymi wyzwaniami w praktycznych zastosowaniach, nowe systemy dostarczania nano-technologii oraz ukierunkowane strategie modyfikacji dostarczyły obiecujących rozwiązań do przezwyciężenia tego wąskiego gardła²⁴.

Chociaż proapoptotyczne, antyproliferacyjne i hamujące migrację działanie CUM w GBM zostało opisane w wielu ^{badaniach 25,26}, większość istniejących badań koncentruje się na jego wpływie na tradycyjne szlaki apoptozy lub autofagii. Celem tego badania jest wyjaśnienie, czy CUM hamuje złośliwy postęp GBM poprzez regulację kuproptozy. Badałyśmy, czy CUM może częściowo wywołać kuproptozę poprzez tłumienie osi AKT/Wnt/β-katenina, co hamuje GBM. Na tej podstawie badanie to dostarcza eksperymentalnych podstaw CUM do poprawy leczenia GBM oraz do opracowania nowych celów w terapii GBM.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach były wykonywane zgodnie z ustalonymi standardami instytucjonalnymi dotyczącymi humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych i zostały formalnie zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet Etyki Zwierząt. Podjęto działania mające na celu zmniejszenie dyskomfortu i niepokoju zwierząt, kiedy tylko było to możliwe.

Prace związane ze związkami chemicznymi, barwnikami i próbkami biologicznymi były zgodne z ustalonymi praktykami bezpieczeństwa biologicznego, aby ograniczyć potencjalne ryzyko. Potencjalnie niebezpieczne substancje – w tym paraformaldehyd, odczynniki na bazie miedzi i DHE – były traktowane przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego, w tym rękawiczek, masek i okularów ochronnych. Wszystkie odpady, takie jak zużyte odczynniki i skażone jednorazowe przedmioty, zostały rozdzielone do wyznaczonych pojemników na zagrożenia biologiczne, a następnie przetwarzane przez autoryzowane usługi zarządzania odpadami niebezpiecznymi zgodnie z instytucjonalnymi i środowiskowymi przepisami bezpieczeństwa. Ogólny projekt eksperymentalny przedstawiono na Rysunku 1.

Rysunek 1: Przepływ pracy tego badania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Hodowla komórkowa i grupowanie
Prawidłowe ludzkie astrocyty mózgowe (NHA) oraz linie komórkowe glejaka A172, U251, LN229 i SHG-44 (patrz Tabela materiałów) zostały hodowane w pożywce DMEM zawierającej 10% surowicy płodowej bydła (FBS) i przechowywane w inkubatorze w temperaturze 3 °C z 5% CO₂. Medium zmieniano co drugi dzień, a komórki były przepuszczane, gdy osiągały około 80% konfluencji. Odpowiednia dawka i czas ekspozycji na CUM zostały określone za pomocą testu MTT. Komórki NHA, A172, U251, LN229 i SHG-44 były leczone różnymi stężeniami (0, 2,5, 5, 10, 20 i 4 μM) CUM przez 24, 48 i 7 godzin, odpowiednio²³. Następnie dodano 2 μL roztworu MTT. Po wtopie dodano 15 μL dimetylosiarkowodorku do każdego otworu i delikatnie wymieszano. Gęstość optyczna (OD) przy 45 nm była mierzona za pomocą czytnika mikropłyt. Nieleczone komórki (grupa kontrolna) były wykorzystywane jako negatywne kontrolne we wszystkich eksperymentach.

Komórki A172 i U251 zostały zasiane i podzielone na grupy: kontrolne, CUM niskodawkowe (1 μM), CUM w wysokiej dawce (2 μM), inhibitor AKT (MK-2206), inhibitor AKT + inhibitor Wnt (MK-2206 + LGK974) oraz Elsm-Cu (Elesclomol + CuCl₂), w zależności od warunków leczenia. Komórki z grup CUM były traktowane 10 lub 2 μM CUM przez 4 godziny. Komórki z grupy MK-2206 otrzymały 1 μM MK-2206 na 2 godziny. Komórki z grupy MK-2206 + LGK974 były leczone μM LGK974 dla h, po ekspozycji na MK-2206. Komórki grupy Elsm-Cu były traktowane 100 nM Elesclomolem i μM CuCl₂ przez 4 godziny^{i 14} godzin.

