Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Izolacja i oczyszczanie zewnętrznych pęcherzyków roślinnych z liści Arabidopsis przy użyciu zoptymalizowanej metody zbierania apoplastów

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69715

⸱

24 marca 2026

 ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology and Microbiology, Texas A&M University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z liści Arabidopsis thaliana , wspierającą dalsze analizy molekularne i funkcjonalne.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to nanocząstki związane z błoną, wydzielane przez różne organizmy i typy komórek, i są coraz częściej uznawane za ważne mediatory komunikacji międzykomórkowej i międzykomórkowej. Chociaż biologia EV jest dobrze ugruntowana w systemach ssaków, badania nad EV roślin są stosunkowo nowe i szybko się rozwijają, częściowo napędzane dowodami, że EV roślinne mogą dostarczać małe RNA, mRNA, białka i inne ładunki zaangażowane w odporność i interakcje roślin-mikroby. Jednak izolacja wysokoczystości elektrownych roślin pozostaje technicznie trudna ze względu na sztywne ściany komórkowe, obfitość metabolitów wtórnych oraz ryzyko skażenia cytosolowego podczas zbierania płynu apoplastycznego. Protokół ten określa uprościony sposób izolacji i oczyszczania EV roślin z tkanki liściowej Arabidopsis thaliana . Stosuje się delikatny krok infiltracji za pomocą strzykawki, aby zminimalizować uszkodzenia komórek i wyciek cytosolowych, a użycie pojedynczych liści liści (bez ogonków ogonkowych/tkanki naczyniowej) pomaga zmniejszyć zanieczyszczenie zawartością naczyniową i wewnątrzkomórkową. EV początkowo wzbogacane są przez różnicową wirówkę i mogą być dalej oczyszczane za pomocą frakcjonowania gradientu gęstości sacharozy lub chromatografii wykluczenia rozmiaru (SEC). Protokół ten zapewnia EV z zachowaną integralnością strukturalną i zmniejszoną skażeniem komórkową poprzez minimalizację ubrażeń komórek i wycieku cytoplazmatycznego podczas pobierania płynu apoplastycznego, co oceniano za pomocą analizy śledzenia nanocząsteczek i transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Te próbki EV nadają się do zastosowań w dalszych etapach, w tym do profilowania RNA, proteomiki oraz testów funkcjonalnych do badań interakcji roślin-mikroorganizm. Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda zapewnia powtarzalne i elastyczne podejście do pozyskiwania wysokiej jakości elektrowni elektrownicznych.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to cząstki błony wiązane z dwuwarstwą lipidową, wydzielane przez szerokie spektrum organizmów, od bakterii po ludzi 1,2. W systemach zwierzęcych EV są powszechnie klasyfikowane na egzosomy, mikropęcherzyki i ciała apoptotyczne na podstawie szlaków biogenezy i rozmiaru3. Egzosomy (~30-150 nm średnicy) powstają w wyniku fuzji ciał wielopęcherzykowych (MVB) z błoną plazmatyczną, co prowadzi do uwolnienia pęcherzyków śródświatłowych4, podczas gdy mikropęcherzyki (~100-1000 nm średnicy) wypadają bezpośrednio z błony plazmatycznej5. Oprócz egzosomów i mikropęcherzyków, komórki ssaków produkują także ciała apoptotyczne, które są uwalniane podczas zaprogramowanej śmierci komórki6. Pęcherzyki te zostały powiązane z modulacją immunologiczną, postępem guza oraz dostarczaniem terapii, co uczyniło je przedmiotem intensywnych badań biomedycznych 7,8. W zakładach klasyfikacja EV jest mniej precyzyjna niż w przypadku zwierząt. Badania na Arabidopsis thaliana zidentyfikowały wiele podtypów EV roślin na podstawie różnic w markerach białkowych, rozmiarze oraz domniemanych szlakach biogenezy. Należą do nich EV pozytywne z tetraspaniną (TET), uznawane za pęcherzyki podobne do egzosomów pochodzące z ciał wielopęcherzowych 9,10, białko syntaksynowe z Penetracją 1 (PEN1) – EV11, EV pochodzące z organelli z dodatnimi egzocystami (EXPO)12,13, a także inne populacje EV, takie jak EV14 związane z autofagią i pyłki15.

