Generowanie interaktywnych trójwymiarowych wizualizacji przestrzennych liczebności mikroorganizmów w żółcie drobiu za pomocą RStudio

Summary

Przedstawiamy tutaj protokół do generowania interaktywnej trójwymiarowej wizualizacji liczebności mikroorganizmów i pH w zagrodzie drobiu, wykorzystując dane z próbek opartych na siatce.

Abstract

Tradycyjne oceny mikrobiologii i składu fizykochemicznego żwirku drobiu często opierają się na statycznych tabelach lub dwuwymiarowych wizualizacjach, które mogą nie oddać przestrzennej heterogeniczności środowiska zagrody. Protokół ten opisuje interaktywne trójwymiarowe (3D) wizualizacje, które integrują dane z enumeracji mikroorganizmów oraz parametry środowiskowe na terenie zagrody dla drobiu. Do przybliżenia próbkowania piórem zastosowano układ oparty na siatce, a najpierw generowano symulowane zbiory danych, aby zademonstrować ten przepływ pracy. Eksperymentalny zbiór danych został wykorzystany do oceny gradientów przestrzennych względem cech środowiskowych, w tym linii wodnej, podajników i wejścia do zagrody. Dane były przetwarzane w RStudio za pomocą plotly do generowania interaktywnych wykresów 3D. Obciążenia bakteryjne tlenowe wahały się od 5,9 do 8,6 log₁₀ CFU/g, z wyraźnie większą liczebnością w pobliżu linii wodnej (P = 0,023) i niższymi liczbami w coraz większej odległości od obiektu. Uzyskane wykresy powierzchniowe wizualnie uwidoczniły skupienie populacji mikroorganizmów wokół obszarów bogatych w wilgoć i pokazały użyteczność ram do interpretacji wzorców przestrzennych społeczności mikroorganizmów w ośmiele drobiu. Chociaż potrzebna jest dalsza ocena w warunkach komercyjnych drobiu, obecny protokół zapewnia powtarzalną metodę wizualizacji i analizy przestrzennej heterogeniczności w zbiorach danych o ściółce drobiu.

Introduction

Przemysł drobiarski obejmuje systemy produkcji niosek i brojlerów, z których każdy generuje znaczne ilości żółty drobiowej poprzez gromadzenie materiału ściółki, odchodów, cząstek paszy, piór, połamanych skorupek jaj oraz wilgoci w czasie ^1,2,3. Ten miot może wspierać różne populacje mikroorganizmów, pochodzące z ptaków, owadów, gryzoni i aerozoli ^2,3. Niektóre z tych mikroorganizmów mogą obejmować patogeny, takie jak Salmonella, które mogą powodować choroby u ptaków i stanowić zagrożenie dla zdrowia publicznego². Ponieważ żółtka drobiowa może być stosowana na lądzie jako nawóz ^4,5, zrozumienie rozmieszczenia mikroorganizmów ma znaczenie dla monitoringu środowiskowego, zdrowia stad oraz bezpieczeństwa żywności.

Reprezentatywne pobieranie próbek ściółki drobiu jest zatem ważne dla charakteryzacji społeczności mikroorganizmów i wykrywania potencjalnych patogenów. Metody pobierania próbek żołków drobiu są badane od kilku dekad, w tym wymazy drag, zbieranie odchodów, bezpośredni odwóz żwirku, jednorazowe pokrowce na buty lub skarpetki ^6,7. Jednak miejsce pobrania próbek w dużym stopniu decyduje o tym, jak dobrze dane odzwierciedlają ogólne warunki dotyczące żwirku drobiu. Ponieważ ptaki poruszają się po całym domu, a elementy środowiskowe, takie jak podoje, karmniki, wentylatory oraz poduszki chłodzące lub grzewcze, tworzą lokalne środowiska, populacje drobnoustrojów i czynniki odżywcze w odruchu drobiu nie są równomiernie rozmieszczone 3,8,9,10. Dlatego uwzględnianie heterogeniczności przy interpretacji danych związanych ze ściółką jest kluczowe dla skutecznego zarządzania i utrzymania zdrowia stada.