Cytometria przepływowa
Hodowane komórki A172 i U251 w każdej grupie były inkubowane PBS zawierającym 1 μg/mL roztwór PI przez 1 minutę. Komórki następnie poddano leczeniu 0,25% trypsyną i pobrano przez wirowanie (20 × g, min, temperatura pokojowa). Komórki PI-dodatnie wykryto za pomocą cytometru przepływowego z kanałem PE (wzbudzenie przy 488 nm), a wskaźnik śmierci komórek obliczono^{na 27}.

Badanie karboksyfluoresceiny sukcinimidyl-aminoesteru (CFSE)
Komórki A172 i U251 były inkubowane barwnikami CellTrace CFSE w temperaturze 3 °C przez 1 minutę w ciemności. Następnie podłoże zostało zneutralizowane, a komórki wirowane w temperaturze 20 × g przez minimum w temperaturze pokojowej. Po zebraniu komórki były hodowlane i traktowane według ich grup. Intensywność fluorescencji CFSE została przeanalizowana za pomocą cytometrii przepływowej (wzbudzenie przy 488 nm)²⁷.

Test formowania klonów komórkowych
Hodowane komórki A172 i U251 zostały strawione, ponownie zawieszone i policzone. Dodano dwa mililitry przygotowanej zawiesiny ogniwowej. Po delikatnym mieszaniu komórki były inkubowane przez około 14 dni. Komórki były następnie utrwalane 4% paraformaldehydem przez 3 minuty, a utrwalacz został odrzucony. Po barwieniu 0,1% kryształowym fioletem. Wykonano zdjęcia kolonii, a tempo formowania klonów obliczono^{na 14}.

Test zarysowania komórki
Komórki A172 i U251 (1 × 10^{6 komórek} /dołek) były hodowane aż do osiągnięcia 90% współbycia. Monowarstwa komórki została raz porysowana sterylnym końcówką 2 μL do stworzenia rany, a następnie poddana różnym stężeniom CUM przez h i 48 h. Obrazy były wykonywane mikroskopem. Szybkość gojenia zadrapań została oceniona za pomocą oprogramowania ImageJ. Obrazy były konwertowane do formatu 8-bitowego, ustawiano jednolity próg rozróżniający obszar zarysowania od obszaru komórki, a obszary zarysowania w godzinach 0 i 48 godzin obliczano za pomocą funkcji Analizuj cząstki . Szybkość leczenia po scratchu (%) = (0 h dystansu − 48 h) / 0 h dystansu × 100%²³.

Eksperyment z transwellem
Komórki A172 i U251 zostały poddane określonym zabiegom, następnie enzymatycznie odłączone i odwirowane w dawce 200 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Komórki zostały ponownie zawieszone w medium wolnym od surowic. Matrigel rozcieńczono w stosunku 1:8 w medium bezsurowicowym, dokładnie wymieszano, a następnie nałożono 5 μL do górnej komory wkładki Transwell, po czym wykonano 4-godzinną inkubację. Łącznie do komory górnej dodano 5 × 10^{4 komórek} na odwiert, natomiast 60 μL medium uzupełnionego 20% FBS umieszczono w dolnej komorze. Po 48 godzinach inkubacji komórki zostały utrwalone paradehydem i barwione kryształowym fioletem. Z centrum i obrzeży każdego odwiertu wybrano pięć pól widzenia. Komórki były obserwowane i obrazowane pod mikroskopem. Inwazyjne komórki obliczono na podstawie ImageJ. Obrazy były konwertowane do formatu 8-bitowego, stosowano progi odróżniające komórki zabarwione od tła, a funkcja Analyze Particles liczyła komórki, które przeszły przez membranę,²³.