Coraz więcej dowodów sugeruje, że rośliny wydzielają pojazdy elektryczne jako część strategii obrony przed patogenami. EV roślinne dostarczają różnorodne ładunki molekularne, w tym małe RNA, mRNA i inne cząsteczki regulacyjne, które tłumią zjadliwość patogenów grzybowych i oomycetowych 10,16,17,18,19. Te wyniki podkreślają EV jako nośniki "wojny RNA", umożliwiając roślinom bezpośrednie hamowanie ekspresji genów patogenów, mechanizm o głębokim znaczeniu dla ochrony upraw20. Poza odpornością, EV roślin mogą również przyczyniać się do przebudowy ściany komórkowej, reakcji stresowych oraz sygnalizacji rozwojowej21. W przeciwieństwie do badań nad EV na zwierzętach, gdzie standardowe protokoły izolacji i charakteryzacji są powszechnieugruntowane, dziedzina elektrowni elektrycznych jest wciąż na wczesnym etapie. Ogranicza to powtarzalność i porównywalność między badaniami, tworząc pilną potrzebę solidnych, standaryzowanych metod izolowania i badania tych pęcherzyków.

Izolowanie elektropojazdów elektrowniowych stawia przed sobą unikalne wyzwania techniczne, których nie spotyka się w systemach zwierzęcych. Uszkodzone tkanki roślinne zawierają obfite metabolity wtórne, szczątki ściany komórkowej oraz fragmenty organellarne, które mogą współoczyszczać z EV, co komplikuje dalszą charakterystykę23. Ponadto płyn do mycia apoplastycznego (AWF), powszechnie stosowany jako materiał wyjściowy do izolacji i oczyszczania elektroaktywów elektrycznych w roślinach, często daje niejednorodną mieszaninę pęcherzyków i zanieczyszczeń24. Chociaż różnicowa wirowanie pozostaje szeroko stosowanym podstawowym rozwiązaniem, nie jest w stanie w pełni rozdzielić odrębnych subpopulacji EV ani oddzielić EV od współizolowanych kompleksów makrocząsteczkowych25,26. Najnowsze przeglądy i badania metodologiczne dostarczyły ważnych wskazówek i najlepszych praktyk dotyczących izolacji i charakterystyki elektrownielektrowni 27,28,29,30,31. Niemniej jednak praktyczne wdrożenie i integracja tych podejść pozostają wyzwaniem, a dodatkowe kroki oczyszczania, takie jak wirowanie gradientowe gęstości czy chromatografia wykluczenia wielkościowego, często są wymagane, aby poprawić czystość i powtarzalność EV w różnych badaniach.

Przedstawiamy tutaj uprościony protokół izolacji pojazdów elektrycznych od płynu do mycia apoplastycznego Arabidopsis, stosując wieloetapową strategię oczyszczania. W przeciwieństwie do powszechnie stosowanych metod izolacji EV w roślinach, które polegają na infiltracji całej rośliny za pomocą pomppróżniowych 11, protokół ten unika inkluzji ogonków i tkanek naczyniowych, które mogą zwiększać zanieczyszczenie przez struktury naczyniowe. Zamiast tego stosuje się izolowane ostrza liści oraz delikatną metodę infiltracji strzykawkowej, aby poprawić zbieranie apoplastów przy jednoczesnym minimalizowaniu zakłóceń tkanek. Staranne traktowanie liści, orientacja i warunki wirowania dodatkowo zmniejszają zanieczyszczenie przez elementy wewnątrzkomórkowe, zapewniając czystszy materiał wyjściowy do izolacji EV. Po różnicowej wirowaniu EV można dodatkowo oczyszczać za pomocą frakcjonacji gradientowej gęstości sacharozy lub chromatografii wykluczającej wielkości, aby uzyskać wyższą czystość i rozdzielczość pęcherzyków. Powstałe przygotowania EV są doskonale przystosowane do dalszych zastosowań, w tym sekwencjonowania RNA, profilowania proteomicznego oraz testów funkcjonalnych, takich jak interakcje patogenów i badania pobierania EV, co zwiększa powtarzalność i interpretowalność w badaniach nad elektromobilami w elektrowniach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Przeprowadzaj kroki wirowania w chłodzonym wirówce w temperaturze 4 °C, aby zachować integralność EV. Powinny być używane rurki sterylne. Wszystkie kroki obsługi próbek powinny być wykonywane szybko i efektywnie, najlepiej przez kilka osób pracujących równolegle, aby zminimalizować uszkodzenia tkanek i zapobiec zanieczyszczeniu, które może pogorszyć jakość pojazdów elektrycznych.

