Efektywna transformacja agrobakterii oparta na regeneracji bezpłciowego gatunku z rodziny kapustnych, Rorippa aquatica

Podsumowanie

Przedstawiamy wydajny, zoptymalizowany protokół transformacji apłciowej obojburzliwej odmiany Brassicaceae, Rorippa aquatica, wywoływanej przez Agrobacterium, bez wymagających zasobów procedur hodowli tkanek sterylnych. Wykorzystanie markera transformacji wizualnej i pipeline'u regeneracji pędów skutecznie wygenerowało transformanty bliskie klonalne, co przyczyniło się do dalszych badań nad adaptacją roślin do środowiska podwodnego.

Streszczenie

Stabilna transformacja genetyczna roślin pośredniczona przez Agrobacterium tumefaciens stała się potężnym narzędziem dla podstawowych badań biologii roślin oraz biotechnologii roślin, które bezpośrednio wpływają na poprawę upraw. Proste i skuteczne procesy transformacji, takie jak metoda zanurzania kwiatów dla Arabidopsis, znacznie zaawansowały analizę funkcji genów na dużą skalę. Jednak taki proces nie może być stosowany do gatunków roślin, które nie poddają się rozmnażaniu płciowemu. Rorippa aquatica to wyłaniający się model płazowy gatunek z rodziny kapustnych, wykazujący heterofilne, drastyczne zmiany formy liści i roślin w środowiskach lądowych lub podwodnych. R. aquatica rozmnaża się wyłącznie wegetatywnie. Zoptymalizowany proces przedstawiony tutaj zapewnia wydajną i niezawodną transformację R. aquatica pośredniczoną przez Agrobacterium, która nie wymaga hodowli tkanek jałowych. Sadzonki liści są krótko zanurzone w Agrobacterium zawieszonym w buforze transformacyjnym zawierającym wektor binarny, który wyraża marker wzrokowy, RUBY, pod promotorem konstytutywnym. Następnie szczepionki są hodowane na papierze filtrującym nasączonym wodą w komorze wzrostowej. Następnie oddziela się odświeżające rośliny o pigmentacji RUBY Red i sadzi je w ziemi. Te początkowe regeneranty T1 (R1-T1) wyrażają czerwone sektory. Poprzez wycięcie czerwonego sektora i powtórzenie etapów regeneracji, w kolejnej generacji R2-T1 powstaje duża liczba transgenicznych rodzeńców, z których niektóre są niemal jednolicie czerwone; wskazująca na ekspresję RUBY. Ten prosty proces transformacji można zastosować dla R. aquatica i ewentualnie innych roślin rozmnażających się wegetatywnie, aby wprowadzić interesujące geny do badania ich funkcji w adaptacji do lądowych vs. środowiska wodne.

Wprowadzenie

Stabilna transformacja genetyczna, czyli wprowadzenie i ekspresja genów interesujących dany gatunek rośliny, jest kluczowa dla podstawowej nauki o roślinach i biotechnologii roślin. Transformacja pośredniczona przez Agrobacterium tummefaciens jest zdecydowanie najczęściej stosowanym sposobem inżynierii genetycznej roślin ze względu na niezawodne generowanie stabilnych transformantów¹. Rozwój systemu wektorów binarnych, w którym wektor klonujący T-DNA i rozbrojony plazmid pomocniczy wirusa są rozdzielone na dwie jednostki, zrewolucjonizował transformację pośredniczoną przez Agrobacterium ^1,2. Dla modelowej rośliny Arabidopsis thaliana prosta, opłacalna procedura transformacji kwiatowej umożliwiła wysokoprzepustowe generowanie klonalnych (hemizygotycznych) transformantów dla genetyki funkcjonalnej i genomiki ^3,4. Jednak takie podejście nie jest możliwe dla gatunków roślin, które rozmnażają się głównie lub wyłącznie wegetatywnie.

Rośliny płazowe wykazują unikalną zdolność do rozwijania się zarówno w środowiskach lądowych, jak i wodnych (podwodnych)⁵. Rorippa aquatica to gatunek płazów z rodziny Brassicaceae, który wykazuje heterofil. W środowisku lądowym R. aquatica rozwija okrągłe liście, których naskórek składa się z komórek nawierzchni i szparków szparkowych. Natomiast ich liście wodne wykazują morfologie dobrze przystosowane do środowiska podwodnego: silnie rozdrobnione, igiełkowate liście z naskórkiem pozbawionym skórnych komórek nawierzchni lub szparków^{szparkowych 6,7}. Filogenetycznie R. aquatica jest blisko spokrewniona z Arabidopsis thaliana; obie należą do tej samej rodziny, Brassicaceae⁶. Wraz z dostępnością danych z całych sekwencji genomowych oraz wysoką zachowanością sekwencji genów kodujących pomiędzy R. aquatica a A. thaliana, R. aquatica pełni rolę rozwijającej się rośliny modelowej płazowej do badania molekularnych podstaw adaptacji do lądu i wody⁸. Rzeczywiście, najnowsze badania fizjologiczne i ekspresyjne genów sugerują, że przekształcenie szlaków sygnalizacji świetlnej i hormonalnej jest kluczowe dla heterofilu R. aquatica ^7,8.

