Analiza DNA mikroorganizmów w terenie z wykorzystaniem zestawu do ekstrakcji biologicznej oraz jednostki qPCR

Summary

Niezawodne i dokładne formy analizy DNA w terenie są kluczowe dla wielu branż. Niniejszy artykuł oferuje dwie metody analizy mikroorganizmów środowiskowych w terenie: 1) izolację DNA mikroorganizmów z próbek środowiskowych za pomocą zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej oraz 2) analizę DNA za pomocą jednostki qPCR w terenie.

Abstract

W miarę jak ilościowa PCR (qPCR) jest coraz powszechniej wdrażana w różnych branżach, zdolność do wydobycia i analizy DNA w zdalnych warunkach bez przeszkód logistycznych staje się niezbędna. Jednym z wyraźnych przykładów jest potrzeba prostych narzędzi do ilościowego określania bakterii degradujących zanieczyszczenia na odległych terenach dotkniętych wykolejeniami pociągów lub uwolnieniem ropy naftowej, co umożliwia szybką ocenę ryzyka i wpływu na środowisko. Aby to niezawodnie osiągnąć, procesy muszą być przenośne i lekkie, przyjazne dla osób niebędących naukowcami, odporne na zanieczyszczenia oraz zdolne do szybkiego osiągania rezultatów, jednocześnie zachowując rygorystyczną kontrolę jakości. Chociaż opcje zarówno ekstrakcji kwasów nukleinowych, jak i analizy qPCR istnieją poza laboratorium od lat, dopiero niedawno postęp technologiczny umożliwił opracowanie systemów możliwych do wdrożenia w terenie, zdolnych do niezawodnej i precyzyjnej wydajności. W tym badaniu demonstrujemy użycie zestawu do ekstrakcji DNA w terenie połączonym z przenośnymi instrumentami qPCR w realistycznych warunkach środowiskowych. Badania terenowe przeprowadzone w temperaturze zewnętrznej około 30 °C wykazały wydajność DNA i efektywność amplifikacji porównywalną z tymi uzyskanymi w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Co ważne, wyniki uzyskane w terenie wykazały równą czułość i powtarzalność, potwierdzając, że przenośne przepływy pracy mogą dostarczać wysokiej jakości dane bez potrzeby konwencjonalnej infrastruktury laboratoryjnej. Wyniki te podkreślają potencjał zdecentralizowanych analiz molekularnych, które rozszerzają zasięg qPCR na zdalne i ograniczone zasoby, jednocześnie zachowując dokładność i niezawodność niezbędną do podejmowania decyzji.

Introduction

Rozważając analizy molekularno-biologiczne, takie jak qPCR, istnieje kilka ograniczeń dotyczących zarządzania próbkami. Wyraźnym przykładem jest zapotrzebowanie na proste, wiarygodne narzędzia do ilościowego określania bakterii degradujących zanieczyszczenia na odległych terenach dotkniętych wykolejeniami pociągów lub uciekami ropy naftowej, wspierające terminową ocenę ryzyka środowiskowego i wpływu 1,2,3,4,5. Głównym ograniczeniem jest to, że bez względu na to, jak zimno trzymasz próbkę, społeczności mikroorganizmów mogą (i będą) zmieniać się w czasie ^6,7. Aby zapewnić dokładne odzwierciedlenie oryginalnego środowiska, z którego pobrano próbki, zaleca się wyodrębnienie DNA z tych próbek w ciągu 24 godzin^{i 8 godzin}. Dla inżyniera zbierającego próbki mikroorganizmów na platformie naftowej na morzu lub naukowca głęboko w wnętrzu lasu deszczowego, taki harmonogram nie jest wykonalny. Dostarczenie próbki wody lub gleby z jednego z tych odległych miejsc do firmy transportowej tego samego dnia, a następnie przewiezienie na noc do laboratorium (wszystko to przy zachowaniu chłodzenia), gdzie DNA można pobrać przed analizą, jest po prostu niemożliwe.

Po wyekstrahowaniu DNA zegar się zatrzymuje, a cała informacja genetyczna próbki jest przechowywana w nieskończoność przy odpowiednich technikach przechowywania⁹. To sprawia, że wyodrębnione DNA jest niezwykle unikalne w porównaniu z zdecydowaną większością próbek chemicznych, metalurgicznych i biologicznych – z których większość ma ograniczony okres przydatności. Archiwalne DNA można odzyskać po latach lub dekadach i przeanalizować pod kątem nowych celów na nowych platformach. Z tego powodu kluczowe jest, aby wyodrębnione DNA rzeczywiście reprezentowało oryginalną społeczność mikroorganizmów, a nie tę zmienioną z opóźnionego transportu.

