Automatyczne rozdzielanie HPLC z wykorzystaniem LC-Mate: zintegrowany powtarzalny automatyczny próbnik i kolektor frakcji do mikroskalowego oczyszczania

Podsumowanie

Opracowano zintegrowany autosampler i kolektor frakcji (LC-mate), aby zautomatyzować powtarzalne separacje HPLC. Kompatybilny z detektorami HPLC generującymi sygnały analogowe, LC-mate zwiększa wydajność systemów obsługiwanych ręcznie i przyspiesza procesy badawcze oparte na wysokowydajnej chromatografii cieczowej.

Streszczenie

Wysokowydajna chromatografia cieczowa (HPLC) odgrywa kluczową rolę w oczyszczaniu związków o wysokiej wartości, odpowiadając rosnącym wymaganiom dziedzin chemii i biologii zarówno w środowisku akademickim, jak i przemysłowym. Jednak powtarzające się ręczne wstrzykiwanie i pobieranie frakcji podczas mikroskalowego oczyszczania znacząco ogranicza efektywność i powtarzalność. Aby przezwyciężyć to wąskie gardło, opracowaliśmy zintegrowany system automatycznego próbkowania i kolektora frakcji, tymczasowo nazwany LC-mate, który automatyzuje powtarzalne separacje, reagując bezpośrednio na sygnały analogowe z detektora HPLC. Instrument zbudowany jest wokół wysokociśnieniowego, sześcioportowego zaworu przełączającego do wstrzykiwania próbki oraz zaworu selektora do zbierania ułamków, a parametry operacyjne są kontrolowane za pomocą intuicyjnego interfejsu dotykowego. LC-mate jest kompatybilny z komercyjnymi detektorami HPLC zdolnymi do analogowego wyjścia i może również umożliwić powtarzalne rozdzielenie trybu elucii gradientowej poprzez synchroniczne wyzwalanie sygnału. Eksperymenty demonstracyjne potwierdziły stabilną pracę i powtarzalne separacje dla oczyszczania produktów naturalnych, co wyraźnie skróciło czas ręcznej manipulacji. System oferuje praktyczne i dostępne rozwiązanie do usprawnienia automatyzacji w tradycyjnych procesach HPLC, łącząc systemy ręczne z w pełni zautomatyzowanymi.

Wprowadzenie

Chromatografia, zapoczątkowana przez M.S. Tswetta na początku XX wieku, przekształciła się w nowoczesną wysokowydajną chromatografię cieczową (HPLC) w latach 60. XX wieku wraz z postępem w instrumentacji ^1,2,3.

Obecnie HPLC odgrywa kluczową rolę w oczyszczaniu związków o wysokiej wartości, odpowiadając rosnącym wymaganiom dziedzin biomedycyny, chemii i biologii zarówno w środowiskach akademickich, jak i przemysłowych. W badaniach akademickich mikroskalowe oczyszczanie produktów naturalnych oraz rozdzielanie cząsteczek chiralnych zależy krytycznie od półprzygotowawczych technik HPLC 4,5,6,7,8. W większości praktycznych przypadków naukowcy wstrzykują część roztworu próbki do kolumny HPLC naraz, zamiast całej, aby uniknąć nieprzewidywalnej utraty próbki lub z powodu ograniczeń objętych kolumną, co sprawia, że wielokrotne wstrzykiwanie próbek i pobieranie frakcji są nieuniknione. Pomimo wyjątkowej zdolności separacji, zastosowanie HPLC do oczyszczania próbek pozostaje ograniczone przez inherentne ograniczenia obecnej instrumentacji i procesów pracy. Głównym ograniczeniem jest silne uzależnienie od interwencji manualnej, szczególnie przy iniekcjach próbek i pobieraniu frakcji. Procesy te są nie tylko czasochłonne i pracochłonne, ale także podatne na błędy ludzkie, co obniża przepustowość, powtarzalność i ogólną efektywność operacyjną ^9,10.

