Artykuł metodologiczny

Walidacja systemu ciśnienia hiperbarycznego za pomocą znieczulenia ksenonowego dla Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/69671

⸱

20 lutego 2026

 , 
1Clore Laboratory, University of Buckingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gazy, które wydają się nieszkodliwe przy ciśnieniu atmosferycznym, mogą wywoływać zachowania takie jak narkoza w warunkach hiperbarycznych. Konwencjonalne komory ciśnieniowe hiperbaryczne są kosztowne i wymagają dużo pracy. Niniejsze badanie przedstawia prostą, niskokosztową metodę badania wpływu ksenona na Drosophila melanogaster przy umiarkowanych ciśnieniach poniżej 4 atm.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W warunkach hiperbarycznych podwyższone stężenia gazów otoczących mogą wywoływać szereg reakcji behawioralnych u różnych zwierząt. Znaczna część tych zachowań odzwierciedla zmiany w stanach poznawczych, które są jeszcze słabo rozumiane. Jednym z godnych uwagi przykładów jest znieczulenie ogólne. Wpływ behawioralny kilku gazów w warunkach hiperbarycznych w znieczuleniu ogólnym, czyli narkozie, jest długoletnim badaniem naukowym, mimo niezwykle częstego stosowania tych leków w medycynie. Ksenon, klasyfikowany jako gaz szlachetny i środek znieczulający, uważany jest za jedną z najbezpieczniejszych opcji znieczulenia ogólnego u ludzi. Jednak nie znieczula much w warunkach normobarycznych. Tutaj ustanowiliśmy prosty eksperymentalny system, który zwiększa ciśnienie otoczenia do ~3 atm i umożliwia badanie znieczulenia ksenonowego u jednego z najpopularniejszych organizmów modelowych, Drosophila melanogaster. Taki eksperymentalny układ dodatkowo ułatwia badania innych gazów i ich wpływu w warunkach hiperbarycznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwa skrajne aspekty efektów behawioralnych zaobserwowane u zwierząt w warunkach hiperbarycznych to drgawki spowodowane tlenem oraz narkozę azotu 1,2. Co ciekawe, zgłaszano zaburzenia poznawcze, takie jak halucynacje i zaburzenia pamięci, przy stężeniu azotu i wodoru przy wartościach ciśnienia przed poziomem nieprzytomności 3,4. Znieczulenie wywołane ksenonem, kryptonem i podtlenkiem azotu w warunkach hiperbarycznych zostało zgłaszane przed 5,6.

Znieczulenie ogólne jest zarówno fundamentem medycyny, jak i zjawiskiem o znacznym znaczeniu naukowym. Pomimo długotrwałego i powszechnego stosowania, nasza wiedza pozostaje ograniczona, jak dokładnie niektóre substancje chemiczne wywołują tymczasowy brak ruchu, pamięci, bólu i świadomości7. Xenon, będąc gazem szlachetnym, można by mianować najbardziej osobliwym członkiem wśród środków znieczulających. Uważana jest za bezpieczną opcję znieczulenia, oferującą szybkie indukcje i rekonwalescencję, minimalne zaburzenia fizjologiczne oraz jedynie łagodne skutki uboczne, takie jak nudności pooperacyjne 8,9.