Dodatkowo, wymóg posiadania laboratorium do pobierania i analizy próbek znacznie ogranicza elastyczność i spójność programów pobierania próbek. Koszty logistyczne same w sobie mogą być zbyt wysokie dla niektórych projektów¹⁰. Możliwość analizy próbek, precyzyjnego określania celów genetycznych w ciągu kilku godzin, a nawet minut od pobrania, otwiera wiele drzwi dla projektów środowiskowych na całym świecie.

Protocol

UWAGA: Następujący protokół został wykonany przy użyciu zestawu Bio-Extract (zestaw terenowy do ekstrakcji biologicznej) oraz qPCR FieldQuant (qPCR opartego na terenie).

1. Pobieranie próbek biomasy z wód gruntowych oraz protokół izolacji DNA z użyciem filtra zamkniętego i zestawu do eksploracji biologicznej

1. Na każdym etapie kroku 1 noś rękawiczki i okulary ochronne.
2. Przygotuj pompę perystaltyczną i rurkę oraz przepłukaj studnię za pomocą standardowego oczyszczenia objętościowego, zgodnie z wytycznymi Agencji Ochrony Środowiska (EPA) dotyczącymi pobierania próbek wód gruntowych¹¹.
3. Usuń kapsułkowany filtr, adapter, zacisk i kapsle z dostarczonej rurki wirówki (Rysunek 1).
4. Przeprowadź rurkę (średnica wewnętrzna 1/4-5/16 cala [I.D.]) przez dostarczony zacisk i dokręć ją, aby zabezpieczyć wąż do blokującego adaptera luer (Rysunek 2).
5. Podłącz wlot filtra do adaptera Luer-Lock zainstalowanego w poprzednim kroku.
6. Umieść filtr w pojemniku odbiorczym, aby można było dokładnie zmierzyć ilość filtrowanej wody.
7. Przefiltruj do 1 L wody przy niskich przepływach (<0,5 L/min). Ilość filtrowanej wody będzie się różnić w zależności od mętności wody.
   1. Jeśli filtr zatka, zanim zostanie przefiltrowany 1 litr, zatrzymaj się i przejdź do kolejnego kroku.
      UWAGA: Analiza DNA jest czuła i może być przeprowadzona już przy 10 mL, w zależności od biomasy układu.
8. Ręcznie zapisz objętość, która przeszła przez filtr w mililitrach (mL). Wyrzuć filtrowaną wodę.
9. Zakręć filtr na obu końcach. Upewnij się, że cieńszy koniec jest zamknięty czerwoną zakrętką, a grubszy białym korkiem Luer-Lock.
10. Włóż filtr z powrotem do plastikowej rurki.
11. Przyklej etykietę do rurki wirówki i zanotuj ilość wody, która przeszła przez filtr, lokalizację, datę pobrania próbek oraz wymagane analizy. Przechowuj w temperaturze 1-4 °C do momentu ekstrakcji.
    UWAGA: Filtry muszą być wyciągane w ciągu 24 godzin od pobrania próbek.
12. Używając dołączonych chusteczek do przygotowania alkoholu, wyczyść płaską powierzchnię, którą można wykorzystać do przeprowadzenia ekstrakcji (np. drewniana deska, klapa bagażnika itp.)
13. Aby wyodrębnić DNA, rozłóż wszystkie składniki zestawu do ekstrakcji biologicznej na płaskiej, czystej powierzchni (Rysunek 3).
    1. Odkręć oba końce filtra i odłóż kondensatory na później. Znajdź i otwórz jedną z 3 mL strzykawek dołączonych do zestawu. Wciągnij powietrze do strzykawki 3 mL i podłącz ją do filtra przez złącze blokujące luer.