1. Przygotowanie i infiltracja liści

  1. Przygotuj 1 L buforu izolacyjnego pęcherzyka (VIB) składającego się z 20 mM hydratu MES, 2 mM CaCl2, 0,1 M NaCl, pH 6.
  2. Usuń dalsze strefy ostrza liści, wycinając u podstawy ostrza, aby usunąć ogonek.
    UWAGA: Zaleca się co najmniej 100 roślin w wieku czterech tygodni na jedno zabieg lub genotyp, aby zapewnić odpowiednią wydajność EV. Rośliny Arabidopsis uprawiano w cyklach 8-godzinnych światła/16 godzin ciemności. Nie używaj liści, które wykazują widoczne oznaki stresu, takie jak wybielanie czy więdnięcie liści.
  3. Trzy razy myj liście wodą odwróconej osmozy (RO). Połóż je na ręcznikach papierowych i delikatnie osusz.
  4. Załaduj około 50 mL liści do strzykawki o pojemności 120 mL. Delikatnie stuknij strzykawką, aby ułożyć liście.
  5. Dodaj około 60 mL VIB do strzykawki, aż liście będą całkowicie zanurzone. Wydmuchuj uwięzione powietrze, delikatnie naciskając tłok. Naciśnij kawałek parafilmu złożony czterokrotnie na końcu strzykawki, aby zapobiec wyciekowi.
    UWAGA: Podczas infiltracji próżniowej za pomocą strzykawki upewnij się, że strzykawka i tłok są dobrze złożone przed zastosowaniem próżni. Stopniowo stosuj siłę i utrzymuj mocny uchwyt na strzykawce, aby zapobiec nagłemu ruchowi tłoka lub utracie kontroli.
  6. Infiltruj liście, powoli wyciągając tłok na zewnątrz, tworząc próżnię. Trzymaj tłok w wyprostowanej pozycji przez 5 sekund, a potem powoli go puszczaj. Powtarzaj ten cykl infiltracji 2-3 razy, aż liście staną się ciemniejsze i przezroczyste, co wskazuje na sukces infiltracji.
  7. UWAGA: Szarpnięcie tłoka wymaga umiarkowanej siły ze względu na odporność na podciśnienie. Strzykawkę należy mocno trzymać, podczas gdy tłok jest powoli wyjmowany, aby utrzymać kontrolowaną infiltrację.
  8. Gdy liście zostaną już przeniknięte, wyciągnij tłok. Wylej nadmiar bufora do zlewu.
  9. Powtarzaj kroki 1.4-1.7, aż wszystkie zebrane liście zostaną przeniknięte (Rysunek 1A).

2. Zbieranie płynu do mycia apoplastycznego (AWF)

  1. Wytnij ~12-calowy pasek taśmy klejącej i przyłóż go do góry. Przymocuj jeden koniec taśmy, owiniając go wokół pustej, niepotrzebnej strzykawki 1 mL tuż pod szerszym końcem. Ostrożnie ułóż około 50-70 infiltrowanych liści w nakładających się warstwach wzdłuż lepkiej powierzchni, ustawiając je tak, aby podstawa każdego ostrza była skierowana do dolnej strzykawki, a końcówki skierowane do góry do zbierania (Rysunek 1B).
    UWAGA: Nakładanie kilku liści na jeden pasek taśmy pomaga zapobiec uszkodzeniom. Wszystkie liście ustaw tak, aby ostrze było skierowane na jeden koniec i skierowane ku dnie probówki, aby umożliwić efektywne odzyskiwanie płynu apoplastycznego podczas wirowania.
  2. Owiń dobrze taśmą liście wokół strzykawki, a wierzch wiązki przymocuj dwoma paskami taśmy klejącej. Włóż owiniętą strzykawkę do probówki o pojemności 50 mL, z odciętymi końcami liści i podstawą strzykawki skierowaną ku dnu. Upewnij się, że liście są mocno zaklejone taśmą, ponieważ luźne owijanie może uszkodzić liście i uwolnić połamane komórki, które zanieczyszczają płyn do mycia apoplastów (rysunek 1B).
  3. Wiruj owiniętą strzykawkę zawierającą przeniknięte liście w 900 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, używając wirówki chłodniczej wyposażonej w wirnik o stałym kącie. Zbieraj płyn do mycia apoplasticznego w nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml i trzymaj próbkę na lodzie. Powtarzaj kroki 2.1-2.3, aż wszystkie liście zostaną wykorzystane do zebrania AWF.
    UWAGA: AWF musi być przezroczysty, nie zielony ani nawet jasnozielony. Zielony AWF wskazuje na obecność chloroplastów/chlorofilu i może również wskazywać na skażenie komórek. Aby zminimalizować uszkodzenia liści, użyj wirnika o stałym kącie.