Komercyjne autosamplery i kolektory frakcji od głównych producentów HPLC, takich jak Agilent, Shimadzu i Waters, zapewniają niezawodną i precyzyjną automatyzację, ale zazwyczaj są ograniczone do ekosystemów sprzętowych i programowych zastrzeżonych. Na przykład autosampler Agilent 1260 Infinity II oraz kolektor frakcji G1364F są bezproblemowo zintegrowane z systemami HPLC firmy Agilent, zapewniając doskonałą powtarzalność, ale ograniczoną kompatybilność międzyplatformową. Podobnie, autosamplery SIL-20A/40C firmy Shimadzu oraz kolekcjonery frakcji FRC-40/FRC-10A oferują dużą przepustowość i doskonałą precyzję mechaniczną, a jednocześnie opierają się na architekturach sterowania LC-20 i Nexera Shimadzu. Moduły autosamplera HPLC i kolektora frakcji III firmy Waters Alliance również zapewniają solidne parametry i elastyczne formaty zbierania (do 300 mL/min), ale pozostają dostosowane do autorskich środowisk UHPLC i LC-MS firmy Waters. Ponadto tradycyjne automatyczne próbkatory oparte na igłach do wtrysków mogą ograniczać odzyskiwanie próbki, a kolektory frakcji oparte na rurkach mogą być niewygodne przy obsłudze dużych objętości eluentów. W przypadku większości innych instrumentów HPLC separacja półprzygotowawcza nadal zależy od żmudnej, powtarzalnej pracy manualnej.

Te wyzwania podkreślają potrzebę innowacyjnego podejścia do automatyzacji oczyszczania próbek w procesach HPLC. Aby sprostać tej potrzebie, opracowaliśmy LC-mate, kompaktowy i wszechstronny instrument, który integruje moduły autosamplera i kolekcji ułamków w jednej platformie. Rdzeń płynowy LC-mate składa się z dwóch kluczowych elementów: wysokociśnieniowego, sześciokanałowego zaworu przełączającego (SKVA-3130-S) wykonanego ze stali nierdzewnej SUS 316 o przepływie 0,4 mm i obsługującego ciśnienie robocze do 45 MPa, co pozwala precyzyjnie kontrolować wtrysk próbki, oraz 10-kanałowego wielopozycyjnego zaworu selektora o minimalnej martwej objętości (27,5 μL port-port, Rowek wirnika o pojemności 5 μL) o średnicy kanału przepływowego 1,2 mm dla efektywnego zbierania frakcji. Ta konfiguracja minimalizuje objętość martwą i zmniejsza ryzyko zanieczyszczenia krzyżowego. Szczegółowe specyfikacje przyrządów można znaleźć w Tabeli 1. LC-mate może odbierać analogowe wyjście z detektorów HPLC i uruchamiać instrument HPLC za pomocą sygnału synchronicznego, umożliwiając niezależną kontrolę zarówno wstrzykiwania próbki, jak i zbierania frakcji.

Tabela 1: Parametry instrumentów związanych z LC-mate. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Instrument wyposażony jest w przyjazne dla użytkownika oprogramowanie sterujące oraz intuicyjny interfejs dotykowy, który umożliwia wizualizację analogowych sygnałów chromatograficznych w czasie rzeczywistym. LC-mate obsługuje zarówno tryby separacji izokratycznej, jak i gradientowej, umożliwiając użytkownikom konfigurację kluczowych parametrów – w tym objętość wstrzykiwania, liczbę powtórzeń, czas interwału każdego wniesionka oraz tryb zbierania [oparty na progu, czasowy lub Collect All (zbieranie ułamków powyżej i poniżej progu)], oraz uruchamianie w pełni zautomatyzowanej pracy jednym poleceniem. Eliminuje to potrzebę powtarzalnej interwencji ręcznej i znacząco zwiększa efektywność oczyszczania HPLC.

Rysunek 1 ilustruje ogólny wygląd, zasadę działania oraz konfigurację LC-mate zintegrowanego z systemem HPLC. Demonstracja zasady działania znajduje się w Dodatkowym Wideo 1.