    2. Wypchnij powietrze ze strzykawki, aby wypchnąć resztki wody z filtra. Odłącz strzykawkę i wciągnij więcej powietrza przed powtórzeniem.
    3. Powtórz kilka razy, upewniając się, że jak najwięcej wody zostanie wypchnięte z filtra. Zmień czerwony korek wylotu.
14. Odwróć zamkniętą strzykawkę Roztworu A kilka razy, aby dobrze wymieszać. Zdejmij nakrętkę strzykawki z blokadą luer.
15. Podłącz strzykawkę Roztworu A do zamkniętego wlotu filtra 0,2 μm przez końcówkę blokującą luer i powoli dodawaj cały Roztwór A, wciskając tłok. Zbyt szybkie naciskanie może powodować powstawanie ciśnienia wstecznego, więc pamiętaj, by opuszczać tłok powoli. Jeśli zatykanie filtra uniemożliwia dodanie Roztworu A, zdejmij czerwoną koreczkę wylotową filtra i spróbuj ponownie. Zmień filtr.
16. Energicznie potrząśnij zamkniętym filtrem przez 5 minut.
    UWAGA: Aby zapobiec zmęczeniu, do tego etapu można przygotować wiele próbek, a wszystkie można jednocześnie potrząsnąć ręcznie. Jeśli jest dostępny, do wykonania tego kroku można użyć akumulatorowego miksera wirowego, zamiast ręcznego potrząsania.
17. Odwróć zamkniętą strzykawkę Roztworu B kilka razy, aby upewnić się, że dobrze się wymiesza. Zdejmij nakrętkę blokującą luer ze strzykawki.
18. Zdejmij kapsułkowaną pokrywę wlotową filtra. Podłącz strzykawkę Roztworu B do wlotu filtra zamkniętego przez końcówkę blokującą luer i powoli dodawaj cały Roztwór B, naciskając tłok. Zbyt szybkie naciskanie może powodować powstawanie ciśnienia wstecznego, więc pamiętaj, by opuszczać tłok powoli. Zmień pokrywę wlotu filtra.
19. Energicznie potrząśnij zamkniętym filtrem przez 5 minut.
    UWAGA: Aby zapobiec zmęczeniu, można przygotować kilka próbek do tego etapu i wszystkie jednocześnie potrząsnąć ręcznie. Jeśli jest dostępny, do wykonania tego kroku można użyć akumulatorowego miksera wirowego, zamiast ręcznego potrząsania.
20. Zdejmij korek wlotowy.
21. Gdy filtr jest odwrócony, wpchnij 1 mL powietrza do filtra za pomocą strzykawki 3 mL podłączonej do kapsułkowanej jednostki filtracyjnej, a następnie pociągnij tłok, aby usunąć jak najwięcej lizatu (cieczy).
    UWAGA: Jeśli lizat jest szczególnie lepki, może być konieczne wielokrotne pchnięcie i ciągnięcie tłoka, aby usunąć roztwór z filtra.
22. Dodaj lizat do probówki z kulkami 5 mL. Zatkaj tubkę i zabezpiecz ją parafilmem na górze.
23. Energicznie potrząśnij tubką przez 5 minut. Ustaw rurkę pionowo, kontynuując kroki.
    UWAGA: Aby zapobiec zmęczeniu, do tego etapu można przygotować wiele próbek, a wszystkie można jednocześnie potrząsnąć ręcznie. Jeśli jest dostępny, do wykonania tego kroku można użyć akumulatorowego miksera wirowego, zamiast ręcznego potrząsania.
24. Aby uniknąć zanieczyszczenia foliowej górnej warstwy, umieść wkład do przygotowania próbki na płaskiej powierzchni.
