Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Terapeutyczne efekty ekstraktu Acorus calamus L. na uszkodzenia skóry wywołane promieniowaniem w modelu szczura

466 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69705

⸱

9 stycznia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine, General Hospital of Northern Theater Command, 2College of Medicine and Biological Information Engineering, Northeastern University, 3Shenzhen Institute for Advanced Study, University of Electronic Science and Technology of China

W tym artykule

Podsumowanie

Uszkodzenie skóry wywołane promieniowaniem to częste i poważne powikłanie radioterapii u pacjentów onkologicznych. Nie istnieje skuteczne leczenie kliniczne. Protokół ten ocenia terapeutyczny wpływ ekstraktu Acorus calamus L. na urazy skóry wywołane promieniowaniem, z celem dostarczenia nowych kandydatów na leki oraz strategii terapeutycznych do ich klinicznej profilaktyki i leczenia.

Streszczenie

Uszkodzenia skóry wywołane promieniowaniem to częste i wyniszczające powikłanie w terapii nowotworowej, często prowadzące do opóźnienia gojenia się ran i zwiększonego dyskomfortu pacjenta. Dostępnych jest kilka leków terapeutycznych do profilaktyki lub leczenia. Tradycyjna medycyna chińska, a konkretnie Acorus calamus L., wykazała potencjał w leczeniu różnych chorób skóry, jednak jej skuteczność w uszkodzeniach wywołanych promieniowaniem pozostaje niedostatecznie zbadana.

W tym badaniu wykorzystano model szczura Sprague-Dawley wystawiony na promieniowanie 45 Gy, aby wywołać uszkodzenie skóry. Szczury były traktowane ekstraktem L. w 10%, 20% i 40% przez 40% Acorus calamus. Gojenje ran, stan zapalny, apoptoza i angiogeneza oceniano za pomocą szybkości gojenia ran, analizy histopatologicznej, pomiarów cytokin, barwienia TUNEL oraz immunohistochemii. Leczenie Acorus calamus L. przyspieszyło gojenie ran, przy czym grupa przyjmująca średnie dawki wykazała najwyższy wskaźnik gojenia (88,97% po 45 dniach). Analiza histopatologiczna wykazała zmniejszenie stanu zapalnego, poprawę organizacji kolagenu oraz powstawanie nowych naczyń krwionośnych. Poziomy cytokin zapalnych w surowicy (IL-1β, IL-6, TNF-α) były istotnie obniżone, a apoptoza zmniejszona, co doprowadziło do modulacji kluczowych białek apoptoty (P53, Bax, Bcl-2). Ekspresja VEGF i bFGF została zwiększona, co sprzyjało angiogenezie i naprawie tkanek. Acorus calamus L. wspomaga gojenie urazów skóry wywołanych promieniowaniem poprzez redukcję stanu zapalnego, hamowanie apoptozy i wspieranie angiogenezy. Wyniki te sugerują jego potencjał jako czynnika terapeutycznego w leczeniu uszkodzeń skóry wywołanych promieniowaniem, stanowiąc obiecującą alternatywę w leczeniu urazów skóry wywołanych promieniowaniem w klinicznej onkologii. Potrzebne są dalsze badania, aby wyjaśnić mechanizmy molekularne.

Wprowadzenie

Uszkodzenie skóry wywołane promieniowaniem jest częstym i trudnym powikłaniem zarówno wypadków jądrowych, jak i radioterapii nowotworowej1. W radioterapii około 95% pacjentów rozwija pewien stopień uszkodzenia skóry, w tym rumień mięśniowy, odkwamację, nawracające martwicze wrzody, utrzymujący się ból oraz podwyższone ryzyko postępu nowotworów2. Te zmiany często są oporne na leczenie, co znacząco obniża jakość życia pacjentów i czasem wymaga przerwania radioterapii, co stanowi poważne wyzwanie kliniczne w onkologii radioterapii3. Mechanizmy ukryte u podstaw uszkodzeń skóry wywołanych promieniowaniem są złożone i głównie polegają na produkcji wolnych rodników w tkankach skóry, które zakłócają procesy komórkowe i pogarszają proces gojenia 4,5. Skutkuje to przedłużoną ekspresją genów związanych z apoptozą, zaburzeniami reakcji zapalnych oraz zmienionymi szlakami sygnalizacyjnymi, co wszystko przyczynia się do utrzymującego się charakteru ran wywołanych promieniowaniem6.

Obecnie nie istnieje powszechnie akceptowana terapia na złoty standard w leczeniu urazów skóry wywołanych promieniowaniem. Leczenie kliniczne kładzienacisk na działania przeciwzapalne lub antyoksydacyjne 7, zwłaszcza miejscowe kortykosteroidy, które zmniejszają reakcje skórne poprzez działanie przeciwzapalne, immunosupresyjne i wazoograniczackie, ale mogą powodować przerzedzenie skóry przy długotrwałym stosowaniu8. Amifostyna, zatwierdzony przez FDA środek radioochronny, jest ograniczony w zastosowaniu klinicznym ze względu na istotne skutki niepożądane9. Czynniki wzrostu przyspieszają gojenie ran poprzez promowanie proliferacji komórek, angiogenezy i powstawania tkanki granulacyjnej, jednak ich działania są wąsko ukierunkowane, dają ograniczoną kontrolę nad głębokimi uszkodzeniami tkanek i stanami zapalnymi oraz niosą ryzyko nadmiernej hiperplazji7. W konsekwencji Tradycyjna Medycyna Chińska (TKM) przyciągnęła uwagę dzięki swojej holistycznej filozofii, wielu aktywnym składnikom o różnorodnych efektach terapeutycznych oraz korzystnemu profilu bezpieczeństwa. Poprzednie badania wykazały, że produkty naturalne, takie jak ekstrakt z lukrecji, polisacharydy aloesowe i kurkumina, łagodzą zapalenie i uszkodzenia tkanek wywołane promieniowaniem poprzez usuwanie wolnych rodników, hamowanie mediatorów prozapalnych (TNF-α, IL-6) oraz promowanie proliferacji fibroblastów 10,11,12 . Jednak większość tych badań dotyczy pojedynczych aktywnych związków lub pojedynczych celów, dostarczając niewystarczającego wglądu w mechanizmy wieloskładnikowego działania synergicznego. Acorus calamus L., roślina znana ze swoich właściwości przeciwzapalnych, antyoksydacyjnych, antybakteryjnych i gojących rany, wykazała potencjał w różnych schorzeniach skóry.

