Wizualizacja elektrotaksji zależnych od wieku komórek macierzystych pochodzących z ludzkiego tłuszczu pod wpływem pól elektrycznych prądu stałego

Summary

W niewielkiej grupie kobiet dawców starzenie się zmniejszyło elektrotaktyczną migrację hADSC. DCEF zmienił ekspresję genów (747 w górę, 624 w dół), wzbogacając terminy transportu sodu/kanału GO oraz szlaki PI3K-Akt KEGG, sugerując udział w elektrotaksji związanej z wiekiem, nie ustalając przyczynowości.

Abstract

Komórki macierzyste pochodzące z ludzkiego tłuszczu (hADSC) są kluczowe dla regeneracji tkanek i gojenia ran, a ich ukierunkowana migracja jest warunkiem koniecznym do wywierania tych efektów terapeutycznych. Pola elektryczne (EF) są dobrze znane jako kluczowe sygnały kierujące migracją komórek podczas leczenia ran, jednak zachowanie elektrotaktyczne hADSC — zwłaszcza to, jak cechy dawcy (np. wiek) regulują to zachowanie i jego podstawowe mechanizmy molekularne — pozostaje słabo poznane. Ta luka w wiedzy ogranicza optymalne zastosowanie hADSC w medycynie regeneracyjnej. W tym badaniu najpierw potwierdziliśmy istnienie elektrotaksji w hADSC i potwierdziliśmy jej zależność od napięcia: przy polach elektrycznych prądu stałego (DCEF) o napięciu 100-200 mV/mm hADSC migrowały kierunkowo w kierunku anody, przy silniejszych intensywnościach EF, które poprawiały zarówno kierunek migracji, jak i prędkość (w porównaniu do kontroli 0 mV/mm). Następnie porównaliśmy hADSC młodych dawczyń (27,00 ± 4,58 lat) oraz starszych dawczyń (62,33 ± 4,04 lata) za pomocą sekwencjonowania RNA (RNA-seq) po stymulacji DCEF 200 mV/mm. Analiza transkryptomiczna zidentyfikowała 747 genów zwykłych i 624 obniżonych u starszych hADSC, z genami różnicowo ekspresyjnymi (DEG) wzbogaconymi w procesy biologiczne i szlaki krytyczne dla elektrotaksji — w tym transbłonowy transport jonów sodu, aktywność kanału sodowego zależną od napięcia (terminy GO) oraz szlak sygnalizacyjny PI3K-Akt (szlak KEGG). Funkcjonalnie starsze hADSC wykazywały istotnie mniejszą migrację anodalną (zmniejszona odległość akumulowana, odległość euklidesowa i bezpośredniość) w porównaniu z młodymi hADSC pod stymulacją DCEF. Badanie to dostarcza pierwszych dowodów na elektrotaksję zależną od wieku u hADSC, wykazując, że wiek dawcy koreluje z upośledzoną zdolnością elektrotaktyczną. Dodatkowo ujawnia, że zaburzenia aktywności kanałów sodowych i sygnalizacji PI3K-Akt mogą być podstawą tego spadku związanego z wiekiem. Wyniki te wskazują na potencjalne mechanizmy regulacyjne elektrotaksji hADSC i dostarczają nowych wskazówek w zakresie dostosowywania terapii opartych na hADSC (np. wybór optymalnych dawców lub ukierunkowanie na szlaki sodowe/PI3K-Akt) w celu poprawy regeneracji tkanek i gojenia ran.

Introduction

Komórki macierzyste pochodzące z apipozy (ADSC) posiadają silną zdolność samoodnowy oraz znaczący potencjał regeneracyjny. W odpowiednich warunkach indukcyjnych mogą się różnicować na osteoblasty, chondrocyty i adipocyty, między innymi¹. Dzięki sygnalizacji parakrynocznej ADSC może również wspierać powstawanie naczyń krwionośnych i limfatycznych ^2,3, hamować powstawanie blizn⁴ oraz wykazywać efekty regulacyjne układu odpornościowego⁵. Dlatego ADSC jest uważane za idealną komórkę nasienną do terapii komórkowych w medycynie regeneracyjnej.

Funkcja ADSC zależy od różnych cech dawcy, które mogą wpływać na ich potencjalną skuteczność w terapiach komórkowych, w tym wieku dawcy, wskaźnika masy ciała, płci i innych⁶. ADSC pochodzące od starszych dawców wykazują wyraźniejsze cechy starzenia, z obniżonym potencjałem różnicowania adipogennego, potencjałem różnicowania osteogennego oraz zdolnością migracyjną ^7,8,9. Ponadto zdolność do wspierania proliferacji keratynocytów i stymulowania mechanizmów samonaprawy organizmu jest ograniczona¹⁰.