25. Wyjmij strzykawkę o pojemności 1 mL z opakowania i przykręć kolumnę z blokadą luer-lock na końcu strzykawki. Użyj ostrego końca kolumny, aby zrobić dwa otwory w pierwszej części wkładu do przygotowania próbki.
    UWAGA: Niektóre fragmenty wkładu zawierają sole chaotropowe i/lub etanol. Noś rękawiczki i okulary ochronne.
26. Używając plastikowej pipety objętościowej, przelej 1 mL lizatu (tylko w cieczy, unikaj przenoszenia kulek z kulki tak bardzo, jak to możliwe) z rurki do nowo wybitego otworu w sekcji wkładu przygotowującego pierwszą próbkę. Dla najlepszych efektów powoli dodawaj lizat pod lekkim kątem podczas pipetowania do otworu w folii.
27. Włóż kolumnę strzykawki z powrotem do czerwonej części wkładu. Całkowicie wciągnij płyn do strzykawki, a następnie wypchnij go. Wykonaj ten ruch pompy 10 razy.
28. Wypchnij cały płyn ze strzykawki z powrotem do czerwonej części wkładu, zanim przejdziesz do kolejnego kroku. Nie należy przenosić płynu z jednej sekcji do drugiej – dotyczy to każdego pozostałego etapu protokołu izolacji DNA próbki.
29. Umieść ostry koniec kolumny strzykawki nad czerwono-pomarańczową sekcją i przebij dwa otwory przez folię. Użyj tłoka, żeby wyciągnąć pełną objętość strzykawki, płyn aż do góry strzykawki i wypompować z powrotem na zewnątrz. Powtórz ten krok raz, łącznie 2 pompy, wypychając cały płyn. Nie przelewaj żadnego płynu do kolejnego etapu.
30. Umieść ostry koniec kolumny strzykawki nad pomarańczową sekcją i przebij dwa otwory przez barierę foliową. Użyj tłoka, aby wciągnąć pełną objętość płynu strzykawki do strzykawki i wypompować ją całkowicie na zewnątrz. Nie przelewaj żadnego płynu do kolejnego etapu.
31. Umieść ostry koniec kolumny strzykawki nad żółtą częścią i dwukrotnie przebij barierę foliową. Użyj tłoka, aby wciągnąć pełną objętość płynu strzykawki do strzykawki i wypompować ją całkowicie na zewnątrz. Nie przelewaj żadnego płynu do kolejnego etapu.
32. Umieść ostry koniec kolumny strzykawki nad niebieską sekcją suszącą na powietrzu i przebij barierę foliową tylko raz. Użyj tłoka, aby wciągnąć pełną objętość powietrza strzykawki do strzykawki i szybko ją wypompować. Szybko powtórz tę pompę co najmniej 20 razy, aż kolumna będzie sucha.
33. Umieść ostry koniec kolumny strzykawki nad ostatnią zieloną częścią i dwukrotnie przebij barierę foliową. Użyj tłoka, aby wciągnąć pełną objętość płynu strzykawki do strzykawki i wypompować ją całkowicie na zewnątrz. Powtarzaj ten krok, łącznie 5 pomp.
34. Używając strzykawki o pojemności 1 mL i kolumny przygotowawczej, przelej cały roztwór z zielonej sekcji do dobrze oznakowanej mikrorurki o pojemności 1 mL – to jest próbka DNA pobrana w terenie. Przechowuj w temperaturze 1-10 °C (np. w chłodziarce z lodem/okładami z lodu, w lodówce itp.) przez tydzień lub do momentu użycia.
    UWAGA: Do długotrwałego przechowywania próbki DNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony.