Acorus calamus L., wieloletnie zioło z rodziny Araneae, zawiera kilka związków bioaktywnych, w tym terpeny, fenylopropanoidy, flawonoidy, sterydy i alkaloidy. Jego skład wieloskładnikowy umożliwia jednoczesne działanie na wielu celach, co generuje synergiczne efekty farmakologiczne13. Badania pokazują, że hamuje szlaki sygnalizacji zapalnej, takie jak NF-κB i MAP, a w zależności od dawki obniża ekspresję mRNA czynników prozapalnych, takich jak TNF-α i IL-6, jednocześnie zwiększając aktywność enzymów antyoksydacyjnych, takich jak SOD i GSH-Px, wywierając tym samym działanie przeciwzapalne, antyoksydacyjne i antybakteryjne14,15. Pomimo udokumentowanych korzyści w leczeniu schorzeń skóry spowodowanych infekcjami i alergiami, rola Acorus calamus L. w urazach skóry wywołanych promieniowaniem pozostaje niedostatecznie zbadana. Najnowsze badania wykazały jego działanie ochronne przed uszkodzeniami wywołanymi promieniowaniem, wspomagając gojenie ran i zmniejszając stan zapalny13. Jednak specyficzne mechanizmy terapeutyczne Acorus calamus L. w urazach skóry wywołanych promieniowaniem nie zostały w pełni wyjaśnione.

Głównym celem tego badania jest ocena terapeutycznych efektów ekstraktu Acorus calamus L. w modelach zwierzęcych uszkodzeń skóry wywołanych promieniowaniem. Oceniamy gojenie ran, reakcje zapalne oraz zachowania komórkowe, aby wyjaśnić mechanizmy działania ekstraktu z różnych perspektyw. Wyniki mają na celu ustanowienie teoretycznych podstaw dla stosowania Acorus calamus L. w klinicznym leczeniu zmian skórnych powstałych w wyniku radioterapii nowotworowej. Ponadto badanie przedstawi funkcjonalne cechy ekstraktu, odpowiednie scenariusze interwencji oraz dane o skuteczności podstawowej, aby pomóc czytelnikom ocenić, czy podejście oparte na produktach naturalnych uzupełnia ich potrzeby badawcze lub kliniczne. Ostatecznie prace te poszukują skutecznych opcji terapeutycznych poprawy jakości życia pacjentów poddawanych radioterapii nowotworowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach opisane w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Medycznych na Zwierzętach Szpitala Generalnego Północnego Teatru Działań (Numer Zatwierdzenia Etyki: 2018-03). W badaniu użyto samców szczurów o stopniu SPF (6-8 tygodni, waga 190-220 g). Szczegóły dotyczące odczynników i używanego sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Zakwaterowanie zwierząt doświadczalnych

  1. Wybierz samce szczurów o SPF 108, w wieku od 6 do 8 tygodni i ważące od 190 do 220 g.
  2. Utrzymuj temperaturę w pokoju zwierząt na poziomie 22 ± 2 °C, wilgotność względną na poziomie 50 ± 5% oraz 12-godzinny cykl światła-ciemności. Pozwól szczurom na nieograniczony dostęp do jedzenia i wody. Po tygodniowym okresie aklimatyzacji przechodzimy do eksperymentów kontrolnych.

2. Grupowanie zwierząt

  1. Losowo przydziel szczury do pięciu odrębnych grup: Grupa normalna (Normalna, n = 18), Grupa Modelowa (Model, n = 18), grupy leków pozytywnych (Dodatnie, n = 18, Krem Betametazon)16, Grupa eksperymentalna z niskimi dawkami (Eksperymental-L, n = 18), Grupa eksperymentalna ze średnimi dawkami (Eksperymental-M, n = 18) oraz grupa eksperymentalna z wysoką dawką (Eksperymental-H, n = 18). Z wyjątkiem grupy normalnej, wszystkie grupy były narażone na promieniowanie.

3. Ustalenie zwierzęcego modelu radioaktywnego uszkodzenia skóry

  1. Podawaj znieczulenie precyzyjnie i przy minimalnym dyskomfortie poprzez iniekcję dootrzewną (i.p.) roztworu pentobarbitalu sodu o zawartości 1% (40 mg/kg). Potwierdź głębokość znieczulenia, obserwując brak odruchu rogówkowego oraz brak reakcji na szczypanie palców. Nakładaj maść na oczy szczurów, aby zapobiec suchości.
  2. Usuń szczurom włosy z tyłu za pomocą golarki elektrycznej. Następnie zdezynfekuj okolice pleców jodem i alkoholem 75%.
  3. Postaw każdego szczura w pozycji na brzuchu. Zabezpiecz iradiator 32P-β (dawka powierzchniowa: 0,9 Gy/min) nad obustronnym obszarem kręgosłupa (2 cm × 2 cm) w centrum 1 cm bocznie od linii środkowej, zapewniając, że źródło styka się z naskórkiem bez przerwy. Zabezpiecz aplikator sterylną taśmą medyczną, aby zapobiec przesunięciu podczas napromieniowania. Napromieniuj docelowy obszar skóry przez 50 minut, aby uzyskać całkowitą dawkę wchłoniętej 45 Gy17.
  4. Gdy szczur odzyska przytomność po napromieniowaniu, należy go odesłać do indywidualnej klatki, zapewniając dostęp do wody i jedzenia ad libitum, utrzymując temperaturę 22 ± 2 °C, wilgotność względną 50 ± 5% oraz 12-godzinny cykl światła i ciemności.
    UWAGA: Proces eksperymentalny musi ściśle przestrzegać ustalonych zasad biologicznej i radioaktywnej ochrony zawodowej. Ponadto wszystkie procedury operacyjne muszą być zgodne z wytycznymi dotyczącymi właściwej i zgodnej utylizacji odpadów medycznych i radioaktywnych, aby zapewnić bezpieczeństwo i zdrowie wszystkich zaangażowanych pracowników.

