Ocena wielomodalnej funkcjonalności chimerycznych receptorów antygenowych komórek T w rozdzielczości pojedynczej komórki za pomocą analizy optofluidycznej

Summary

Adoptowana terapia limfocytami T z użyciem komórek CAR-T wykazuje obiecujące skutki w leczeniu nowotworów krwi, choć trwałe odpowiedzi są niespójne. Polifunkcyjne limfocyty T korelują z trwałością remisji, ale standardowe testy zaciemniają kluczowe podpopulacje. Przedstawiamy workflow pojedynczej komórki z wykorzystaniem platformy optofluidycznej do identyfikacji i izolacji wysoko funkcjonalnych komórek CAR-T do dalszych badań.

Abstract

Adoptywna terapia limfocytami T to nowatorski paradygmat leczenia, w którym autologiczne limfocyty T są genetycznie modyfikowane, aby wyrazić receptor antygenu chimerycznego (CAR) ukierunkowany na guz przed ekspansją ex vivo i ponownym wszczepieniem do pacjenta. Pomimo niezwykłych wykazów mocy przeciwnowotworowej u pacjentów z zaawansowanymi nowotworami hematologicznymi, długotrwałe odpowiedzi nie objawiają się w znacznej części przypadków. Chociaż na zmienność wyników klinicznych może wpływać kilka osobliwych czynników, coraz więcej dowodów wskazuje, że odsetek polifunkcyjnych komórek T w produkcie komórek CAR-T przed infuzją silnie koreluje z trwałością remisji nowotworowej. Niestety, standardowe oceny produktów komórkowych CAR-T obecnie opierają się na pomiarach populacji masowych lub testach końcowych, co ogranicza możliwość izolowania i badania subpopulacji o podwyższonych właściwościach funkcjonalnych. Tutaj demonstrujemy workflow wykorzystujący platformę optofluidyczną do oceny zarówno profilu wydzielania cytokin, jak i aktywacji poprzez ekspresję CD137 poszczególnych komórek CAR-T, co można opcjonalnie łączyć z oceną aktywności cytotoksycznej. Komórki wykazujące największą funkcjonalność multimodalną mogą być izolowane do dalszych analiz, które pozwolą na projektowanie terapii komórkowych CAR-T nowej generacji.

Introduction

Limfocyty T ekspresujące receptor antygenowy chimeryczne (CAR) wykazały niezwykłą skuteczność przeciwnowotworową u pacjentów z zaawansowanymi nowotworami hematologicznymi ^1,2. Jednak znaczna część leczonych pacjentów ostatecznie nawraca, co podkreśla potrzebę opracowania produktów komórkowych CAR-T o większej funkcjonalności 3,4,5,6. Chociaż wiele osobliwych czynników może wpływać na zmienność wyników klinicznych, coraz więcej dowodów wskazuje, że odsetek polifunkcyjnych komórek T w produkcie komórek CAR-T przed infuzją silnie koreluje z trwałością remisji nowotworowej. W związku z tym strategie wzbogacania lub inżynierii komórek CAR-T o większej polifunkcjonalności mogłyby przynieść produkty terapeutyczne o zwiększonym potencjale do pośredniczenia w długotrwałych odpowiedziach klinicznych ^6,7,8. Niestety, obecne metody charakteryzacji funkcji komórek CAR-T w dużej mierze opierają się na pomiarach populacji zbiorczej lub testach końcowych. Ograniczają one zdolność do izolowania i badania konkretnych subpopulacji o podwyższonych właściwościach wielofunkcyjnych. Na przykład wydzielanie cytokin jest zazwyczaj oceniane albo za pomocą supernatantów objętych, jak i poprzez barwienie wewnątrzkomórkowe. To drugie wymaga fiksacji komórek w zamian za informacje na poziomie pojedynczej komórki⁹. Podobnie, potencjał cytotoksyczny najczęściej ocenia się dla populacji komórek CAR-T w masie, poprzez ilościowe określenie utraty żywotności komórek docelowych po współhodowli limfocytów T i komórek docelowych¹⁰. Możliwość oceny wydzielania, aktywacji i aktywności cytolitycznej żywotnych komórek CAR-T w rozdzielczości pojedynczych komórek mogłaby pobudzić rozwój produktów terapeutycznych o trwałszej skuteczności przeciwnowotworowej.

Przedstawiamy tutaj metodę jednoczesnego profilowania pojedynczych komórek CAR-T pod kątem funkcjonalności multimodalnej za pomocą platformy optofluidycznej jednokomórkowej (Rysunek 1). System wykorzystuje opto-elektryczne pozycjonowanie (OEP) do przenoszenia kulek wychwytujących cytokin i pojedynczych komórek do przestrzennie podzielonych zagrod, umożliwiając funkcjonalną ocenę pojedynczych komórek CAR-T (Rysunek 2A). W tym protokole demonstrujemy sposób generowania komórek CAR-T poprzez transfer genów niewirusowych oraz oceniamy wydzielanie i aktywację cytokinów poprzez CD137 pojedynczych komórek CAR-T podczas współhodowli z komórkami docelowymi wyrażającymi antygeny i antygen-ujemnymi (Rysunek 3 i Rysunek 4)¹¹. Potencjał różnicowania profili cytokin i aktywacji między zmodyfikowanymi produktami komórkowymi ilustruje porównanie standardowych komórek CAR-T z tymi o nadekspresji c-Jun⁶. Aktywność cytotoksyczną wobec pojedynczych komórek docelowych można również ocenić za pomocą odczytów na bazie kaspazy lub fluorescencji na platformie optofluidycznej (Rysunek 2B). Jednak do określenia kinetyki interakcji wymagana jest analiza poklatkowa, która może się znacząco różnić w zależności od konstrukcji i eksperymentu CAR. Podobnie, powtarzalne testy zabijania naśladujące przewlekłą stymulację wymagają alternatywnego przepływu pracy. Dlatego w tym artykule opisujemy podstawową procedurę przeprowadzania oceny cytotoksyczności, ale nie omawiamy jej szczegółowych zastosowań.

Na podstawie wybranej oceny i cech docelowych, żywe komórki CAR-T wykazujące największy stopień wielofunkcyjności mogą być rozładowane z instrumentu i przeniesione do pojedynczych odwiertów w płytach 96-dołowych do dalszych badań (Rysunek 2C).

Protocol

UWAGA: Bufor i przygotowanie podłoża przedstawiono w Tabeli 1.

1. Izolacja komórek T CD8 od czopków systemu redukcji leukocytów

UWAGA: Wszystkie etapy wykonuj sterylną, aseptyczną techniką w szafce biobezpieczeństwa do hodowli tkanek. Wszystkie media do rozcieńczania, mycia i ponownych zawiesin powinny być utrzymywane w temperaturze 4 °C przez cały zabieg.