3. Izolacja Arabidopsis EV od AWF za pomocą wirowania różnicowego

  1. Wirować zebrany płyn do mycia apoplastycznego o mocy 2000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C, używając chłodniczej wirówki wyposażonej w wirnik z łyżką obrotową, ze standardowymi ustawieniami przyspieszenia i hamowania. Po wirowaniu użyj filtra nylonowego o średnicy 0,45 μm, aby usunąć duże zanieczyszczenia komórkowe z supernatantu. Wyrzuć granulkę. Przelej przefiltrowany supernatant do nowych rurek wirówek (Rysunek 2).
  2. Wiruj filtrowany supernatant w 10 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, używając chłodniczej wirówki wyposażonej w wirnik o stałym kącie, ze standardowymi ustawieniami przyspieszania i hamowania. Usuń granulkę i zachowaj supernatant do ultrawirowania. Ten krok dalej usuwa duże zanieczyszczenia komórkowe i duże pęcherzyki (Rysunek 2).
  3. Przelej supernatant do rurek ultrawirówki o pojemności 17 mL i podaj ultrawirówkę przy 100 000 × g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C, używając ultrawirówki wyposażonej w wirnik typu swing-bucket, ze standardowymi ustawieniami przyspieszenia i hamowania. Po wirowaniu odrzuć supernatant i ponownie zawiesić granulat w około 16 mL buforu VIB do mycia. Powtórz cykl ultrawirowania, aby zebrać EV (Rysunek 2).
    UWAGA: Wirowanie w 100 000 x g wykonuje się w celu sedymentacji małych pęcherzyków, takich jak egzosomy. Kolejne etapy mycia pomagają wyeliminować białka niebędące EV, ponownie zawieszając pellet w buforze. Rurki ultrawirówki muszą być starannie wyważone masowo zgodnie ze specyfikacją producenta przed wirowaniem. Przed użyciem sprawdź rury i wirniki pod kątem wad oraz upewnij się, że wirnik jest odpowiednio zabezpieczony przed rozpoczęciem pracy.
  4. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulkę w trybie VIB. Użyj końcówki pipety, aby delikatnie zeskrobać dno rurki, aby umożliwić całkowite odzyskanie pelletu EV (Rysunek 2).
    UWAGA: Śrut EV jest często przezroczysty i może nie być widoczny wzrokowo po ponownym zawieszeniu. Delikatne skrobanie dna rurki ułatwia proces ponownej zawieszenia EV. Dostosuj objętość zawiesiny, aby osiągnąć pożądane stężenie EV, ponieważ mniejsze ilości zawiesin zazwyczaj prowadzą do bardziej skoncentrowanych preparatów EV. Zazwyczaj ponowne zawieszenie EV w 50 μL daje stężenia białek około 1-1,5 μg/μL oraz stężenia cząstek zbliżające się do 10 9-10 10 cząstek/mL.
  5. Przechowuj ponownie zawieszone EV w temperaturze 4 °C do natychmiastowego użycia lub w -80 °C do długotrwałego przechowywania bez nagłego zamarzania w ciekłym azocie.
    UWAGA: Długoterminowe przechowywanie może obniżyć integralność pojazdów elektrycznych. Używaj świeżo przygotowanych pojazdów elektrycznych, kiedy tylko to możliwe.

4. Zastosowanie frakcjonowania gradientu gęstości sacharozy do oczyszczania EV

UWAGA: Sama ultrawirówka współosadza wiele typów pęcherzyków. Aby uzyskać dokładniejszą rozdzielczość, można zastosować frakcjonowanie gradientów gęstości, rozdzielając pęcherzyki według ich gęstości wyporności i właściwości flotacyjnych. W tym podejściu gradienty sacharozy są wykorzystywane do wzbogacania zdefiniowanych subpopulacji EV. Alternatywnie można stosować gradienty jodoksanlowe.