Migracja ukierunkowana na komórki jest kluczowym mechanizmem fizjologicznym w gojeniu ran i regeneracji tkanek, przy czym pola elektryczne (EF) odgrywają ważną rolę w kierowaniu migracją komórek i wspieraniu naprawy ran¹¹. Na przykład, gdy bariera nabłonkowa zostaje uszkodzona, natychmiast generowane są endogenne pola elektryczne, które pozostają utrzymywane aż do zagojenia się rany i przywrócenia funkcji bariery nabłonkowej 12,13,14. Jako jeden z sygnałów kierujących skierowaną migracją komórek, wykazano, że sygnały elektryczne mają wyższy priorytet niż inne współistniejące sygnały, takie jak hamowanie kontaktu, siły mechaniczne oraz czynniki chemotaktyczne^15,16. Opracowano kilka metod wspierających gojenie ran i regenerację tkanek, takich jak leki i zewnętrzne urządzenia do stymulacji elektrycznej, które wzmacniają lub naśladują endogenne pola elektryczne w ludzkim ciele ^17,18. Zdolność komórek do migracji zgodnie z gradientem pola elektrycznego nazywana jest elektrotaksją. Badania in vitro wykazały, że wiele różnych typów komórek jest zdolnych do ukierunkowanej migracji w polach elektrycznych. Niektóre komórki migrują w kierunku anody, takie jak komórki grzebienia czaszkowego ssaków, astrocyty ludzkie oraz ludzkie komórki raka piersi 19,20,21. Inne komórki migrują w kierunku katody, takie jak ludzkie komórki nabłonkowe nerk, ludzkie włóknistości skórne oraz ludzkie neutrofile 22,23,24. ADSC może być kierowane do migracji w kierunku anody w polach elektrycznych prądu stałego (DC), a w warunkach długotrwałych hodowli wykazano, że egzogenny pulsacyjny prąd elektryczny skutecznie promuje kierunku migracji ADSC w stronę anody, jednocześnie utrzymując żywotność komórki²⁵. Do dziś badania dotyczące właściwości elektrotaksji ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu pozostają nieliczne, a mechanizmy regulujące ich zachowanie elektrotaktyczne nie są w pełni poznane.

Jesteśmy pierwszymi badającymi zależne od wieku różnice elektrotaktyczne w hADSC między młodymi a starszymi kobietami w warunkach gradientowych pól prądu stałego (DCEF) oraz dalej odkrywając mechanizmy leżące u podstaw (aktywność kanałów sodowych i sygnalizację PI3K-Akt) za pomocą analizy transkryptomicznej. W tym badaniu analizowaliśmy wpływ DCEF na hADSC. Stosując sekwencjonowanie RNA oraz różnicową analizę wzbogacenia genów, porównaliśmy profile ekspresji genów między dwiema grupami hADSC – pochodzącymi od młodych i starszych dawczyń – po stymulacji DCEF, aby zidentyfikować różnice transkrypcyjne związane z wiekiem. Wysunęliśmy hipotezę, że starzenie się dawcy upośledza elektrotaktyczną reakcję hADSC, a ten związany z wiekiem spadek jest powiązany ze zmianą aktywności kanałów sodowych i sygnalizacją PI3K-Akt.

Protocol

Przed pobraniem tkanek uzyskano świadomą zgodę wszystkich uczestników. Badanie to zostało zatwierdzone przez Komisję Etyczną Pierwszego Afiliowanego Szpitala Chińskiego Uniwersytetu Medycznego (Nr Zatwierdzenia: [2018]2018-110-2). Przed pobraniem tkanek uzyskano pisemną świadomą zgodę wszystkich uczestników

Izolacja i kultura hADSC
Pobieranie tkanek: Podczas rutynowych zabiegów planowej liposukcji wykonywanej w Katedrze Chirurgii Plastycznej Pierwszego Afiliowanego Szpitala Chińskiego Uniwersytetu Medycznego pobrano próbki tkanki tłuszczowej z ciała brzusznego. Wszystkie dawczynie były zdrowymi wolontariuszkami poddawanymi plastycznej liposukcji jamy brzusznej i nie przeprowadzono dodatkowych zabiegów chirurgicznych w celach badawczych. Próbki tkanek były pobierane przez chirurga operacyjnego w warunkach sterylnych bezpośrednio po aspiracji i przekazywane do laboratorium w sterylnych pojemnikach na lodzie w ciągu 30 minut.

Wielkość próby: W tym badaniu wzięło udział łącznie 6 dawców, w tym 3 młodszych dawców (wiek: 27,00 ± 4,58 lat) oraz 3 starszych dawców (wiek: 62,33 ± 4,04 roku).

Przetwarzanie tkanek: Przełóż fragmenty tkanki tłuszczowej do stożkowej rurki o pojemności 50 mL, wiruj w 1800 x g przez 3 minuty w 4 °C i ostrożnie zasysaj górną fazę oleju (aby usunąć nadmiar lipidów). Dodaj 0,2% kolagenazy typu IV (końcowa objętość: 5-10 mL na 1 g tkanki tłuszczowej) do granulki tkankowej, a następnie umieść tubkę w kąpieli wodnej lub inkubatorze o temperaturze 37 °C na 45 minut. Delikatnie mieszaj rurkę co 10-15 minut podczas trawienia, aby zapewnić równomierny kontakt kolagenazy z tkanką. Po trawieniu zakończ reakcję, dodając niskoglukozowy DMEM wzbogacony o 10% FBS oraz 1% penicyliny/streptomycyny (stosunek objętości medium neutralizującego do roztworu kolagenazy = 1:1).

UWAGA: Podczas obsługi kolagenazy należy nosić jednorazowe rękawiczki, fartuch laboratoryjny oraz okulary ochronne, aby uniknąć kontaktu ze skórą i wzrokami, przygotować i użyć odczynnika w szafce bezpieczeństwa biologicznego (BSC), aby zapobiec zanieczyszczeniu aerozolem, a w przypadku wycieku natychmiast przetrzyj 75% etanolem i utylizuj zanieczyszczone materiały jako odpady biologiczne.

Izolacja komórek: Wiruj zneutralizowaną mieszaninę trawienną w 1 200 x g przez 10 minut w 4 °C, aby rozpylić komórki. Usuń supernatant, następnie ponownie zawiesij pellet w buforze lizy erytrocytów (155 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA; pH 7,4; objętość: 2-3 mL na pellet) i inkubuj w temperaturze pokojowej (22-25 °C) przez 5 minut w celu lizy pozostałości czerwonych krwinek. Filtruj zawiesinę komórkową sekwencyjnie przez sita o średnicy 200 μm, aby usunąć niestrawione resztki tkanki i uzyskać zawiesinę pojedynczą.