4. Przygotowanie ekstraktu Acorus calamus L. i podawanie leków

  1. Zważ kłącza Acorus calamus L., dokładnie oczyści, pozwól wyschnąć na powietrzu i zmielić na gruby proszek (siatka 40). Włącz 10-20 objętości etanolu 50% i ujednolic w temperaturze pokojowej przez 24 godziny
  2. Po pozostawieniu ekstraktu do osadzenia się przez 30 minut, przelej supernatant i przeprowadź wstępną filtrację przez 4-8 warstw gazy, aby usunąć grube zanieczyszczenia. Następnie filtruj za pomocą papieru filtracyjnego i odparowuj filtrat pod obniżonym ciśnieniem w parowniku obrotowym w temperaturze 50-60 °C, aby odzyskać rozpuszczalnik, co skutkuje powstaniem pozostałości stałej wolnej od rozpuszczalnika (AE, zawartość wilgoci < 5%).
  3. Przygotowanie maściAE 18
    UWAGA: Formułuj 10% (eksperymentalne-L, w/w), 20% (eksperymentalne-M, w/w) oraz 40% (eksperymentalne-H, w/w) maści z ekstraktu Acorus calamus L. zgodnie z wydaniem Chińskiej Farmakopoei 2020 (rozdział ogólny 0109)19.
    1. Dokładnie waż AE (np. 20 g maści 20%) oraz odpowiadający jej petrolaton farmaceutycznej (np. 80 g maści 20%).
    2. Dodaj 10% całkowitego petrolatu do AE, energicznie tryturuj przez 5 minut, aby uzyskać jednorodną pastę (metoda rozcieńczania geometrycznego, zapewniająca równomierne rozpraszanie AE w zasadzie lipofilowej).
    3. Roztop pozostałą ilość petrolatu w temperaturze 60 °C, schłodzi do 55 °C i powoli dodaj do pasty AE-petrolatum.
    4. Mieszaj magnetycznie z prędkością 250 obr./min przez 30 minut w temperaturze 55 °C, a następnie mieszaj ciągle, chłodząc do temperatury pokojowej, aby uzyskać gładką, wolną od cząstek maść.
    5. Przygotowanie do kontroli pustych warstw: Roztopić petrolaton w 60 °C, mieszać w 250 obr./min przez 30 minut i schłodzić do temperatury pokojowej (identyczne jak baza maści AE).
    6. Wszystkie maści i biały petrolaton przechowuj w temperaturze 4 °C w szczelnych, sterylnych pojemnikach.
  4. Wszystkie grupy były podawane miejscowo środki dwa razy dziennie o 09:00 i 17:00 przez 45 kolejnych dni po napromieniowaniu (normalna grupa, nienapromieniowana, otrzymywała synchronicznie ten sam harmonogram podawania). Dawka wynosiła 0,2 g/cm², równomiernie rozłożona na obszarze skóry grzbietowej o powierzchni 2 cm × 2 cm. Grupa zwykła otrzymała pojazd (petrolatum), a grupa modelowa pojazd (petrolatum). Grupa kontrolna otrzymała krem z betametazonem. Grupy eksperymentalne L, M i H otrzymały kremy zawierające AE odpowiednio w zakresie 10%, 20% i 40% (w/w). Po każdej aplikacji poddane miejsce delikatnie masowano przez 10 sekund, aby poprawić wchłanianie, a szczury były unieruchomiane przez 5 minut, aby zapobiec lizaniu.

5. Zbieranie tkanek skórnych i krwi szczurów

  1. Znieczulaj szczury za pomocą 1% roztworu sodu pentobarbitalu (40 mg/kg, i.p.). Dezynfekować narzędzia chirurgiczne i usunąć skórę w okolicy rany.
  2. Utraż część tkanki w 4% paradehydu (10 mL), inną część w glutaraldehydzie/czterotlenku osmu (5 mL, 2,5%), a resztę zachowaj w ciekłym azocie do dalszej analizy (patrz Tabela materiałów).
  3. Pobierz próbki krwi z aorty brzusznej szczura. Wirówka w 3 000 × g w 4 °C przez 15 minut; wdychanie supernatantu do lamp EP; zachowuj i przechowywaj w temperaturze -80 °C.

6. Ocena leczenia

  1. Obserwuj ranę w 7., 15., 30. i 45. dniu po napromieniowaniu i wykonuj zdjęcia powierzchni rany kamerą wysokiej rozdzielczości. Zaimportuj obrazy do ImageJ i narysuj obszar rany wzdłuż krawędzi rany. Oblicz obszar na obrazie. Upewnij się, że każda operacja jest spójna, aby uniknąć błędów pomiarowych. Oblicz czas gojenia rany i szybkość gojenia.
    UWAGA: Szybkość gojenia rany (%) = (Początkowy obszar napromieniowany - Obszar niezagojonej rany) / Początkowy obszar napromieniowany. Kryteria gojenia rany: Całkowite gojenie definiuje się jako zaschnięty obszar < 5% powierzchni rany lub zagojony obszar > 95% powierzchni rany. Początkowy obszar napromieniowania: obszar rany mierzony w momencie, gdy napromieniowane zwierzęta wykazywały stabilną ranę (punkt wyjściowy).