1. Dodaj 15 mL nośnika separacyjnego komórki (gęstość 1,077 g/mL) do każdej z dwóch stożkowych rurek po 50 mL (rurka separacyjna).
2. Trzymaj stożek systemu redukcji leukocytów (LRS) (stożkowa strona w dół) nad otwartą 50 mL stożkową rurką. Za pomocą sterylnych nożyczek przetnij plastikową rurkę sięgającą poniżej stożka LRS. Połóż stożek LRS na otwartej stożkowej rurce 50 mL i przetnij plastikową rurkę powyżej. Pobierz około 8-10 ml krwi do stożkowej probówki o pojemności 50 mL.
3. Napełnij stożkową probówkę 50 mL do 50 ml PBS + EDTA (przygotowaną zgodnie z listą mediów i buforów) i podaj pipetę do wymieszania rozcieńczonej krwi. Rozcieńczoną krew podziel równomiernie między dwie rurki rozdzielcze.
4. Wiruj rurki separacyjne z rozcieńczoną krwią w ilości 750 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT), z 9 jako przyspieszenie i 2 jako zwolnienie.
5. Używając pipety serologicznej o pojemności 10 mL, ostrożnie pobierz i przenieś białą powłokę z każdej probówki separacyjnej do świeżej stożkowej rurki o pojemności 50 mL.
6. Napełnij każdą stożkową probówkę 50 mL do 40 mL PBS + EDTA i ponownie zawiesij, aby uzyskać zawiesiny jednokomórkowe. Wiruj zawiesiny jednokomórkowe w dawce 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Aspiruj supernatant.
7. Ponownie zawiesij i połącz granulki komórkowe w 40 mL PBS + EDTA. Wiruj zawiesinę jednokomórkową w 300 x g przez 10 minut w 4 °C. Aspiruj supernatant.
8. Ponownie zawiesij osad komórkowy w PBS + EDTA i określ żywotną gęstość komórek zawiesiny jednojądrowej krwi obwodowej (PBMC) za pomocą barwienia Trypan Blue.
   UWAGA: Trypan Blue to barwnik nieprzepuszczalny dla żywych komórek, który barwi DNA. W ten sposób zarówno żywe PBMC, jak i komórki niejądrowe (czyli czerwone krwinki) pozostaną nieprzebarwione. Ważne jest, aby wykluczyć małe komórki (np. czerwone krwinki) przy określaniu żywotnej gęstości PBMC.
9. Przenieś pożądaną liczbę PBMC do świeżej stożkowej rurki o pojemności 50 mL w celu wzbogacenia magnetycznego ogniw CD8⁺ T. Oszacuj 10-krotnie liczbę pożądanych komórek T CD8⁺ jako początkową ilość PBMC potrzebnych do wzbogacenia magnetycznego. Utrzymuj odczynniki w zimnie podczas zabiegu.
10. Wiruj zawiesinę ogniwa PBMC w ilości 300 x g przez 10 minut w 4 °C. Wsysaj supernatant. Ponownie zawiesij osad komórki w 40 μL buforu MACS (przygotowanego zgodnie z listą nośników i buforów) na 1 x 10^{7 komórek} .
11. Dodaj 10 μL koktajlu biotyny-Ab z komórek CD8⁺ T na 1 x 10 komórek⁷ komórek. Mieszaj przez pipetowanie i inkubuj przez 5 minut w 4 °C.
12. Dodaj 30 μL bufora MACS na 1 x 10^{7 komórek} . Dodaj 20 μL mikrogranulek CD8⁺ T na 1 x 10 komórek⁷ . Mieszaj przez pipetowanie i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
13. Umieść wcześniej schłodzone kolumny LS na magnesie. Pod spodem umieść stożkową rurkę o pojemności 15 mL, aby zbierać przepływ cieczy. Wyrównaj każdą kolumnę LS za pomocą 3 mL bufora MACS.
14. Używając tej samej stożkowej rurki o pojemności 15 mL co probówka zbiorczej, załóż zawiesinę ogniwową na wyrównaną kolumnę LS. Przemyj kolumnę 3 razy 1 mL bufora MACS. Pozwól, by każde 1 mL przeciekało przez kolumnę LS przed kolejnym przemyciem.
15. Ostrożnie ponownie zawiesnij zebrane komórki i określ żywotną gęstość komórek wzbogaconej zawiesiny komórek CD8⁺ T za pomocą barwienia Trypan Blue.

2. Aktywacja komórek T CD8⁺ za pomocą koralików

1. Oblicz liczbę ludzkich koralików CD3/CD28 potrzebnych do proporcji 1:1 komórek T do kulek. Materiał do kulek aktywacyjnych zawiera 1 x 10^{6 koralików} na 25 μL.
2. Delikatnie przesuwaj kulki aktywacyjne przez co najmniej 30 sekund, zanim przeniesiesz obliczoną objętość zawieszenia kulek do stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Dodaj równą ilość medium, aby przemyć koraliki i wirować przez co najmniej 5 sekund.
3. Włóż stożkową rurkę 15 mL do odpowiedniego magnesu na 1 minutę, aby zebrać kulki po bokach rurki. Aspiruj i odrzucaj supernatant.
4. Oblicz objętość podłoża potrzebną do końcowego stężenia komórek T 1 x 10 6 T komórek/mL. Usuń stożkową rurkę o pojemności 15 mL z magnesu i ponownie ją zawiesz w obliczonej objętości pożywki hodowlowej. Dodaj rekombinowany ludzki IL-2 do końcowego stężenia 50 U/mL.
5. Przenieś w pełni uzupełnione medium do rurki zawierającej limfocyty T i ponownie zawiesnij. Zasiać zawiesinę komórkową do odpowiedniego formatu hodowli komórkowej (np. 1 mL na płytkach 48-dołkowe, 2 mL na płytkach 24-dołkowe) i inkubować przez 40 godzin.

3. Generowanie komórek CAR-T poprzez transfer genów niewirusowych za pomocą jądra

UWAGA: Wstępne podgrzewanie podłoża (37 °C), odczynników (RT) oraz wirówki (RT) jest kluczowe dla zapewnienia wysokiej efektywności transferu genów.