Wykrywanie potencjału błony mitochondrialnej (MMP)
Hodowane komórki A172 i U251 w każdej grupie były inkubowane z mL roztworu roboczego JC-1 przez 30 minut w ciemności. Komórki były delikatnie myte za pomocą wstępnie schładzonego buforu JC-1, obserwowane i fotografowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Przy wzbudzeniu 488 nm sygnały polimerowe i monomerowe JC-1 były zbierane odpowiednio za pomocą filtrów emisyjnych 590 nm i 530 nm. Stosunek fluorescencji czerwono-zielonej (agregat JC-1 do monomerów) został przeanalizowany za pomocą oprogramowania ImageJ do oceny zmian MMP²⁸. Zdjęcia kanałów czerwonych i zielonych były wyodrębniane osobno, a średnia intensywność fluorescencji w tym samym obszarze była kwantyfikowana.

Wykrywanie szybkości zużycia tlenu (OCR)
Hodowane komórki A172 i U251 zostały zasiane. Płyta została umieszczona w rozgrzanym analizatorze w temperaturze 3 °C w celu adaptacji. Po adaptacji dodano medium determinujące. Po automatycznej kalibracji płyta była wyważona przez 15-2 minuty w temperaturze 3 °C bez_CO2. Zmierzono bazowe OCR, a program testów został ustawiony tak, aby rejestrować mitochondrialne OCR w określonych odstępach czasu. Dane zostały wyeksportowane do dalszej analizy²⁸.

Wykrywanie fluorescencyjnych sond MitoSOX reaktywnych rodzajów tlenu (ROS)
Komórki A172 i U251 zostały dostosowane do gęstości 1× 10^{4 komórek} /mL, a 1 mL na dołek zostało zasiane w naczyniu konfokalnym, po czym przeprowadzono interwencję lekową. Supernatant komórki został odrzucony, a dodano 1 mL rozcieńczonej sondy MitoSOX (1:1 000). Komórki inkubowano w ciemności w temperaturze 3 °C przez 1 minutę. Sygnał fluorescencji został zarejestrowany za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (wzbudzenie/emisja: 510/580 nm) w celu oceny mitochondrialnych poziomów ROS²⁹.

Immunofluorescencja
Pokrywki były myte raz za pomocą medium kulturowego DMEM. Następnie umieszczano je w płytkach z sześcioma dołkami do zasiewania komórek i interwencji lekowej. Po 24 godzinach komórki zostały utrwalone w 4% paraformaldehydu i następnie zablokowane 5% surowicą bydłą albuminą (BSA) przez 30 minut. Usunięto roztwór blokujący, a rozcieńczone przeciwciała pierwotne skierowane na dihydrolipoamidową acetyltransferazę (DLAT) oraz β-kateninę, a następnie wykonano inkubację przez noc w temperaturze^{°C 30}. Następnie wprowadzono fluorescencyjnie znakowane przeciwciała wtórne, które inkubowano w temperaturze 3 °C przez 30 minut. Jądra komórek były barwione DAPI, a szkiełka montowano za pomocą odczynnika przeciwzanikającego. Obrazy fluorescencyjne były rejestrowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a natężenie sygnału mierzono za pomocą oprogramowania ImageJ. Obrazy były konwertowane na format 8-bitowy, a stosowano stały próg odróżniający sygnały docelowe od szumu tła. Narzędzie Rectangle zostało użyte do wyboru pożądanych obszarów komórek, a średnia intensywność fluorescencji została^{zmierzona na poziomie 27}. Aby zobrazować mitochondria, komórki były leczone 20 nM MitoTracker Red CMXRos przez 30 minut, a następnie stabilizowane paraformaldehydem³⁰.

Zestaw reportera TCF/LEF1 do lucyferazy
Aktywację Wnt/β-katenin w komórkach A172 i U251 oceniono za pomocą zestawu reportera TCF/LEF1 lucyferazy. Wektor reporterowy TCF/LEF zawiera elementy odpowiedzi TATA oraz elementy odpowiedzi na czynnik T/czynnik wzmacniający limfoid (TCF/LEF), umożliwiając pośrednie wykrywanie aktywności transkrypcyjnej β-kateniny poprzez ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP). Hodowane komórki A172 i U251 zostały odwrócone transfekcją wektorem reporterowym TCF/LEF o masie 5 ng. Szesnaście godzin po transfekcji zarejestrowano intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikropłyt z ustawieniami wzbudzenia i emisji odpowiednio 488 i 51 nm, czyli³¹ nm.

