Lokalne RNAi i ektopowa ekspresja genów u pijawki lekarskiej

Podsumowanie

W tym filmie przedstawiamy procedurę dokładnego dostarczania reagentów do żywej tkanki metodą biolistyczną przy użyciu nowoczesnej miniaturowej wyrzutni genów. Przeprowadzamy wyciszenie ekspresji cząsteczki Netrin, odpowiedzialnej za prowadzenie aksonów, w embrionach pijawek poprzez dostarczenie cząsteczek dsRNA do brzusznej ściany ciała i zwojów pojedynczych segmentów.

Streszczenie

W niniejszym filmie prezentujemy zastosowanie pneumatycznej pistoletowej mikrosstrzykawki kapilarnej do precyzyjnego biolistycznego dostarczania odczynników do żywej tkanki. Procedurę tę wykorzystujemy do zaburzania wzorców ekspresji genów w wybranych segmentach embrionów pijawek, pozostawiając segmenty niepoddane działaniu odczynników jako wewnętrzne kontrole.

Pneumatyczna strzykawka kapilarna może być wykorzystywana do dotarcia do wewnętrznych warstw komórek we wczesnych stadiach rozwoju bez konieczności otwierania preparatu. Jako metoda lokalnego wprowadzania substancji do żywych tkanek, dostarczanie biolistyczne za pomocą tej strzykawki oferuje kilka zalet: jest szybkie, bezkontaktowe i niedestrukcyjne. Ponadto jedna strzykawka kapilarna może służyć do niezależnego dostarczania różnych substancji. Obszar dostarczenia może mieć wymiary boczne rzędu ~50-150 µm i rozciągać się na ~15 µm wokół średniej głębokości penetracji, która jest regulowana w zakresie od 0 do 50 µm. Ta metoda dostarczania ma tę zaletę, że pozwala na targetowanie ograniczonej liczby komórek w wybranym miejscu, co stanowi rozwiązanie pośrednie między wyciszaniem pojedynczych komórek za pomocą mikroiniekcji a wyciszaniem systemowym poprzez iniekcje pozakomórkowe lub za pomocą metod genetycznych.

W celu wyciszenia (knock-down) lub nadekspresji (knock-in) cząsteczki kierowania aksonami Netrin, która naturalnie występuje w niektórych neuronach centralnych i w brzusznej ścianie ciała, ale nie w domenie grzbietowej, wprowadzamy cząsteczki dsRNA lub plazmidowe DNA do ściany ciała i zwojów centralnych. Procedura ta obejmuje następujące etapy: (i) przygotowanie układu eksperymentalnego dla konkretnego testu (regulacja ciśnienia przyspieszającego), (ii) powlekanie cząsteczek cząsteczkami dsRNA lub DNA, (iii) załadowanie powlekanych cząsteczek do armatki, do dwóch odczynników w jednym teście, (iv) przygotowanie zwierząt do wprowadzenia cząsteczek, (v) wprowadzenie powlekanych cząsteczek do tkanki docelowej (ściany ciała lub zwojów) oraz (vi) przetwarzanie embrionów (immunobarwienie, immunohistochemia i znakowanie neuronów) w celu wizualizacji wyników, zazwyczaj od 2 do 3 dni po wprowadzeniu.

Kiedy cząstki zostały powleczone dsRNA netryny, spowodowały one wyraźnie widoczny knock-down ekspresji netryny, który występował wyłącznie w komórkach zawierających cząstki (zazwyczaj 1-2 cząstki na komórkę). Cząstki powleczone plazmidem kodującym EGFP indukowały fluorescencję w komórkach neuronalnych, gdy zatrzymały się w ich jądrach.

Protokół

Cząstki mogą być powlekane różnymi odczynnikami, takimi jak cząsteczki dsRNA, plazmidy DNA lub barwniki. Rodzaj i średnica cząstek są dobierane w zależności od odczynnika oraz głębokości położenia docelowych komórek w tkance: większe cząstki wnikają głębiej, lecz mogą spowodować uszkodzenia tkanki.