1. Przygotuj i oznacz płytkę na 48 dołków z 1 ml pożywki hodowli komórkowej dla każdego warunku nukleoefektu. Inkubuj płytkę przez co najmniej 30 minut, aby zapewnić ciepłe medium o stężeniu_CO2 o pH fizjologicznem.
2. Włącz Nucleofector i wybierz pozycje do nukleofektu w pasku 16-dołkowym. Wybierz odpowiedni program (np. FI-115, aby preferować wysoką efektywność, lub EO-115 dla wyższej efektywności).
3. Wyjmij płytkę hodowlową z limfocytami T z inkubatora i użyj mikroskopu, aby sprawdzić wygląd wizualny komórek i uzyskać pierwsze wrażenie, czy aktywacja się powiodła. Aktywowane limfocyty T powinny wykazywać równomierne skupienie i powiększony kształt komórki. Średni kolor różniący się od świeżego medium do lekko pomarańczowego odcienia wskazuje, że aktywacja doprowadziła do bardziej aktywnego stanu metabolicznego i jest uważana za dobry znak. Na tym etapie analiza cytometryczna przepływu wczesnych markerów aktywacji CD25 i CD69 może potwierdzić aktywację.
4. Ponowna zawieszka, pobranie i policzenie aktywowanych komórek T. Oblicz potrzebną liczbę komórek T, uwzględniając 1,2 do 2 x 10 6 komórek T na warunki. Przelej obliczoną objętość do świeżej stożkowej rurki o pojemności 15 mL i wiruj w wirówce 200 x g przez 10 minut w stanie RT.
5. Aspiruj i wyrzuć supernatant oraz myj limfocyty T 10 mL ciepłego PBS. Wiruj w 200 x g przez 10 minut w RT. Wykorzystaj czas wirowania do rozmrażenia plazmidów kodujących CAR, zwykle zawierających stężenie DNA 1 μg/μL. Złóż plazmid kodujący transpozazę (SB100x) (1,0 μg) lub minikoł (0,5 μg) razem z plazmidem kodującym CAR (1,0 μg) lub minikręgiem (0,6 μg) w pojedynczej, wolnej od DNA rurce mikrowirującej 1,5 mL na każdy stan nukleofekcji.
6. Przygotuj odpowiednią ilość roztworu P3 Nucleofector z dodatkiem suplementu (na warunki: 16,4 μL Nucleofector Solution + 3,6 μL Suplementu).
7. Wyjmij stożkową rurkę 15 mL zawierającą limfocyty T z wirówki, zasysaj supernatant i wiruj przez 1 minutę przy 200 x g, aby zebrać resztki płynu na dnie. Weź pipetę 200 μL, aby ostrożnie usunąć jak najwięcej buforu, nie dotykając granulki komórkowej.
8. Natychmiast kontynuować ponowną zawiesie pelletu z ogniwa T w 20 μL buforu P3 (zgodnie z listą materiałów) na każdy stan. Przelej 20 μL zawiesiny ogniwowej w buforze P3 do rurki mikrowiringowej 1,5 mL zawierającej odpowiednie konstrukcje, wymieszaj delikatnie bez wprowadzenia powietrza i przenieś zawiesinę ogniwa do 16-dołkowego paska nukleoefektyjnego. Delikatnie stuknij, aby usunąć powietrze z dna studni.
9. Umieść pasek 16-dołkowy w systemie 4D Nucleofector i rozpocznij procedurę nukleofekcji. Po udanej nukleofekcji na ekranie dla każdego wybranego dołku powinien być widoczny zielony krzyż.
10. Natychmiast dodaj 100 μL podgrzanego medium z przygotowanej 48-dołkowej płyty przed inkubacją 16-dołkowego paska przez 10 minut w inkubatorze.
11. Ostrożnie ponownie zawiesnij 2 do 3 razy, przelej zawiesinę komórkową do przygotowanej płytki z 48 dołkami i włóż z powrotem do inkubatora.
12. Po 4-5 godzinach ostrożnie usuń 500 μL z każdego dołka i dodaj 500 μL świeżego i wcześniej podgrzanego pożywki z dodatkiem 50 U/mL rekombinowanego ludzkiego IL-2.
13. Regularnie wymieniaj ośrodka co drugi dzień, aby powiększać komórki, utrzymując gęstość komórek między 0,5 a 2 x 10 6 T komórek/mL.
14. W 6. dniu usuń kulki aktywacyjne CD3/CD28. Pobieraj limfocyty T, delikatnie je zawieszając 10 razy i przenosząc zawiesinę do stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Włóż stożkową rurkę 15 mL do odpowiedniego magnesu na 1 minutę.
15. Aspiruj zawiesinę komórkową, przelej na świeżą płytkę hodowlową i podaj komórki świeżym medium do hodowli komórkowych uzupełnionym IL-2 do końcowego stężenia 50 U/mL. Koraliki powinny pozostać widoczne w bocznych ściankach stożkowej rurki 15 mL pozostałej w magnesie.
16. Analizuj efektywność transferu genów w 7. dniu za pomocą analizy cytometrycznej odpowiedniego CAR lub zastępczego markera, zanim przejdziesz do magnetycznego sortowania transgenowo-pozytywnych komórek CAR T w dniu 8 (Strategia bramkowania na Rysunku Uzupełniającym 1).

4. Wzbogacenie magnetyczne komórek T z dodatnim wpływem transgenu

UWAGA: Wszystkie etapy wykonuj sterylną, aseptyczną techniką w szafce biobezpieczeństwa do hodowli tkanek. Wszystkie media do rozcieńczania, mycia i ponownych zawiesin powinny być utrzymywane w temperaturze 4 °C przez cały zabieg.

1. Pobieraj limfocyty T, delikatnie je zawieszając i przenosząc do stożkowych probówek o pojemności 15 mL. Policz komórki T, pobierz liczbę ogniw wzbogaconych magnetycznie i wiruj przez 10 minut przy 300 x g.
2. Wsysaj i wyrzuć supernatant oraz przepłucz, ponownie zawieszając 10 mL buforu MACS. Wirówka przez 10 minut przy 300 x g. Wdysaj i odrzuć supernatant.
3. Oblicz ilość biotynowalnego przeciwciała skierowanego przeciwko zastępczemu markerowi (np. tEGFR) potrzebnemu. Zazwyczaj przeciwciało powinno być titrowane do 1 μL na 1 x 10^{6 komórek} .
4. Ponownie zawiesz limfocyty T o gęstości 1 x 10^{7 komórek} na mL i dodaj obliczoną ilość biotynowo zbieżonych przeciwciał. Inkubuj przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
5. Przemyj przez dodanie 10 ml buforu MACS i wirówkę przez 10 minut przy 300 x g. Wdysaj i odrzuć supernatant.
6. Ponownie zawiesnij limfocyty T w proporcjach 1 x^{10 7 komórek} na 80 μL buforu MACS. Dodawaj mikrogranulki antybiotynowe o objętości 20 μL na 1 x 10^{7 komórek} . Dobrze wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
7. Przemyj przez dodanie 10 ml buforu MACS i wirówkę przez 10 minut przy 300 x g. Wdysaj i odrzuć supernatant. Ponownie zawiesij komórki w 500 μL buforu MACS.
8. Umieść wcześniej schłodzone kolumny LS na magnesie. Pod spodem umieść stożkową rurkę o pojemności 15 mL, aby zbierać przepływ cieczy.
9. Wyrównaj każdą kolumnę LS za pomocą 3 mL bufora MACS. Używając tej samej stożkowej rurki o pojemności 15 mL co probówka zbiorczej, załóż zawiesinę ogniwową na wyrównaną kolumnę LS.
10. Przemyj kolumnę 3 razy 1 mL bufora MACS. Pozwól, by każde 1 mL przeciekało przez kolumnę LS przed kolejnym przemyciem.
11. Aby zebrać komórki transgenowo-pozytywne, należy pobrać kolumnę LS z magnesu i umieścić ją w świeżej stożkowej rurce o pojemności 15 mL. Dodaj 5 ml buforu MACS i delikatnie wypchnij płyn z kolumny.
12. Policz izolowane komórki i wiruj przez 10 minut przy 300 x g. Ponownie zawiesz komórki z transgenem w odpowiedniej objętości pożywki uzupełnionej IL-2 i inkubuj do czasu przeprowadzenia ocen funkcjonalnych i/lub fenotypowych. Przed rozpoczęciem pracy przeprowadź sprawdzenie czystości, barwiąc pod kątem CAR lub zastępczego markera transdukcji (Rysunek uzupełniający 2).