Biorąc pod uwagę medyczne znaczenie znieczulenia oraz nietypowe właściwości chemiczne ksenonu, celem tego badania są zbadanie znieczulenia wywołanego ksenonem za pomocą prostego modelu zwierzęcego Drosophila melanogaster. Przeprowadzono różnorodne badania badawcze z użyciem muszek owocowych do badania znieczulenia ogólnego, z wieloma proponowanymi ustawieniami oraz stosowaniem różnych lotnych środków znieczulających 10,11,12,13. Jednak nie odnotowano znieczulenia ksenonowym u Drosophila. W warunkach normobarycznych ksenon nie wywołuje znieczulenia u Drosophila melanogaster, powszechnie znanych jako muszki owocowe. Aby rozwiązać to ograniczenie, badanie oferuje system hiperbariczny umożliwiający kontrolowaną manipulację ciśnieniem otoczenia w zakresie od 1 atm do około 4 atm. Przeprowadzono kilka badań z wykorzystaniem komór hiperbarycznych do odpowiedzi na podobne pytania14,15. Jednak większość komercyjnych komór hiperbarycznych korzysta z wytrzymałych, nieszczelnych materiałów, ale mają dużą objętość (~3 L) i są systematycznie skomplikowane w obsłudze oraz kosztowne. Zamiast tego metoda opisana w tym artykule jest prosta i niedroga, umożliwiając badanie wpływu różnych gazów i ich kombinacji. Zapewnia to rozwiązanie odpowiednie dla modeli zwierząt, takich jak D. melanogaster i C. elegans.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparat Drosophila melanogaster

  1. Zbierz 20 samic i 20 samców much w wieku 1-3 dni na każdy eksperyment z użyciemCO2.
  2. Wybrane muchy odpoczywać w fiolce z jedzeniem przez co najmniej 24 godziny przed eksperymentem w temperaturze ~22 °C.

2. Podanie znieczulenia

  1. Przenieś gazy z ich zbiorników do nieszczelnych worków gazowych do zastosowań eksperymentalnych. Do bezpośredniego transferu gazu z pojemnika do worków użyj rurek silikonowych.
  2. Przymocuj silikonową rurkę o średnicy 25 mm (3,4 mm) do strzykawki polipropylenowej. Następnie podłącz strzykawkę polipropylenową do worków gazowych i do trójdrogowego kranu. Dla jasności, strzykawka polipropylenowa będzie w dalszej części tekstu określana jako strzykawka #1.

3. Montaż układu hiperbarycznego (Rysunek 1)

  1. Ustaw stół LED w orientacji poziomej na stole (długa krawędź poziomo do powierzchni stołu).
  2. Umieść pompę wtryskową obok jednej z krótkich stron stołu LED light, dbając o to, aby orientacja pompy pozwoliła eksperymentalnej strzykawce wysunąć się ponad podświetlenie.
  3. Umieść kamerę nad urządzeniem, aby objąć obszar, w którym znajduje się eksperymentalna strzykawka.
  4. Wytnij rurkę krzemową o długości 75 mm (średnica 3,4 mm). Podłącz trójdrożny odwór do manometru za pomocą silikonowej rurki z centralnej dyszy.
  5. Użyj zacisków sprężynowych na dyszę z boku manometru oraz trójprzewodnikowego odczepu, aby upewnić się, że rurka jest szczelna.
  6. Za pomocą przycisku oznaczonego podwójną strzałką w jednostce sterującej pompy wtryskowej ustaw prędkość na 80 mm/m, a czas trwania na 38 s, aby automatycznie sprężać lub dekompresować tłok.