  1. Rozdzielanie gradientu sacharozy z obciążeniem górnym w EV
    1. Przygotuj zapasy gradientu sacharozy o stężeniach 10-90% obejmujące następujące stężenia: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%. 52%, 58%, 64%, 70% i 90% korzysta z VIB. Użyj kąpieli wodnej o temperaturze 60 °C, aby pomóc rozpuścić zapasy 70% i 90%.
    2. Przygotuj nieciągły gradient, nakładając 1 mL każdego roztworu sacharozy w rurce ultrawirówki o pojemności 17 mL, zaczynając od najbardziej skoncentrowanego roztworu na dnie i przechodząc kolejno do najmniej skoncentrowanego. Wyłącz warstwę 10% sacharozy przy składaniu gradientu.
      UWAGA: Ostrożnie rozprowadzaj każdą warstwę gęstości wzdłuż wewnętrznej ściany rurki, aby zminimalizować mieszanie między sąsiednimi warstwami. Zaleca się automatyczne ustawienie pipety na wolną prędkość dozowania, aby zapewnić ciągły, kontrolowany przepływ i poprawić stabilność nachylenia. Jeśli używa się zwykłej ręcznej pipety, dozowanie powinno odbywać się powoli i równomiernie, z końcówką pipety umieszczoną tuż nad granicą poprzedniej warstwy, z zachowaniem ostrożności, aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza.
    3. Wymieszaj ponownie zawiesowany pellet EV (~100 μg białka EV) z 1 ml roztworu 10% sacharozy. Następnie warstwę tę mieszankę ułóż jako ostatnią warstwę warstwy nieciągłej. Całkowity wolumen wyniesie ~12,1 mL.
    4. Wirówka w 100 000 g przez 16 godzin w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: W przypadku dłuższych prób ultrawirowania potwierdzić, że rurki, kondensatory i wirniki są przystosowane do długotrwałej pracy z dużą prędkością oraz że stosuje się zalecane przez producenta procedury wyważania.
    5. Pobierz sześć frakcji po 2 mL na próbkę przez pipetowanie od góry. Przelej każdą frakcję do nowej rurki ultrawirówki o pojemności 17 mL.
    6. Ponownie zawiesz zebrane frakcje w buforze VIB o pojemności ~16 mL i zachwyć w wirówce 100 000 g przez godzinę w 4 °C.
    7. Usuń supernatant, a następnie ponownie zawiesz każdy granulat w 50 μL VIB.
      UWAGA: Pellet EV nie jest widoczny. Delikatnie zeskrobaj dno rurki końcówką pipety, aby ponownie zawiesić rurkę. Dostosowuj objętość buforu w razie potrzeby (np. 10 μL dla wyższego stężenia).
  2. Separacja gradientu sacharozy z obciążeniem dna w EV
    1. Przygotuj zapasy gradientowe 10-90% sacharozy, obejmujące następujące stężenia: 10%, 16%, 22%, 28%, 34%, 40%, 46%, 52%, 58%, 64%, 70% oraz 90% z wykorzystaniem bufora VIB. Użyj kąpieli wodnej o temperaturze 60 °C, aby pomóc rozpuścić zapasy 70% i 90%.
    2. Wymieszaj ponownie zawiesowany pellet EV (~100 μg białka EV) z 1 mL roztworu sacharozy 90%. Następnie ułóż tę mieszankę jako pierwszą warstwę warstwy nieciągłej.
    3. Przygotowanie pozostałego nieciągłego gradientu sacharozy, nakładając kolejno 1 ml każdego roztworu sacharozy na mieszankę sacharozy EV-90%, zaczynając od 70% sacharozy i stopniowo zmniejszając stężenia (64%, 58%, 52%, 46%, 40%, 34%, 28%, 22%, 16% i 10%). Ostrożnie rozprowadzaj każdą warstwę wzdłuż ścianki rurki za pomocą pipety, aby zminimalizować mieszanie się między sąsiednimi warstwami. Całkowity wolumen wyniesie ~12,1 mL.
    4. Wirówka w 100 000 g przez 72 godziny w 4 °C.
      UWAGA: W przypadku dłuższych prób ultrawirowania potwierdzić, że rurki, kondensatory i wirniki są przystosowane do długotrwałej pracy z dużą prędkością oraz że stosuje się zalecane przez producenta procedury wyważania.
    5. Pobierz sześć frakcji po 2 mL na próbkę przez pipetowanie od góry. Przelej każdą frakcję do nowej rurki ultrawirówki o pojemności 17 mL.
    6. Ponownie zawiesz zebrane frakcje w buforze o pojemności ~16 mL VIB i wiruj w 100 000 g przez godzinę w 4 °C.
    7. Usuń supernatant, a następnie ponownie zawiesij każdy granulek w 50 μL buforu VIB.
      UWAGA: Pellet EV nie jest widoczny. Delikatnie zeskrobaj dno rurki końcówką pipety, aby ponownie zawiesić rurkę. Dostosowuj objętość buforu w razie potrzeby (np. 10 μL dla wyższego stężenia).