2. Protokół analizy qPCR oparty na terenie z wykorzystaniem jednostki qPCR w polu

UWAGA: Instrument qPCR oparty na terenie oraz telefon sterujący instrumentem korzystają z akumulatorów do ładowania. Upewnij się, że oba są w pełni naładowane przed podróżą na pole.

1. Umieść do trzech próbek DNA z pola w czystych szczelinach na tacce. Upewnij się, że w każdej sekcji jest jedna próbka: jedna próbka w miejscach 1, 2 lub 3, jedna próbka w szczeblach 4, 5 lub 6 oraz jedna próbka w miejscach 7, 8 lub 9.
2. Umieść paski testowe dla każdej próbki w odpowiednich szczelinach A, B lub C na tacce. Wyrównaj pierwszy wgłębienie na pasku z pierwszym otworem na tacce.
3. Odblokowaj telefon i otwórz aplikację nazwaną na cześć zastrzeżonego instrumentu qPCR. Telefon i jednostka qPCR w terenie łączą się za pomocą zintegrowanego połączenia bezprzewodowego krótkiego zasięgu. Gdy aplikacja się otworzy, naciśnij przycisk Start Run .
   UWAGA: Aplikacja jest wstępnie zainstalowana na dołączonym telefonie i nie można jej pobrać gdzie indziej.
4. Na następnym ekranie kliknij przycisk Generuj ID .
5. Na tym kolejnym ekranie wprowadzane są informacje o próbce dla każdej próbki; kliknij pod Sample ID i wpisz nazwę próbki.
   1. Pobieraj jednostki pobierania próbek i wybierz odpowiednią jednostkę objętości dla typu próbki użytej podczas ekstrakcji (gramy [g], mililitry [mL] lub wymaz).
   2. Następnie podczypnij ilość próbki i wpisz objętość próbki użytej do powyższego wyodrębnienia (np. mililitry przefiltrowanej wody). Powtórz ten proces dla pozostałych dwóch próbek.
   3. Po zakończeniu wprowadzania informacji o próbce dla wszystkich próbek należy stuknąć przycisk kontynuuj .
      UWAGA: Jeśli używasz mniej niż 3 próbek, pozostawij identyfikator próbki jako domyślny, wybierz dowolną jednostkę i wpisz 1 w linii ilości próbki, aby ewentualne niewykorzystane próbki mogły przejść dalej.
6. Na następnym ekranie kliknij folder. Przejdź na następny ekran i kliknij zapisz do aktualnego folderu.
7. Na następnym ekranie wpisz nazwę serii i naciśnij potwierdź.
8. Włącz instrument, naciskając i przytrzymując przycisk zasilania , znajdujący się w lewym górnym rogu instrumentu, aż wszystkie światła z przodu instrumentu się zapalą (~5 s). Następnie kliknij potwierdź w aplikacji, aby kontynuować.
9. Na następnym ekranie kliknij połączenie przez zintegrowane połączenie krótko-dystansowe. Naciśnij zintegrowany przycisk bezprzewodowy krótkiego zasięgu (znany znak rozpoznawczy) na górze instrumentu, aż niebieskie światło zacznie migać. Kliknij potwierdź i poczekaj, aż aplikacja i instrument zsynchronizują się razem. Po synchronizacji kliknij nazwę instrumentu w aplikacji, aby ją wybrać, a następnie stuknij przycisk połączenia , aby przejść do ładowania pasków testowych.
   UWAGA: Jeśli instrument i aplikacja nie synchronizują się za pierwszym razem, upewnij się, że zintegrowana krótko-zasięgowa lampka bezprzewodowa na instrumencie nadal miga i ponownie skenuj stuknięciem.
10. Przed wyjęciem kapsuł z pasków testowych sprawdź, czy liofilizowane granulki nie znajdują się na górze żadnej z dołków do testowania. Jeśli tak, delikatnie strzepnij dno dołka, aby pellet spadł niżej do dołu.
11. Zdejmij kapsle z probówek go strip przy pierwszej próbce. Dodaj 18 μL wody sterylnej do pierwszego dołka paska testowego i delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby rozpuścić granulat. Powtórz dla pozostałych 2 studni.
12. Dodaj 2 μL próbki do każdego dołka i zamknij probówki, wkładając do nich zestaw gumowych kapsli do testów, z wcięciami między kapslami skierowanymi do tyłu tacki. Powtórz kroki 2.10-2.12 dla pozostałych próbek, jeśli to konieczne. Gdy wszystkie paski testowe zostaną napełnione i zapieczętowane kapslami, kliknij potwierdź w aplikacji.
13. Zdejmuj każdy pasek testowy pojedynczo i sprawdzaj, czy na dnie dołków nie ma bąbelków. Jeśli na dnie którejkolwiek z studni są bąbelki, delikatnie kołysz pasek tam i z powrotem, aż bąbelki przesuną się w górę studni. Po sprawdzeniu wszystkich otworów kliknij potwierdzenie w aplikacji i przejdź do ładowania pasków do instrumentu.
14. Otwórz pokrywę instrumentu i umieść paski testowe w przyrządzie qPCR w tej samej kolejności i ustawieniu, w jakiej znajdują się na tacce, tak aby zawiasy wgłębienia i nacięcia między kapslami były skierowane do tyłu instrumentu. Po dodaniu wszystkich pasków delikatnie naciśnij pokrywkę, aż się zablokuje, i stuknij do potwierdzenia.
15. Naciśnij przycisk start run w aplikacji.
    UWAGA: Bieg rozpocznie się i zajmie ~45 minut, stosując z ustaleniem warunków biegu. Te warunki nie są edytowalne.
16. Po zakończeniu biegu kliknij wynik wymail. Gdy telefon jest podłączony do Wi-Fi, wyniki zostaną przesłane do analizy i raportowania; do tego czasu wyniki są przechowywane na urządzeniu.
    1. Po połączeniu z Wi-Fi użytkownik musi ponownie nacisnąć przycisk wyślij, aby wysłać wyniki.
17. Czyść tacę między cyklami, aby uniknąć zanieczyszczenia między próbkami.
    UWAGA: Wyjściem jest plik Excel zawierający wartości progu cyklu (Ct) dla każdego dołka. Wyniki te są przesyłane do laboratorium, które sprawdza jakość amplifikacji i przekształca wartości Ct na obfitości za pomocą zweryfikowanych krzywych standardowych specyficznych dla każdego celu qPCR oraz opartych na objętości i macierzy oryginalnej próbki. Wyniki te są przesyłane użytkownikowi jako elektroniczny dokument oraz PDF.