Liczenie komórek: Przed zasiewem liczbę komórek mierzono za pomocą hemocytometru. Krótko mówiąc, hADSC zostały odłączone z 0,25% trypsyną-EDTA, ponownie zawieszone w podłożu wzrostu i wymieszane w stosunku 1:1 z 0,4% roztworem trypan-blue. Żywotne komórki (niebarwione) były liczone ręcznie za pomocą hemocytometru Neubauera pod mikroskopem świetlnym, a całkowita liczba żywotnych komórek obliczono jako: liczba komórek/mL = (średnia liczba policzonych komórek x współczynnik rozcieńczenia x 10⁴).

Posiew komórkowy: Nasiaj przefiltrowane komórki o gęstości 5 x 10^{3 komórek/cm 2} w podłożu wzrostu (niskoglukozowy DMEM + 10% FBS + 1% penicylina/streptomycyna) i inkubuj w temperaturze 37 °C z 5%_CO2. Wymieniaj podłoże co 2-3 dni, aby usunąć nieprzywierające komórki i utrzymać optymalne warunki hodowla. Wszystkie hADSC użyte w kolejnych eksperymentach — w tym charakteryzacja komórek (wykrywanie markerów powierzchniowych, testy różnicowania trójliniowego), stymulacja DCEF, analiza migracji i morfologii, testy starzenia/proliferacji oraz sekwencjonowanie RNA — znajdowały się na przejściu 3 do przejścia 5.

Charakterystyka hADSC
Ekspresja markerów powierzchni komórek: Hodować komórki do 70% konfluencji, następnie dysocjować komórki przylegające z 0,25% trypsyną-EDTA (inkubować w 37 °C przez 3 minuty). Wiruj zawiesinę ogniwa w 300 x g przez 5 minut w 4 °C, odrzucaj supernatant i ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1x PBS (objętość: 1-2 mL). Zachowaj 1 x 10^{5 komórek} na próbkę (zawieszonych w 100 μL 1x PBS) i dodaj fluorescencyjnie sprzężone przeciwciała przy określonych rozcieńczeniach: anty-CD44 (1:50), anty-CD90 (1:100), anty-CD29 (1:50), anty-CD73 (1:50) oraz anty-CD105 (1:20)^1,4,7. Inkubuj mieszaninę przeciwciał i komórek w temperaturze 4 °C przez 30 minut w ciemności, aby uniknąć hartowania fluoroforem. Po inkubacji wiruj w 1000 x g przez 5 minut w 4 °C i całkowicie zasysaj supernatant. Ponownie zawiesić granulek w 1-2 mL 1x PBS, ponownie wirować w 1000 x g przez 3 minuty w 4 °C, wyrzucić supernatant i powtórzyć ten proces mycia 2 razy, aby usunąć niezwiązane przeciwciała. Na koniec ponownie zawiesić pellet komórkowy w 200 μL świeżego 1x PBS, pobrać dane fluorescencyjne za pomocą cytometru przepływowego i przeprowadzić analizę ilościową za pomocą oprogramowania FlowJo (v10). Przepływ pracy gatetowania przebiegał według standardowych procedur fenotypowania MSC: bramka FSC-SSC do wykluczenia odpadów oraz wybór głównej populacji komórek na podstawie rozmiaru i granularności, a następnie podwójne wykluczenie przy użyciu wykresów FSC-A vs. FSC-H oraz SSC-A vs. SSC-H, aby zapewnić zdarzenia pojedyncze komórki. Następnie przeprowadzono bramkowanie żywych komórek, aby wykluczyć martwe komórki trypan-niebieskie lub PI-dodatnie. Dla kontrolnych osób z pojedynczym barwieniem wykonano bramkowanie fluorescencyjne, a kontrolne bez barwienia stosowano do ustalania progów dla CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 (markery dodatnie) oraz CD34, CD45 (markery ujemne). Reprezentatywne wykresy bramkowe zostały wyeksportowane i przeanalizowane, aby potwierdzić tożsamość hADSC.

Potencjał różniczkowania
Różnicowanie adipogenne: Pobierać hADSC generacji P3 przy 85% konfluencji przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA, następnie zasiewać je na płytkach 24-dołkowych o gęstości 1 x 10⁵ komórek na dołek (używając kompletnego medium DMEM) i inkubować w 37 °C z 5% CO₂ , aż komórki ponownie osiągną 85% konfluencję. Do indukcji użyj zestawu różnicującego adipogenezy, który rekonstytuuje komponent A (induktor adipogenny) i składnik B (podtrzymujący adipogen) zgodnie z instrukcją, i przez pierwsze 3 dni używaj składnika A, zanim przez 1 dzień przejdziesz na składnik B. Powtarzaj ten cykl przez 3 tygodnie. Do barwienia aspiruj medium indukcyjne, delikatnie myj komórki 3 mL 1x PBS (unikaj rozbijania warstw komórkowych), utrwalaj komórki 4% paraformaldehydem (PFA) w temperaturze pokojowej przez 20 minut, a następnie inkubuj w roztworze 0,3% Oil Red O (przygotowanym w 60% izopropanolu) w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Umyj komórki 3x 1x PBS, aby usunąć nadmiar barw, a następnie obrazuj krople lipidowe za pomocą mikroskopu odwróconego światła (20x).