Aby przetestować funkcje molekularne genów i szlaków kandydatów, transformacja genetyczna jest absolutnie niezbędna. R. aquatica rozmnaża się wegetatywnie w naturze ^8,9. Dlatego, w przeciwieństwie do A. thaliana, transformacja kwiatowa Agrobacterium nie może być zastosowana do R. aquatica. Co niezwykłe, R. aquatica łatwo regeneruje całe rośliny z odłączonych liści bez egzogennego suplementowania fitohormonami¹⁰. Krótko, w ciągu kilku dni od odłączenia segmentu liścia, proliferacja komórek aktywnie się rozwija w tkance naczyniowej na bliższym końcu powierzchni przecięcia. W ciągu tygodnia zarówno korzenie, jak i pędy regenerują się, ostatecznie tworząc młode sadzonki (rozety). Pojedyncze rośliny można oddzielić i uprawiać do dojrzałości¹⁰. Ten spontaniczny proces regeneracji całych roślin może być łatwo wykorzystany do przemiany genetycznej R. aquatica.

Opisany tutaj zoptymalizowany pipeline umożliwia efektywną i niezawodną transformację R. aquatica pośredniczoną przez Agrobacterium, wykorzystując jej zdolność do spontanicznej regeneracji po odłączeniu liści. Aby łatwo selekcjonować transformanty bez konieczności kosztownych procesów hodowli sterylnych, zastosowano nieinwazyjny marker selekcji wzrokowej RUBY – syntetyczny wektor z trzema genami prowadzącymi do biosyntezy betalainy¹¹. Poprzez optymalizację warunków hodowli bakteryjnej, etapów szczepienia oraz procesów inkubacji sadzonek liści w celu regeneracji, niezawodnie produkowano rośliny transgeniczne R. aquatica do dojrzałości. Prawie wszystkie początkowe transformanty pokolenia R1-T1 wykazują czerwone sektory, co wskazuje, że są to heterogeniczne mozaiki genetyczne. Poprzez wycięcie sektorów czerwonych liści RUBY+ i powtórzenie procesów regeneracji, możliwe jest generowanie całkowicie czerwonych roślin rozetowych, a więc niemal klonalnych, R. aquatica transformantów w kolejnym pokoleniu R2-T1. Ten proces transformacji można łatwo zastosować do wprowadzania/ekspresji obcych genów interesujących R. aquatica, co przyspiesza molekularnogenetyczne badania heterofilu i adaptacji roślin do ekstremalnych środowisk.

Protokół

Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie materiałów roślinnych

1. Ściąć i pociąć, całkowicie płatowate, dojrzałe, zdrowe liście na kawałki o długości 1-2 cm z dwumiesięcznych, dojrzałych roślin matczynych (Rysunek 1A).
2. Wyłóż tacę do rozmnażania roślin (20 tac na gniazdo Perma o wymiarach 30 cm) dwoma warstwami autoklawowanych, złożonych ręczników papierowych. Namocz ręczniki papierowe sterylną wodą, aby na wierzchu pojawiła się cienka warstwa wody.
3. Umieść sadzonki stroną do góry, z przestrzenią wokół każdego rośliny, aby uniknąć nakładania się (Rysunek 1A).
4. Lekko spryskaj plasterki i szczelnie przykryj tacę folią spożywczą.
5. Umieść tacki w komorze wzrostu w temperaturze 25 °C-28 °C z okresem światła i 8 godzin ciemności w wilgotnych warunkach i intensywnością światła 50 μmol/m²/s.
6. Sprawdzaj i utrzymuj czyste, wilgotne tace do propagacji 2-3 razy w tygodniu.
   1. Dodaj sterylną wodę, aby utrzymać cienką warstwę wody na nasączonych ręcznikach papierowych.
   2. Wymień folię spożywczą, która straciła przyczepność i/lub wykazuje oznaki zanieczyszczenia (np. widoczne mętności wody).
7. Używając mikronożyczek lub skalpela, starannie wycinam regenerowane, zdrowe rośliny rozetowe, które mają zarówno pęd, jak i korzeń między 14 a 21 dniami po zakorzenieniu (rysunek 1B).
   UWAGA: Potrzebne jest dokładne wycięcie, aby uzyskać pojedynczą sadzę rozetową z nienaruszonym pędem i korzeniem. Rośliny rozety rorippa gęsto mnożą się wzdłuż przecięcia liścia i żyłka środkowego, co utrudnia identyfikację poszczególnych roślinek rozet. Pęd roślinki rozetowej rośnie osiowo, podczas gdy korzenie rosną pod powierzchnią liścia, co utrudnia widoczność całej roślinki rozetowej (Rysunek 1B).
8. Przesadz pojedyncze roślinki rozetowe do doniczek zawierających wilgotne podłoże glebowe (stosunek 2:1:1 mieszanki doniczkowej: wermilkulit: perlit) uzupełnione nawozem o wolnym uwalnianiu (rysunek 1B).
9. Podlewanie wodą z kranu uzupełnianym 0,25 g/l granulowanego nawozu NPK i przykrywanie kopułą wilgotności lub folią spożywczą, aby utrzymać wilgotne warunki.
10. Umieść tacki w komorze wzrostu w warunkach wcześniejszych (25 °C-28 °C z 16 godzinami światła i 8 godzin ciemności w wilgotnych warunkach i intensywnością światła 50 μmol/m²/s)
    UWAGA: Kluczowe jest zachowanie wilgotnych warunków glebowych. Utrzymuj cienką warstwę wody pod doniczkowymi przesadkami.