Podejścia do mapowania przestrzennego zostały szeroko stosowane w agronomii i gleboznawstwie do wizualizacji heterogeniczności mikroorganizmów i fizykochemicznych oraz zlokalizowanych hotspotów^11,12. Jednak gdy dane o żółcie drobiu są zbierane w wielu regionach w zagrodzie, trudno jest odczytać trendy przestrzenne na podstawie wartości^{liczbowych 8,9}. Trójwymiarowa (3D) wizualizacja oferuje praktyczne podejście do integracji pomiarów mikrobiologicznych i fizykochemicznych z współrzędnymi przestrzennymi, aby generować interaktywne modele powierzchni^13,14. W porównaniu ze statycznymi modelami 2D, modele 3D umożliwiają rotację, powiększanie i oddalanie oraz wizualizację gradientów na podstawie głębokości na siatce próbkowej, co może poprawić interpretację wzorców przestrzennych w środowisku kurniku.

Obecny protokół opisuje uporządkowane i powtarzalne podejście do generowania interaktywnych wizualizacji 3D na podstawie danych mikrobiologicznych i fizykochemicznych drobiu, zbieranych przy użyciu układu siatkowego i analizowanych w RStudio. Najpierw do demonstracji procesu wizualizacji używa się symulowanych danych mikrobiologicznych i fizykochemicznych, a następnie stosuje się podejście do eksperymentalnego liczenia mikroorganizmów żołków drobiu. Celem tego protokołu jest zapewnienie powtarzalnych ram do wizualizacji przestrzennej heterogeniczności w zbiorach danych o ściółce drobiu oraz wsparcie interpretacji wzorców rozmieszczenia mikroorganizmów w odniesieniu do cech domów drobiowych.

Protocol

Protokół ten wykorzystuje symulowany zbiór danych dla wartości mikroorganizmów i pH do prezentacji każdego etapu procesu wizualizacji, a następnie stosuje się do eksperymentalnych liczeń mikroorganizmów na żołądze drobiu, aby zilustrować użycie danych eksperymentalnych i wspierać statystyczną interpretację powiązań mikrobiologicznych związanych z odległością. Nie przeprowadzono żadnych zabiegów na żywych zwierzętach. Próbki żwirku pobrano z zagrody drobiarskiej bez bezpośredniego kontaktu ze zwierzętami. Dlatego nie było wymagane zatwierdzenie instytucjonalnej opieki nad zwierzętami.

1. Zbieranie próbek żwirku drobiu i generowanie danych o liczebności mikroorganizmów

1. Ustal siatkowy układ próbkowania w zagrodzie dla brojlerów, stosując stałe odstępy między zagrodą.
   UWAGA: W mniejszych długopisach można to zrobić za pomocą siatki sznurków, natomiast większe długopisy mogą używać znaczników flagowych do oznaczania każdego miejsca próbkowania. Siatka zazwyczaj zaczyna się w lewym dolnym rogu długopisu, który jest traktowany jako punkt startowy. Każde miejsce próbkowania jest rejestrowane według swojej pozycji w siatce.
2. Zapisz współrzędne X i Y każdego miejsca pobierania próbek oraz punktów środowiskowych, takich jak dokarmniki, linia wodna, lampa grzewcza i wejście w tej samej siatce, używając pojedynczego miejsca lub linii reprezentującej ich pozycję.
   UWAGA: Kierunek X biegnie wzdłuż długości pióra, a kierunek Y przebiega przez szerokość.
3. Uwzględnij kolumnę "Pen" w zbiorze danych, aby zidentyfikować pióro lub grupę leczenia dla każdego miejsca pobierania próbek (np. "P1", "P2").
   UWAGA: Grupowanie według pióra zapewnia, że analizy przestrzenne są przeprowadzane w odpowiednich warunkach mieszkaniowych. Do tej demonstracji zdefiniowano ustrukturyzowaną siatkę 6 × 10 na powierzchni pióra, co dało 60 miejsc próbkowania (n = 60) z jednego pióra. Siatka 6 × 10 została wybrana, aby zapewnić jednolity pokrycie przestrzenne na całym zapiórze, z symetrycznym, równomiernym układem. Przykład układu siatki pokazano na Rysunku 1.
4. W każdym miejscu pobierania próbek zbieraj trzy próbki ściółki do analizy mikrobiologicznej lub fizykochemicznej. Do testów mikrobiologicznych zważ 10 g żwirku na replikę i umieść go w 90 mL sterylnej wody buforowanej z peptonem, aby wykonać pierwsze rozcieńczenie (10⁻¹). Dokładnie wymieszaj próbkę, aby ujednolicić zawiesinę.
5. Przygotuj 10-krotne seryjne rozcieńczenia próbki mieszanej żwirki i nakładaj 0,1 mL każdego rozcieńczenia na płytki agarowe.
   UWAGA: W zależności od grupy badanych bakterii można stosować różne media. Na przykład bakterie tlenowe mogą być nakładane na tryptyczny agar sojowy (TSA), bakterie kwasu mlekowego na agarze MRS, a Enterobacteriaceae na agarze MacConkey.
6. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny, a następnie policz widoczne kolonie. Oblicz obfitość mikroorganizmów jako jednostki tworzące kolonie na gram ściółki (CFU/g), używając:
   CFU/g = (kolonie liczone × współczynniku rozcieńczenia) ÷ objętości powłoki
7. Raportuj średnią wartość w różnych replikacjach.
   UWAGA: Granica wykrywania jest określana przez objętość powłoki (0,1 mL), odpowiadającą około 10 CFU/mL w zawiesinie pokrytej lub 100 CFU/g ściółki w oryginalnej próbce.
8. Zapisz wyniki enumeracji mikroorganizmów w arkuszu kalkulacyjnym w formacie numerycznym do dalszej analizy statystycznej i wizualizacji.
9. Stwórz plik CSV z następującymi kolumnami: ID próbki, X (współrzędna przestrzenna), Y (współrzędna przestrzenna), Xnum (numeryczna kolejność sortowania dla X, opcjonalna) oraz liczby mikroorganizmów lub parametry fizykochemiczne, takie jak pH. Przykład symulowanego arkusza tabeli przedstawiono na Rysunku 2.
10. Generuj symulowane wartości obfitości mikroorganizmów przy użyciu normalnie rozkładanych wartości losowych. Zdefiniuj średnią, odchylenie standardowe i zakres na podstawie pomiarów empirycznych. Zastosuj stały losowy seed, aby zapewnić powtarzalność. Wprowadź gradienty przestrzenne na siatce i dodaj drobne losowe zmiany, aby uniknąć jednolitych wzorców.
    UWAGA: Parametry symulacji używane do generowania danych, w tym typ rozkładu, zasięg i struktura przestrzenna, są podsumowane w Tabeli 1.