Results

Ekstrakcja DNA z reprezentatywnych próbek środowiskowych została przeprowadzona zarówno przy użyciu zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej, jak i wysoko zweryfikowanej metody laboratoryjnej opisanej^{wcześniej 4}. Jak pokazano na Rysunku 4, pomyślne zakończenie izolacji DNA przy użyciu zestawu terenowego potwierdzono podczas porównywania wyników qPCR z wysoko zweryfikowaną metodą ekstrakcji laboratoryjnej. Ta spójność potwierdza, że metoda zachowała integralność DNA próbek środowiskowych w terenie.

Elementy zestawu qPCR w terenie przedstawiono na Rysunku 5. Analiza standardowego rozcieńczania hodowli Dehalococcoides (DHC) z użyciem jednostki qPCR w polu została przeprowadzona zarówno w temperaturach wewnętrznych (21 °C), jak i zewnętrznych (30 °C), aby zilustrować odporność instrumentu w rzeczywistych warunkach terenowych. Wyniki, widoczne na Rysunku 6, podkreślają niskie odchylenie dla 10 różnych powtórzeń każdego z nich. Dla pełnego kontekstu, DHC jest organizmem zdolnym do rozkładu chlorowanych rozpuszczalników i jest powszechnie ilościowo określany za pomocą qPCR w przemyśle remediacji środowiskowej⁴.

Aby potwierdzić precyzję instrumentów, DHC przeanalizowano w trzech różnych stężeniach przy użyciu dziesięciu polowych qPCR wykonanych w duplikatach (rysunek 7). Nawet przy niskich ilościach względne odchylenie standardowe pozostało niskie (poniżej 5%) we wszystkich przebiegach. Należy zauważyć, że w porównaniu do odchylenia standardowego, względne odchylenie standardowe jest ważne dla danych logarytmicznych, ponieważ normalizuje wyniki za pomocą następującego równania:

Gdy RSD to względne odchylenie standardowe, σ to odchylenie standardowe zbioru danych, a μ to średnia zbioru danych.

Obie metody w tym artykule razem dostarczają powtarzalnych wyników poprzez replikowane ekstrakcje terenowe oraz testy qPCR. Zgoda między ekstrakcji terenowymi i laboratoryjnymi oraz analizą qPCR pokazuje, że można uzyskać wiarygodne, wysokiej jakości dane bez uzależnienia od infrastruktury laboratoryjnej, co umożliwia przeprowadzanie analiz mikroorganizmów w środowiskach zdalnych lub o ograniczonych zasobach.