7. Badanie mikroskopem elektronowym

  1. Szybkie pobieranie próbek tkanek i ich utrwalanie
    1. Użyj ostrego ostrza do usunięcia bloku tkanki skóry o powierzchni 1 mm³, obejmującego warstwę naskórka i skóry skóry.
    2. Natychmiast zanurz próbkę w schłodzonym buforze fosforanu glutaraldehydu (0,1 M, pH 7,4) w 4 °C na 24 godziny w celu utrwalenia.
  2. Zmywanie buforowe
    1. Przeprowadź trzy płukania z buforem fosforanowym 0,1 M (pH 7,4), co pozwala na 15 minut na każde płukanie.
  3. Po fiksacji
    1. Przejście próbki do roztworu czterotlenku osmu o stężeniu 1% w temperaturze 4 °C, aby utrwalić trwającą 1,5 godziny.
  4. Odwodnienie gradientowe
    1. Stopniowo przekraczaj stężenia acetonu na poziomie 50%, 70%, 80%, 90% i 100%, przeznaczając na każdy etap 15 minut.
    2. Powtórz zabieg z acetonem 100% trzy razy, przy czym każde zanurzenie trwa 10 minut.
  5. Osadzanie żywicy epoksydowej
    1. Mocz próbkę w mieszance 2:1 acetonu i żywicy epoksydowej przez 2 godziny, po czym następuje nocne zanurzenie w czystej żywicy epoksydowej.
    2. Polimeryzuj próbkę w 60 °C przez 48 godzin, aby utworzyć blok stały.
  6. Krojonowanie i barwienie
    1. Wykonaj ultracienkie przekroje o średnicy 70 nm przy użyciu ultramikrotomu.
    2. Barwimy octanem uranu przez 15 minut, a następnie cytrynianem ołowiu przez 5 minut w temperaturze 60 °C.

8. Barwienie hematoksylinowo-eozynowe (HE)

  1. Wykonaj osadzenie parafiny
    1. Próbki skóry wycizowej, odwodnić za pomocą gradientu alkoholowego (np. 70%, 80% i 95% etanolu, każdy przez 15 minut, po czym następuje dwie wymiany 100% etanolu, każda przez 15 minut), a następnie przenieść do ksylenu, aż tkanka osiągnie stan przezroczystości.
    2. Zanurz w parafinie, aby zapewnić osadzenie, a następnie pozwól na zastygnięcie.
  2. Wykonaj dewaksowanie i nawodnienie
    1. Zanurz sekcje parafiny w ksylenie I/II na 10 minut każda.
    2. Przepłukaj ksylen 100% etanolem, następnie zanurz w 95% etanolu na 3 minuty, w 80% etanolu przez 3 minuty, 70% etanolu przez 3 minuty, a na końcu spłuknij wodą destylowaną.
  3. Przeprowadz barwienie jądrowe hematoksylyny
    1. Mocz w roztworze hematoksyliny Harrisa przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Płukaj pod bieżącą wodą przez 10 minut, aż pojawi się niebieskie ubarwienie.
  4. Wprowadź różnicowanie i barwienie przeciwbarwne
    1. Różnicuj za pomocą 1% kwasu solnego w etanolu przez 3 sekundy (obserwuj klarowność jądrową pod mikroskopem).
    2. Kontrastuj roztworem 0,5% amoniaku przez 30 sekund.
  5. Wykonaj kontrubaryzację eozyną
    1. Barwić roztworem eozyny 0,5% (zawierającym 1% kwasu octowego lodowca) przez 90 sekund.
    2. Szybko spłuknij wodą destylowaną przez 5 sekund, żeby usunąć nadmiar plamy.
  6. Przeprowadz odwodnienie i oczyszczanie
    1. Kolejno przepuszczaj 70%, 80%, 95%, 100% etanolu I/II (po 1 minutę każdy).
    2. Przezroczysty ksylen I/II przez 2 minuty każdy.
  7. Zastosowanie uszczelnienia i obserwacji
    1. Nałóż żywicę neutralną kropelą, a potem przykryj nakładką pokrywkową.
    2. Susz w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 30 minut przed badaniem mikroskopowym.

9. Trójbarwne barwienie Massona

  1. Wykonuj rutynowe odwoskowanie podobne do barwienia przed HE.
  2. Barwienie jądrowe
    1. Mocz w roztworze hematoksyliny przez 10 minut.
    2. Płukaj pod bieżącą wodą przez 5 minut, aż niebieski odcień wróci.
  3. Barwienie włókna kolagenowego
    1. Zanurz się w mieszance Alizarin Red i Acid Fuchsin przez 5 minut.
  4. Różnicowanie kwasu fosfomilibdykowego
    1. Przelej do 1% roztworu wodnego kwasu fosfomilibdykowego na 1 minutę.
  5. Kontrastowanie miofibr
    1. Przelać bezpośrednio do roztworu 2,5% błękitu anilinowego na 5 minut.
    2. Szybko spłukuj wodą roztworem kwasu octowego o stężeniu 0,5% przez 5 sekund.
  6. Odwodnienie i montaż
    1. Wykonaj odwodnienie gradientowe etanolem: 95% etanolu I, 100% etanolu II (po 30 sekund każdy).
    2. Przezroczyste z ksylenem.
    3. Zamontuj żywicą neutralną, wysusz w temperaturze 60 °C, a następnie zbadaj pod mikroskopem.

10. Wykrywanie poziomów IL-1β, IL-6 i TNF-α ELISA

UWAGA: IL-1β, IL-6 i TNF-α to ważne prozapalne cytokiny powszechnie stosowane do oceny zarówno obecności, jak i intensywności stanu zapalnego. Monitorowanie ich poziomów jest kluczowe dla uzyskania wglądu w procesy zapalne oraz określenia skuteczności leczenia przeciwzapalnego.