2. Skonfiguruj środowisko obliczeniowe

1. Zainstaluj i załaduj niezbędne pakiety do obliczeń statystycznych.
   install.packages(c("plotly"))
   Biblioteka (fabuła)
2. Zaimportuj zbiór danych CSV do środowiska obliczeniowego i ustaw katalog roboczy.
   setwd("path/to/your/folder")
   Zbiór danych <- read.csv("path_to_your_file.csv")
   UWAGA: Zbiór danych wejściowych powinien być zorganizowany w formacie arkusza kalkulacyjnego (plik CSV), przy czym każdy wiersz powinien reprezentować pojedynczą lokalizację próbkowania. Wymagana struktura danych wejściowych oraz definicje zmiennych są podsumowane w Tabeli 2.

3. Przygotowanie i formatowanie danych

1. Sprawdź plik CSV pod kątem brakujących lub niespójnych wartości.
   Podsumowanie (zbiór danych)
   any(is.na(dataset))
2. Czyść zbiór danych w razie potrzeby, usuwając wartości 'NA'.
   Dataset <- na.omit(dataset)
3. Aby znormalizować i poprawić wizualizację wykresów, należy stosować liczenie mikrobiologiczne w sposób logarytmiczny.
4. Standaryzuj nazwy zmiennych za pomocą spójnej notacji opartej na podkreśleniach (np. log10_CFU_A i log10_CFU_B), aby poprawić czytelność i powtarzalność.
5. Zastosuj transformację log10 do danych o liczbie mikroorganizmów, aby ustabilizować wariancję i dostosować ją do standardowych praktyk raportowania CFU.
   Dataset$Log10_CFU_A <- log10(Dataset$OrganismA_counts + 1)
   Dataset$Log10_CFU_B <- log10(Dataset$OrganismB_counts + 1)
6. Upewnij się, że wartości współrzędnych X i Y są numeryczne. Jeśli dane są alfabetyczne, przelicz na wartości liczbowe, aby dokładnie odpowiadały miejscom próbkowania na siatce.
   UWAGA: Ostateczny zbiór danych powinien zawierać wszystkie unikalne identyfikatory w systemie współrzędnych pióra, numeryczne współrzędne przestrzenne oraz liczenie mikrobiologicznych transformacji logarytmicznej.