Różnicowanie osteogenne: Nasiaj hADSC w płytkach 12-dołkowych o gęstości 1 x 10⁵ komórek na dołek, a gdy komórki osiągną 85% konfluencję, użyj zestawu do różnicowania osteogenezy do indukcji — rekonstytuuj składnik zestawu A (induktor osteogenny) i składnik B (suplement osteogenny) w niskoglukozowym DMEM (końcowe stężenia: 10% FBS, 1% penicylina/streptomycyna, 0,1 μM deksametazon, 10 mM β-glicerofosforanu, 0,05 mM kwasu askorbinowego-2-fosforanu) i odnawiać podłoże co 3 dni przez 3 tygodnie. Do barwienia utrwalaj komórki 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 15 minut, myj 3x za pomocą 1x PBS, a następnie inkubuj z 2% roztworem Alizarin Red S (pH 4,2, przygotowany w wodzie dejonizowanej) w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przemyj komórki 3x 1x PBS, aby usunąć niezwiązane plamy, następnie obrazuj guzły osadzone w wapniu pod mikroskopem fazowym (20x) i ilościowo określ mineralizację, mierząc powierzchnię guzków Alizarin Red S-dodatnich za pomocą oprogramowania ImageJ.

Różnicowanie chondrogenne: Wiruj 250 000 hADSC przy 500 x g przez 5 minut w stożkowej rurce o pojemności 15 mL, aby uformować granulkę komórkową, dodaj 500 μL kompletnego medium DMEM do probówki i inkubuj przez noc w 37 °C z 5%_CO2 , aby ustabilizować granulkę. Następnego dnia użyj zestawu różnicującego chondrogenezę do indukcji – rekonstytuuj składnik zestawu A (indukator chonarogeniczny) w medium niezależnym od_CO2 (końcowe stężenia: 1% penicyliny/streptomycyny, 10 ng/mL TGF-β3, 50 μg/mL kwasu askorbinowego-2-fosforanu, 100 μg/mL piropirowianu sodu) i delikatnie odświeżaj podłoże co 3 dni (nie zakłócając granulatu). Po 3 tygodniach od wprowadzenia utrwalić granulat komórkowy 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aspirować utrwalający, inkubować roztworem 0,1% (w/v) Toluidine Blue O (przygotowanym w buforze octanowym 0,1 M sodu, pH 4,0) w temperaturze pokojowej przez 15 minut, zasysać barwnikę, przepłuczkę 3 razy wodą dejonizowaną, aby usunąć nadmiar barwnika, następnie obrazuj pod mikroskopem jasnego pola (20x) i ilościowo określam nagromadzenie siarczanowego proteogikanu, mierząc średnią gęstość optyczną (OD) barwienia Toluidynowym Blue O za pomocą oprogramowania ImageJ.

UWAGA: Podczas obsługi 4% PFA (toksycznego i odczynnika) pracuj wyłącznie w okapie spalającym i nosząc jednorazowe rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne, aby uniknąć wdychania pary lub kontaktu ze skórą i oczami – jeśli do kontaktu dojdzie, natychmiast spłuknij wodą przez 15 minut i zgłoś się po pomoc medyczną. Do utylizacji odpadów niebezpiecznych zbieraj zużyte materiały PFA oraz materiały skażone PFA (np. końcówki pipety, talerze) w dedykowanym pojemniku na odpady chemiczne oznaczone jako odpady PFA i utylizuj je zgodnie z procedurami instytucjonalnymi dotyczącymi odpadów niebezpiecznych, dbając o to, by nie mieszać się z odpadami biologicznymi.

Zespół komory elektrotaksyjnej: Wywierć dwa otwory (0,75 cm średnicy) na przeciwległych końcach linii środkowej na pokrywce z miseczki Petriego o średnicy 10 cm, umieszczonej 1 cm od krawędzi naczynia (aby umożliwić mostki agarowo-solne). Nałóż cienką warstwę smaru próżniowego (≤ 2 cm długości ≤ 1 cm) na dno szalki Petriego wzdłuż linii środkowej, 4 cm od każdej krawędzi (Rysunek 1A). Używając sterylnych kleszczy z drobnym końcówkami, umieść sterylną szklaną pokrywkę o wymiarach 1 cm x 2 cm na każdą plastrę smarową i delikatnie dociśnij, aby zapewnić szczelność (unikaj zerwania pokrywki; Rysunek 1B-C). Nałóż kolejną cienką warstwę smaru próżniowego na każdą przymocowaną pokrywkę, a następnie umieść drugą sterylną szklaną pokrywkę o wymiarach 1 cm x 2 cm bezpośrednio na smarze, tworząc stos podwójnej pokrywki. Delikatnie dociskaj, aby zapewnić szczelność między dwoma pokrywkami (zapobiegać średniemu przeciekowi; Rysunek 1D). Wzdłuż linii ukośnej łączącej lewy górny róg jednego stosu pokrywy z krawędzią naczynia oraz prawy dolny róg przeciwległego stosu z najbliższą krawędzią, nałóż smar próżniowy, tworząc ciągłą ścianę barierową. Ściana powinna być mocno przylegająca do dna naczynia (bez szczelin) i mieć około 2 cm wysokości oraz 0,5 cm szerokości (Rysunek 1E). Sterylizuj złożoną komorę pod światłem UV przez 20 minut (aby wyeliminować zanieczyszczenie mikroorganizmami), a następnie przechowuj w temperaturze pokojowej w warunkach sterylnych do czasu użycia (rysunek 1F).