  1. Przygotuj próbki surowicy
    1. Postępuj zgodnie z protokołem opisanym w kroku 5.3, aby pobrać próbki surowic.
  2. Standardy rozcieńczone i próbki
    1. Stwórz gradientowe rozcieńczenie standardów z wykorzystaniem rozcieńczalnika próbki; Rozcieńczone próbki surowicy w proporcji 1:4.
  3. Dodaj próbki i inkubuj
    1. Wprowadź 100 μL standardu/próbki do każdego dołka; przykryć studnie membraną; inkubować w 37 °C przez 90 minut; Następnie wyrzuć płyn i wysuszyć studnie.
  4. Wykrycie reakcji przeciwciało-enzym
    1. Do każdego dołka należy podać 100 μL enzymatycznego odczynnika specyficznego dla IL-1β, IL-6 i TNF-α; inkubować w 37 °C przez 60 minut; usuń płyn i wysusz go do sucha; myj płytę cztery razy 200 μL buforu do mycia.
    2. Dodaj 100 μL roztworu roboczego streptawidyny-HRP (rozcieńczenie 1:100) do każdego dołku; inkubować w 37 °C w ciemności przez 30 minut; myj płytę cztery razy 200 μL buforu do mycia.
  5. Wywołaj kolor i zakończ
    1. Wprowadź 100 μL roztworu substratu TMB do każdego dołu; inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut; następnie do każdej studni należy dodać 50 μL roztworu stopowego.
  6. Odczyt danych
    1. Zmierz absorpcję na 450 nm (z długością fali kalibracyjnej 630 nm) za pomocą enzymatycznego immunosorbentowego czytnika testów w ciągu 30 minut; Oblicz stężenie (pg/mL) za pomocą krzywej standardowej.

11. Analiza TUNELOWA

  1. Wstępne przygotowanie sekcji
    1. Odwoskuj i susz sekcje parafiny, aż dotrzą do wody destylowanej.
    2. Wprowadź roztwór roboczy proteinazy K w stężeniu 20 μg/mL i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
    3. Myj te fragmenty trzy razy PBS, każde pranie trwa 2 minuty.
  2. Reakcja etykietowania
    1. Należy zastosować mieszaninę reakcji TUNEL zawierającą enzym TdT oraz znakowany fluoresceiną dUTP.
    2. Inkubuj w nawilżonej komorze w temperaturze 37 °C w ciemności przez 60 minut.
  3. Konwersja sygnału
    1. Myj trzy razy PBS, zostawiając 5 minut na każde pranie.
    2. Wprowadź przeciwciało antyfluoresceinowe znakowane HRP w rozcieńczeniu 1:500.
    3. Inkubuj w 37 °C przez 30 minut.
  4. Rozwój chromogeniczny DAB
    1. Po myciu PBS nałóż roztwór chromogeniczny DAB i monitoruj rozwój pod mikroskopem przez 1 do 3 minut.
    2. Zatrzymaj reakcję za pomocą wody destylowanej.
  5. Barcowanie przeciwbarwne i montaż
    1. Neutralizuj jądra hematoksyliną przez 1 minutę.
    2. Susz za pomocą sortowanego etanolu, przezroczystego ksylenem i mocuj żywicą neutralną.
  6. Interpretacja wyników
    1. Identyfikuj jądra apoptotyczne jako brązowożółte, podczas gdy normalne jądra wyglądają na niebieskie.
    2. Wybierz losowo pięć pól o wysokiej mocy (400×) na każdy slajd, aby obliczyć tempo apoptozy.

12. Immunohistochemiczne barwienie

  1. Odwoskowanie i pobieranie antygenów
    1. Mocz sekcje parafiny w ksylenie I przez 10 minut, a następnie przelej na ksylenie II przez kolejne 10 minut. Następnie odwodnić za pomocą serii gradientowej etanolu, zaczynając od 5 minut w 100% etanolu I, następnie 5 minut w 100% etanolu II, po 3 minuty w 95%, 80% i 70% etanolu, a na końcu płukać wodą destylowaną przez 2 minuty.
    2. Przeprowadz naprawę cieplną pod wysokim ciśnieniem z buforem cytrynianu sodu 0,01 M przy pH 6,0, utrzymując temperaturę 121 °C przez 3 minuty.
  2. Interferencja endogenna blokująca
    1. Wprowadź roztwór 3% H2O2 w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby inaktywować enzymy endogenne.
    2. Nałóż 5% roztwór blokujący BSA na tkankę i inkubuj w nawilżonej komorze w temperaturze 37 °C przez 45 minut; Aspiruj nadmiar roztworu blokującego bez płukania.
  3. Inkubacja przeciwciał
    1. Podawaj 5% roztwór blokujący BSA i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    2. Dodaj pierwotny roztwór roboczy przeciwciał w zoptymalizowanym stężeniu (np. P53, Bax, Bcl-2, VEGF i bFGF) i inkubuj przez noc w nawilżonej komorze w temperaturze 4 °C; myj trzy razy buforem PBS-T zawierającym 0,1% Tween-20 przez 5 minut każdy.
    3. Wprowadź przeciwciało wtórne z oznakowaniem HRP rozcieńczone w 1:200; inkubować w nawilżonej komorze w temperaturze 37 °C przez 60 minut; myj trzy razy buforem PBS-T przez 5 minut każdy. Następnie dodaj roztwór sprzężony ABC i inkubuj w 37 °C przez 30 minut, po czym wykonuję trzy płukania z buforem PBS przez 5 minut każda.
  4. Wywoływanie kolorów DAB
    1. Dodaj roztwór wywoływający DAB zawierający 0,02% H₂O₂ i monitoruj rozwój pod mikroskopem w temperaturze pokojowej przez 1-4 minuty.
    2. Natychmiast przerwij reakcję wodą destylowaną.
  5. Barcowanie przeciwbarwne i montaż
    1. Zanurz próbkę w roztworze hematoksyliny Harrisa na 1 minutę i przepłucz pod bieżącą wodą przez 10 minut, aby uzyskać odzyskanie niebieskiego koloru.
    2. Zanurz kolejno w następujących roztworach: 70% etanolu przez 30 sekund, 80% etanolu przez 30 sekund, 95% etanolu przez 30 sekund, 100% etanolu I przez 1 minutę oraz 100% etanolu II przez 1 minutę.
    3. Aby całkowicie oczyścić i utrwalić, zanurz w ksylenie I przez 2 minuty, a następnie przelej do ksylenu II przez 2 minuty. Dodaj neutralną żywicę mocującą średnio kropelowo, przykryj pokrywką i susz w piekarniku o temperaturze 60 °C przez 30 minut.
  6. Ilościowość wyników
    1. Brązowy kolor oznacza pozytywną reakcję; sygnały pozytywne (brązowo-żółte) powinny kontrastować z negatywnym tłem.
    2. Wykorzystaj oprogramowanie Image-Pro Plus, aby obliczyć procent pozytywnych komórek w co najmniej 5 polach widzenia.