4. Generuj interaktywne wizualizacje 3D

1. Przed skonstruowaniem macierzy przestrzennej zweryfikowaj strukturę zbioru danych, aby upewnić się, że siatka może być poprawnie wygenerowana. Następnie przygotuj macierze danych przestrzennych, łącząc wiele części, takich jak współrzędne przestrzenne i liczebność bakterii przekształconych logarytmicznie, aby dopasowały się do układu siatki pióra.
   UWAGA: Kod grupuje obserwacje według Pen, X i Y, oblicza średnią Log10_CFU_A w każdym punkcie siatki, a następnie przekształca wartości w macierz na podstawie unikalnych współrzędnych X i Y w zestawie danych.
   org1_means <- agregat(Log10_CFU_A ~ Pióro + Y + X,
   dane = zbiór danych,
   ZABAWA = złośliwe,
   na.rm = PRAWDA)
   org1_P1 <- podzbiór(org1_means, Pen == "P1")
2. Uporządkuj punkty tak, aby macierz poprawnie odwzorowała
   x_vals <- sort(unique(org1_P1$X))
   y_vals <- sort(unique(org1_P1$Y))
   ncol_grid <- długość (x_vals)
   nrow_grid <- długość(y_vals)
   org1_mat_P1 <- matryca (org1_P1$Log10_CFU_A,
   nrow = nrow_grid,
   NCOL = ncol_grid,
   byrow = NIEPRAWDA)
3. Upewnij się, że nie brakuje wartości, aby graf wyglądał gładko.
   for(i in 1:ncol(org1_mat_P1)) {
   org1_mat_P1[is.na(org1_mat_P1[,i]), i] <- mean(org1_mat_P1[,i], na.rm=PRAWDA)
   }
4. Zwizualizuj liczenie mikroorganizmów przestrzennie jako 3D.
   UWAGA: Dla tego grafu rozmiar siatki odzwierciedlał układ przestrzenny zbioru danych
   rys. A <- plot_ly(
   x = x_vals,
   y = y_vals,
   z = org1_mat_P1,
   typ = "powierzchnia", skala kolorów = lista(
   c(0, "ciemnoniebieski"),
   c(1, "zielony")
   )
   )
5. Dodaj elementy środowiskowe, takie jak linia wodna, aby pomóc w wizualizacji odległości liczenia mikroorganizmów lub innych parametrów śmieci do tego miejsca, pozwalając użytkownikom zobaczyć wzorce przestrzenne.
   figA < - figA %>%
   add_trace(
   x = c(1, 5),
   y = c(6, 6),
   z = c(8.5, 8.5),
   typ = "scatter3d",
   mode = "linie",
   linia = list(kolor = "#1f77b4", szerokość = 8),
   nazwa = "Linia Woda"
   ) %>%
   add_text(
   x = 3, y = 6, z = 8,6,
   tekst = "Linia Woda",
   textfont = lista (rozmiar = 14, kolor = "ciemnoniebieski"),
   showlegend = FALSE
   ) %>%
   layout(
   tytuł = "Symulowany organizm A",
   scena = list(
   xaxis = lista (tytuł = "współrzędna X", tickvals = x_vals),
   yaxis = lista (tytuł = "współrzędna Y", tickvals = y_vals),
   zaxis = list(title = "log10 CFU")
   )
   )
   rys. A
6. Sprawdź Plik Uzupełniający 1 , gdzie znajdziesz kod używany do wizualizacji poziomów pH w zagrodzie drobiu.

5. Zastosowanie modelu 3D do eksperymentalnych liczeń mikroorganizmów żółtów drobiu

1. Zbieraj próbki żwirku drobiu z określonego układu siatki w zagrodzie i rejestruj miejsca pobierania próbek za pomocą współrzędnych przestrzennych.
   UWAGA: W tym badaniu próbki pobrano z zagrody drobiowej na Uniwersytecie Wisconsin w Madison, WI, przy użyciu określonego układu siatki. Próbki pobrano według siatki o wymiarach 5 × 7 m.
2. Zważ określoną ilość ściółki z każdego miejsca pobierania próbek i zawiesi ją w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) lub równoważnym rozcieńczalniku, aby przygotować początkowe rozcieńczenie.
   UWAGA: W tym badaniu zebrano 1 g ścielki na miejsce za pomocą worków Whirl-Pak i rozcieńczono w proporcji 1:10 w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
3. Przeprowadz enumerację mikroorganizmów, nakładając próbki żółty na odpowiedni podłoże wzrostu i inkubując je w odpowiednich warunkach.
   UWAGA: W tym badaniu próbki zostały powielone pokrycie metodą dot-platingu na tryptycznym agarze sojowym (TSA) i inkubowane w temperaturze 37 °C przez 24 godziny. Materiały potrzebne do wyliczania mikroorganizmów są wymienione w Tabeli Materiałów.
4. Ilościowo określ obfitość mikroorganizmów jako jednostki tworzące kolonie (CFU) i zastosuj transformację log₁₀ do danych do analizy.
5. Integruj przetworzone dane mikrobiologiczne z procesem obliczeniowym i formatuj je zgodnie z wymaganą strukturą wejściową.
6. Generuj trójwymiarową wizualizację przestrzenną, używając opisanych powyżej metod, aby zobrazować obfitość mikroorganizmów w całym piórze.
   UWAGA: W tym badaniu wygenerowano wizualizację ukazującą obfitość bakterii tlenowych na próbkowanym zagrodzie.