5. Zastosowanie chromatografii wykluczenia rozmiaru (kolumna 35 nm) do oczyszczania EV

  1. Przygotowanie buforu i wyrównanie kolumny
    1. Przygotuj VIB i wszystkie dodatkowe bufory świeże. Wszystkie bufory przefiltruj przez membranę o średnicy 0,22 μm i odgazuj w kąpieli ultradźwiękowej przed użyciem, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza i zatkaniu porów.
      UWAGA: Niepełne odgazowywanie lub stosowanie niefiltrowanych buforów może wprowadzać pęcherzyki powietrza lub cząstki do warstwy żywicy, prowadząc do zakłóceń przepływu i obniżenia efektywności separacji EV. Jeśli w kolumnie zaobserwuje się bąbelki, bieg powinien zostać przerwany, a kolumna ponownie wyrównana.
    2. Pozwól kolumnie i buforom wyrównać temperaturę pokojową (18-24 °C) przed zdjęciem pokrywek kolumny.
      UWAGA: Kolumna i bufory powinny być w pełni wyważone do temperatury pokojowej przed zdjęciem korekcji. Zastosowanie bufora temperatury pokojowej do zimnej kolumny może powodować powstawanie pęcherzyków wewnątrz żywicy, co skutkuje zniekształceniami profili elucii i zmniejszoną powtarzalnością.
    3. Ustaw kolumnę w pozycji pionowej i ostrożnie usuń górną pokrywę kolumny.
    4. Zdejmij dolną pokrywkę i pozwól, by bufor całkowicie odpłynął z kolumny.
      UWAGA: Upewnij się, że bufor magazynowy jest całkowicie opróżniony z kolumny przed wyrównaniem.
    5. Wyrównaj kolumnę, przepłukując trzema objętościami kolumny (25,5 mL) odgazowanego bufora VIB o pojemności 0,22 μm.
  2. Ładowanie i pobieranie próbek EV
    1. Do każdego oczyszczania SEC należy użyć 100 μg całkowitego białka EV. Przed załadowaniem na kolumnę SEC dostosuj próbki EV do końcowej objętości 500 μL za pomocą VIB.
    2. Załóż zawieszenie elektryczne o pojemności 500 μL bezpośrednio do fritu załadunkowego na szczycie kolumny.
    3. Pozwól próbce całkowicie wejść do warstwy żywicy przed dodaniem bufora VIB. Utrzymuj ciągły przepływ kolumnowy przez cały czas separacji, aby zapewnić dokładną elucię na podstawie rozmiaru.
      UWAGA: Przepływ kolumnowy powinien pozostawać ciągły przez cały czas separacji. Pozwolenie kolumnie na wyschnięcie lub zatrzymanie przepływu na dłuższy czas zakłóca rozdzielanie oparte na rozmiarze i może prowadzić do nakładania się frakcji oraz zmniejszenia wzbogacenia EV.
    4. Po pełnym wejściu próbki EV (500 μL) do warstwy żywicy należy dodać 2 mL VIB i pozwolić jej całkowicie się wyludzić. Ten eluat odpowiada martwemu wolumenu kolumny i powinien zostać odrzucony. Frakcje EV były następnie pobierane przez kolejne dodanie 400 μL VIB i zebranie eluatu, powtarzając ten proces, aby uzyskać frakcje 1-6 w rurkach mikrowirówek 1,5 mL.
      UWAGA: Martwy wolumen nie powinien zawierać pojazdów elektrycznych. Na podstawie walidacji w kolumnie 35 nm, EV są zazwyczaj odzyskiwane w frakcjach 1-3. W razie potrzeby martwą objętość można ocenić za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) lub immunoblotingu markerów EV, aby potwierdzić brak EV.
  3. Czyszczenie i przechowywanie kolumn
    1. Bezpośrednio po zebraniu frakcji przepłucz kolumnę jedną objętością kolumny (8,5 mL) 0,5 M NaOH, aby zdezynfekować żywicę. Następnie przepłucz kolumnę 17 mL VIB, aby przywrócić neutralne pH. Kolumna jest wtedy gotowa do załadunku kolejnej próbki.
      UWAGA: Samo przepłukanie kolumny buforem nie wystarcza do usunięcia pozostałości białek lub pęcherzyków. Etap czyszczenia NaOH jest niezbędny, aby zapobiec przenoszeniu się do próbek, szczególnie w dalszych analizach kwasów nukleinowych lub RNA.
    2. Do długoterminowego przechowywania przepłukaj kolumnę dwoma objętościami wody dejonizowanej po oczyszczeniu, a następnie dwa objętości po 20% etanolu do przechowywania. Zmień kolumnę i schowaj ją pionowo.
      UWAGA: Płukanie kolumny wodą dejonizowaną przed magazynowaniem etanolu zapobiega krystalizacji soli w warstwie żywicy, co zachowuje wydajność kolumny.