13. Wykrywanie zachodniego blottingu

  1. Przygotowanie do lizy tkanek
    1. Wprowadzenie tkanki skórnej zmrożonej ciekłym azotem do wcześniej schłodzonej zaprawy ze stali nierdzewnej w temperaturze -80 °C; stopniowo dodawaj ciekły azot w trzech krokach, aby ograniczyć parowanie; szlifować pionowo, aż wszystkie cząstki przestają być widoczne; przenieś powstały proszek do probówki EP zawierającej bufor lizowy.
    2. Włączaj inhibitor proteazy (1:100) i inhibitor fosfatazy (1:50); Vortex na lodzie przez 30 sekund; przeprowadzanie zakłóceń ultradźwiękowych; inkubować w 4 °C w inkubatorze potrząsającym przez 2 godziny; wirówka w temperaturze 4 °C, 14 000 × g przez 20 minut; ostrożnie zasysaj supernatant.
  2. Ilościowa i przetwarzanie białek
    1. Podaję 5 μL supernatantu do płytki z 96 dołkami; dodanie 200 μL roztworu roboczego BCA; inkubować w 37 °C w ciemności przez 30 minut; mierzenie absorpcji przy 562 nm za pomocą czytnika mikropłyt; określ stężenie zgodnie z krzywą standardową.
    2. Połącz 5× zredukowanego buforu ładowania białka z roztworem białkowym w stosunku 4:1; denaturacja przez umieszczenie w kąpieli wodnej na 15 minut; przechowywać w temperaturze -20 °C na przyszłość.
  3. Elektroforeza SDS-PAGE
    1. Przygotuj żel rozwiązujący akryloamid o stężeniu 12%; wlej żel aż do 1 cm poniżej zębów grzebienia; przykryj izopropanolem, aby zapobiec wytrzymywaniu powietrza; Po zastygnięciu usuń izopropanol; wlej żel koncentrujący 4%; włóż grzebień z 15 dołkami; pozwalać na zastygnięcie w temperaturze pokojowej przez 30 minut; Dodaj 5 μL wcześniej barwionego markera białkowego do dołka załadunku 1; dodanie 20 μL pustego lizatu do dołka 2; do każdego dołka należy dodać 10 μL próbki zawierającej 40 μg białka od 3 do 14.
    2. Rozpocznij elektroforezę przy napięciu 80 V; przełącz się na 120 V, gdy błękit bromofenolu przechodzi do żelu separującego; utrzymywanie temperatury 10-15 °C przy cyrkulacji lodowej wody; Pracuj, aż bromofenolowy niebieski osiągnie 0,5 cm od dna żelu.
  4. Procedura mokrego umazywania
    1. Przygotuj bufor transferowy zawierający 20% metanolu; wstępne schładzenie do 4 °C. Aktywacja membrany PVDF, zanurzenie jej w metanolu na 1 minutę; wyrównuj błonę NC w buforze. Złóż zacisk transferowy w następującej kolejności: "Płytka katodowa - Podkładka gąbkowa - Papier filtracyjny - Żel - Membrana - Papier filtracyjny - Podkładka gąbkowa - Płyta anoda"; dokładnie usuń wszelkie pęcherzyki wałkiem; ustaw parametry zgodnie z docelową masą cząsteczkową białka: dla białek < 50 kDa stosuj stały transfer napięcia przy 100 V przez 60 minut; dla białek o masie 50-100 kDa należy stosować stały transfer prądu o napięciu 250 mA przez 90 minut; dla białek > 100 kDa wprowadź stały transfer prądu przy 300 mA przez 120 minut; podłącz się do cyrkulacyjnej kąpieli wodnej o temperaturze 4 °C.
  5. Procedura immunodetekcji
    1. Po transferze zanurz membranę PVDF w metanolu na 1 minutę; myj trzy razy TBST przez 5 minut każdy; pokryć powierzchnię błony 3% H₂O₂/TBST; inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 15 minut; zasysać ciecz; dodanie 5% roztworu blokującego BSA/TBST; blokować przez 1 godzinę w inkubatorze wstrząsającym 37 °C; myj błonę trzy razy metodą TBST przez 5 minut każdy.
    2. Dodaj pierwotny roztwór przeciwciał roboczych (takie jak P53, Bax, Bcl-2, VEGF i bFGF); inkubować przez noc w temperaturze 4 °C w inkubatorze trzęsącym się; myj błonę cztery razy metodą TBST przez 10 minut każdy; dodanie przeciwciał wtórnych znakowanych HRP; inkubować w inkubatorze wstrząsającym w temperaturze pokojowej przez 90 minut; myj membranę sześć razy metodą TBST + 0,5% SDS przez 8 minut każdy.
  6. Obrazowanie chemiluminescencyjne
    1. Wymieszaj równe objętości roztworów ECL A i B; równomiernie pokrywają powierzchnię błony; pozwalamy na reakcję w ciemności przez 60 sekund; zasysać nadmiar cieczy; ustaw pojedynczy czas ekspozycji między 1-5 s dla białek silnych sygnałów; przeprowadzenie skumulowanej ekspozycji w pięciu segmentach (10/30/60/120/300 s) na białka sygnałowe o słabym stopniu; Rejestruj obrazy za pomocą obrazowania chemiluminescencji.
  7. Workflow analizy danych
    1. Ilościowa liczba białek za pomocą oprogramowania ImageJ; ustalić jednolity próg odejmowania tła; oblicza stosunek szarości białka docelowego do białka referencyjnego (β-aktyna lub GAPDH)
    2. Zaimportuj dane do GraphPad Prism do analizy.