1. Przygotowanie cząstek powlekanych dsRNA

1. Umieścić 100% izopropanol na lodzie.
2. Resuspendować 5 mg cząsteczek złota (S1600ri, Seashell Technology, LLC; średnica średnia 1,6 µm) w 100 ml buforu wiążącego. Po przygotowaniu roztworu przejść do następnego kroku.
3. Rozcieńczyć roztwór cząsteczek, dodając 100 µl buforu wiążącego, krótko wymieszać na wortexie i sonikować przez 1-2 min, aby zapobiec zlepianiu się cząsteczek.
4. Dodać 5-10 µg dsRNA/siRNA (dsRNA/siRNA powinny być rozpuszczone w wodzie do stężenia ~1 µg/µl).
5. Wymieszać na wortexie i pozostawić w temperaturze pokojowej na 2 min. Takie stężenie i przedział czasowy pozwalają na uzyskanie cząsteczek złota nasyconych siRNA.
6. Odwirować kompleksy siRNA/cząsteczki złota w wirówce stołowej przy prędkości ~2 500 rpm przez ~15 s.
7. Usunąć nadsącz i ostrożnie dodać 750 ml zimnego izopropanolu, unikając naruszenia osadu. Krótko odwirować i usunąć nadsącz.
8. Resuspendować cząsteczki złota w 100 µl zimnego 100% izopropanolu, a następnie krótko sonikować w myjce ultradźwiękowej (2-3 impulsy), aby rozbić aglomeraty cząsteczek. Na koniec wylać zawiesinę cząsteczek na szkiełko przedmiotowe i pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej.

2. Przygotowanie układu eksperymentalnego dla konkretnego testu

1. Każda pistolet posiada dyszę o innej średnicy otworu, w zakresie od minimum ~50µm do ~3mm. Dyszę do konkretnego pistoletu dobiera się zatem w zależności od obszaru tkanki, który ma zostać objęty działaniem.
2. Ciśnienie He dostosowuje się do głębokości zalegania komórek docelowych w tkance, zazwyczaj do ~100µm (wyższe ciśnienia umożliwiają głębsze wprowadzenie cząsteczek). Na głębokość penetracji wpływa również odległość między embrionem a końcówką dyszy, ponieważ cząsteczki złota tracą pęd w powietrzu.

3. Załadowanie pistoletu cząstkami z naniesioną powłoką

Cząsteczki należy wprowadzić w formie suchego proszku do linii wtryskiwania cząsteczek z rurek Tygon, które są podłączone do rozdzielacza. Rurki te, które w przypadku nieużywania powinny być przechowywane w suchej atmosferze w temperaturze 4°C, mogą być ponownie wykorzystane w kolejnych eksperymentach z użyciem tych samych odczynników. Nasza konfiguracja eksperymentalna pozwala na podawanie do dwóch różnych odczynników na jeden test poprzez oddzielne porty w rozdzielaczu.

1. Zeskrob wysuszone cząstki z powłoką z szkiełek przedmiotowych, używając krawędzi szkiełka nakrywki lub żyletki, przed wprowadzeniem ich do przewodu z rurki Tygon. Ta rurka Tygon będzie przeznaczona wyłącznie dla tego odczynnika, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych.
2. Podczas wprowadzania cząstek zgnij rurkę w kształt litery U blisko złącza, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się cząstek wzdłuż całej rurki i zapewnić ich koncentrację w pobliżu złącza. Zbierz cząstki małą szpatułką lub kawałkiem złożonego papieru wagowego i wprowadź około połowę z nich do rurki dla każdej serii embrionów. Opukiwanie rurki podczas wprowadzania pozwoli na równomierne rozłożenie cząstek.

4. Przygotowanie zwierząt

Przed i po wprowadzeniu cząsteczek złota zarodki są przechowywane w sterylnej sztucznej wodzie stawowej w temperaturze pokojowej.