Rysunek 1: Projekt i konfiguracja systemu LC-mate. (A) Schemat układu. (B) Schemat przyrządów. (C) Zdjęcie praktycznego ustawienia. (D) Połączenie linii transmisyjnej sygnału między detektorem UV a LC-mate. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Protokół

1. Sprawdzanie połączenia

1. Sprawdź połączenia rozpuszczalnikowe między HPLC, LC-mate a kolumną chromatograficzną, aby zapewnić prawidłowe ścieżki przepływu (rysunek 1A).
2. Sprawdź połączenie linii transmisyjnej sygnału między detektorem UV a LC-mate, jak pokazano na Rysunku 1D.
   1. Podłącz przewód do czerwonego zacisku, a biały do czarnego zacisku, aby dopasować polaryzację sygnału analogowego.
   2. Obserwuj wyświetlacz LC-mate. Jeśli pojawi się analogowy przebieg sygnału, połączenie jest poprawne.
      UWAGA: Jeśli nie widać przebiegu, odwróć połączenia: podłącz przewód do czarnego zacisku, a biały przewód do czerwonego zacisku.
3. Sprawdź połączenie spustu między detektorem UV a LC-mate.
   1. Podłącz pojedynczy koniec kabla danych do portu wyjściowego detektora UV.
   2. Podłącz i biały przewód z drugiego końca odpowiednio do niebieskiego i czarnego zacisku wyzwalającego LC-mate.
   3. Dokręć zacisk i spust, aby zapewnić solidne połączenie.

2. Uruchomienie zintegrowanego systemu separacji

1. Upewnij się, że HPLC uruchamia się prawidłowo.
2. Upewnij się, że LC-mate jest prawidłowo uruchamiany.
   1. Po uruchomieniu systemu LC-mate kliknij ikonę LC-mate w interfejsie, aby automatycznie uruchomić program samotestu systemu i zainicjować kluczowe moduły sprzętowe.
   2. Poczekaj na krótki sygnał powiadomienia Di (około 0,5 s) i zniknięcie komunikatu "Samotestowanie" na ekranie po zakończeniu samotestu, ponieważ oznaczają, że inicjalizacja została zakończona.

3. Optymalizacja warunków

1. Konfiguruj warunki separacji HPLC i rozpocznij elucię, aby osiągnąć równowagę kolumny.
2. Kliknij ikonę Test po lewej stronie ekranu LC-mate, a na ekranie pojawi się następujący interfejs (Rysunek 2A). Wprowadź parametry Volume Injection, Elucia oraz Repetition Times oraz naciśnij ikonę Start ; zostanie zainicjowane uruchomienie autosamplera, kolektora ułamków i HPLC. W takim przypadku eluent wypływa tylko przez port 10 zaworu selektora i może być pobierany ręcznie lub wyrzucany.
3. Zidentyfikuj możliwe warunki separacji, w tym rozdzielczość, czas działania, czas retencji, objętość wtrysku oraz długość fali UV itp., aby ułatwić późniejsze rozdzielanie i zbieranie frakcji w odpowiednich trybach.

4. Automatyczne uruchamianie

UWAGA: Na podstawie chromatogramu możliwych warunków separacji można wybrać odpowiedni sposób zbierania frakcji z opcji Threshold, Timing Collection i Collect All po lewej stronie interfejsu.