14. Analiza statystyczna

  1. Przedstawij dane według średniej ± standardowego błędu średniej. Stosuj niezależne próby testów t do porównań między dwiema grupami oraz jednokierunkową ANOVA do porównań między wieloma grupami.
  2. Analizuj dane za pomocą SPSS 26.0 i GraphPad Prism 8.0.2.
  3. Rozważmy P < 0,05 jako wskaźnik statystycznie istotnych różnic.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Terapeutyczny wpływ Acorus calamus L. na uszkodzenia skóry wywołane promieniowaniem
15 dni po napromieniowaniu wszystkie grupy szczurów wykazywały suche łuszczenie, miejscowe zaczerwienienie, obrzęk, wrzody i strupy. 30 dni po napromieniowaniu grupa modelowa wykazała najpoważniejsze uszkodzenia skóry, z strupach i wrzodami w miejscu napromieniowania osiągającymi szczyt. Po 45 dniach grupa modelowa wykazała minimalne wypadanie strupów, a rana wykazywała pewne skurcze. Natomiast grupy Acorus calamus L. ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Uszkodzenia skóry wywołane promieniowaniem pozostają jednym z najczęstszych i najtrudniejszych powikłań w klinicznej radioterapii nowotworów. Jako największy narząd i pierwszy cel promieniowania, skóra jest podatna na uszkodzenia spowodowane przez wolne rodniki i reaktywne odmiany tlenu powstające w wyniku promieniowania, które mogą utrudniać funkcje komórkowe, w tym podział komórek, migrację i różnicowanie, co ostatecznie prowadzi do opóźnionego gojenia się ran i uszkodzenia tkanek20,21

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Prace te były wspierane przez wspólny plan planu naukowo-technologicznego prowincji Liaoning (Projekt Technicznego Omówienia) (2024JH2/102600273) oraz niezależny projekt badawczy Północnego Teatru Ogólnego (ZZKY2024001, ZZKY2024002, ZZKY2024003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4% roztwór paraformaldehyduBeyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinyP0099
Ekstrakt Acorus calamus L.Przygotowane wewnętrznieN/A   Szczegółowy protokół przygotowania opisany jest w Sekcji 4 Protokołu.
Przeciwciała anty-Bax   Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chiny)GB11690
Przeciwciało przeciw Bcl-2Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chiny)GB113375
Przeciwciała przeciwbFGFProteintech Group, Inc. (Wuhan, Hubei, Chiny)11234-1-AP
Przeciwciało przeciw P53 & nbsp;Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chiny)GB111740
Przeciwciała przeciw VEGF & nbsp;Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chiny)GB111971
Zestaw do testów białek BCA Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chiny)G2026-200T
Krem z betametazonem  United Pharmaceutical Co., Ltd. (Chiny)N/A Stężenie: 0,1% w/w
Narodowe Zatwierdzenie Leku nr H19994057
EtanolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.E111991Używany jako rozpuszczalnik do ekstrakcji ekstraktu Acorus calamus L.
System obrazowania żelowego i plamowegoBio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA)ChemiDoc MP
Zestaw barwienia hematoksylin-eozynyPekin Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Pekin, Chiny)    G1120
HRP sprzężony kozy antykróliczy IgG (H+L)Wuhan servicebio technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Chiny)GB23303
Odwrócony mikroskop fluorescencyjnyOlympus Corporation (Tokio, Japonia)IX83   
Masson' Zestaw Trichrome Stain KitPekin Solarbio Science & Technology Co., Ltd. (Pekin, Chiny)    G1340
Czytnik mikropłyt (do wykrywania absorpcji, fluorescencji i luminescencji)Urządzenia molekularne (San Jose, CA, USA)SpectraMax iD3
PetrolatumSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Szanghaj, Chiny)N/A   Biały petrolaton o jakości farmaceutycznej; Temperatura topnienia: 45-60 stopni; C;  Narodowe Zatwierdzenie Leku Nr H31022350
Rat IL-1β ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinyPI303
Rat IL-6 ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinyPI328
Rat TNF i alfa; ELISA Kit   Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinyPT516
Zestaw do wykrywania apoptozy komórek TUNEL (DAB)Beyotime Biotech Inc (Beyotime), ChinyC1091