Myszy noszące guzy
Dziesięciu samców nagich myszy BALB/c (7 tygodni, 2 ± 2 g) było utrzymywanych w określonych warunkach wolnych od patogenów (2 °C, wilgotność 65%) z nieograniczonym dostępem do standardowego jedzenia i wody. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet Przeglądu Etyki Pierwszego Afiliowanego Szpitala Uniwersytetu Jangcy (nr 2023092; data zatwierdzenia: 18.10.2023).

Aby ustanowić model ksenograftu GBM, komórki A172 (4 × 10^{6 komórek} /mL) zostały zawieszone w medium wolnym od surowicy, a 0,1 mL zostało wstrzyknięte podskórnie w prawy bok każdej myszy. Zwierzęta zostały losowo przypisane do grupy kontrolnej lub grupy leczonej CUM (n = 5 na grupę). Grupa CUM otrzymywała 60 mg/kg kurkuminy dziennie doustnie, podczas gdy grupa kontrolna otrzymywała równą ilość soli fizjologicznej. Średnice guzów były rejestrowane co 7 dni za pomocą zacisku werniera, a objętość guza obliczano według wzoru 1/2 × długości × szerokości² (^{mm 3}). Po 5 tygodniach myszy były usypiane przez zwichnięcia szyjki macicy, a guzy pobierano w warunkach sterylnych do pomiaru masy³².

Analiza TUNEL
Tkanki nowotworowe były utrwalane w 4% paraformaldehydu przez 24 godziny, odwodnione w etanolu, osadzone w parafinie i przecięte z grubością μm. Cięcia były odwoskowane i nawilżane, płukane PBS, traktowane proteinazą K przez 50 minut w celu pobrania antygenów oraz inkubowane z użyciem nadtlenku wodoru 3%. Mieszanina reakcyjna TUNEL była stosowana przez 1 godzinę, po czym mocowano odczynnikiem antyfadowym. Obrazy fluorescencji pozyskiwano mikroskopią, a komórki TUNEL-dodatnie na pole były ilościowo określane za pomocą oprogramowania ImageJ.

Immunohistochemia
Fragmenty guza osadzone w parafinie były wypalane w temperaturze 6 °C, odwoskowane ksylenem i nawodniane przez serię etanolu stopniowego. Pobranie antygenów przeprowadzono przy użyciu podgrzanego buforu EDTA, a następnie wygaszono aktywność endogennej nadoksydazy. Preparaty inkubowano z pierwotnym przeciwciałem przeciw Ki-67 przez noc w temperaturze °C. Po inkubacji z przeciwciałem wtórnym przez 20 minut, cięcia były barwione diaminobenzydyną (DAB) przez 5 minut i kontrastowane hematoksyliną. Po odwodnieniu i montażu żywicom neutralną slajdy były fotografowane pod mikroskopem. Pozytywne barwienie zidentyfikowano za pomocą brązowo-żółtego osadu, a komórki Ki-67 dodatnie zidentyfikowano ilościowo za pomocą ImageJ²⁷.

Barwienie fluorescencyjne dihydroetydem (DHE)
Poziomy ROS oceniano za pomocą barwienia fluorescencyjnego DHE. Zamrożone fragmenty tkanki nowotworowej były płukane PBS. Tłumiono fluorescencję tła, a do każdej sekcji dodawano μM DHE na 3 minuty. Po myciu PBS sekcje zostały zamknięte w ciemności. Fluorescencję obserwowano za pomocą mikroskopu (wzbudzenie/emisja: 518/605 nm), a na każdą grupę zebrano po pięć losowych obrazów. ImageJ był używany do ilościowego określania poziomów ROS.

Wykrywanie zawartości Cu²⁺
Stężenie Cu²⁺ w komórkach GBM i tkankach nowotworowych oceniano za pomocą kolorymetrycznego zestawu detekcyjnego. Komórki A172 i U251, po zabiegu, zostały pobrane i odwirowane w dawce 1 500 × g przez 10 minut w temperaturze °C. Granulki komórkowe zostały ponownie zawieszone w stężeniu 0. mL wody destylowanej, sonikowanej na lodzie i ponownie odwirowanej. Tkanki nowotworowe były homogenizowane w wodzie destylowanej i podobnie wirowane w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Supernatanty (1 μL) zostały przelane na płytkę z 96 dołkami, wymieszane z 23 μL odczynnika chromogenicznego, zamknięte i inkubowane przez 5 minut. Gęstość optyczna (OD) została zmierzona na 58 nm za pomocą czytnika mikropłytek, a poziomy Cu^{2+ obliczono na 14}.