5. Przygotowanie systemu

1. Włącz instrument i otwórz oprogramowanie Cell Analysis Suite (CAS). Upewnij się, że pojemnik na odpady jest pusty. Sprawdź, czy w kolumnie nawilżacza jest woda.
2. Przejdź do panelu przepływów pracy. Otwórz workflow Full Clean (wstępnie załadowany podczas instalacji systemu).
   UWAGA: Zaleca się uruchomienie pełnego czyszczenia w ciągu 72 godzin od rozpoczęcia eksperymentu na instrumencie.
3. Wykonaj wszystkie kontrole i przejdź dalej, klikając Start. Na żądanie wymien stożkowe rurki i butelki odczynnikowe w każdej ze szczelin komory na świeże pojemniki z roztworzeniem BLI czyszczącego. Kliknij ikonę Run , aby przejść dalej.
4. Na polecenie wymień stożkowe rurki i butelki odczynnikowe w każdej ze szczelin komory na świeże pojemniki z wodą sterylną. Kliknij ikonę Run , aby przejść dalej.
5. Otwórz workflow Pre-flight Check (wstępnie załadowany podczas instalacji systemu). Wykonaj wszystkie kontrole i przejdź dalej, klikając Start.
6. Przygotuj stożkową probówkę o pojemności 50 ml z 2 mL roztworu zwilżającego. Przygotuj osobną stożkową probówkę o pojemności 50 mL z 39,6 mL 1x DPBS i 400 μL dodatku do zwilżania.
7. Na żądanie zamień chip Flush na układ optofluidyczny. Kliknij ikonę Run , aby przejść dalej. Przed zamknięciem gniazd dokładnie wyczyść powierzchnię chipu optofluidycznego i tulejek gniazda 70% etanolem.
8. Na żądanie wymień stożkowe rurki i butelki odczynnikowe w każdej ze szczelin w komorze na świeże pojemniki z odpowiednimi roztworami.

6. Tworzenie procesu testowego

1. Przejdź do panelu przepływów pracy. Wybierz Create new workflow (+), wybierz Opto T cell Profiling, a następnie wybierz MCA i Cytotoxicity Assay z rozwijanego menu.
2. Kliknij dwukrotnie Multiplex Cytokine Bead Load , aby rozszerzyć listę załadunku koralików. Jeśli badasz mniej niż 3 cele cytokiny, kliknij X , aby usunąć kulki cytokinowe z listy ładowania kulek.
3. Zaktualizuj każde pole odpowiednim typem kulki, celem cytokinowym oraz lokalizacją importu.
   UWAGA: Oprogramowanie CAS automatycznie ładuje każdą kulkę przechwytywania cytokiny w kolejności spadania jasności Cy5, niezależnie od tego, jak ułożone są wpisy ładowania kulek.
4. Kliknij dwukrotnie Priorytetyzowane załadowanie APC z Control , aby rozszerzyć listę obciążenia komórek docelowych. Jeśli badamy więcej niż 1 komórkę kontrolną i 1 linię docelową-komórkę, dodaj dodatkowe kroki ładowania komórek.
5. Aktualizuj każde pole o żądaną nazwę linii docelowej komórki, pożądane pole widzenia (FOV) do pióra oraz kryteria wyboru APC (poprzez określenie pliku szablonu wyboru celowego pióra (TPS).
6. Wybierz konfigurację obciążenia komórek T i wybierz wiele linii komórkowych. Kliknij dwukrotnie Priorytetyzowane obciążenie komórek T , aby rozszerzyć listę obciążeń komórek T.
7. Aktualizuj każde pole o wybraną nazwę linii limfocytu T, pożądane FOV do pióra oraz kryteria wyboru komórek T (poprzez określenie pliku szablonu TPS).
8. Kliknij dwukrotnie Cytotoksyczny Assay , aby rozszerzyć ustawienia testu cytotoksyczności. Zaktualizuj pola Ustawień obrazowania specyficzne dla przepływu pracy o pożądany czas trwania badania (h).
9. Kliknij dwukrotnie testy fenotypu i cytokin , aby rozszerzyć protokół barwienia w testie wydzielania cytokin.
10. Zaktualizuj pola On Chip Staining o odpowiednią lokalizację importu dla barw pierwotnych i wtórnych.
11. Kliknij dwukrotnie przycisk T Cell Unload , aby rozszerzyć listę rozładunku. Zaktualizuj pole # eksportów na chip (w tym puste miejsca) do żądanej liczby eksportów. Zapisz i otwórz nowo utworzony workflow.

7. Ładunek kulek cytokiny

1. Sonikować i/lub wirować każdą fiolkę koralików, aby całkowicie zawiesić kulki chwytające. Określ stężenie kulek za pomocą licznika komórek.
2. Reguluj gęstość koralików do 4,5 x 10⁶ koralików/mL (koraliki typu A) lub 4 x 10⁶ koralików/mL (koraliki typu B) w 30 μL bufora rozcieńczania koralików.
3. Przechowywać zawiesiny kulek w temperaturze 4 °C, aż zostaną poproszone o załadowanie do komory załadunku próbek. Wykonaj wszystkie kontrole i przejdź dalej, klikając Start.
4. Na żądanie wymieszaj zawieszenie kulek cytokinowych z pipetą 20 μL i załaduj zawieszenie kulek w odpowiednim miejscu importu. Kliknij ikonę Run , aby przejść dalej.
5. Na wezwanie wizualnie sprawdź kilka punktów widzenia, aby upewnić się, że kulki chwytające zostały załadowane równomiernie w kanałach płynowych o odpowiedniej gęstości. Jeśli rozkład obciążenia i/lub gęstość były nieoptymalne, wybierz Flush i Import , aby ponownie spróbować załadunku kulki. Jeśli rozkład i gęstość ładunku były odpowiednie, wybierz Kontynuowaj , aby rozpocząć zaklejanie koralików.
6. Powtórz krok 7.3 dla każdego koralika chwytającego cytokiny.