Bibliografia

  1. Piffkó, A., et al. Radiation-induced amphiregulin drives tumour metastasis. Nature. 643 (8072), 810-819 (2025).
  2. Wang, K., Tepper, J. E. Radiation therapy-associated toxicity: Etiology, management, and prevention. CA Cancer J Clin. 71 (5), 437-454 (2021).
  3. Grosu-Bularda, A., et al. Navigating the complexities of radiation injuries: therapeutic principles and reconstructive strategies. J Pers Med. 14 (11), 1100(2024).
  4. Kemin, L., Rutie, Y. A critical review of the progress in prevention and treatment of radiation-induced skin damage. Front Oncol. 14, 1395778(2024).
  5. Borrelli, M. R., et al. Radiation-induced skin fibrosis: Pathogenesis, current treatment options, and emerging therapeutics. Ann Plast Surg. 83 (4S Suppl 1), S59-S64 (2019).
  6. Xu, Y., Liu, Q., Li, W., Hu, Z., Shi, C. Recent advances in the mechanisms, current treatment status, and application of multifunctional biomaterials for radiation-induced skin injury. Theranostics. 15 (7), 2700-2719 (2025).
  7. Deng, G. M., He, W. S., Liu, W. Y., Wu, F. S., Chen, J. B. Evolution of radiation-induced dermatitis treatment. Clin Transl Oncol. 26 (9), 2142-2155 (2024).
  8. Bian, X. W., et al. Epigenetic memory of radiotherapy in dermal fibroblasts impairs wound repair capacity in cancer survivors. Nat Commun. 15 (1), 9286(2024).
  9. Singh, V. K., Seed, T. M. The efficacy and safety of amifostine for the acute radiation syndrome. Expert Opin Drug Saf. 18 (11), 1077-1090 (2019).
  10. Wang, Z., Chen, R., Chen, J., Su, L. 18β-glycyrrhetinic acid alleviates radiation-induced skin injury by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway. Biol Chem. 405 (6), 407-415 (2024).
  11. Wang, Z. W., et al. Aloe polysaccharides mediated radioprotective effect through the inhibition of apoptosis. J Radiat Res. 45 (3), 447-454 (2004).
  12. Kongkham, B., Duraivadivel, P., Hariprasad, P. Acorus calamus L. rhizome extract and its bioactive fraction exhibits antibacterial effect by modulating membrane permeability and fatty acid composition. J Ethnopharmacol. 331, 118323(2024).
  13. Abdeahad, H., et al. Therapeutic potency of curcumin on radiodermatitis: A systematic review. Avicenna J Phytomed. 14 (3), 297-304 (2024).
  14. Kim, H., Han, T. H., Lee, S. G. Anti-inflammatory activity of a water extract of Acorus calamus L. leaves on keratinocyte HaCaT cells. J Ethnopharmacol. 122 (1), 149-156 (2009).
  15. Zhao, Y., et al. botanic, phytochemistry and pharmacology of the Acorus L. genus: A review. Molecules. 28 (20), 7117(2023).
  16. Kuan, C., et al. Rice bran extract alleviates inflammation and promotes wound healing in radiation dermatitis. Exp Dermatol. 34 (9), e70162(2025).
  17. Salgueiro, M. J., et al. Biological effects of brachytherapy using a (32)P-patch on the skin of Sencar mice. Appl Radiat Isot. 67 (32), 1769-1774 (2009).
  18. Jain, N., Jain, R., Jain, A., Jain, D. K., Chandel, H. S. Evaluation of wound-healing activity of Acorus calamus Linn. Nat Prod Res. 24 (6), 534-541 (2010).
  19. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2020 Edition. , China Medical Science Press. Beijing. (2020).
  20. Chen, Y., et al. Senescent fibroblast facilitates re-epithelization and collagen deposition in radiation-induced skin injury through IL-33-mediated macrophage polarization. J Transl Med. 22 (1), 176(2024).
  21. Milam, E. C., Rangel, L. K., Pomeranz, M. K. Dermatologic sequelae of breast cancer: From disease, surgery, and radiation. Int J Dermatol. 60 (4), 394-406 (2021).
  22. Haran, P., Shanmugam, R., Deenadayalan, P. Free radical scavenging, anti-inflammatory and antibacterial activity of Acorus calamus leaves extract against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Cureus. 16 (3), e55987(2024).
  23. Sytykiewicz, H., Łukasik, I., Goławska, S. Chemical composition, anti-tyrosinase and antioxidant potential of essential oils from Acorus calamus (L.) and Juniperus communis (L.). Molecules. 30 (11), 2417(2025).
  24. Liu, Y., et al. Proteomics and transcriptomics explore the effect of mixture of herbal extract on diabetic wound healing process. Phytomedicine. 116, 154892(2023).
  25. Zhou, L., Zhu, J., Liu, Y., Zhou, P. K., Gu, Y. Mechanisms of radiation-induced tissue damage and response. MedComm. 5 (10), e725(2020).
  26. Elgellaie, A., Thomas, S. J., Kaelle, J., Bartschi, J., Larkin, T. Pro-inflammatory cytokines IL-1α, IL-6 and TNF-α in major depressive disorder: Sex-specific associations with psychological symptoms. Eur J Neurosci. 57 (11), 1913-1928 (2023).
  27. García-García, M. L., et al. Fluoxetine modulates the pro-inflammatory process of IL-6, IL-1β and TNF-α levels in individuals with depression: A systematic review and meta-analysis. Psychiatry Res. 307, 114317(2022).
  28. Yan, T., et al. Single-cell RNA-seq analysis of molecular changes during radiation-induced skin injury: The involvement of Nur77. Theranostics. 14 (15), 5809-5825 (2024).
  29. Tu, W., et al. Integrative multi-omic analysis of radiation-induced skin injury reveals the alteration of fatty acid metabolism in early response of ionizing radiation. J Dermatol Sci. 108 (3), 178-186 (2022).
  30. Mukherjee, S., Dutta, A., Chakraborty, A. The cross-talk between Bax, Bcl2, caspases, and DNA damage in bystander HepG2 cells is regulated by γ-radiation dose and time of conditioned media transfer. Apoptosis. 27 (3-4), 184-205 (2022).
  31. Avadanei-Luca, S., et al. Tissue regeneration of radiation-induced skin damages using protein/polysaccharide-based bioengineered scaffolds and adipose-derived stem cells: A review. Int J Mol Sci. 26 (13), 6469(2025).
  32. Hartono, S. P., et al. Vascular endothelial growth factor as an immediate-early activator of ultraviolet-induced skin injury. Mayo Clin Proc. 97 (1), 154-164 (2022).
  33. Guangmei, D., Weishan, H., Wenya, L., Fasheng, W., Jibing, C. Evolution of radiation-induced dermatitis treatment. Clin Transl Oncol. 26 (9), 2142-2155 (2022).
  34. Gupta, S., et al. Exploring anticancer properties of medicinal plants against breast cancer by downregulating human epidermal growth factor receptor 2. J Agric Food Chem. 72 (17), 9717-9734 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ekstrakt z Acorus Calamusgojenie rantradycyjna medycyna chińskacytokiny zapalnehamowanie apoptozypromowanie angiogenezyanaliza histopatologicznaimmunohistochemia
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.