2. Kultury agrobakterii do przemiany

1. Szczep Streak A. tumefaciens GV3101 zawierający Ti-plazmid pMP90 (pTiC58DT-DNA) zawierający wektor RUBY na 30 mL płycie LB zawierającej ryfampicynę (0,03 mg/mL), gentamycynę (0,025 mg/mL) i spektromycynę (0,05 mg/mL) i rośnie w temperaturze 28°C przez 48-72 godziny, aż pojawią się pojedyncze kolonie.
2. Wybierz pojedynczą kolonię i zaszczep 5 ml bulionu MG/L wzbogaconego biotyną i wcześniejszymi selektywnymi antybiotykami (Tabela 1) i inkubuj w rotacyjnym shakerze o temperaturze 28 °C przy 200 obr./min przez 16 godzin.
3. Przełóż inokulum do stożkowej kolby z bulionem o pojemności 250 MG/L i inkubuj w obrotowym shakerze o temperaturze 28 °C przy 200 obr./min przez 16 godzin.
4. Upewnij się, że hodowla cieczowa ma minimalny OD₆₀₀ wynoszący 1,2 za pomocą spektrofotometru. Granuluj bakterie przez wirowanie w dawce 3396 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (około 22 °C). Uzupełnij bulion inokulum 200 μM acetosyringonem (AS).
   UWAGA: Aliquoty filtrującej sterylnej AS przygotowuje się w DMSO w stężeniu roboczym 100 mM i przechowywa w temperaturze -20 °C. Bulion inokulum powinien być przygotowywany na świeżo. AS dodaje się bezpośrednio przed etapem wirowania, aby zminimalizować degradację. Opisy i komponenty mediów wymienione są w Tabeli 1.
5. Aby uniknąć bezpośredniego zakłócenia osadu bakteryjnego, wyrzuć supernatant i ponownie zawiesić osad w bulionie inokulum.
6. Ręcznie mieszaj kolbę tak, aby roztwór miał przedawkowanie₆₀₀ około 0,8.
7. Inkubuj inokulum na shakerze przy 90 obr./min przez 2,5 godziny w temperaturze otoczenia (około 22 °C).
8. Zapisz istotne warunki (hodowla i inokulum OD₆₀₀, stężenie AS i ilość surfaktantu, okres szczepienia oraz liczbę jednostek eksperymentalnych wymaganych dla efektywności przekształcenia.
   UWAGA: Optymalne stężenia w kulturze bakteryjnej i resuspension są niezbędne dla maksymalizacji efektywności transformacji przy jednoczesnym minimalizowaniu nadmiernego wzrostu bakterii. Przed wirowaniem upewnij się, że kultura bakteryjna ma minimalny OD600 na poziomie 1,2; ponownie zawiesz do inokulum OD600 0,8. Poprawki w bulionie indukcyjnym są optymalizowane, aby zwiększyć przemianę bez utraty żywotności regeneracji. Zalecane stężenia to 150-225 μM dla AS i 0,005% dla surfaktantu.
   UWAGA: Wszystkie transgeniczne bakterie i rośliny usypiaj do wyznaczonych pojemników na odpady biologicznie niebezpieczne.

3. Przemiana sadzonek liści R. aquatica

1. Podczas gdy hodowla resuspendacji inokulum przechodzi inkubację, wybierz kilka dwumiesięcznych roślin stadnych, które prezentują zdrowe liście z pełnymi marginesami.
2. Przygotuj tacę do rozmnażania roślin (20 x 30 cm tacy na gniazdo Perma) z 2 warstwami automatycznych ręczników papierowych. Składaj ręczniki papierowe. Namocz ręczniki papierowe sterylną wodą, aby na wierzchu pojawiła się cienka warstwa wody.
   UWAGA: Ustal tackę kontroli negatywnej, w której niezaszczepione rośliny poddają się identycznym warunkom środowiskowym.
3. Upewnij się, że stanowisko laboratoryjne jest wyposażone w 100-500 mL ddH_2O, sterylne pojemniki odpowiednie dla przewidywanej objętości ponownie zawiesowanego inokulum, mikropipetę oraz końcówki.
4. Przed zakończeniem fazy inkubacji szybko usuń dziesięć liści u podstawy ogonków z wybranych roślin stockowych. Umieść rośliny w szalce Petriego z wodą sterylną.
   UWAGA: Kluczowe jest użycie świeżo usuniętej tkanki do inokulacji liści, aby zapobiec ich wysuszeniu.
5. Po 2,5 godzinie pipeta 50 μL surfaktantu do roztworu resuspension o pojemności 1 L (stężenie surfaktantu 0,005%) i delikatnie mieszaj w kolbie, aby wymieszać (Rysunek 2A). Zapewnij dostępność tacy do rozmnażania roślin po szczepieniu (Rysunek 2B).
6. Ustaw stronę odśrodkową do góry i przetnij prostopadle wzdłuż śródżebka na kawałki o długości 1 cm skalpelem (Rysunek 2C).
7. Natychmiast umieść świeżo przycięte liście w probówce o pojemności 50 mL, odpowiedniej do obrotowego mieszacza rurkowego, aby służyć jako szczepionki szczepionkowe.
8. Wlej inokulum do probówki z rośliną w określonej objętości, aby nasycić cały materiał, a następnie mieszaj w mikserze obrotowym przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu inokulacji (rysunek 2D,E).
9. Usuń wszystkie zaszczepione liście z roztworu kleszczami i umieść je bezpośrednio w przygotowanej tacce do rozmnażania.
10. Oddziel i rozłóż namoczone rośliny tak, aby były częściowo, ale nie całkowicie, zanurzone w cienkiej warstwie wody na nasączonych ręcznikach papierowych (Rysunek 2F).
    UWAGA: Utrzymuj warunki aseptyczne i unikaj kontaktu z powierzchniami lub narzędziami używanymi podczas procedur Agrobacterium przed ich dezynfekcją.
11. Każdą tacę zapakuj folią spożywczą i inkubuj w ciemności w temperaturze otoczenia (22°C) przez trzy dni.
12. Po zakończeniu okresu ciemności upewnij się, że tacy są zamknięte przezroczystą folią plastikową i uzupełnij je ddH₂₀, aby utrzymać poziom wilgoci.
13. Przenieś tace do inokulacji do komory wzrostu w warunkach rozmnażania wegetatywnego.
    UWAGA: Skonsoliduj odpady szczepionkowe w pojemniku na odpady, obrób je roztworem wybielacza 10% i utylizuj zgodnie z wytycznymi dotyczących bezpieczeństwa biologicznego.