4. Procedura znieczulenia ksenonowego

  1. Ogranicz oświetlenie otoczenia w pomieszczeniu eksperymentalnym, włącz stół LED i ustaw jasność na poziom 3. To pomaga zwiększyć kontrast w filmie.
  2. Usuń tłok strzykawki poliwęglanowej. Włóż niewielką ilość waty do sutku strzykawki, aby powstrzymać muchy przed ucieczką. Dla jasności, strzykawka poliwęglanowa będzie w dalszej części tekstu określana jako strzykawka #2.
  3. Aby przenieść 40 much z fiolki do strzykawki #2, najpierw wyjmij pokrywkę fiolki i umieść pojemnik strzykawki pionowo na fiolce. Kołnierz lufy powinien połączyć się z górną częścią fiolki, aby umożliwić muchom wejście do lufy strzykawki. Obróć konstrukcję o 180° i stuknij. To umieszcza muchy na dnie beczki strzykawki. Włóż tłok z powrotem. Włóż strzykawkę z muchami do pompy wtryskowej.
  4. Ukierunkuj ślady lufy strzykawki po bokach, aby lepiej zobaczyć muchy z perspektywy kamery.
  5. Przymocuj strzykawkę od lufy i głowicy tłoka do pompy wtryskowej za pomocą regulowanych śrub.
  6. Usuń watę z końcówki strzykawki #2 i podłącz ją do trójstopniowego kranu.
  7. Rozpocznij nagrywanie wideo. Włącz manometr. Przekręć zawor, aby połączyć manometr ze strzykawką #2 i potwierdź ciśnienie 0 kPa w strzykawce za pomocą manometru.
  8. Przekręć trójstronny odkrążek w pozycję boczną, aby umożliwić wymianę powietrza ze strzykawką przed eksperymentem.
  9. Przesuń tłok z poziomu 20 do 2 ml za pomocą ręcznej opcji sterowania pompą wtryskową, która została zaprojektowana tak, by ułatwić najszybszą operację.
  10. Wciągnij 18 mL gazu znieczulącego z worka gazowego do strzykawki #1. Połącz strzykawkę #1 z trójdrożnym odłączeniem z bocznego portu blokady luer. Aby ocenić właściwą objętość, 18 mL gazu znieczulałego w łącznej ilości 20 mL daje 90% procentu gazu. Można to zmieniać zgodnie z pożądanym końcowym procentem gazu.
  11. Przesuń tłok z powrotem do linii 20 mL za pomocą ręcznej opcji pompy wtryskowej.
  12. Przekręć zawor, aby połączyć manometr ze strzykawką #2. Zazwyczaj manometr pokazuje ciśnienie ~-3 kPa po napełnieniu środka znieczulającego.
  13. Automatycznie przesuwaj tłok, ustawiając prędkość i czas na 80 mm/s i 38 s. Pompa ma osiągnąć 5 mL bara lufy w ciągu 38 sekund. Gdy tłok się zatrzyma, maksymalne ciśnienie musi wynosić ~200 kPa.
  14. Zostaw tłok na pozycji 5 mL przez 20 sekund. Zwróć uwagę na szczytowe ciśnienie.
  15. Stuknij strzykawką, by usunąć muchy przyczepione do tłoka, sprawiając, że osiadają nieruchomo na dnie.
  16. Rozpocznij automatyczną dekompresję po 20 sekundach. Zakończ eksperyment, gdy tłok wróci do baru 20 mL. Zwróć uwagę na ostateczne ciśnienie do kontroli nieszczelności.

5. Analiza danych

UWAGA: W tym eksperymencie zastosowano emergencję znieczulającą jako punkt końcowy. Ruchy lotu były kwantyfikowane od momentu rozpoczęcia dekompresji tłoka. Opracowano dwie różne metody analizy: analizę pikseli oraz śledzenie much. Każda metoda analizy miała swoje wady, które są przedstawiane w dyskusji.