6. Analiza statystyczna

1. Wykonaj podstawowe analizy statystyczne, aby podsumować wzorce przestrzenne dotyczące liczebności mikroorganizmów i zmiennych środowiskowych.
2. Analizę statystyczną należy przeprowadzać wyłącznie na eksperymentalnym zbiorze danych o ściółce drobiu. Używaj symulowanych zbiorów danych wyłącznie do demonstracji wizualizacji i nie włączaj ich do testów statystycznych.
3. Oblicz wartości średnie dla każdej lokalizacji siatki, gdy dostępne były powtórzone pomiary.
4. Do oceny zależności między liczebnością mikroorganizmów a odległością od punktów orientacyjnych środowiskowych wykorzystaj analizę regresji liniowej.
5. Obliczaj odległości od punktów orientacyjnych środowiska, korzystając z ich znanych pozycji w siatce w zagrodzie. Traktuj odległości jako zmienne ciągłe.
6. Wykorzystaj wyniki do badania trendów przestrzennych i wspierania interpretacji wizualizacji, zamiast do ustalania przyczynowych relacji biologicznych.

Results

Symulowane dane mikrobiologiczne i fizykochemiczne do ilustracji modelu 3D
Obecne badanie dostarcza kodu do wizualizacji liczebności mikroorganizmów (Organizm A i Organizm B) oraz pH żółty w zagrodzie drobiu, na podstawie symulowanych danych. Powstałe wykresy 3D wizualizowały liczbę mikroorganizmów (rysunek 3A, B) oraz pH (rysunek 3C; dla interaktywnego doświadczenia zobacz Plik Uzupełniający 3) na podstawie modelu opartego na siatce. Symulowane wartości pH wykazywały zmienność przestrzenną w całym piórze, z stopniowymi zmianami na siatce, odpowiadającymi narzuconym gradientom przestrzennym. Pełny kod, wolny od przerw tekstowych, jest dostępny w Pliku Uzupełniającym 1.

Zastosowanie modelu 3D do eksperymentalnych liczeń mikroorganizmów w żółcie drobiu
Aby pokazać, jak model działa na rzeczywistych danych ekologicznych, zmapowano i statystycznie przeanalizowano liczebność bakterii tlenowych z żółtów drobiu, aby ocenić wpływ odległości od punktów środowiskowych, takich jak karmniki i linie wodne, na liczebność bakterii przy użyciu modelu regresji liniowej (LRM). Eksperymentalny zbiór danych użyty do analizy znajduje się w Pliku Uzupełniającym 2. Wizualizacja 3D pokazała wyraźne różnice w liczbie tlenowych w całym zagrodzie, pokazując, że podejście to może skutecznie wyświetlić rzeczywiste rozkłady mikroorganizmów w środowiskach dla drobiu (Rysunek 4; dla interaktywnego doświadczenia zobacz Plik Uzupełniający 3). Wizualizacje te ujawniły heterogeniczne rozmieszczenie przestrzenne, z lokalnymi obszarami o większej liczebności bakterii w pobliżu określonych cech środowiskowych. W całym zagrodzie dla drobiu liczebność tlenowa wahała się od 5,9 do 8,6 log₁₀ CFU/g, z najwyższymi stężeniami wykrytymi w pobliżu linii wodnej, a niższymi wokół centralnych zasobów karmowych i dalej od linii wodnej. Średnia ilość tlenowa spadła z 8,0 log₁₀ CFU/g w pobliżu linii wodnej do 7,4 log₁₀ CFU/g na najdalszej odnotowanej odległości. Liczba mikroorganizmów reprezentuje średnie wartości powtórzonych pomiarów w każdym miejscu pobierania próbek. Ponadto odległość od linii wodnej była istotnym czynnikiem predyktora obciążenia bakteryjnym tlenowym (LRM, P < 0,05), podczas gdy odległości od zasilających i wejścia nie (LRM, P > 0,05). Te ilościowe wyniki potwierdzają wizualny trend obserwowany na 3D wykresach powierzchniowych, pokazując wyraźny spadek liczebności mikroorganizmów wraz ze wzrostem odległości od źródeł wilgoci. Ostatecznie wyniki pokazują, że ramy oparte na siatce 3D stanowią praktyczne podejście do wizualizacji i analizy heterogeniczności przestrzennej w zbiorach danych o ściółce drobiu. Wykorzystując zarówno dane symulowane, jak i eksperymentalne, model ten uchwycił zlokalizowane wzorce rozmieszczenia mikroorganizmów i dodatkowo umożliwił statystyczną interpretację związku między liczebnością bakterii a cechami środowiskowymi w zagrodzie.