4. Regeneracja roślin rozetowych i ustanowienie generacji R1-T1

1. Sprawdzaj tacki do szczepień 2-3 razy w tygodniu, aby zapewnić czystość i wilgotność.
   1. Dodaj ddH₂O za pomocą butelki do ściskania. Jeśli jest to możliwe, przed ponownym zamknięciem tacek użyj spryskiwacza, użyj spryskiwacza.
   2. Utrzymuj wysoką wilgotność, wymieniając folię spożywczą, która straciła przyczepność lub wykazuje oznaki skażenia (np. widoczne mętności wody).
2. Wizualnie sprawdź zregenerowane sadzeczki rozet pod kątem właściwości przydatności do przesadzenia. Idealne regeneratory mają nienaruszony pęd z wieloma liśćmi i korzeniami o długości co najmniej 2-3 mm (rysunek 2G).
   UWAGA: Sadzonki rozet transgenicznych regenerują się zazwyczaj wolniej, zwykle osiągając odpowiedniość do przesadzenia 21-28 dni po umieszczeniu w komorze wzrostowej.
3. Akcyza i przeszczep nienaruszone sadzonki rozet transgenicznych w tych samych warunkach co klonalne regeneranty WT.
4. (Opcjonalnie) Zapisz liczbę zregenerowanych transformantów i skoreluj z ich warunkami transformacji, aby ocenić efektywność.
   UWAGA: Zachowaj szczególną ostrożność podczas selekcji. Regeneranty transgeniczne są często małe i łatwo je pomijać. Dokładnie sprawdź zarówno powierzchnie liści adaksialnych, jak i abaksjalnych za pomocą kleszczy, aby zmaksymalizować plastyczność i zminimalizować uszkodzenia.
5. Sadziwka rozety akcyzowej, unikając dotykania liści transgenicznych. Przytnij nadmiar liści bezpośrednio wokół liścia transgenicznego. Przesadź jedną roślinę na doniczkę.
6. Szybko nawoź, podlej i spryszcz każdą roślinę, a następnie umieść ją pod plastikową kopułą, aby utrzymać wilgotność (rysunek 2G,H).
7. Oznacz i zapisz każdą transgeniczną sadzonkę.
8. Zwróć rośliny zawierające transformanty bez pędów, korzeni lub wydają się zbyt małe, by je przesadzić do tacy do rozmnażania w celu dalszego przesiewania. Przeszczep dodatkowe transformanty, gdy wzrost jest wystarczający.
9. Przez pierwszy tydzień codziennie przeszczepiam mgłę i wodę. Upewnij się, że w tacce zawsze jest woda.
10. Usuń i wyrzuć wszelkie przeszczepy, które się zestarzały lub nie wykazują już ekspresji pigmentu RUBY.
    UWAGA: Utylizować wszystkie materiały transgeniczne zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego.

5. Późniejsza regeneracja i ustanowienie niemal klonalnej generacji R2-T1

1. Gdy sadzonki rozetowe rozwiną się w duże, zdrowe rośliny (2 miesiące), usuwa się rozszerzone liście wyrażające RUBIN z pojedynczego siewki (rysunek 2H).
   UWAGA: Chociaż liście wyrażające RUBIN mogą wyglądać jednolicie czerwienie, częściej są to chimeryczne. Oba fenotypy nadają się do rozmnażania. W kolejnych etapach należy stosować standardowe metody mnażenia wegetatywnego.
2. Podziel przekształcone kawałki liści i umieść je w tacce do rozmnażania. Wyraźnie oznacz każdą tacę do rozmnażania odpowiednim identyfikatorem dawcy siewek.
   UWAGA: Nie mieszaj liści z wielu siewek w jednej tacy. Każda sadzonka reprezentuje unikalne wydarzenie transgeniczne i musi być śledzona jako odrębne pokolenie.
3. Przesadzone rośliny R2-T1 (14-28 dni po rozmnażaniu). Przypisz każdej roślinie nowy identyfikator odzwierciedlający jej drugi status. Kontynuuj standardową opiekę po przeszczepie, jak opisano wcześniej (rysunek 2I,J).