8. Obciążenie ogniwa docelowego

1. Określ gęstość żywych komórek każdej linii docelowej za pomocą barwienia Trypan Blue.
   UWAGA: Ten proces zakłada, że komórki docelowe pochodzą z aktywnych hodowli. Jeśli zamiast tego mają być użyte komórki kriokonserwowane, upewnij się, że komórki zostały wyhodowane przynajmniej przez jeden przejście po rozmrożu i są co najmniej w 90% żywotne.
2. Pobierz 1 x 10 komórek docelowych⁶ do probówki mikrofugowej o pojemności 1,7 mL. Wiruj w 300 x g przez 5 minut w RT. Wsysaj supernatant.
3. Ponownie zawiesij każdy okręt celowy w 100 μL roztworu barwiącego Annexin V. Inkubuj przez 30 minut w RT, chroniony przed światłem.
4. Dodaj 400 μL bufora wiązającego 1x Annexin V i ponownie zawiesij przez pipetowanie. Wiruj w 300 x g przez 5 minut w RT. Wsysaj supernatant.
5. Każdą kulkę ogniwa docelowego ponownie zawiesić w 250 μL medium ładowającego + CaCl₂. Przechowywać zawiesiny ogniwa docelowego w temperaturze 4 °C, dopóki nie zostaną poproszone o załadowanie do komory załadunku próbek.
6. Na żądanie ponownie zawiesz ogniwa docelowe pipetą 200 μL i załaduj zawiesinę ogniwa docelowego do odpowiedniego miejsca importu. Kliknij ikonę Run , aby przejść dalej.
7. Na żądanie, wizualnie sprawdź kilka FOV, aby upewnić się, że komórki docelowe zostały załadowane równomiernym rozkładem w kanałach płynowych o odpowiedniej gęstości. Jeśli rozkład obciążenia i/lub gęstość były nieoptymalne, wybierz Flush i Import , aby ponownie spróbować ładowania komórki docelowej. Jeśli rozkład obciążenia i gęstość były wystarczające, wybierz Kontynuowaj , aby rozpocząć TPS gating.
8. Po wywołaniu przejdź do Operacji Manualnych, następnie kliknij TPS i załaduj żądany szablon TPS.
9. Określ filtr(y) optyczne i FOV, które mają być obrazowane do definiowania bramek TPS, a następnie kliknij Capture Only , aby rozpocząć akwizycję obrazu.
10. Otwórz Edytor Konfiguracji Gating (Edytor Konfiguracji), kliknij pole wyboru Annexin i wybierz odpowiedni kanał do barwienia Annexin V dla parametru X. W menu rozwijanym wybierz Log (Delta Mediana Jasności). Wybierz OEP dla parametru Y. W menu rozwijanym wybierz Najbliższego Sąsiada.
11. Przeciągnij narożniki powstałej bramki, aby wykluczyć Annexin V^hi i Nearest Neighbor^{low cells,} a następnie zapisz szablon TPS bez zmiany nazwy pliku.
12. Przejdź z powrotem do Przepływów pracy i kliknij Kontynuuj , aby kontynuować pisanie. Powtarzaj kroki 8.7-8.11 dla każdej linii cel-komórka.

9. Obciążenie limfocytów T

1. Określ gęstość żywych komórek każdej linii limfocytów T za pomocą barwienia Trypan.
   UWAGA: Ten workflow zakłada, że limfocyty T pochodzą z aktywnych hodowlań. Jeśli zamiast tego mają być użyte komórki krioprezerwowane, upewnij się, że komórki zostały wyhodowane przez noc po rozmrożnięciu i są co najmniej w 90% żywotne.
2. Pobierz 1 x 10 komórek⁶ T do mikrofugeowej probówki o pojemności 1,7 mL. Wiruj w 300 x g przez 5 minut w RT. Wsysaj supernatant.
3. Ponownie zawiesij każdy okręt celowy w 100 μL roztworu barwiącego Annexin V. Inkubuj przez 30 minut w RT, chroniony przed światłem.
4. Dodaj 400 μL bufora wiązającego 1x Annexin V i ponownie zawiesij przez pipetowanie. Wiruj w 300 x g przez 5 minut w RT. Wsysaj supernatant.
5. Każdą granulkę ogniwa T ponownie zawiesić w 250 μL nośnika obciążeniowego + CaCl₂. Przechowywać zawiesiny komórek T w temperaturze 4 °C, dopóki nie zostaną poproszone o załadowanie do komory załadunku próbek.
6. Na żądanie, ponownie zawiesz ogniwa docelowe pipetą 200 μL i załaduj zawiesinę ogniwa T do odpowiedniego miejsca importu. Kliknij ikonę Run , aby przejść dalej.
7. Na wezwanie wizualnie obejrzyj kilka FOV, aby upewnić się, że komórki T zostały załadowane równomiernie w kanałach płynowych o odpowiedniej gęstości. Jeśli rozkład obciążenia i/lub gęstość były nieoptymalne, wybierz Flush i Import , aby ponownie spróbować ładowania komórek T. Jeśli rozkład obciążenia i gęstość były wystarczające, wybierz Kontynuowaj , aby rozpocząć TPS gating.
8. Po wywołaniu przejdź do Operacji Manualnych, następnie kliknij TPS i załaduj żądany szablon TPS.
9. Określ filtr(y) optyczne i FOV, które mają być obrazowane do definiowania bramek TPS, a następnie kliknij Capture Only , aby rozpocząć akwizycję obrazu.
10. Otwórz Edytor Konfiguracji Gating (Edytor Konfiguracji), kliknij pole wyboru Annexin i wybierz odpowiedni kanał do barwienia Annexin V dla parametru X. W menu rozwijanym wybierz Log (Delta Mediana Jasności). Wybierz OEP dla parametru Y. W menu rozwijanym wybierz Najbliższego Sąsiada.
11. Przeciągnij narożniki powstałej bramki, aby wykluczyć Annexin V^hi i Nearest Neighbor^{low cells,} a następnie zapisz szablon TPS bez zmiany nazwy pliku.
12. Przejdź z powrotem do Przepływów pracy i kliknij Kontynuuj , aby kontynuować pisanie. Powtórz kroki 9.7-9.11 dla każdej linii limfocytów T.