6. Walidacja, ilościowość oraz ocena rozmiaru/morfologii EV

  1. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Zmierz rozkład wielkości EV i stężenie cząstek według NTA.
    2. Rozcieńcz próbki EV w skali 1:100 w sterylnym, 0,2 μm filtrowanym VIB, aby uzyskać stężenie cząstek w optymalnym zakresie detekcji (około 10⁷-10⁹ cząstek/mL).
    3. Delikatnie wymieszaj rozcieńczone próbki, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków, i załaduj je do instrumentu wyposażonego w laser 532 nm oraz kamerę sCMOS o wysokiej czułości.
    4. Przeprowadzaj akwizycję i analizę danych za pomocą oprogramowania NS Xplorer z progiem detekcji 10 nm (do 1 000 nm), stosując dynamiczny algorytm koncentracji objętościowej obserwacji.
  2. Analiza zachodnich plam markerów EV
    1. Do analizy Western blot należy przemyć i ponownie zawiesować frakcje EV uzyskane po separacji gradientu sacharozy w 50 μL VIB. Zmieszaj aliquot 10 μL z każdej frakcji z buforem ładunkowym SDS, denaturowanym i rozdzielonym na żelu tris-glycine 12% przed immunoblotingiem z przeciwciałami markerów EV TET8.
    2. Dla frakcji EV pochodzących z SEC najpierw skoncentruj 400 μL każdej frakcji do 50 μL za pomocą odśrodkowego filtra odśrodkowego o masie cząsteczkowej o masie cząsteczkowej 100 kDa. Następnie użyj 10 μL skoncentrowanej próbki do analizy Western blot, jak opisano powyżej.
  3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Złóż 5 μL EV zawieszonych w systemie VIB na siatki węglowo-formwarowe o rozmiarze 300 mesh wyładowanych ze światłem węgla. Następnie zetnij nadmiar próbki za pomocą papieru filtracyjnego.
    2. Następnie negatywnie barwi siatkę 3 μL barwieniem elektronowym mikroskopii elektronowej, zmyj knotem za pomocą papieru filtracyjnego i pozwól wyschnąć przed obrazowaniem 300 kV TEM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby ocenić, czy zoptymalizowany protokół zbierania AWF zmniejsza uszkodzenia tkanek i skażenie cytoplazmatyczne, uzyskany AWF za pomocą naszej metody (Metoda 1) został bezpośrednio porównany z alternatywną metodą (Metoda 2) opartą na infiltracji pompy próżniowej całej instalacji11. Uszkodzenie komórek po infiltracji oceniono za pomocą barwienia Trypan Blue, które wykazało znacznie zmniejszone barwienie liści przetworzonych metodą 1, wskazując na niższe poziomy pęknięć komórek (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

EV roślinne stały się kluczowymi graczami w odporności roślin, szczególnie w komunikacji międzykrólestwowej z patogenami grzybowymi32. Coraz więcej dowodów wskazuje, że rośliny wydzielają EV do apoplastu, gdzie dostarczają małe RNA (sRNA), mRNA oraz białka zdolne do tłumienia zjadliwości u najeżdżających patogenów, takich jak Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani oraz patogen oomycetów Phytophthora capsici 10,18,33

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie ujawniają konfliktu interesów.

Podziękowania

B.D. jest wspierany przez stypendium Pathways to the Doctorate Fellowship z Texas A&M University. B.H. jest wspierany przez fundusze początkowe Texas A&M University oraz Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych HATCH 7009138 numer projektu: TEX08074.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 & mikro; Filtry nylonowe mVWR76479-032
1 ml niepotrzebnej strzykawkiBD Biosciences309659
Ultraodśrodkowy filtr 100 kDaAmiconUFC 910008
100 ml niepotrzebnej strzykawkiBD Biosciences551721050
Stożkowe rurki o pojemności 15 mlVWR89039-664
Stożkowe rurki 50 mlVWR89039-656
Arabidopsis thaliana (Col-0)Linie utrzymywane przez laboratoriumNie dotyczy
Siatki węglowo-formwarowe o rozmiarze 300 meshTED PELLA01753-F
Przezroczysta taśmaSzkocka Magiczna TaśmaS-9783
ParafilmFisher Scientific13-374-12
Bufor PBSWytwarzane na własnym rynkuNie dotyczy
qEV oryginalna kolumna Gen2 35 nmIZON ScienceICO-35
Wirówka chłodzonaEppendorf5810R
Wirnik o stałym kącie w chłodniEppendorfF-34-6-38
Wirnik z łyżką obrotową w chłodniarniEppendorfA-4-62
SacharozaVWR470302-810
UltrawirówkaBeckman CoulterXPN-100
Rurki ultrawirówkoweBeckman Coulter337986
Plama UranyLessNauki o mikroskopii elektronowej250218-01