Wyniki

Parametry transformacji A. tumefaciens zostały zoptymalizowane, aby skutecznie produkować transgeniczne rośliny R. aquatica wyrażające RUBY, omijając ograniczenia bezpłodności, jednocześnie wykorzystując szybkie tempo bezpłciowej regeneracji (Rysunek 1 i Rysunek 2). Po zaszczepieniu i poddaniu kolejnej 72-godzinnej ciemnej pielęgnacji rośliny zregenerowane rośliny zaczęły rosnąć w ciągu 2 tygodni w opisanych warunkach. Zregenerowane roślinki wykazujące chimeryczne sektory RUBY, które były wystarczająco duże do przesadzenia, znaleziono między 3 a 5 tygodniami po szczepieniu (Rysunek 3) i były nieco mniejsze niż te nieekspresyjne rośliny rozety. Na tacach kontrolnych, dzikich nie znaleziono zregenerowanych roślinek RUBY, co potwierdza, że to zjawisko różni się od fizjologii R. aquatica. Typ bulionu kulturowego bakteryjnego, typ wywaru z inokulum w zawieszeniu, metoda infiltracji oraz okres szczepienia nie różniły się istotnie pod względem zdolności ani szybkości wytwarzania transformantów (Tabela 2 i Tabela 3). Czynniki zabiegowe, które pozytywnie wpływały na efektywność transformacji, obejmowały zwiększone stężenie AS oraz leczenie ekspozycji na auxinę przed inokulacją roślin liściowych. Zwiększone stężenie powierzchniowo czynnego negatywnie wpływało na wydajność i okazało się, że nie jest to odpowiednie.

Wersja R 4.4.2 12,13,14,15 została użyta do analizy danych o liczbie roślin różowych według Poisson General Linear Mixed Model (Poisson GLMM). Jednak w Eksperymencie D (Tabela 2D), gdzie regeneranty eksprimowane w RUBY były badane pod kątem 15-minutowej inokulacji zmodyfikowanej 150 μM AS lub 225 μM AS, model łamał założenia wynikające z niedodyspersji i zamiast tego zastosowano ujemny dwumianowy GLMM.

Dokładnie zbadano wpływ różnych warunków bulionu bakteryjnego i hodowli na efektywność transformacji. Spośród pięciu eksperymentalnych replikatów, użycie bulionu LB Millera lub specyficznego dla transformacji bulionu MG/L skutkowało ekspresją transformantów RUBY przy niemal identycznych parametrach i nie różniły się istotnie pod względem efektów (Tabela 2A). Metody regenerowanych roślinek rozet RUBY z pojedynczych kawałków liści, składających się z 15-60 roślin na zabieg, wahały się od 1,61 ± 0,71 regenerantów wyprodukowanych w eksperymentach wykorzystujących bulion z resuspension hodowli LB i nie-MS (Kontrolny Indukcyjny Bulion, Tabela 1) oraz 3,23 ± 1,13 regenerantów z eksperymentów z MG/L i Zoptymalizowanym Bulionem Indukcyjnym. Pomimo braku istotnej różnicy, z powodu subiektywnych obserwacji, wybrano kulturę MG/L oraz Zoptymalizowany Bulion Indukcyjny (Tabela 1) do przyszłych eksperymentów optymalizacyjnych.

Następnie testowaliśmy czynniki wpływające na obciążenie bakteriami oraz możliwość dostępu do merystematycznej tkanki roślinnej. Spośród ośmiu replikantów (Tabela 2B) zaszczepione rośliny o zwiększonym stężeniu powierzchniowo czynnych o 0,01% wykazały skrajny stres miesiąc później, co skutkowało powstaniem małych, w dużej mierze nieożywialnych regenerantów. Wśród tych replikantów nie było zregenerowanych transformantów, choć stresowany fenotyp regeneranta eksplantów miał pigmentację bordową, brązową i żółtą, więc mogły istnieć potencjalne transformanty. Niezależnie od tego, nieżywotność regenerantów potwierdziła utrzymanie stężenia powierzchniowo czynnego na poziomie 0,005%.

Porównano dwie techniki mechanistyczne, agitację lub infiltrację próżniową, pod względem efektu wprowadzania pożądanego DNA do rośliny gospodarza. Metoda infiltracji kontrolnej, polegająca na zanurzeniu eksplantów w 50 mL ponownie zawiesowanego inokulum i obracaniu w miksze rurkowej, skutecznie wyprodukowała regeneranty ekspresyjne RUBY we wszystkich wymienionych zabiegach. Zastosowana infiltracja próżniowa również wywołała regeneranty z ekspresją RUBY, ale nie różniły się pod względem efektywności transformacji w porównaniu z metodą kontrolną (p = 0,478, Tabela 2D). Zaobserwowano około 2-5 regenerantów ekspresyjnych RUBY na tacę propagacyjną, niezależnie od tego, czy były inokulowane przez infiltrację próżniową, czy fizyczne mieszanie.