Stymulacja DCEF: Umieść sterylne szkiełka szklane (do zasiewania komórek) w 10-cm szalce Petriego i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C z 5%_CO2 , aby przygotować preparaty wstępnie (wspierać przyczepność komórek). Przygotować roztwór Steinberga, rozcieńczając 10 mL 10x roztworu zapasowego w 90 mL ddH₂O (bezpłodne; końcowe stężenia: 58 mM NaCl, 0,67 mM KCl, 0,44 mM Ca(NO₃)₂4H₂O, 0,83 mM MgSO₄7H₂O, 10 mM HEPES; pH 7,4). Dodaj 0,3 g agaru do 20 mL przygotowanego roztworu Steinberga, podgrzej w mikrofalówce przez 20 sekund, aż agar się całkowicie rozpuści, a roztwór stanie się przezroczysty, następnie natychmiast wypełnij niestandardowe szklane mostki solne mieszanką gorącego agaru i Steinberga i pozwól jej zastygnąć w temperaturze pokojowej. Po zastygnięciu sterylizuj mostki solne pod światłem UV przez 15 minut, a następnie sterylizuj dwie zlewki (każda zawierająca 30 mL roztworu Steinberga) pod światłem UV przez 15 minut. Seed P3-generation hADSC na wstępnie sterylnych szkiełkach o gęstości 2 x 10⁴ komórek/cm², inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 24 godziny, aby umożliwić przyczepność komórek, następnie przenosi szkiełki z zasiewkami komórkowymi na pas startowy zmontowanej komory elektrotaksji i zabezpiecza je sterylnymi bocznymi suwakami (aby zapobiec ruchowi). Uszczelnij pas startowy, nakładając na smar próżniowy szklany pokrywak o wymiarach 3 cm x 2 cm, delikatnie dociskając, aby zapewnić szczelność i nakładając dodatkowy smar próżniowy wzdłuż krawędzi górnej pokrywy, aby utworzyć barierę (zapobiegając parowaniu medium). Napełnić zbiorniki komory medium niezależnym od_CO2 (uzupełnionym 10% FBS i 1% penicyliną/streptomycyną; objętość: 5-8 mL na zbiornik), wprowadzić sterylizowane mosty agarowo-solne przez otwory w pokrywce szalki Petriego (z jednym końcem zanurzonym w medium zbiorniku komory, a drugim w zlewkach wypełnionych roztworem Steinberga), oraz podłączają zlewki do zasilania za pomocą elektrod Ag/AgCl (dostarczając stabilny prąd stały). Należy zastosować pole elektryczne prądu stałego (DCEF) o napięciu 2 V/cm przez 4 godziny, monitorować napięcie co 15 minut za pomocą cyfrowego multimetru (dostosować, jeśli to konieczne, aby utrzymać stałą siłę pola) oraz rejestrować zdjęcia poklatkowe migracji komórek co 5 minut w 4 losowych polach za pomocą oprogramowania (5x obiektyw, tryb jasnego pola).

UWAGA: Podczas korzystania ze sprzętu elektrycznego upewnij się, że zasilacz i elektrody są suche i umieszczone na powierzchni nieprzewodzącej, aby uniknąć porażenia prądem. Noś izolowane rękawice podczas podłączania lub odłączania elektrod, wyłącz zasilanie przed regulacją konfiguracji, a w przypadku przecieku medium na elementy elektryczne natychmiast wyłącz zasilanie i wytrzyj chłonnym papierem nasączonym 75% etanolem. W tym badaniu, poprzez minimalizację grubości komory elektroforezy i utrzymanie jej na poziomie około 1 mm, a także przeprowadzenie wielopunktowych pomiarów napięcia na obu końcach komory, zmiana natężenia pola była kontrolowana w zakresie 10%. W tych warunkach uważa się, że rozkład pola elektrycznego w obrębie obszaru hodowli jest zasadniczo jednolity²⁶.

Migracja i analiza morfologii
Obrazowanie na żywo: Dla hADSC pod stymulacją DCEF zaimportuj sekwencje obrazów poklatkowych (5-minutowe interwały) do oprogramowania ImageJ, ręcznie śledz 100 komórek w 4 niezależnych polach od początku (t=0) do końca stymulacji (t=4 h) za pomocą wtyczki Manual Tracking oraz obliczaj średnią prędkość migracji (μm/min) i kierunkowość (stosunek D/T, gdzie D = odległość prosta od początku do końca, T = całkowita długość ścieżki) za pomocą wtyczki Chemotaxis Tool (ImageJ).

Śledzenie: Oblicz następujące parametry migracji, aby ilościowo określić zachowanie elektrotaktyczne: Kierunkowość (Σcosθi/n, gdzie θi to kąt między wektorem przemieszczenia komórki a kierunkiem pola elektrycznego (EF), a n to całkowita liczba śledzonych komórek, w zakresie od -1 do 1, z wartościami bliższymi 1 wskazującymi na silniejszą migrację skierowaną na anody), Odległość skumulowana (całkowita długość ścieżki pokonanej przez każdą komórkę podczas okresu stymulacji, w μm), prędkość toru (skumulowana odległość podzielona przez czas stymulacji, w μm/h) oraz odległość euklidesowa (przemieszczenie każdej komórki w linii prostej w μm, odzwierciedlające migrację netto).

Morfometria: Po stymulacji DCEF utrwal komórki 4% PFA w temperaturze pokojowej przez 20 minut, przemyj 3x 1x PBS, barw cytoszkielet falloidyną-TRITC (rozcieńczenie 1:500 w 1x PBS; objętość: 200 μL na dołek dla płytek 24-dołkowych) w temperaturze pokojowej przez 30 minut (do oznakowania F-aktyny) i zabarw jądra przeciwbarwione DAPI (1 μg/mL w 1x PBS; objętość: 100 μL na dołek) przez 5 minut. Komórki były obrazowane mikroskopem fluorescencyjnym z powiększeniem 20x (reprezentatywne obrazy o wysokiej rozdzielczości uzyskano z prędkością 40x). Falloidyna-TRITC została zwizualizowana przy użyciu długości fali wzbudzenia 540-555 nm oraz długości fali emisyjnej 565-580 nm, natomiast DAPI była obrazowana przy użyciu długości fali wzbudzenia 358-405 nm oraz długości fali emisyjnej 420-480 nm. Następnie zmierz następujące parametry morfologiczne w Obrazie J: Oś Długa (maksymalna średnica Fereta, największa odległość między dowolnymi dwoma punktami na obwodzie komórki), Długość pionowa (szerokość komórki prostopadła do osi długiej) oraz Pionowość (sinα, gdzie α to kąt między długą osią komórki a kierunkiem EF, gdzie wyższe wartości wskazują na większe dopasowanie do EF).