  1. Analiza pikseli
    1. Użyj ScreenFlow do edycji filmów. Przytnij każdy film do interesującego obszaru (ROI), czyli pierwszych 5 ml lufki strzykawki.
    2. Przytnij wideo do pierwszych 20 sekund po dekompresji strzykawki. Eksportuj edytowane filmy jako GIF-y. Zduplikuj GIF.
    3. Korzystając z Fidżi, usuń pierwszą klatkę z jednego duplikatu, a ostatnią z drugiego. Aby to osiągnąć, wybierz Edycję obrazu > wideo > Usuń klatki.
    4. Spraw, by każdy GIF był binarny na Fidżi, tak aby muchy na czarnym tle były białe. Aby to osiągnąć, wybierz Proces > Binarny > Zrób binarny.
    5. Otwórz oba GIF-y na Fidżi. Oblicz różnicę pikseli między GIF-ami. Aby to osiągnąć, wybierz Process > Image Calculator. Ta operacja tworzy GIF różnicy pikseli.
    6. Zachowaj GIF różnicy pikseli. Analizuj cząstki w różnych GIF-ach. Aby to zrobić, wybierz Analizuj > Analizuj cząstki na Fidżi. Dostosuj progi rozmiaru pikseli, aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu.
    7. Po analizie cząstek Fiji generuje obraz CSV z różnicami pikseli na klatkę. Zachowaj CSV. Dane CSV mogą być używane do wyznaczania ruchu na klatkę. Użyj skumulowanego ruchu przez klatki, aby przypisać statystyczne różnice między eksperymentami.
  2. Śledzenie lotów
    UWAGA: W metodzie śledzenia much wykorzystano technologię AI do wykrywania i śledzenia środka masy każdej muchy w filmach eksperymentalnych. Do tego celu połączono dwa modele: YOLO (You Only Look Once) do wykrywania oraz MASA (Matching Anything by Segmenting Anything) do śledzenia. Modele były wykonywane w Google Colab przy użyciu karty Tesla T4.
    1. Zainstaluj bibliotekę YOLO Ultralytics w Colabie, a następnie załaduj model yolo11n.pt. Użyj CVAT (Computer Vision Annotation Tool) do adnotacji much w klatkach wyodrębnionych z filmów, a następnie eksportuj zbiór danych w formacie YOLO do treningu. Szczegółowe procedury instalacji i szkolenia opisane są w repozytorium online.
    2. Zainstaluj repozytorium MASA w Google Colab i zastosuj filtr Kalmana do śledzenia obiektów w kolejnych klatkach. Integruj wytrenowany model detekcji YOLO z ramami śledzącymi MASA.
    3. Użyj FixTrack, aby ręcznie przejrzeć ścieżki generowane przez połączony potok MASA+YOLO. Identyfikacja i łączenie nieprawidłowo fragmentowanych torów lub korygowanie niezgodności tożsamości, aby uzyskać ciągłe trajektorie dla pojedynczych much. Szczegółowe procedury instalacji i szkolenia opisane są w repozytorium FixTrack.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana w tym artykule pozwala monitorować zarówno czas, jak i zakres aktywności lokomotorycznej u much w warunkach hiperbarycznych. Ta konfiguracja pozwala gazom takim jak ksenon i podtlenek azotu, które w normalnych warunkach nie mają właściwości znieczulających, wywołać znieczulenie u Drosophila melanogaster. Aby to udowodnić, eksperymentowaliśmy z różnymi stężeniami ksenonu i powietrza. Zaczęliśmy proces od 90% ksenonu i 10% powietrza. Następnie wykazaliśmy wrażliwość metodologii, porównując różnice m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To proste, niskokosztowe rozwiązanie sprawia, że badania behawioralne hiperbaryczne u Drosophila są szeroko dostępne, umożliwiając szybkie i powtarzalne eksperymenty bez stosowania specjalistycznych zbiorników ciśnieniowych. Jednak ma to pewne ograniczenia. Jednym z ważnych kompromisów jest niższe maksymalne ciśnienie w porównaniu do istniejących układów. Najwyższe ciśnienie, jakie możemy wywołać w tym układzie, to ~4 atm, podczas gdy naczynia ciśnieniowe stosowane dla Drosophili osiągają około dwukrotn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie zgłaszają konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało finansowo wsparte przez TBD (Tiny Blue Dot) Foundation. Dziękujemy Jennifer Sun i Ting Liu z Google DeepMind za pomoc i wskazówki dotyczące śledzenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szczelne poduszki gazowe (0,5 L)Techinstro7440440