Zmienione stężenie acetosyringonu (AS) w inokulum bakteryjnym wyraźnie różniło się pod względem wpływu na efektywność transformacji. Zwiększenie stężenia AS z 150 μM do 225 μM znacząco poprawiło produkcję transgenicznych eksplantów RUBY ekspresyjnych (p = 0,000309, 0,000458; Tabela 3C,D). Spośród czterech eksperymentów każdy zabieg składał się z tacy z 40 identycznie poddanymi szczepieniami szczepionymi roślinami. Osoby zaszczepione w wyższym stężeniu średnio zawierały prawie 5 regenerantów RUBY ekspresyjnych, w porównaniu do 1 transformantu na tacę kontrolnej AS (Tabela 3C). Ponadto efekt AS wydawał się być oddzielny od okresów trwania szczepienia.

Spośród trzech eksperymentów z 15-minutowym okresem szczepienia, w których eksplanty zostały uzupełnione 225 μM AS, znaleziono średnią 7,28 ± 4,13 regenerantów z ekspresją RUBY, co było wyraźnie wyższe niż w leczeniach 150 μM, gdzie tempo regeneracji 2,03 ± 1,32 (Tabela 3D). Nie stwierdzono wyraźnego wpływu na przedział czasowy w kontrolnych terapiach 150 μM AS (p = 0,676), dla których średnia częstotliwość szczepienia 10 minut wynosiła 1,48 ± 0,954 w porównaniu do 1,84 ± 1,230 regenerantów przy szczepieniu 15-minutowym (Tabela 3B). Podobnie, inokulanty leczone 225 μm w ciągu 10 minut regenerowały około 5 roślinek rozety o ekspresji RUBY na jeden zabieg, co nie różniło się wyraźnie od zabiegów inokulantów o długości 15 minut, gdzie wskazano 6-7 regenerantów do tacy zabiegowej (Tabela 3A).

Ponadto testowano roślinny hormon auxin, który wspomaga regenerację roślin w ogóle. Wystawienie świeżo usuniętych fragmentów liści na terapię pulsową auxiną przed szczepieniem miało wyraźny pozytywny efekt na zwiększoną regenerację RUBY w porównaniu z tymi w ddH_2O(p = 0,00969, Tabela 2C). Po umieszczeniu w ddH_2,0wzbogaconym o 285 μM indolu-3-octowego kwasu (IAA), eksplanty wykazywały średnią szybkość transformacji 6,67 ± 1,490 na leczenie, w porównaniu do leczenia wolnego od auxiny, które średnio wynosiło 2,00 ± 0,816 mg.

Natychmiast zregenerowana linia transgeniczna została oznaczona jako generacja R1-T1 (Rysunek 2), z poszczególnymi regenerantami jako liniami. Wszystkie początkowe roślinki rozet R1-T1 wykazywały ekspresję RUBY w postaci chimerycznych liści, z różnorodnymi wzorami chimerycznymi. Najczęściej 1-3 liście roślinek wykazywały wyraźne chimery, gdzie tkanka eksprimowana i nieekspresyjna RUBY rozdzielały się w śródglědzie. Większość miesięcznych siewek R1-T1 zachowała ekspresję chimeryczną (Rysunek 3A), ale znaleziono niewielką liczbę siewek całkowicie wyrażających RUBY.

Bezpłciowo rozmnażane z RUBY-pigmentem chimeryczne sektory z fragmentów liści siewek R1-T1 (Rysunek 3B) zregenerowały się w pełni RUBY lub chimeryczne sadzonki rozetowe R1-T1 w ciągu 2-4 tygodni od wycięcia (Rysunek 3C). Po miesiącu większość siewek R2-T1 wykazywała głównie liście RUBY, a niektóre miały drobne, niewyrażone obszary chimeryczne (Rysunek 3D,E).

Rysunek 1: Protokół i harmonogram propagacji wegetatywnej. Reprezentatywne obrazy ilustrują proces produkcji używany do regeneracji bezpłciowych roślinek rozet. (A) Wycinanie dojrzałych, zdrowych, całych, płatkowanych liści z ukorzenionych roślin macierzystych i cięcie ich na 2-3 kawałki. (B) Umieszczanie roślin w tacce rozmnażającej i utrzymywanie ich w określonych warunkach. Po 3 tygodniach roślinki rozetowe zostały wycięte z roślin i przesadzone do podłoża glebowego. Poniżej znajduje się prawdziwe zdjęcie zregenerowanych rozet wciąż przymocowanych (różowe strzałki) do macierzystego liścia. Te roślinki są na idealnym etapie do przesadzenia. Skala: 10 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Transformacja sadzonek liści R. aquatica i regeneracja transformantów wyrażających transkrypty RUBY . Graficzny przegląd procedury transformacji i produkcji regenerantów transformowanych. (A) Uzyskanie szczepionki bakteryjnej. (B) Przygotowanie tacy do propagacji z jałowym papierem filtracyjnym i wodą. (C) Wycinanie liści na kawałki roślin. (D) Zanurzanie roślin w inokulum. (E) Mieszanie w mikserze obrotowym przez 20 r/1 min przez 10 minut. (F) Rozłożenie nasyconych roślin w tacy, przykrycie plastikową kopułą i inkubacja w ciemnych warunkach przez 72 h. (G,H) Po 1 miesiącu usuwanie nienaruszonych regenerantów z roślin narażonych na Agrobacterium i przesadzanie w celu ustanowienia dojrzałych roślin. (I,J) Powtarzanie kroku propagacji (G,H), aby uzyskać niemal klonalną generację R2-T1. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Bezpłciowo rozmnażane pokolenia linii transgenicznej RUBY . (A) Dojrzałe siewki R1-T1 wykazujące chimeryczne liście wykazujące ekspresję RUBY . Pasek łuski: 1 cm. (B) Dwa z dwudziestu roślin świeżo umieszczone w tacce do rozmnażania z trzymiesięcznej sadzonki pokazanej w (A). Rośliny wykazują chimeryczny wzór RUBY oddzielony w żyłku środkowym. Pasek łuski: 1 cm (C) Zregenerowane roślinki rozetowe R2-T1 z różnym stopniem chimerycznej ekspresji RUBY , miesiąc po wycięciu, przed przeszczepem. Zregenerowane dodatnie pierwiastki RUBY (strzałka marrona). Pasek łuski: 2 cm (D) Siewka R2-T1 widoczna 1 miesiąc po przeszczepie, wykazująca ekspresję RUBI. Pasek łuski: 2 cm (E) Dojrzałe siewki R2-T1 3 miesiące po przeszczepie, wykazujące małe sektory (zielone strzałki). Pasek skali: 2 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Schemat blokowy zoptymalizowanego potoku. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Formuły mediów Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Wpływ czterech parametrów optymalizacyjnych na efektywność transformacji R. aquatica. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Wpływ stężenia acetosyringonu w inokulum na efektywność transformacjiR. aquatica. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