1. Umieść embriony stroną brzuszną do góry w rowku wyciętym w płaskim, 5mm grubym kawałku gumy silikonowej (Sylgard 184, Dow Corning, Midland, MI) i znieczul je w roztworze 8% etanolu w sterylnej sztucznej wodzie stawowej (młodsze embriony w stadiach E6-E8 mogą pozostać w sztucznej wodzie stawowej bez etanolu przez cały czas trwania eksperymentu).
2. Bezpośrednio przed wystrzeleniem cząstek obniż poziom kąpieli, usuwając część roztworu, aby odsłonić powierzchnię brzuszną embrionów. Na wierzchu umieść kawałek ręcznika papierowego z wyciętym w środku małym otworem, aby ustabilizować próbkę i zapobiec wysychaniu jej powierzchni.

5. Dostarczenie powlekanych cząsteczek do tkanki docelowej

Jedna porcja cząsteczek może być zazwyczaj wykorzystana do dziesięciu strzałów, przy czym pojedynczy strzał dostarcza zazwyczaj rzędu kilkuset cząsteczek.

1. Wygeneruj impuls, otwierając jeden z zaworów na 0,3 s, co spowoduje wstrzyknięcie bolusa cząsteczek z odpowiadającej linii rurek do pistoletu.
2. Między impulsami delikatnie opukuj rurki, aby odczepić cząsteczki od ich ścianek i w ten sposób ułatwić ich wstrzyknięcie do strumienia He w pistolecie.
3. Aby pokryć interesowany obszar tkanki, może być konieczne wykonanie wielu impulsów.
4. Po dostarczeniu cząsteczek umieść embriony z powrotem w sztucznej wodzie stawowej, najlepiej po jednym embrionie na dołek w płytce wielodołkowej.

6. Immunobarwienie i znakowanie neuronów

Przechowywać zarodki w temperaturze pokojowej i w ciemności od 1 do 3 dni po dostarczeniu cząsteczek, aż do uzyskania efektu RNAi (lub ekspresji ektopowej). Następnie w próbkach doświadczalnych i kontrolnych przeprowadza się jedną z poniższych procedur:

1. Hybrydyzacja in situ w celu oceny obecności lub braku mRNA Netryny. Znakowane digoksigeniną ryboproby netryny pijawki są hybrydyzowane z całymi zarodkami pijawki.
2. Immunocytochemia w celu oceny białka Netryny oraz innych białek charakterystycznych dla tkanki neuronalnej (takich jak przeciwciała przeciwko acetylowanej tubulinie). Procedurę tę wykonuje się również na całych zarodkach (whole-mount).
3. Mikroiniekcje barwników lipofilowych (DiI i DiO) do pojedynczych neuronów, w celu wypełnienia barwnikiem i oznakowania pełnych drzewek neuronów będących przedmiotem badania (w naszym przypadku mechanosensorycznych neuronów nacisku) w segmentach traktowanych i kontrolnych. Analizę tę przeprowadza się na żywych zarodkach (nienaruszonych lub wypreparowanych).

Dyskusja

W niniejszym pokazie wykorzystano pneumatyczną działo kapilarne do wprowadzania cząstek złota do komórek w niewielkiej, zlokalizowanej objętości żywego embrionu pijawki w celu wykonania knock-in oraz knock-down genów. Region docelowy miał zazwyczaj średnicę ~150 µm, a cząstki znajdowały się w obrębie ~15 µm wokół średniej głębokości penetracji, którą można było regulować w zakresie od 0 do 50 µm. Gdy cząstki zostały pokryte cząsteczkami dsRNA czynnika prowadzenia aksonów netryny, spowodowało to wyraźny knock-down ekspres...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
cząsteczki złota	Inne	Seashell Technology, LLC	S1600ri
bufor wiążący	Odczynnik	Seashell Technology, LLC
guma silikonowa	Odczynnik	Dow Corning	Sylgard 184