Testy starzenia i proliferacji
Barwienie SA-β-Gal: Użyj zestawu do wykrywania starzenia do identyfikacji komórek starzenia (komórek barwionych na niebiesko) pod mikroskopem jasnego pola (20x obiektyw). Nasiać hADSC generacji P3 na płytkach 6-dołkowych o gęstości 2 x 10^{5 komórek} na odwór, hodować do 80% konfluencji, aspirować medium, delikatnie myć komórki 3x 1x PBS, dodać 1 ml roztworu utrwalacza (dostarczonego w zestawie) na dołek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut, przemyć komórki 3x PBS, aby usunąć pozostałości utrwalacza po fiksacji, dodaj 0,5 mL roztworu roboczego do barwienia SA-β-galon (przygotowanego przez wymieszanie 50 μL podłoża SA-β-galon z 450 μL buforu barwiącego zgodnie z instrukcją zestawu) na dołek, uszczelnij płytę przezroczystą taśmą (aby zapobiec parowaniu), inkubuj przez noc (16-18 godzin) w 37 °C (unikaj ekspozycji na_CO2 , ponieważ zmienia on pH i hamuje aktywność enzymów), Następnego dnia wykonaj zdjęcia jasnego pola ≥10 losowych pól na studnię (10x cel), policz liczbę komórek zabarwionych na niebiesko (SA-β-gal⁺) oraz całkowitą liczbę komórek, a procent komórek senescentnych obliczaj jako (Liczba komórek SA-β-gal⁺ / Całkowita liczba komórek) x 100.

Immunobarwienie Ki67
Po barwieniu SA-β-gal aspiruj roztwór barwiący, płucz komórki 2x PBS, przepuszczaj błony komórkowe 0,1% Triton X-100 (przygotowany w 1x PBS; 1 mL na dołek) w temperaturze pokojowej przez 10 minut oraz blokuj wiązanie przeciwciał niespecyficznych 5% BSA (w 1x PBS; 1 mL na dołek) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Następnie komórki inkubowano z pierwotnym przeciwciałem przeciw Ki67 (rozcieńczenie 1:200 w 1% BSA/PBS; 500 μL na dołek) w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia komórki były myte 3 razy 1x PBS (po 5 minut każda), usuwając niezwiązane przeciwciało pierwotne i inkubowane przeciwciałem wtórnym Alexa Fluor 488 488 (rozcieńczenie 1:500 w 1% BSA/PBS; 500 μL na dołek) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności. Komórki były ponownie myte 3 razy 1x PBS i barwione DAPI (1 μg/mL w 1x PBS; 200 μL na dołek) przez 5 minut. Obrazy fluorescencyjne wykonywano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z powiększeniem 20x (reprezentatywne obrazy o wysokiej rozdzielczości uzyskano przy 40x). Komórki Ki67⁺ oznaczone Alexa Fluor 488 zostały zwizualizowane przy użyciu długości fali wzbudzenia 485-495 nm oraz długości fali emisyjnej 515-545 nm, natomiast jądra barwione DAPI obrazowano przy użyciu długości fali wzbudzenia 358-405 nm oraz długości fali emisyjnej 420-480 nm. Procent komórek proliferacyjnych obliczono jako: (Liczba komórek Ki67⁺ / Liczba jąder ^DAPI+ ) x 100.

UWAGA: Podczas obsługi przeciwciał pierwotnych i wtórnych należy pracować w BSC, aby zapobiec zanieczyszczeniu, aliquotować przeciwciała do jednorazowych objętości, aby uniknąć powtarzających się cykli zamarzania i rozmrażania, oraz zbierać materiały zanieczyszczone przeciwciałami (np. końcówki pipet, płytki) w dedykowanym woreczku na odpady biologiczne do autoklawu do sterylizacji przez autoklaw przed utylizacją.

Analiza elektrotaksji zależnej od wieku hADSC: Użyj zasilania impulsowego DC do generowania DCEF o trzech intensywnościach: 0 mV/mm (sterowanie), 100 mV/mm i 200 mV/mm, użycie stacji roboczej z żywymi komórkami do obserwowania i rejestrowania migracji komórek w czasie rzeczywistym, a dla każdej intensywności EF ilościowo porównanie zdolności migracyjne anodów hADSC od młodych i starszych dawczyń, mierząc skumulowaną odległość, Odległość euklidesowa, prędkość toru i skierowaność, z trzema niezależnymi biologicznymi replikacjami na grupę, aby zapewnić wiarygodność wyników. Parametry migracji elektrotaktycznej zostały zmierzone za pomocą wtyczek Manual Tracking i Chemotaxis Tool w ImageJ (NIH). Poszczególne komórki były ręcznie śledzone przez cały okres 4-godzinnej stymulacji, a według standardowych metod obliczono następujące parametry: Zgromadzona odległość: całkowita długość ścieżki pokonanej przez każdą komórkę w okresie rejestracji. Odległość euklidesowa: prosta odległość między początkową i końcową pozycją komórki. Prędkość toru: skumulowana odległość podzielona przez całkowity czas śledzenia (μm/h). Kierunkowość: obliczana jako średni cosinus kąta (θ) między każdym wektorem przemieszczenia a wektorem pola elektrycznego (wartości wahają się od -1 do 1; wartości bliższe 1 wskazują na silną migrację anodów).