W tym badaniu ustaliliśmy prostą, opartą na bezpośredniej regeneracji stabilną transformację R. aquatica, rośliny płazowej z rodziny Brassicaceae, która rozmnaża się wyłącznie bezpłciowo ^10,16. Nie ustalono jeszcze dokładnego pipeline'u transformacyjnego roślin obojmocnych rozmnażanych wegetatywnie, ani praktyczna transformowalność R. aquatica nie została wykorzystana za pomocą markera wizualnego. Co istotne, ten proces nie wymaga żmudnego, sterylnego procesu hodowli tkanek roślinnych ani specjalistycznych inkubatorów wzrostu. Dzięki temu protokół ten może być szeroko stosowany w różnych środowiskach eksperymentalnych – od laboratoriów badawczych po sale wykładowe.

Spośród różnych testowanych warunków szczepienia i inkubacji, kilka czynników znacząco poprawiło efektywność transformacji. Warto zauważyć, że nieco wyższe stężenie acetosyringonu (AS) oraz stężenie kwasu indol-3 octowego (IAA) pozytywnie wpłynęły na efektywność transformacji (Tabela 1 i Tabela 2). AS to związek fenolowy przyciągający Agrobacterium, który wykazuje poprawę efektywności przemiany roślin w Arabidopsis¹⁷. Fitohormon auxina jest kluczowa dla przeprogramowania komórek roślinnych. Podczas^regeneracji wywołanej raną zaobserwowano szybki wzrost ekspresji genów związanych z auxiną. Z tego powodu można przypuszczać, że egzogenicznie aplikowana auxina (IAA) podczas szczepienia z zewnątrz zwiększa efektywność regeneracji. Jednak nie zaobserwowano różnic w liczbie zregenerowanych sadzenic z trzech badań (57 7,55 vs. 59,67 5,51 dla grupy kontrolnej vs. leczeniowej). Dlatego leczenie auxiną może raczej wspomóc proces transformacji niż samą regenerację.

Niejonowy surfaktant, alksylowany trisilan (znany jako Silwet L-77), znacznie zwiększa efektywność transformacji Arabidopsis za pomocą metody floral-dip³, dlatego jest szeroko stosowany w środowisku biologii roślin. Wśród roślin zmodyfikowanych Silwetem L-77 zaobserwowano minimalny stres roślinny w stężeniu 0,005% (zalecane stężenie dla roślin kwiatowych). Gdy dawka ta została podwojona (0,01%), sadzonki liści R. aquatica zostały poważnie uszkodzone, co skutkowało niemal zerowym odzyskiwaniem transformantów (Tabela 2B). Podczas zanurzania roślin Arabidopsis stosowanie powierzchniowo czynnych zmniejsza napięcie powierzchniowe inokulantów i zwiększa dostęp do pąków kwiatowych. Natomiast jako gatunek rośliny płazowej, R. aquatica rozwija gładkie liście pozbawione trichomów lub grubych skórek⁵. Zwiększona ilość powierzchniowo czynnego powodowała uszkodzenia tkanek liści, co wskazuje, że dla efektywności transformacji w niepowłosionych tkankach liściowych należy priorytetowo traktować czynniki inne niż surfaktant. Surfaktant jest bardziej istotny dla fenotypu połokatego, gdzie ułatwia penetrację tkanek. Po integracji wszystkich testowanych parametrów otrzymuje się potok o najbardziej optymalnych warunkach w postaci diagramu przepływu (Rysunek 4).