Rysunek 1: Siatka zagrody drobiowej do pobierania próbek. Schematyczne przedstawienie siatkowego systemu próbkowania używanego do definiowania współrzędnych przestrzennych i miejsc pobierania próbek w zagrodzie drobiu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Przykładowy układ symulowanych danych w formacie arkusza kalkulacyjnego. Reprezentatywna struktura arkusza kalkulacyjnego pokazująca identyfikatory próbek, współrzędne przestrzenne (X i Y) oraz zmienne mikrobiologiczne lub fizykochemiczne używane do analizy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Symulowane rozkłady przestrzenne liczby mikroorganizmów i pH w zagrodzie drobiu. (A) Symulowane liczby Organizmów A, (B) symulowane Organizmy B oraz (C) symulowane wartości pH wizualizowane za pomocą trójwymiarowego modelu przestrzennego opartego na siatce. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Przestrzenne rozmieszczenie liczebności bakterii tlenowych na zagrodzie dla drobiu. Wykres powierzchniowy 3D pokazuje zmienność liczby bakterii tlenowych (log CFU/g) na różnych odległościach (współrzędne X–Y). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Parametr	Wartość
Zasięg występowania	Normalne
Mean (μ)	8.26
SD (σ)	0.77
Zasięg	7.10–9.37
Wzorzec przestrzenny	Gradient liniowy (kierunek Y)
Hałas	Normalny (μ=0, niewielka wariancja)
Losowe ziarno	10

Tabela 1: Parametry używane do symulowanego generowania zbioru danych mikroorganizmów. Podsumowanie parametrów dystrybucji, w tym średnia, odchylenie standardowe, zakres wartości oraz ustawienia gradientu przestrzennego używane do generowania symulowanych danych mikroorganizmów.

Nazwa kolumny	Opis	Typ danych	Wymagane
Pen	Identyfikator dla grupy pen lub leczenia	Tekst	Tak
X	Lokalizacja współrzędnych X na siatce	Numeryczne	Tak
Y	Położenie współrzędnych Y na siatce	Numeryczne	Tak
Log10_CFU_A	Logarytmicznie przekształcona liczba mikroorganizmów (Organizm A)	Numeryczne	Tak
Log10_CFU_B	Logarytmicznie przekształcona liczba mikroorganizmów (Organizm B)	Numeryczne	Opcjonalne
pH	Zmierzona wartość pH	Numeryczne	Opcjonalne
Dystans Landmark	Odległość od cech środowiskowych (np. linii wodnej)	Numeryczne	Opcjonalne

Tabela 2: Wymagana struktura zbioru danych wejściowych do analizy przestrzennej. Lista wymaganych zmiennych, w tym identyfikatory próbek, współrzędne przestrzenne oraz pomiary mikrobiologiczne lub fizykochemiczne, wraz z odpowiadającymi formatami danych.

Plik uzupełniający 1: Kod do generowania symulowanych wizualizacji przestrzennych mikroorganizmów i pH.Skrypt R używany do przetwarzania symulowanych zbiorów danych i generowania 3D wykresów powierzchniowych dla Organizmu A, Organizmu B oraz pH w całym zagrodzie dla drobiu. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Eksperymentalny zbiór mikroorganizmów żwirku drobiu. Arkusz kalkulacyjny zawierający liczbę bakterii tlenowych oraz współrzędne przestrzenne używane do wizualizacji 3D i analizy statystycznej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Interaktywne linki do wizualizacji 3D i kody QR. Kody QR i odpowiadające im linki internetowe umożliwiające dostęp do interaktywnych wykresów 3D symulowanych i eksperymentalnych zbiorów danychProsimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Wykresy oparte na symulacji przedstawione w tym badaniu zostały opracowane, aby wykazać potencjał trójwymiarowego mapowania przestrzennego do poprawy wizualizacji rozkładów mikroorganizmów i fizykochemicznych w środowiskach żółtowych drobiu (Plik uzupełniający 3). Ponadto połączyliśmy to podejście z danymi z mikrobiologicznej enumeracji oraz markerami środowiskowymi i przestrzennymi w zagrodzie, aby ocenić lokalne wzorce rozmieszczenia i zidentyfikować zależności zależne od odległości (Plik uzupełniający 3).