1. Zbieranie ułamków na podstawie wartości progowej
   1. Wybierz moduł funkcji Threshold po lewej stronie interfejsu, a system wyświetli interfejs ustawień parametrów, jak pokazano na Rysunku 2B.
   2. Wprowadź objętość wstrzykiwania, czas powtórzeń, próg i czas elucii, i naciśnij start; HPLC i LC-mate będą działać automatycznie. Frakcje z pikami chromatograficznymi przekraczającymi próg będą zbierane w różnych butelkach zbiorczych.
   3. Monitoruj wskaźniki statusu ułożone pionowo na wyświetlaczu: Obserwuj iniekcję w trakcie , aby potwierdzić, że wprowadzenie próbki zostało rozpoczęte. Sprawdź separację w trakcie, aby upewnić się, że separacja chromatograficzna faktycznie zatrwa. Zwróć uwagę na "opróżnianie strzykawki", aby rozpoznać, kiedy strzykawka oczyszcza resztki płynu. Obserwuj niebieskie podświetlenie odpowiadającego tekstu, aby potwierdzić, który stan operacyjny jest aktualnie aktywny.
      UWAGA: Podczas procesu separacji naciśnięcie ikony "Chromatogram" wyświetla chromatogram i linię progową na nowym interfejsie, a chromatogram jest identyczny z tym, który pokazuje ekran komputera sterującego HPLC.
2. Zbieranie ułamków na podstawie okresu
   1. Wybierz moduł Timing Collection z lewej strony interfejsu, aby otworzyć menu ustawień parametrów (Rysunek 2C).
   2. Wprowadź wymagane parametry: objętość wstrzykiwania, czasy powtórzeń, czas elucii oraz serię potrzebnych czasów zbierania.
   3. Naciśnij przycisk start , aby uruchomić automatyczną sekwencję, a następnie system HPLC i LC-mate będą działać wielokrotnie zgodnie z ustawionymi parametrami.
3. Zbieranie ułamków w trybie "Collect All"
   1. Wybierz moduł funkcji Collect All po lewej stronie interfejsu, system wyświetli interfejs ustawień parametrów, jak pokazano na Rysunku 2D.
   2. Ustaw wartość progu zbioru, a piki chromatograficzne powyżej lub poniżej progu będą zbierane oddzielnie, co może gwarantować, że żaden związek w mieszaninach nie zostanie utracony.
      UWAGA: Acetonitryl to łatwopalny i toksyczny rozpuszczalnik. Wszystkie procedury z użyciem acetonitrylu lub innych rozpuszczalników organicznych muszą być wykonywane w dobrze wentylowanym pomieszczeniu laboratoryjnym. Personel musi zawsze nosić odpowiedni sprzęt ochrony osobistej (PPE), w tym okulary chemiczne przeciw rozprysku oraz rękawice odporne na rozpuszczalniki. Odpady acetonitrylu i innych rozpuszczalników organicznych muszą być zbierane w wyznaczonych, odpowiednio oznakowanych pojemnikach na niebezpieczne odpady chemiczne. Strumienie tych odpadów były obsługiwane zgodnie z protokołem zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego naszej instytucji przez licencjonowaną usługę utylizacji.

5. Oczyszczanie rurociągów

UWAGA: Czyszczenie rurociągu zapewnia, że żadna próbka nie pozostaje w rurociągu podczas następnego użycia autosamplera.

1. Przygotuj małą butelkę z czystym rozpuszczalnikiem i włóż rurociąg wtryskowy autopróbkatora do rozpuszczalnika.
2. Wybierz moduł Oczyszczania z lewego interfejsu, aby otworzyć menu ustawień parametrów (Rysunek 2E).
3. Czyszczenie rurociągu wtryskiwacza
   1. Ustaw objętość wstrzyknięcia w zakresie od 0 do 1000 i ustaw Czasy Powtórzeń (bez ograniczeń).
   2. Kliknij na Oczyszczanie poniżej "Czyszczenie zakończone", aby rozpocząć oczyszczanie rurociągu wtryskowego.
   3. Monitoruj liczbę "cykli", aby śledzić liczbę zakończonych cykli prania.
4. Oczyszczanie pociągu zbiorczego
   1. Ustaw czas oczyszczania (bez ograniczeń).
   2. Kliknij na Oczyszczanie poniżej "Aktualnego Pipeline", aby rozpocząć oczyszczanie pociągu zbiorowego.
   3. Monitoruj wyświetlacz Current Pipeline , aby potwierdzić, który potok jest czyszczony, podczas gdy system przetwarza proces kolejno od pipeline 0 do pipeline 10.