Western Blot (WB)
Białka izolowano z hodowanych komórek i tkanek nowotworowych. Supernatanty uzyskano poprzez wirowanie w stężeniu 12 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C, a stężenia białek określano za pomocą testu BCA. Po denaturacji próbki były rozdzielane za pomocą SDS-PAGE, przenoszone do membran PVDF i blokowane mlekiem odtłuszczonym 5% na 1 godzinę. Błony były myte w TBST i inkubowane przez noc w temperaturze °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko FDX1, LIAS, DLAT, DLD, AKT, p-AKT, Wnt3a, GSK-3β, p-GSK-3β, β-kateninowi, p-β-kateninie oraz β-aktynie (patrz Tabela Materiałów)^14,33. Po kolejnych płukaniach TBST błony były inkubowane przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP przez 1 godzinę, opracowanymi przy użyciu odczynnika ECL i wizualizowanymi za pomocą chemiluminescencji. Oprogramowanie ImageJ zostało użyte do ilościowego pomiaru intensywności sygnału za pomocą narzędzia do wyboru prostokąta oraz funkcji analizy Gels. Relatywna ekspresja białek została obliczona jako stosunek wartości docelowej pasma szarej do kontroli wewnętrznej (GAPDH). Ekstrakty jądrowe z komórek A172 i U251 przygotowywano przy użyciu zestawu do ekstrakcji białek jądrowych. Oceniono ekspresję β-kateniny i laminu B1, przy czym Lamin B1 pełnił funkcję kontroli ładunku jądrowego³⁴.

Analiza statystyczna
Wyniki ilościowe odzwierciedlają średnią trzech niezależnych replikacji. Wszystkie dane zostały ocenione pod kątem normalnego rozkładu i jednorodności wariancji. Jednokierunkowa ANOVA, a następnie test post hoc Tukeya został wykorzystany do porównań między wieloma grupami. Dane przedstawiane są jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Wartość P poniżej 0,05 uznano za statystycznie istotną. Procedury te zostały wykorzystane, aby zapewnić odporność danych i wspierać wiarygodność wniosków.

Wyniki

Hamowanie żywotności komórek GBM i indukowanej śmierci komórki
Po pierwsze, nie zaobserwowano istotnej zmiany żywotności komórek NHA po 2 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach interwencji CUM (rysunek 2A), co wskazuje, że stosowane stężenia CUM nie miały toksycznego wpływu na komórki normalne. Dla porównania, żywotność linii komórkowych GBM (A172, U251, LN229 i SHG-44) była istotnie obniżona przy stężeniach CUM ≥ 1 μM (P < 0,05-0,001) (Rysunek 2B-...

Dyskusja

Częstotliwość nawrotów GBM wiąże się z jego złośliwymi cechami biologicznymi³⁶. CUM wywiera działanie anty-GBM poprzez regulację stresu oksydacyjnego, apoptozy, autofagii, przerzutów, inwazji oraz kluczowych celów molekularnych³⁷. W tym badaniu eksperymenty na poziomie komórkowym wykazały, że CUM istotnie zwiększa śmiertelność komórek GBM oraz hamuje proliferację, tworzenie kolonii, migrację i inwazję – wyniki zgodne z wcześniejszymi raportami²⁰.