Kluczowym krokiem w obecnym protokole jest dokładne ustanowienie ram próbkowania opartych na siatce. Ponieważ powierzchnia 3D zależy od wiarygodnych współrzędnych przestrzennych, prawidłowe wyznaczenie punktów początkowych, równomierne odstępy oraz precyzyjne zapisywanie pozycji X i Y są niezbędne. Najbardziej pracochłonną częścią metody jest rozłożenie siatki i potwierdzenie, że każda próbka odpowiada przypisanemu współrzędnemu i punktowi orientacyjnym środowiskowym, takim jak zasilniki, linie wodne, punkty wejścia czy strefy grzewcze. Małe błędy pozycyjne na tym etapie mogą wpływać na późniejsze analizy. W większych lub komercyjnych lokalizacjach narzędzia pomiarowe oparte na laserach lub podobne pomoce pozycjonowania mogą zmniejszyć ilość pracy i poprawić powtarzalność. Dokładne notowanie punktów orientacyjnych w zagrodach jest również ważne, ponieważ te cechy stanowią kontekst ekologiczny do zrozumienia gradientów mikroorganizmów w środowiskach ściółkowych, powstałych przez aktywność ptaków, wilgoć i dystrybucję składników^{odżywczych 2}.

Obecny protokół jest adaptowalny do szerszych zastosowań rolniczych. Oprócz liczby mikroorganizmów i pH, może być stosowany także do innych zmiennych związanych ze ściółką lub podłogą, w tym wilgoci, temperatury, rozkładu składników odżywczych, miar związanych z amoniakiem lub cech społeczności mikroorganizmów pochodzących z sekwencjonowania. Praktyczne modyfikacje obejmują grupowanie danych według pióra, dynamiczne generowanie macierzy z zarejestrowanych zbiorów danych oraz sprawdzanie brakujących wartości przed rozpoczęciem wykresów. Typowe kroki rozwiązywania problemów obejmują konwersję etykiet współrzędnych na wartości liczbowe, uśrednianie wartości replikowanych w punktach wspólnych, sprawdzanie duplikatów lub brakujących współrzędnych oraz potwierdzenie, że struktura macierzy odpowiada oryginalnemu układowi pióra. Ramy mogą być również rozszerzone o analizy wielowymiarowe i głębokość świertli, umożliwiając ocenę zarówno heterogeniczności poziomej, jak i pionowej.

Należy również uwzględnić kilka ograniczeń. Metoda ta nie zwiększa zasadniczo rozdzielczości próbkowania ani reprezentacji biologicznej; zamiast tego poprawia organizację przestrzenną i interpretację danych po zebraniu. Jakość modelu końcowego nadal zależy więc od projektu próbkowania i spójności wykonania w terenie. Budowa siatki może być fizycznie wymagająca i czasochłonna. Dodatkowo, udana implementacja wymaga dostępu do komputera oraz podstawowych umiejętności przetwarzania danych. Błędy w wzorcach nazewnictwa, wprowadzaniu współrzędnych lub brakującym komórkom siatki mogą zakłócać generowanie macierzy lub prowadzić do mylących wizualizacji. Ogólnie rzecz biorąc, obecne podejście należy traktować jako eksploracyjne, oparte na wizualizacji ramy, a nie jako substytut formalnej statystyki przestrzennej czy wnioskowania mechanistycznego.