Rysunek 1: Elementy zestawu filtrów w kapsuli. Filtr zamknięty służy do filtrowania biomasy z próbki wody. Podłączając do pompy perystaltycznej przez rurki, woda jest przepychana przez filtr. Po zanotowaniu całkowitej objętości wody, woda jest odrzucana, a biomasa zebrana na filtrze jest gotowa do ekstrakcji DNA. Komponenty: a. rurka sterylna trzymająca filtr i komponenty przed i po użyciu, b. nakron wlotowy, c. zacisk węża, d. adapter złącza rury z blokadą luer, e. filtr zamknięty, f. gumowa nakrętka wylotu. Obraz użyty za zgodą Microbial Insights, ^Inc.12. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Połączenie filtra i rury. Rurka jest przesuwana nad adapterem złącza rury blokującej luer i utrzymywana za pomocą zacisku węża. Drugi koniec rury jest podłączony do pompy perystaltycznej (to połączenie i działanie pompy wykraczają poza zakres tego protokołu). Obraz użyty za zgodą Microbial Insights, ^Inc.12. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Komponenty zestawu do izolacji DNA. Wszystkie komponenty są sterylne przed użyciem. Elementy obejmują: (1) zestaw filtrujący z kapsułką (patrz Rysunek 1 dla szczegółów), (2) strzykawkę o pojemności 3 mL, (3) 1 mL strzykawkę z roztworem A, zakapszoną, (4) 1 mL strzykawkę z roztworem B, zakrytą, (5) strzykawkę o objętości 3 mL, (6) rurkę z silikonowymi kulkami, (7) strzykawkę o pojemności 1 mL z kolumną izolacyjną, (8) jednorazową pipetę transferową o pojemności 1 mL, (9) Wkład do przygotowania próbek DNA, (10) rurka mikrowirówka o pojemności 1,5 mL. Nie pokazano: kwadraty parafilmowe do uszczelniania podczas wstrząsania oraz chusteczki do przygotowania alkoholu używane do czyszczenia powierzchni używanej do ekstrakcji. Obraz użyty za zgodą Microbial Insights, ^Inc.12. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Porównanie ekstrakcji polowej z użyciem próbek z rzeczywistego świata. Porównawcze wyniki qPCR DNA wyizolowanego z dwóch reprezentatywnych próbek metodą laboratoryjną (czerwone pręgi) w porównaniu do zestawu terenowego do ekstrakcji biologicznej (niebieskie pręgi). Nie zostały one przeanalizowane w trybie replikacyjnym, jak można by się spodziewać w standardowej analizie qPCR. Cele genowe (oś x) wykazują obfitość (oś y) w obrębie rzędu wielkości dla obu metod. Informacje o konkretnym celu genu nie są uwzględnione, ponieważ wykraczają poza zakres niniejszego artykułu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Instrument qPCR i komponenty oparte na terenie. Elementy obejmują: A. Instrument qPCR w terenie, B. tacka przygotowująca próbkę, pasek testowy C. zawierający liofilizowane odczynniki, D. telefon z aplikacją używaną do uruchamiania instrumentu. Obraz użyty za zgodą Microbial Insights, ^Inc.12. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 6: Demonstracja odporności qPCR w terenie. Standard Dehalokokoidów (DHC) analizowany w dziesięciu replikach w warunkach temperatur zewnętrznych (30 °C, czerwone paski) i wewnątrz (21 °C, niebieskie paski), co podkreśla niezawodność instrumentu w terenie. Liczba powtórzeń jest podawana wzdłuż osi x, a obliczona ilość DHC wzdłuż osi y. Średnia wewnątrz (20 °C) została obliczona na 4,92 × 10² komórki/mL, SD = 1,14 × 10² komórek/mL (n = 10), a średnia zewnętrzna (30 °C) wynosiła 5,89 × 10² komórek/mL, SD = 1,80 × 10² komórki/mL (n = 10). Pomiary uzyskane w temperaturach 20 °C i 30 °C nie różniły się istotnie (test t Welcha, p = 0,17). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 7: Demonstracja precyzji qPCR w polu polowym. Precyzyjne działanie na 10 różnych instrumentach, działających w duplikatach przy trzech różnych standardowych stężeniach. Wartość rzeczywista i liczba replikowana (n = 2 dla 10 instrumentów przy każdym stężeniu standardowym) są podane wzdłuż osi x, z kolorowymi paskami specyficznymi dla jednostki pola. Oś y pokazuje obliczoną obfitość dla każdego przebiegu. Procentowe względne odchylenie standardowe dla każdego stężenia standardowego jest pokazane w przerywanych liniach nad paskami. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Discussion

Kluczową cechą tego protokołu jest umożliwienie ekstrakcji DNA mikroorganizmów oraz analizy qPCR w warunkach terenowych bez potrzeby infrastruktury laboratoryjnej lub zasilania^{elektrycznego 12}. Metoda została zoptymalizowana tak, aby zrównoważyć przenośność z niezawodnością, zapewniając powtarzalne wyniki zgodne z pracą laboratoryjną nawet podczas wykonywania na zewnątrz w^{zakresie temperatur} otoczenia. Sugerowany zakres użycia to 4 °C do 95 °C (39 °F do 104 °F), a porównania obok siebie przy standardowych temperaturach zewnętrznych (30 °C, 86 °F) dla ekipy terenowej pokazują wiarygodną spójność (Rysunek 6). Ta spójność jest niezbędna, aby wyniki terenowe były interpretowalne w porównaniu z zbiorami danych laboratoryjnych.