Sekwencjonowanie RNA
Ekstrakcja i przygotowanie RNA: Sterylizuj pojemnik wypełniony lodem pod światłem UV przez 15 minut (aby utrzymać stabilność RNA) i wykonaj wszystkie kolejne etapy na lodzie. Przenieś szkiełka z nasionami hADSC (1 cm x 2 cm) z komory elektrotaksji do sterylnej szalki Petriego, umyj komórki 3 mL lodowatego 1x PBS (delikatnie dodaj PBS, lekko pomieszaj i całkowicie aspiruj, aby usunąć pozostałe medium), następnie dodaj 1 ml odczynnika TRIzol do każdego szkiełka i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby całkowicie lizować komórki (upewnij się, że lizat pokrywa całą warstwę komórkową). Przelej lizat do rurki wirówki o pojemności 1,5 mL wolnej od RNazy, dodaj 0,2 mL chloroformu, intensywnie zawiruj przez 15 sekund, aby wywołać separację fazową, inkubuj probówkę na lodzie przez 15 minut, a następnie wiruj w 12 000 x g przez 15 minut w 4 °C. To rozdziela lizat na trzy warstwy: górną fazę wodną zawierającą RNA, środkową warstwę białkową oraz dolną fazę organiczną. Ostrożnie przelej górną fazę wodną (≈ 0,5 mL) do nowej rurki wolnej od RNazy (unikaj dotykania warstwy środkowej), dodaj 0,5 mL izopropanolu, delikatnie przekaż wir, aby wytrącić RNA, inkubuj na lodzie przez 10 minut, a następnie wiruj w 12 000 x g przez 10 minut w 4 °C; RNA tworzy biały osad na dnie rurki. Usuń supernatant, powtórz wytrącenie izopropanolu raz, aby poprawić czystość RNA, całkowicie aspiruj supernatant, susz na powietrzu pellet RNA w BSC w temperaturze pokojowej przez 5-10 minut (nie przesuszaj, ponieważ zmniejsza to rozpuszczalność), ponownie zawiesij granulat RNA w 30 μL wody poddawanej DEPC, inkubuj w 55 °C przez 10 minut, aby ułatwić rozpuszczanie, ilościowo określić czystość RNA poprzez pomiar stosunku A260/A280 (cel: 1,8-2,0) za pomocą spektrofotometru, ocenić integralność RNA za pomocą chipu RNA Nano Chip; Cel: Numer integralności RNA [RIN] > 8,0 i przechowywać kwalifikowane próbki RNA w temperaturze -80 °C do czasu sekwencjonowania.

UWAGA: Trizol i chloroform są toksyczne, lotne i rakotwórcze, więc obchodz się z nimi wyłącznie w okapu oparowym, nosząc rękawice nitrylowe, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne – unikaj wdychania par, wytrzyj ręcznikiem papierowym i płucz wodą mydłem i wodą przez 10 minut, jeśli zostaną rozlane na skórę, i nie mieszaj ich z wybielaczem ani innymi utleniaczami (ponieważ mogą one powodować toksyczne gazy). Do utylizacji odpadów niebezpiecznych związanych z ekstracją RNA zbieraj mieszaniny, supernatanty izopropanolu oraz skażone rurki w szczelnym, chemicznie odpornym pojemniku oznaczonym jako odpady RNA (nie mieszać z odpadami wodnymi ani biologicznymi) i utylizować je zgodnie z instytucjonalnymi protokołami niebezpiecznych odpadów, dbając o to, by nie wylewać do odpływów.

Wstępne przetwarzanie danych i kontrola jakości: Przygotowanie bibliotek sekwencjonowania z wykorzystaniem zestawu VAHTS mRNA-seq Library Prep Kit zgodnie z protokołem producenta – wzbogacaj mRNA za pomocą magnetycznych kulek oligo(dT), fragmentuj mRNA na fragmenty o częstotliwości 200-300 bp za pomocą kationów dwuwartościowych, syntetyzuj cDNA pierwszej nici za pomocą losowych heksamerów, a następnie drugiego łańcucha cDNA, wykonuj naprawę końcowych, dodaj ogony typu A, ligać adaptery sekwencjonowania, wzmacniaj biblioteki za pomocą PCR i oczyszczaj za pomocą kulek. Sekwencjonowanie bibliotek na platformie sekwencjonacyjnej (odczyty parowane na końcu 150 bp), generując około 50 milionów surowych odczytów na próbkę, a następnie użyj oprogramowania do przycinania odczytów niskiej jakości (usuwanie odczytów z bazami >50% o ocenie jakości Phred <20) oraz sekwencji adapterów, zachowując około 48 milionów czystych odczytów na próbkę (Q30 > 90%) do analizy po przycięciu.