...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1% roztwór do barwienia kryształowego fioletu	Servicebio	G1014	Komórki znakujące
4% paraformaldehydu	Beyotime	P0099	Napraw komórki lub tkanki
Inhibitor AKT (MK-2206)	Selleck.cn, Szanghaj, Chiny	S1078	Specyficzny inhibitor AKT
Przeciwciała (pierwotne i wtórne)	ABclonal Technology, Wuhan, Chiny / abcam, Cambridge, Wielka Brytania / Servicebio, Wuhan, Chiny / Beyotime, Szanghaj, Chiny / Cell Signaling, Danvers, MA, USA	A8814, ab32572, GB25303, ab15580, ab108257, ab246917, A8814, AF6708, AA326, 4060, ab219412, 280376, 9322, ab97051, ab229025	Wykrywanie poziomów ekspresji białek
Zestaw do wykrywania apoptozy komórek	Servicebio, Wuhan, Chiny	G1021	Wykrywanie apoptozy
Barwnik CFSE Cell Trace	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	C34570	Wykrywanie proliferacji komórek
System obrazowania chemiluminescencyjnego	Bio-Rad, Hercules, CA, USA	Chemi Doc XRS+	Wykrywanie białka o ultrawysokiej czułości
Cu2+ zestaw do testów kolorymetrycznych	Elabscience, Wuhan, Chiny	E-BC-K300-M	Wykrywanie zawartości Cu2+ w tkankach nowotworowych i komórkach GBM
CuCl2	Sigma-Aldrich, Darmstadt, Niemcy	751944	Induktor kuproptozy
Kurkumina (CUM)	Liść źródłowy Szanghaju, Szanghaj, Chiny	S19245	Związek polifenolowy
Zestaw do wykrywania DHE	Beyotime, Szanghaj, Chiny	S0063	Wykrywanie poziomów ROS
Dimetylsulfotlenek (DMSO)	Servicebio	G4101-2	Rozpuszczalnik do testu MTT
Deweloper ECL	Servicebio	G2161	Używany do Western blot
Elesclomol	Selleck.cn	S1052	Induktor kuproptozy
Cytometria przepływowa	BD Biosciences, New Jersey, USA	BD FACSAria III	Stosowane do testów śmierci komórkowej i CFSE
Mikroskop fluorescencyjny	OLIMP, Tokio, Japonia	IX73	Stosowane do testów immunofluorescencji, ROS, TUNEL, DHE i MMP
Linie komórkowe glejaka A172 (RRID: CVCL_0131), U251 (RRID: CVCL_0021), LN229 (RRID: CVCL_0393) oraz SHG-44 (RRID: CVCL_6902)	Punosai Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Chiny	CL-0012, CL-0237, CL-0578, CL-0207	Linie komórkowe glejaka ludzkiego
Oprogramowanie GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software, LLC	Wersja 9.0	Analiza statystyczna
Oprogramowanie ImageJ 1.53k	Narodowy Instytut Zdrowia Psychicznego	Wersja 1.53k	Obliczenia statystyczne
Rozwiązanie robocze JC-1	Solarbio, Pekin, Chiny	M8650	Wykrywanie MMP
Męskie nagie myszy BALB/c	Slack Kingda Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, Chiny		Eksperyment z myszą
Czytnik mikropłyt	Bio-Tek, Vermont, USA	ELX-800	Dla pomiaru wartości OD450 nm
Mikroskop	OLIMP	BX53	Wykorzystywany do testów zarysów komórkowych, eksperymentu Transwella oraz testów immunohistochemicznych
Sonda MitoSOX	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	M36008	Wykorzystywane do wykrywania ROS
Mitotracker Red CMXRos	Thermo Fisher Scientific	M7512	Specyficzne oznaczanie mitochondriów w komórkach żywych
Zestaw do wykrywania MTT	Servicebio	G4101-1	Wykrywanie żywotności komórek
Normalne komórki NHA w ludzkim mózgu (RRID:CVCL_B0DK)	Huatuo Biotechnology Co., Ltd., Shenzhen, Chiny	HTX2408	Linia komórkowa do eksperymentów kontrolnych
Zestaw do ekstrakcji białek jądrowych	Beyotime	P0027	Ekstrakcja białka jądrowego
Analizator metabolizmu energii komórek konika morskiego	Agilent,   Pekin, Chiny	Seahorse XF	Wykorzystywane do wykrywania OCR
Zestaw reportera TCF/LEF1 do lucyferazy	Biolab Technology Co., Ltd, Pekin, Chiny		Wykrywanie aktywności szlaku sygnalizacyjnego Wnt/β-kateninowy
Zestaw detekcji TUNEL	Beyotime	C1088	Wykrywanie apoptozy w tkankach nowotworowych
Inhibitor Wnt (LGK974)	Selleck.cn	S7143	Specyficzny inhibitor Wnt