10. Badanie cytotoksyczności

1. Przygotować medium perfuzyjne w stożkowej tubce o pojemności 50 mL, dodając 100 μL wcześniej rozmrożonego odczynnika NucView 530 Caspase-3 do 20 mL medium T-komórkowego (stężenie podstawowe 1 mM, stężenie końcowe 5 μM).
2. Na żądanie wymień odpowiednią stożkową tubkę w szczelinach komory odczynnikowej na przygotowaną stożkową rurkę zawierającą medium perfuzyjne. Kliknij ikonę Run , aby przejść dalej.
   UWAGA: 20 ml medium perfuzyjnego wystarcza do perfuzji pojedynczego chipu optofluidyki przez 24 godziny. Przygotuj dodatkowe medium perfuzyjne, jeśli test cytotoksyczności ma trwać dłużej niż 24 godziny.
3. Jeśli chcesz, zakończ pozostałe etapy badania cytotoksyczności w dowolnym momencie po upływie 14 godzin, klikając Pomiń resztę obrazowania TPS i kontynuuj przepływ pracy.

11. Badanie fenotypu i cytokinów

1. Przygotować pierwotny roztwór barwienia w probówce mikrofugowej o pojemności 1,7 mL, mieszając 76 μL wieloskładnikowych przeciwciał do wykrywania panelowego dla ludzi CD8/NK oraz 4 μL anty CD137_BV421.
2. Mieszaj przez pipetowanie i przechowuj w temperaturze 4 °C, aż pojawi się polecenie załadowania. Na żądanie wymieszaj pierwotny roztwór barwiący z pipetą 20 μL i załaduj do odpowiedniego miejsca importu. Kliknij ikonę Run , aby przejść dalej.
3. Przygotowanie wtórnego roztworu barwienia w osobnej probówce mikrofugowej o pojemności 1,7 mL, mieszając 72 μL 1x DPBS z 8 μL zestawu multipleksowego SA-PE.
   UWAGA: Roztwór wtórny należy przygotować wcześniej, tak aby był gotowy do załadunku zaraz po zakończeniu pierwotnego barwienia.
4. Mieszaj przez pipetowanie i przechowuj w temperaturze 4 °C, aż pojawi się polecenie załadowania. Na żądanie wymieszaj wtórny roztwór barwienia z pipetą 20 μL i załaduj do odpowiedniego miejsca importu. Kliknij ikonę Run , aby przejść dalej.

12. Analiza testu

1. Przejdź do pulpitu i otwórz oprogramowanie Assay Analyzer . Wybierz Assay Analyzer, wybierz Workflows, a następnie wybierz typ workflow do analizy.
2. Użyj dowolnych kryteriów, aby zdefiniować zagrody interesujące do rozładunku. Wygeneruj listę wyładowania zgodnie z pożądanymi kryteriami, następnie wróć do oprogramowania CAS i wybierz Kontynuuj wybrany workflow.
3. Sprawdź, czy pole wyboru Utwórz listę eksportową za pomocą Assay Analyzer, dla: [identyfikator chipu optofluidics] jest zaznaczone.

13. Rozładunek

1. Przygotuj płytkę z 96 dołkami o okrągłym dnie i 50 μL medium T-komórkowego na odwiert. Kliknij Kontynuuj , aby kontynuować rozładowywanie komórek.
2. Na żądanie otwórz komorę ładowania chipów, otwórz pokrywę gniazda i wyjmij chip optofluidyczny. Umieść chip w sterylnej szalce Petriego, z górną krawędzią chipu optofluidyki uniesioną o >1°, aby zapobiec wysuwaniu się komórek z długopisów. Podczas kolejnego etapu przepłukania przechowuj w sterylnym inkubatorze do hodowli tkankowej.
3. Włóż sterylny chip Flush do pustego gniazda, zamknij pokrywę, a potem zamknij komorę na chipy. Kliknij Gotowe , a następnie Kontynuuj.
4. Gdy pojawi się polecenie, otwórz komorę ładowania chipów, otwórz pokrywę Nest i usuń chip Flush. Włóż chip optofluidyczny do pustego gniazda, zamknij pokrywę gniazda, a potem zamknij komorę na chipy. Kliknij ikonę biegu, aby przejść dalej.
5. Po pojawieniu się pytania wybierz Otwórz się, aby wyświetlić menu Ładowanie/Rozładunek Płyty Studni . Kliknij Unload, aby usunąć poprzednią tablicę. Zaktualizuj identyfikator płyty i typ płytki studni, wybierz Załadowanie, a następnie Gotowe.
6. Kliknij Kontynuuj , aby kontynuować rozładowywanie komórek. Po rozładowaniu wszystkich pożądanych piór przejdź do trybu Operacje Manualne i otwórz komorę chipów, aby wyjąć płytkę zawierającą interesujące komórki.

Results

Stosując opisany protokół, wyzwaliśmy poszczególne mock-nukleofektowane, CAR i c-Jun–nadekspresyjne komórki CAR T za pomocą komórek nowotworowych K562 ( np. Rysunek 3 ) lub pozostawialiśmy je niestymulowane (tylko limfocyty T). Komórki docelowe oceniano pod kątem jednorodnej ekspresji antygenu jako warunku wstępnego dla powtarzalnych wyników (Rysunek uzupełniający 3). Dzięki ich izolacji w pojedynczych nanopenach mogliśmy scharakteryzować profile ekspresji cytokin tych komórek jako producentów pojedynczych, podwójnych lub potrójnych, w zależności od testowanego stanu (Rysunek 3). Wyniki te zostały zweryfikowane przy użyciu ELISA jako ugruntowanej metody wykrywania cytokin (Rysunek uzupełniający 4).

Jak można się spodziewać, większość mock-nukleofectowanych limfocytów T pozostała ujemna dla wszystkich trzech mierzonych cytokin (TNF-α, IFN-γ i IL-2). Wśród standardowych komórek CAR T wykryto producentów cytokin z podwójnym, potrójnym i pojedynczym dodatnim wynikiem IFN-γ oraz niewielkie frakcje komórek wydzielających TNF-α i IL-2 podczas wykrycia antygenów, podczas gdy ekspozycja na komórki nowotworowe ujemne antygenem nie wywołała wielokomórkowej wydzieliny cytokiny. Co ciekawe, nadekspresja c-Jun zwiększyła odsetek producentów podwójnych i potrójnych cytokin, a także komórek wydzielających pojedyncze cytokiny, po spotkaniu z celem, zmniejszając tym samym ogólny udział komórek cytokin-ujemnych w porównaniu ze standardowymi komórkami CAR T. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi raportami opisującymi fenotypową modulację komórek CAR T poprzez wymuszoną ekspresję tego czynnika transkrypcyjnego⁶. Co istotne, zaobserwowaliśmy większy odsetek komórek z IFN-γ–dodatnim w grupie wyłącznie T-komórki niż w grupie komórek nowotworowych z antygen-ujemnym, co może wynikać z mniejszej liczby komórek analizowanych w tym stanie.