Wykorzystanie markera wizualnego, RUBY, jest kluczowe dla tego procesu transformacji. RUBY to syntetyczny reporter kodujący trzy geny kodujące (CYP76AD1, DODA i glukozyltransferaza), które syntetyzują jaskrawoczerwony pigment, betalain¹¹. Gdy ekspresja RUBY była obserwowana u regenerantów R1-T1, wykazywała ekspresję jako czerwone sektory, co wskazuje, że najprawdopodobniej są chimeryczne (Rysunek 2 i Rysunek 3). Wcześniejsze badanie wykazało, że regeneracja R. aquatica pochodzi z naczyniowego kambium ciętego liścia^{sekcja 10}. Co ciekawe, regeneranty R1-T1 czasami wykazują chimeryczną granicę wzdłuż żyłki środkowej, z połową ostrza liścia czerwoną, a drugą zieloną (Rysunek 3A,B). Regeneracja sektorów RUBY czasami przynosiła w pełni czerwone rośliny z czerwonymi korzeniami (Rysunek 3C, bordowa strzałka), które następnie uprawiano w jednolicie czerwone rośliny R2-T1 (Rysunek 3D). Nie zaobserwowano negatywnych skutków nadekspresji RUBY na wzrost i rozwój R. aquatica (Rysunek 3). Na poparcie nie zaobserwowano zauważalnych różnic w rozmiarze i kształcie liści rozety R1-T1 z sektorami RUBY (np. Rysunek 3B). Możliwe, że każdy silny, konstytutywny transgen napędzany przez promotory może zakłócać normalny wzrost roślin i reakcję fizjologiczną.

Czasami te "niemal klonalne" rośliny RUBY rozwijały zielone sektory (rysunek 3E, zielone strzałki), sugerujące cofnięcie lub wyciszanie transgenów. Wskazuje to, że posiadanie widocznego markera, takiego jak RUBY, jest niezbędne do ektopowej ekspresji lub wyciszania (np. RNAi) genu interesującego go w przyszłych badaniach molekularnych, mechanistycznych. Można wprowadzić interesujący transgen do kasety RUBY i obserwować fenotypy w czerwonych, RUBY sektorach. Podsumowując, wykorzystując bezpośrednie przeprogramowanie indukowane przez cięcia liści oraz nieinwazyjny widoczny marker, prosty, efektywny pipeline transformacji jest zoptymalizowany dla R. aquatica, wegetatywnie rozmnażającej się Brassicaceae. Choć jest to poza zakresem tego protokołu, przyszłe zrozumienie dokładnego pochodzenia regeneracji przekształconej R. aquatica może dostarczyć wglądu w przeprogramowanie komórkowe u roślin.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1000 &mikro; L Low Retention LTS filtrowane końcówki pipetyczne	Rainin	30389213
Acetosyringon	Sigma-Aldrich	D134406-1G
Ekstrakt drożdży bacto, techniczny	Fisher Scientific	DF0886-17-0
BD Bacto Agar	Fisher Scientific	214030
BD Difco LB Broth, Miller	Midland Scientific	DIFCO 244610
BD Bacto Suszony trypton	Fisher Scientific	DF0123-17-3
Proszek liofilizowany biotyną	Sigma-Aldrich	B4501-100MG
Przezroczyste kopuły dla tac PermaNest	Rozwiązanie dla uprawców	GD221
Przezroczysta folia spożywcza	Thomas Scientific	22-305654
Gruby wermikulit	Bectine
di-fosforan potasowy bezwodny	Sigma-Aldrich	105109
Jednorazowe szalki Petriego 100 x 15 mm	VWR International	25384-342
D-Mannitol	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Etanol, 200 proof	Fisher Scientific	04-355-720
Stożkowe rurki wirówkowe Falcon 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22
Złożone ręczniki papierowe 9,3" x 10,5"	Kimberly-Clark	2920
Spektrofotometr widzialny GENESYS 30	Thermo Scientific	840-277000
Roztwór gentamicyny	Sigma-Aldrich	G1272-100ML
Hydrat soli sodowej z kwasem L-glutaminowym	Sigma-Aldrich	G1626-100G
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	M8266-100G
Siarczan magnezu, heptahydrat	Sigma-Aldrich	M9546-250G
Inkubator MaxQ 6000	Thermo Scientific	SHKE6000
Hydrat MES	Sigma-Aldrich	M8250-100G
Murashige i mieszanka bazalnej soli Skoog (MS), proszek	Sigma-Aldrich	M5524-50L
MX-RL-pro: Rotisserie Tube Rotator	Scilogex	824222019999
mio-inozytol	Sigma-Aldrich	I7508-100G
Komora Wzrostu Percivala	Percival	AR36L3
Dodatek do ziemi do sadzenia perlitu	Przemysł PVP	PVP105408
Tacy na rośliny z gniazdem stałym 8''x12''	VWR International	470150-476
pH Seven Compact 5220	Mettler Toledo	30019028
Skalpel chroniony	Fisher Scientific	02-688-79
Ryfampycyna	Sigma-Aldrich	R3501-5G
Nawóz dla roślin z inteligentnym uwalnianiem	Osmocote	B0071CZTBA
Chlorek sodu	Fisher Scientific	S271-3
Spektrinomycyna dihydrochlorkowata pentahydrat	Sigma-Aldrich	S4014-5G
Butelki z rozpylaczem z pompką do waporyzatora	Thomas Scientific	1141V43
Kwadratowe doniczki o średnicy 3,5"	Growers Nursery Supply Inc.	03GA-0350S
Sacharoza	Sigma-Aldrich	S0389-5KG
Słoneczna #4 Profesjonalna gleba mieszana do uprawy	Sun GRO Ogrodnictwo	1341CFL0028P S
Surfaktant – Silwet L-77	Fisher Scientific	NC1791615
Suszarka próżniowa	The Lab Depot	55207
Rozpuszczalna w wodzie uniwersalna żywność roślinna	Miracle-Gro	160101