KameraAppleiPhone 15
Podwójne zaciski sprężynoweMapa źródeła24120200ux2109
Mieszanka pokarmowa DrosophilaZaawansowane hodowlowanieDM900
Drosophila melanogasterDarwin BiologicalLZ-210
Rura wtryskowaAitoserleaB09M8G5BQ8
Stolik LEDLairiM1-3878368
ManometrDwyeromega477AV-8
Metalowy trójstopniowy zaworek zaciskowy do zaciskania i zawor;Sigma Aldrich  Z182184
Strzykawka poliwęglanowa (20 mL)DMC MedicalFD-1031NS
Strzykawka polipropylenowa (20 mL)BD301031
Rurki silikonowe
Gaz ksenonowyGazy przemysłowe Chengdu Taiyu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bert, P. Barometric Pressure: Researches in Experimental Physiology. , College Book Company. Columbus, Ohio. (1943).
  2. Grover, C. A., Grover, D. H. Albert Behnke: nitrogen narcosis. J Emerg Med. 46, 225-227 (2014).
  3. Rostain, J. C., Lavoute, C., Risso, J. J., Vallée, N., Weiss, M. A review of recent neurochemical data on inert gas narcosis. Undersea Hyperb Med. 38, 49-59 (2011).
  4. Clark, J. E. Moving in extreme environments: inert gas narcosis and underwater activities. Extrem Physiol Med. 4, 1(2015).
  5. Lawrence, J. H., Loomis, W. F., Tobias, C. A., Turpin, F. H. Preliminary observations on the narcotic effect of xenon with a review of values for solubilities of gases in water and oils. J Physiol. 105, 197-204 (1946).
  6. Miller, K. W., Paton, W. D., Smith, E. B., Smith, R. A. Physicochemical approaches to the mode of action of general anesthetics. Anesthesiology. 36, 339-351 (1972).
  7. Mashour, G. A., Forman, S. A., Campagna, J. A. Mechanisms of general anesthesia: from molecules to mind. Best Pract Res Clin Anaesthesiol. 19, 349-364 (2005).
  8. Sanders, R. D., Franks, N. P., Maze, M. Xenon: no stranger to anaesthesia. Br J Anaesth. 91, 709-717 (2003).
  9. Law, L. S. C., Lo, E. A. G., Gan, T. J. Xenon anesthesia: A systematic review and meta-analysis of randomized controlled trials. Anesth Analg. 122, 678-697 (2016).
  10. Krishnan, K. S., Nash, H. A. A genetic study of the anesthetic response: mutants of Drosophila melanogaster altered in sensitivity to halothane. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (21), 8632-8636 (1990).
  11. Zalucki, O., Day, R., Kottler, B., Karunanithi, S., van Swinderen, B. Behavioral and electrophysiological analysis of general anesthesia in 3 background strains of Drosophila melanogaster. Fly (Austin). 9, 7-15 (2015).
  12. Daplan, E., Turin, L., Skoulakis, E. M. C. Measuring the anesthetic response to chloroform and isoflurane in general anesthesia mutants in Drosophila melanogaster. Anesthesia Res. 2, 12(2025).
  13. Rodriguez, E., Peng, B., Lane, N. Anaesthetics disrupt complex I-linked respiration and reverse the ATP synthase. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1866, 149511(2025).
  14. Wlodarczyk, A., McMillan, P. F., Greenfield, S. A. High pressure effects in anaesthesia and narcosis. Chem Soc Rev. 35, 890-898 (2006).
  15. Koblin, D. D., et al. Minimum alveolar concentrations of noble gases, nitrogen, and sulfur hexafluoride in rats: helium and neon as nonimmobilizers (nonanesthetics). Anesth Analg. 87, 419-424 (1998).
  16. Thomas, J. J., Baxter, R. C., Fenn, W. O. Interactions of oxygen at high pressure and radiation in Drosophila. J Gen Physiol. 49, 537-549 (1966).
  17. Kent, D. W., Halsey, M. J., Eger, E. I. 2nd, Kent, B. Isoflurane anesthesia and pressure antagonism in mice. Anesth Analg. 56, 97-101 (1977).
  18. Gunning, C. FixtrackV2 at SingleVid. , Github. (2025).
  19. Allada, R., Nash, H. A. Drosophila melanogaster as a model for study of general anesthesia: the quantitative response to clinical anesthetics and alkanes. Anesth Analg. 77, 19-26 (1993).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Hyperbaric PressureXenon AnesthesiaDrosophila MelanogasterAnesthetic GasesBehavioral ResponsePressure ChamberVideo AnalysisPixel DifferenceFly MovementModel Organisms

Powiązane artykuły