Aby dalej zbadać aktywację limfocytów T, oceniliśmy ekspresję CD137 w pojedynczych komórkach CAR z nadekspresją CAR i c-Jun z nadekspresją CAR T leczonymi zgodnie z opisaniem powyżej (Rysunek 4 i Tabela uzupełniająca 1). Wyzwanie komórek CAR T z komórkami docelowymi K562 ekspresującymi antygeny skutkowało zwiększoną ekspresją CD137 w porównaniu z komórkami z mock-nukleofektem. Ponadto zaobserwowaliśmy tendencję do nieco wyższego udziału komórek CD137 dodatnich wśród komórek CAR T o nadekspresji c-Jun w porównaniu ze standardowym produktem CAR.

Podsumowując, opisany protokół umożliwił ocenę wydzielania i aktywacji komórek T CAR na poziomie pojedynczych komórek, umożliwiając identyfikację producentów cytokin jednokomórkowych i wielokomórkowych oraz powtórzenie wcześniej opisanych trendów fenotypowych na poziomie objętości⁶.

Rysunek 1: Schematyczny workflow do profilowania multimodalnego za pomocą platformy optofluidycznej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy różnych cech platform optofluidyki. (A) Importować sekwencję pojedynczych cząstek do poszczególnych długopisów za pomocą OEP. Długopisy w lewej części obrazów zostały załadowane w poprzedniej sekwencji. (B) Zabijanie zdarzeń w trzech indywidualnych zagrodach na przestrzeni czasu, wykazujące komórki nowotworowe wyrażające antygeny ekspresujące GFP. (C) Eksport pojedynczej komórki z jednego pióra za pomocą OEP. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Reprezentatywna analiza profili wydzielania cytokinów na poziomie pojedynczych komórek. Pojedyncze mock-nukleofektowane limfocyty T, czyli komórki CAR-T, hodowano w obecności lub bez komórek nowotworowych K562 z antygen-ujemnymi lub antygen-dodatnimi w nanoopenach zawierających kulki wychwytujące cytokiny dla TNF-α, IL-2 i IFN-γ. Wykresy kołowe przedstawiają proporcje analizowanych indywidualnie zaszczepionych komórek CAR-T z profilem wydzielania cytokin po 24 godzinach współhodowli (analiza końcowa). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Reprezentatywna analiza ekspresji CD137 na poziomie pojedynczych komórek. Pojedyncze mock-nukleofectowane limfocyty T lub komórki CAR-T zostały zabarwione pod kątem ekspresji powierzchniowej CD137 na chipie optofluidycznym, 24 godziny po hodowli w obecności lub braku komórek nowotworowych K562 antygen-ujemnych lub antygen-dodatnich. Wykresy skrzypcowe pokazują intensywność fluorescencji ekspresji CD137 na mock-nukleofekowanych limfocytach T i komórkach CAR-T po 24 godzinach hodowli. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Komponenty medium limfocytarnego T (filtrowane sterylnie za pomocą jednostek filtrów próżniowych 0,22μM)	Objętość (końcowe stężenie)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicylina/Streptomycyna (10 000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
β-Merkaptoetanol (50mM)	0,5 mL (45μM)
Ludzkie serum (nieaktywowane przez ciepło)	50 mL (9%)
Suplement GlutaMAX (100x)	5mL (0,9x)
Komponenty pośrednika komórek nowotworowych	Objętość (końcowe stężenie)
RPMI-1640 (1x GlutaMAX, 25mM HEPES)	500 mL
Penicylina/Streptomycyna (10 000 U/mL)	5 mL (90 U/mL)
Serum do łydki płodu (inaktywowane przez ciepło)	50 mL (9%)
Komponenty bufora MACS	Objętość (końcowe stężenie)
DPBS (Mg2+-wolny, Ca2+-wolny)	500 mL
Serum do łydki płodu (inaktywowane przez ciepło)	2,5 mL (0,5 %)
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Komponenty bufora PBS/EDTA	Objętość (końcowe stężenie)
DPBS	500 mL
EDTA (0,5 M)	2 mL (2 mM)
Komponenty ładowania medium	Objętość (końcowe stężenie)
Medium limfocytarne T	18 mL
Ładowanie odczynnika	2 mL
Obciążenie nośnik+komponenty CaCl2	Objętość (końcowe stężenie)
Nośnik ładowania	499 μL
CaCl2	1,25 μL
Medium perfuzyjne+Podłoże kaspazowe	Objętość (końcowe stężenie)
Medium limfocytarne T	20 mL
Podłoże NucView 530 Caspase-3 (1 mM w DMSO)	100 μL
Komponenty bufora rozcieńczania kulek	Objętość (końcowe stężenie)
DPBS	800 μL
BSA (2% w/v)	100 μL (0,2% w/v)
Tween-20 (10% wagi)	10 μL (0,1% w/v)

Tabela 1: Przygotowanie mediów i bufora.

Rysunek uzupełniający 1. Przykładowa strategia gatingu do oceny efektywności transferu genów przed wzbogaceniem magnetycznym. Przykładowe wykresy konturowe i histogramowe pokazują strategię bramkowania umożliwiającą identyfikację komórek CAR ekspresujących (tEGFR-dodatnie) CAR po transferze genu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2. Sortowanie po sortowaniu po kontroli czystości. Przykładowe wykresy konturowe przedstawiają ułamek komórek CAR T wyrażających CAR (tEGFR-dodatnich) po przeprowadzeniu sortowania magnetycznego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek dodatkowy 3. Ekspresja antygenów na docelowych komórkach nowotworowych. Reprezentatywne wykresy histogramowe przedstawiają komórki nowotworowe WT K562 lub zaprojektowane tak, aby wyrażały ROR1 barwione przeciwciałem izotypowym lub celującym w ROR1 za pomocą cytometrii przepływowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4. Wykrywanie cytokinów za pomocą standardowego ELISA. Stężenia IL-2 i IFN-γ w supernatancie po 24 godzinach współhodowli z komórkami nowotworowymi^{K562 ROR1} przy stosunku E:T 4:1, mierzone metodą ELISA dla komórek CAR vs CAR+cJ T. Istotność statystyczna określona przez niesparowany test t-z *P≤ 0,05, **P≤ 0,01, ***P≤ 0,001, ****P≤ 0,0001. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Analizowane komórki. Tabela pokazuje liczbę analizowanych pojedynczych komórek w danym stanie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

Demonstrowany przepływ pracy umożliwia ocenę profilu wydzielania i aktywacji cytokin poszczególnych komórek CAR-T podczas współhodowli z komórkami docelowymi antygen-dodatnimi i antygen-ujemnymi, co opcjonalnie można łączyć z oceną aktywności cytolitycznej. Chociaż możliwość przechwytywania wielofunkcyjnych danych w rozdzielczości pojedynczych komórek umożliwia analizę wydajności komórek T CAR z niespotykaną dotąd precyzją, mierzalność pomiarów w dużej mierze zależy od dokładności technologii OEP w ładowaniu tej samej liczby kulek chwytających cytokiny, komórek docelowych i komórek CAR-T w każdym zagrożeniu. Dlatego kluczowe jest zapewnienie optymalizacji gęstości ładowania i kryteriów TPS każdego odczynnika lub próbki komórki, aby umożliwić ładowanie pojedynczych kulek i/lub pojedynczych komórek w każdym zagrodzie. Chociaż dostosowanie stężenia kulki lub zawiesiny komórki w kanałach fluidyki pozwala na odpowiednie ładowanie pióra, opcje Flush i Import na platformie stanowią dodatkową strategię do ponownego podejścia do procesu ładowania.