Pomimo tych ograniczeń, protokół oferuje wyraźne przewagi w porównaniu z typowymi podejściami opartymi na próbkach zbiorczych i pomiarach punktowych izolowanych, które mogą maskować zmienność przestrzenną w drobnej skali w obrębie pena lub domu 3,4,5,6,7. W obecnym badaniu zastosowanie tych ram do liczenia bakteryjnych tlenowych wykazało, że populacje mikroorganizmów mogą przestrzennie skupiać się w otoczeniu drobiu. Konkretnie, liczebność bakterii była wyższa w pobliżu linii wodnej i spadała w kierunku centrum zagrody, co powodowało wyraźny gradient na wykresie powierzchniowym 3D (Plik Uzupełniający 3). Ten wzorzec wspiera interpretację, że wyraźne, lokalne warunki środowiskowe, zwłaszcza wilgoć, mogą silnie wpływać na rozmieszczenie mikroorganizmów w ściółce drobiu. Dodatkowe zmienne, takie jak pH i skład składników odżywczych, mogą dodatkowo wyjaśnić te zależności. Wcześniejsze badania również wykazały, że społeczności drobnoustrojowe i warunki środowiskowe drobiu różnią się w przestrzeni pH, wylewów paszy i aktywności ptaków². Łącząc pomiary mikrobiologiczne lub fizykochemiczne z określonymi pozycjami w środowisku zwierzęcym, metoda ta sprawia, że te wzory są bardziej widoczne i interpretowalne. Równolegle stosuje także podejścia do mapowania przestrzennego stosowane w naukach o glebie i agronomii do identyfikacji gradientów, nierówności i lokalnych punktów ogniskowych, jednocześnie stosując te koncepcje do systemu produkcji zwierzęcej 11,12,13. W przyszłości powtarzające się mapowanie przestrzenne w zagrodach, stadach i cyklach produkcyjnych może wspierać modelowanie predykcyjne hotspotów mikroorganizmów oraz bardziej ukierunkowane zarządzanie strefami ekologicznymi wysokiego ryzyka.

Chociaż wizualizacja 3D nie poprawia dokładności ani precyzji danych, to jednak wzmacnia interpretację statystycznie istotnych czynników wpływających na wzorce i trendy mikrobiologiczne w żółcie drobiu. Bardziej przystępna wizualizacja może wspierać komunikację i podejmowanie świadomych decyzji dotyczących zmian w śmicie, zdrowia ptaków oraz wymiany ściółki 14,15,16. Poza zastosowaniami badawczymi, narzędzie to ma praktyczną wartość dla producentów drobiu i pracowników doradztwa akademickiego¹⁷. Te 3D pola mogą służyć jako skuteczne narzędzia do prezentowania złożonych danych mikroorganizmów w bardziej przystępnej i praktycznej formie dla zarządców gospodarstw, interesariuszy i małych producentów drobiu¹⁷. Możliwość dostępu do tych wykresów za pomocą telefonu komórkowego za pomocą kodu QR może dodatkowo zwiększyć ich użyteczność w terenie wsparcia technicznego. W miarę jak produkcja drobiu nadal rozwija technologię sensorów i generowanie danych, takie podejścia mogą stać się coraz bardziej użyteczne w integralnej informatyce drobiu^18,19.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bilans analityczny	Fisher Scientific	15997490	Do ważenia żwirku (np. 10 g/próbka)
Komputer z dostępem do internetu	Dowolny	Nie ma	Do uruchamiania RStudio
Inkubator (37 stopni; C)	Thermo Scientific	50125590H	Na 24-godzinny wzrost bakteryjny
Ośrodki mikrobiologiczne (TSA)	BD Difco	236950	Aby wyliczyć bakterie tlenowe
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Stosowane do rozcieńczania i zawiesin mikroorganizmów
Próbki żwirku drobiu	Dom dla brojlerów drobiu lub zagroda badawcza	Nie ma	Świeży żwir zebrany według siatki
Pakiety R: plotly, dplyr, htmlwidgets	CRAN	https://cran.r-project.org	Do wizualizacji 3D i obsługi danych
Środowisko obliczeń statystycznych w R (wersja 4.3 lub nowsza)	Projekt R	https://cran.r-project.org	cran.r-project.org
RStudio (v2024.12.0.467 lub nowszy)	Pozycja	https://posit.co/download/rstudio-desktop	posit.co
Oprogramowanie do arkuszy kalkulacyjnych (Excel, Google Sheets)	Microsoft/Google	https://www.microsoft.com/exce	Aby zorganizować dane przed importem do RStudio
Stożkowe rurki sterylne 10 mL	Thermo Fisher Scientific	339650	Do transportu aliquotów
Sterylne pipety i pipety Wskazówki	Fisher Scientific	Nie ma	Dla precyzyjnego i sterylnego obchodzenia się z cieczami
Sterylne worki Whirl-Pak	Nasco	B01062	Do zbierania próbek i homogenizacji
Mieszacz wirowy	VWR	10153-838	Dla homogenizujących próbek