Kilka kroków jest kluczowych dla sukcesu protokołu. Podczas procesu ekstrakcji ważne jest całkowite usunięcie cieczy z filtrów oraz dokładne wymieszanie odczynników, aby zapewnić skuteczną lizę i odzyskanie DNA. Podobnie ostrożne przelanie lizatu do wkładu do przygotowania próbki przy jednoczesnym minimalizowaniu przenoszenia się koralików jest kluczowe, aby zapobiec zatkaniu lub awarii kolumny. Strategie rozwiązywania problemów obejmują spowolnienie obniżenia tłoczki w celu zmniejszenia ciśnienia zwrotnego oraz powtarzające pompowanie strzykawką, jeśli lepkie lizaty utrudniają przepływ płynu. W przypadku qPCR unikanie pęcherzyków w dołkach do testów oraz zapewnienie pełnej resuspension pelletów są kluczowe dla dokładnego amplifikowania.

Pomimo zalet, metoda ta ma swoje ograniczenia. Wydajność DNA może być niższa niż w zestawach opartych na wirówce stołowej, a próbki o wysokiej ilościach mętnych lub bogatych w organizmy organiczne mogą stanowić wyzwanie dla wydajności kolumny. Chociaż zestawy izolacyjne są proste i łatwe w użyciu dla każdego – także dla osób bez wcześniejszego doświadczenia laboratoryjnego – istnieje dodatkowe ryzyko błędu przy porównywaniu osoby niedoświadczonej w terenie. Dodatkowo, choć jednostka qPCR w polu zapewnia szybkie wyniki, jest ograniczona do ograniczonej liczby jednoczesnych reakcji (obecnie do 9 celów genowych na serię) w porównaniu ze standardowymi termocyklerami. Ograniczenia te są jednak niwelowane przez szybkość analizy oraz możliwość wychwycenia profili społeczności mikroorganizmów w terenie. Nie ma żadnych ograniczeń co do tego, jakie cele qPCR mogą być analizowane poza katalogiem laboratorium oferującego tę jednostkę.

Znaczenie tej metody polega na jej zdolności do mobilizowania analiz molekularnych, umożliwiających monitorowanie populacji mikroorganizmów w czasie rzeczywistym w środowiskach takich jak pola naftowe, tereny rolnicze czy odległe ekosystemy. Dzięki zachowaniu integralności DNA w momencie pobierania próbek i generowania wyników na miejscu, to podejście zmniejsza bariery logistyczne, poprawia jakość danych i umożliwia szybkie podejmowanie decyzji. Przyszłe zastosowania mogą obejmować nadzór nad patogenami w zdrowiu publicznym, monitorowanie postępów w bioremediacji lub ocenę ryzyka mikroorganizmów w systemach wodnych. Po drobnych modyfikacjach platforma może być stale adaptowana do kolejnych celów molekularnych oraz nowych testów qPCR.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rurka silikonowa 5/16"	Amazon (www.amazon.com)	796753613221	Alternatywne modele mogą być akceptowalne
Chłodzenia	Zszywki (www.staples.com)	24299978	Alternatywne modele mogą być akceptowalne
Zestaw Do Izolacji DNA	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/bio-extract/	Własność
Jednostka qPCR w polu z akcesoriami	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/fieldquant/	Własność
Rękawice	Amazon (www.amazon.com)	To zależy od rozmiaru	Alternatywne modele mogą być akceptowalne
Filtry wód gruntowych	Microbial Insights, Inc.	https://microbe.com/wp-content/uploads/2025/08/MI-Sampling-US-01.02-bio-flo_dna_mi.pdf
Lód	Lokalny sklep spożywczy	NA
Kamoer DIP1500 pompa perystaltyczna 24 V 1500 mL/min hig	Amazon (www.amazon.com)	701705886813	Alternatywne modele mogą być akceptowalne
Szczypce igłowe	Amazon (www.amazon.com)	762983170575	Alternatywne modele mogą być akceptowalne
Ręczniki papierowe	Zszywki (www.staples.com)	2126874	Alternatywne modele mogą być akceptowalne
Okulary ochronne	Amazon (www.amazon.com)	B0BNHKWR6W	Alternatywne modele mogą być akceptowalne
Sharpie Fine Tip Marker	Amazon (www.amazon.com)	71641300033	Alternatywne modele mogą być akceptowalne