Jedną z zalet projektu układu optofluidyki jest rozdzielenie układu pióra na 22 odrębne pola widzenia. Ładując komórki T zaprojektowane różnymi konstrukcjami CAR do różnych FOV w chipie optofluidyki, mogliśmy również ocenić, czy alternatywny konstrukt wymuszający nadekspresję c-Jun może poprawić generowanie komórek CAR-T o funkcjonalności multimodalnej w porównaniu do standardowego konstruktu CAR (Rysunek 3 i Rysunek 4). W ten sposób platforma optofluidyczna umożliwia szybkie zidentyfikowanie kandydatów na konstrukty CAR, które mogą zwiększyć trwałość remisji nowotworów wywołanych przez komórki CAR-T. Warto zauważyć, że analiza interakcji między komórkami docelowymi a efektorowymi na poziomie pojedynczych komórek wymaga kluczowej kontroli kluczowych parametrów, np. heterogeniczności ekspresji antygenów docelowych na komórkach nowotworowych oraz czystości populacji komórek CAR-T (Rysunek uzupełniający 2 i Rysunek uzupełniający 3).

Chociaż skupiliśmy się na ocenie wydzielania IL-2, TNF-α i IFN-γ, szeroki zakres rozpuszczalnych analitów, które można wykryć za pomocą komercyjnie dostępnych multipleksowych paneli wychwytywania cytokin, pozwala na znaczną personalizację przepływu pracy. Najnowsze osiągnięcia wskazują, że dziedzina ta rozwija się również w kierunku cytometrii przepływowej o wysokim wymiarze, otwierając nowe możliwości synergii z profilowaniem funkcjonalnym różnych typów komórek odpornościowych^12,13. Na przykład przyszłe zastosowania mogą obejmować kampanie przesiewowe mające na celu identyfikację polifunkcyjnych regulatornych komórek T (Tregs) wyrażających CAR. Wydzielają one wiele przeciwzapalnych cytokin, takich jak TGF-β i^IL-1014. Dlatego adaptacyjność systemu optofluidyki może utorować drogę do kluczowych wniosków, gdy immunoterapie komórkowe rozszerzają się na nowe granice leczenia chorób niezłośliwych.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nukleofektor 4D	Lonza
Mikrokulki antybiotynowe	Miltenyi Biotec	130-090-485
CD3/CD28 Dynabeads	Thermo Fisher	11131D
Zestaw izolacji ogniw T CD8+	Miltenyi Biotec	130-096-495
Stożkowe rurki CELLSTAR 15 ml (PP)	Greiner Bio-One	188271-N
Stożkowe rurki CELLSTAR 50 ml (PP)	Greiner Bio-One	227261
Corning 75cm² Kolba do hodowli komórek na szyjkę w kształcie litery U z kapsłem uszczelniającym korek	Corning	430720U
Costar 24-dołkowo przezroczyste płyty wielodołkowe z TC, indywidualnie owinięte, sterylne	Corning	3526
Costar 48-dołkowo przezroczyste płytki wielodołkowe impregnowane TC, pojedynczo owinięte, sterylne	Corning	3548
DPBS, bez wapnia, bez magnezu	Thermo Fisher	14190169
DynaMag-15 Magnes	Thermo Fisher	12301D
EGFR (Erbitux, Cetuximab)	Eli Lilly	NDC 66733-948-23	dla koniugacji wewnętrznej (biotyna)
Przeciwciało EGFR (C225 (Cetuximab)) [Alexa Fluor 647]	Novus Biologicals	NBP2-75903AF647
Serum bydlęce płodowe, wartość	Thermo Fisher	A5256801
Suplement GlutaMAX (100x)	Thermo Fisher	35050038
Human IL-2 IS, klasa premium	Miltenyi Biotec	130-097-748
Ludzkie serum	Deutsches Rotes Kreuz (DRK) / Niemiecki Czerwony Krzyż (GRC)	Nie ma
Kolumna separacji komórek MACS, LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303
Zestaw P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X	Lonza	V4XP-3032
Pancoll human, gęstość: 1,077 g/ml	PanBiotech	P04-60500
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I	BD Biosciences	559763
Penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)	Thermo Fisher	15140122
Zestaw do biotinylacji i izolacji powierzchni komórek Pierce'a	Thermo Fisher	A44390
Zestaw startowy QuadroMACS (LS)	Miltenyi Biotec	130-091-051
RPMI 1640 Medium, suplement Glutamax, HEPES	Thermo Fisher	72400054
Pipety serologiczne 2, 5, 10, 25 i 50 ml	Greiner Bio-One	710180, 606180, 607180, 760180, 768180
Trypan Blue Stain (0,4%)	Thermo Fisher	15250-061
UltraPure 0,5  M EDTA, pH 8,0	Thermo Fisher	15575020
β-Merkaptoetanol (50mM)	Thermo Fisher	31350010
Odczynniki beacon
Płyta z 96 dołkami o okrągłym dnie	Corning	3799
Chip Beacon Plastic Flush		500-00030
Roztwór BLI czyszczący, hipokloit sodu, 0,825%	Bruker	520-08000
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma-Aldrich	A4161
Brilliant Violet 421 przeciwciało antyludzkie CD137 (4-1BB)	Biolegenda	309820
Chlorek wapnia (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C5670
LEGENDplex Human IFN-γ Kulki chwytające B3, 13X	Biolegenda	740545
LEGENDplex Human IL-2 Capture Bead A5, 13X	Biolegenda	740934
LEGENDplex Przeciwciała Wykrywania Ludzkiego Panelu Th-Panel V02	Biolegenda	741041
LEGENDplex Human TNF-α Capture Bead B7, 13X	Biolegenda	740711
LEGENDplex SA-PE	Biolegenda	740452
Podłoże NucView 530 Caspase-3, 1 mM w DMSO	Hö lzel	B-10406
OptoSelect Chip 3500	Bruker	500-12001
Azidek sodu	Sigma-Aldrich	S2002
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379
Wegański Eksportowy Bufor	Bruker	520-00040
Butelki VWR Media, Square, PETG, 125ml	VWR	216-2265
Butelki VWR Media, Square, PETG, 500ml	VWR	216-2267
Dodatek zwilżający	Bruker	520-08016
Roztwór zwilżający	Bruker	520-00009