Bibliografia

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. Zhou, X., et al. Small extracellular vesicles: The origins, current status, future prospects, and applications. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 184(2025).
  3. Colombo, M., Raposo, G., Théry, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  4. Akers, J. C., Gonda, D., Kim, R., Carter, B. S., Chen, C. C. Biogenesis of extracellular vesicles (EV): Exosomes, microvesicles, retrovirus-like vesicles, and apoptotic bodies. J Neurooncol. 113 (1), 1-11 (2013).
  5. Ratajczak, M. Z., Ratajczak, J. Extracellular microvesicles/exosomes: Discovery, disbelief, acceptance, and the future. Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).
  6. Hristov, M., Erl, W., Linder, S., Weber, P. C. Apoptotic bodies from endothelial cells enhance the number and initiate the differentiation of human endothelial progenitor cells in vitro. Blood. 104 (9), 2761-2766 (2004).
  7. Marar, C., Starich, B., Wirtz, D. Extracellular vesicles in immunomodulation and tumor progression. Nat Immunol. 22 (5), 560-570 (2021).
  8. Ruan, S., et al. Extracellular vesicles as an advanced delivery biomaterial for precision cancer immunotherapy. Adv Healthc Mater. 11 (5), e2100650(2022).
  9. Cai, Q., et al. Message in a bubble: Shuttling small RNAs and proteins between cells and interacting organisms using extracellular vesicles. Annu Rev Plant Biol. 72, 497-524 (2021).
  10. Cai, Q., et al. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science. 360 (6393), 1126-1129 (2018).
  11. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles isolated from the leaf apoplast carry stress-response proteins. Plant Physiol. 173 (1), 728-741 (2017).
  12. Ding, Y., et al. Exo70e2 is essential for exocyst subunit recruitment and expo formation in both plants and animals. Mol Biol Cell. 25 (3), 412-426 (2014).
  13. Wang, J., et al. Expo, an exocyst-positive organelle distinct from multivesicular endosomes and autophagosomes, mediates cytosol to cell wall exocytosis in Arabidopsis and tobacco cells. Plant Cell. 22 (12), 4009-4030 (2010).
  14. Jeon, H. S., et al. Pathogen-induced autophagy regulates monolignol transport and lignin formation in plant immunity. Autophagy. 19 (2), 597-615 (2023).
  15. Prado, N., et al. Nanovesicles are secreted during pollen germination and pollen tube growth: A possible role in fertilization. Mol Plant. 7 (3), 573-577 (2014).
  16. Samuel, M., Bleackley, M., Anderson, M., Mathivanan, S. Extracellular vesicles including exosomes in cross kingdom regulation: A viewpoint from plant-fungal interactions. Front Plant Sci. 6, 766(2015).
  17. Pinedo, M., De La Canal, L., De Marcos Lousa, C. A call for rigor and standardization in plant extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 10 (6), e12048(2021).
  18. Huang, Y., et al. Rice extracellular vesicles send defense proteins into fungus rhizoctonia solani to reduce disease. Dev Cell. 60 (8), 1168-1181.e6 (2025).
  19. Wang, S., et al. Plant mrnas move into a fungal pathogen via extracellular vesicles to reduce infection. Cell Host Microbe. 32 (1), 93-105.e6 (2024).
  20. He, B., et al. Publisher correction: Rna-binding proteins contribute to small rna loading in plant extracellular vesicles. Nat Plants. 7 (4), 539(2021).
  21. Rutter, B. D., Innes, R. W. Extracellular vesicles as key mediators of plant-microbe interactions. Curr Opin Plant Biol. 44, 16-22 (2018).
  22. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  23. Regente, M., et al. Plant extracellular vesicles are incorporated by a fungal pathogen and inhibit its growth. J Exp Bot. 68 (20), 5485-5495 (2017).
  24. Mu, J., et al. Interspecies communication between plant and mouse gut host cells through edible plant derived exosome-like nanoparticles. Mol Nutr Food Res. 58 (7), 1561-1573 (2014).
  25. Baldrich, P., et al. Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide "tiny" RNAs. Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).
  26. Regente, M., et al. Vesicular fractions of sunflower apoplastic fluids are associated with potential exosome marker proteins. FEBS Lett. 583 (20), 3363-3366 (2009).
  27. Rutter, B. D., Innes, R. W. Growing pains: Addressing the pitfalls of plant extracellular vesicle research. New Phytol. 228 (5), 1505-1510 (2020).
  28. Thieron, H., et al. Practical advice for extracellular vesicle isolation in plant-microbe interactions: Concerns, considerations, and conclusions. J Extracell Vesicles. 13 (12), e70022(2024).
  29. Borniego, M. L., et al. Diverse plant Rnas coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).
  30. Chen, A., He, B., Jin, H. Isolation of extracellular vesicles from Arabidopsis. Curr Protoc. 2 (1), e352(2022).
  31. Koch, B. L., Rutter, B. D., Innes, R. W. Arabidopsis produces distinct subpopulations of extracellular vesicles that respond differentially to biotic stress. bioRxiv. , (2024).
  32. Hamby, R., Cai, Q., Jin, H. RNA communication between organisms inspires innovative eco-friendly strategies for disease control. Nat Rev Mol Cell Biol. 26 (2), 81-82 (2025).
  33. Hou, Y., et al. A phytophthora effector suppresses trans-kingdom RNAi to promote disease susceptibility. Cell Host Microbe. 25 (1), 153-165.e5 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja p cherzyk wr niczkowe wirowaniegradient sacharozychromatografia wykluczanialedzenie nanocz stektransmisyjna mikroskopia elektronowainterakcje ro lin z mikroorganizmami
Izolacja i oczyszczanie zewnętrznych pęcherzyków roślinnych z liści Arabidopsis przy użyciu zoptymalizowanej metody zbierania apoplastów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.