Rysunek 2: Interfejs dotykowy LC-mate do obsługi metody. (A) Ekran optymalizacyjny. (B) Tryb progowy. (C) Tryb pomiaru czasu. (D) Tryb zbierania wszystkiego. (E) Oczyszczanie rurociągów. (F) Ustawienia. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

6. Instrukcje zapisywania danych

1. Włącz automatyczne zapisywanie. System automatycznie zapisuje chromatogram po zakończeniu każdego cyklu elucii.
2. Wykonaj ręczne zapisywanie. Kliknij przycisk Zapisz po zakończeniu elucii. Wprowadź wymagane metadane w oknie dialogowym, aby zapisać plik.
3. Wybierz miejsce przechowywania. Wybierz zapis plików na lokalnej pamięci urządzenia, na karcie SD lub na zewnętrznym pendrive'ie.
   UWAGA: Używaj zewnętrznego pendrive'a do wszystkich danych danych, aby uniknąć ograniczeń pojemności i zapewnić łatwy dostęp do danych.

Wyniki

Oczyszczanie 2"-O-galloyl-hiperozydu
2"-O-Galloyl-hiperozid (2-GH) to główny, rozpuszczalny w wodzie składnik Euphorbia helioscopia L., tradycyjnej medycyny chińskiej o długiej historii stosowania do usuwania flegmy i wilgoci¹¹. Jego struktura chemiczna przedstawiona jest na Rysunku 3. Niedawno stwierdzono, że 2-GH wykazuje działanie przeciwfibrotyczne w modelu^zwierzęc...

Dyskusja

Wyniki te pokazują, że system LC-mate może autonomicznie wykonywać ciągłe wstrzykiwanie próbek i pobieranie frakcji zgodnie z ustalonymi parametrami, co znacząco minimalizuje ręczną interwencję i zwiększa efektywność separacji. System posiada przyjazny dla użytkownika interfejs, wymagający jedynie wstępnej konfiguracji sprzętowej, a następnie intuicyjnej obsługi ekranu dotykowego.

Aby zapewnić sukces eksperymentu, trzy kluczowe aspekty wymagają uwagi. Po pierwsze, analogowe kable sygnałowe i w...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Wysokowydajny chromatograf cieczowy – EasySep-1050	Shanghai Tongwei Analysis Technology Co., Ltd. Strona internetowa instrumentu EasySep®-1050 https://www.instrument.com.cn/netshow/sh100522/C140238.htm	1009992	Modułowy, przygotowawczy system HPLC stosowany w protokole. Zawiera pompę dostarczającą rozpuszczalnik, detektor UV/VIS oraz ręczny zawór wtryskowy. System ten stanowi jednostkę separacji rdzeniowej, którą LC-mate automatyzuje.
(Kolumna chromatograficzna cieczy) Sharpsil-U C18 150 mm (lewa) i czas; 30 mm (identyfikacja) S-10 & mikro; m, 100A	Shanghai Xuanmei Industrial Development Co., Ltd.	U180110-300150	Odwrócone - kolumna chromatograficzna fazy C18 o rozmiarze cząstek 10 μ m oraz pory o rozmiarze 100 Å. Jest zaprojektowany do rozdzielania małych cząsteczek (takich jak leki, związki organiczne) i charakteryzuje się dobrą powtarzalnością oraz stabilnością. Wymiary kolumny (150 mm długości, 30 mm średnicy wewnętrznej) sprawiają, że nadaje się do chromatografii przygotowawczej lub półpreparatywnej.
LC-mate	Shanghai Betterren Medical Technology Co., Ltd. W przypadku wszelkich zapytań dotyczących   instrument LC-mate, prosimy o kontakt z autorem korespondencyjnym pod adresem e-mail: wmzhao@simm.ac.cn	GD202200337	Sprzęt pomocniczy do systemów chromatografii cieczowej, prawdopodobnie używany do wtrysku próbek, mobilnego zarządzania fazą lub pozyskiwania danych. Może być zintegrowany z systemami HPLC, aby poprawić automatyzację i efektywność procesów eksperymentalnych