Analiza bioinformatyczna: Zrównaj czyste odczyty z ludzkim genomem referencyjnym (GRCh38/hg38) za pomocą oprogramowania Hisat2 v2.2.1 i zapisz wyniki wyrównania jako pliki BAM, użyj oprogramowania htseq-count v0.13.5 do liczenia liczby odczytów przypisanych do każdego genu (na podstawie adnotacji genu Ensembl), normalizuj dane o liczbie genów za pomocą funkcji estimateSizeFactors z pakietu DESeq (2012) R, aby wyeliminować efekty partii i różnice w głębokości sekwencjonowania, oraz przeprowadza analizę różnicowej ekspresji za pomocą funkcji nbinomTest (pakiet DESeq), wybierając geny różnicowo ekspresyjne (DEG) przy użyciu progów zmiany fałdów (FC) > 2 oraz skorygowanej wartości p (padj) < 0,05. Przeprowadz analizę wzbogacenia genów (GO) (proces biologiczny, funkcja molekularna, komponent komórkowy) oraz analizę wzbogacenia szlaków w Encyklopedii Genów i Genomów w Kioto (KEGG) na DEG przy użyciu pakietu clusterProfiler v4.0 R, koncentrując się na wzbogaceniach związanych z migracją komórek (np. adhezja komórek, migracja komórek), transportem jonów (np. transbłonowy transport jonów sodu) oraz szlakami sygnałowymi (np. szlak sygnalizacyjny PI3K-Akt). Wykonaj nienadzorowane hierarchiczne klasteryzowanie DEG za pomocą pakietu pheatmap v1.0.12 R oraz wizualizuj wzorce ekspresji genów na próbkach za pomocą heatmapy (skalowane w wierszach z-scores).

Analiza statystyczna: Wszystkie dane eksperymentalne są prezentowane jako średnia ± błąd standardowy średniej (średnia ± SEM), z co najmniej 3 niezależnymi replikacjami biologicznymi na grupę (n ≥ 3). Użyj testu Student t-test do porównania różnic między dwiema grupami (np. młodzi a starsi dawcy) oraz jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu post-hoc Tukeya do porównania różnic między trzema lub więcej grupami (np. różne intensywności EF), przeprowadzenia analiz statystycznych za pomocą oprogramowania SPSS 23.0 i zdefiniowania istotności statystycznej następująco: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

Results

Zastosowanie pól elektrycznych kieruje kierunkową migracją hADSC i zwiększa ich zdolność migracyjną
Wyekstrahowane hADSC wykazywały typowe markery powierzchniowe komórek macierzystych mezenchymalnych (np. CD29, CD44, CD90, CD73, CD105) oraz posiadały potencjał różnicowania trójlinii (adipogenny, osteogenny, chondrogen; Rysunek 2A), spełniający standardowe kryteria identyfikacji hADSC. Zastosowaliśmy pola elektryczne prądem stałym (DCEF) o natężeniu 0 mV/mm, 100 mV/mm i 20...

Discussion

Na wczesnym etapie procesu naprawy i regeneracji uszkodzeń tkanek pola elektryczne pojawiają się jako jeden z najwcześniejszych sygnałów fizycznych ustanowionych w mikrośrodowisku. Ich właściwości kierunkowe są przestrzenno-czasowo-skorelowane z rekrutacją komórek do miejsca urazu²⁷. Endogenne pola elektryczne pochodzą z potencjału transnabłonkowego generowanego przez spolaryzowany transport jonów w tkankach nabłonkowych. Gdy bariera nabłonkowa zostaje zakłócona lub ulega starzeniu, potencjał uleg...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
4 stopnie; C/-20 stopni; C/-80 stopni; C Lodówka	Haier, Chiny	HYC-390/DW-25L262/DW-86L728J
Agar	HUSHI, Chiny	10000561
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Stany Zjednoczone	G2939BA
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	A5533
Szafka Biobezpieczeństwa	Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone	1300 A2 1,5 m
CaNO3· 4H2O	HUSHI, Chiny	10013960
Wirówka	Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone	X4R Pro
CO2 Inkubator	Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone	Forma Steri-Cykl 3307
Kolagenaza typu IV	Biosharp, Chiny	BS076
Mikroskop konfokalny	ZEISS, Niemcy	LSM 900
Zasilacz impulsowy prądu stałego	Daedo Powertronics, Korea	DDP-500
Deksametazon	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	D4902
Multimetr cyfrowy	Fluke, Stany Zjednoczone	FLUKE-175
DMSO	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	D2650
Waga elektroniczna;	Sartorius, Niemcy	BSA224S-CW
FBS	Gibco, Stany Zjednoczone	10270-106
Cytometr przepływowy	Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone	A24858
IBMX (1-metylo-3-izobutyloksantyna)	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	I7018
Indometacyna	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	I7378
Insulina	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	I5500
Mikroskop odwrócony	ZEISS, Niemcy	Obserwator Axio 7 / ACR
ITS-G	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	I3146
KCl	HUSHI, Chiny	10019318
KH2PO4	HUSHI, Chiny	10019320
Kwas linolowy & nbsp;	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	L1376
Stacja komórkowa na żywo	Live Cell Instrument, Korea	Chamlide TC
Niskoglukozowy DMEM	Gibco, Stany Zjednoczone	11885084
MgSO4· 7H2O	HUSHI, Chiny	10019322
Na2HPO4· 12H2O	HUSHI, Chiny	10019324
NaCl	HUSHI, Chiny	10019318
Spektrofotometr NanoDrop 2000	Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone	ND-2000
Olej czerwony O	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	O0625
Penicylina/Streptomycyna	Gibco, Stany Zjednoczone	15140122
Pipety	Eppendorf, Niemcy	4920000061
SYBR Premix EX Taq	Takara, Chiny	RR420A
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	T3260
Tris	HUSHI, Chiny	10019326
TRIzol	Beyotime, Chiny	R0016
Trypsin-EDTA	Gibco, Stany Zjednoczone	25200056
Mikroskop pionowy	ZEISS, Niemcy	415200-0000-000
Smar próżniowy	DOW CORNING, Stany Zjednoczone	1597418
witamina C i c	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	A4544
System oczyszczania wody	Thermo Fisher Scientific, Stany Zjednoczone	GenPure xCAD Plus UF-TOC
β-glicerfosforan	Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone	G9422