Artykuł metodologiczny

Antyproliferacyjny test płytkowy do badania bioaktywnych cząsteczek in vitro przeciwko tachyzoitom Toxoplasma gondii

DOI:

10.3791/69725

⸱

23 stycznia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratório de Quimioterapia de Protozoários Egler Chiari, Departamento de Parasitologia - ICB, Universidade Federal de Minas Gerais

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta ma na celu opisanie prostej metody badania płytki nazębnej, która wspomaga przesiewowe nowe bioaktywne cząsteczki przeciwko stadium tachyzoitu pierwotniaka Toxoplasma gondii.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toksoplazmoza to infekcja pasożytnicza, często związana z uszkodzeniami oczu i malformacjami noworodkowymi. Od początku lat 50. XX wieku leczenie pierwszej linii tej choroby opiera się na połączeniu sulfadiazyny, pirymetaminy i kwasu folinowego. W ciągu tych lat wprowadzono tylko kilka alternatywnych schematów. To podkreśla potrzebę odkrywania nowych bioaktywnych cząsteczek przeciwko Toxoplasma gondii. Ponieważ patogen ten jest pasożytem obligatoryjnym wewnątrzkomórkowym, tradycyjne badania przesiewowe w laboratorium zazwyczaj wymagają kosztownych materiałów i sprzętu, takich jak testy z użyciem białek fluorescencjowych lub pasożytów ekspresujących β galaktozydazą. Dodatkowo, metody takie jak ilościowa mikroskopia optyczna mogą być czasochłonne. Test płytkowy to metoda oceniająca intensywność proliferacji patogenów wewnątrzkomórkowych poprzez pomiar liczby obszarów i obszaru zniszczenia w monowarstwie komórkowej uszkodzonej przez cykl lityczny pasożyta. Praca ta opisuje zoptymalizowany protokół badania blaszki nazębnej zaprojektowany do badania aktywnych cząsteczek przeciwko wewnątrzkomórkowym tachyzoitom T. gondii in vitro. Protokół ten wykorzystuje tanie materiały i prosty system laboratoryjny, co pozwala na szybkie i powtarzalne rezultaty, które ułatwiają identyfikację nowych aktywnych cząsteczek przeciwko temu pasożytowi przez różne grupy badawcze.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toksoplazmoza to choroba zoonotyczna o zróżnicowanym rozmieszczeniu na całym świecie, dotykająca około jednej trzeciej światowej populacji 1,2. Objawy tej choroby wiążą się ze stopniem odporności gospodarza oraz replikacją pasożyta 3,4. Faza ostra choroby, charakteryzująca się replikacją stadium tachyzoitu, jest zazwyczaj bezobjawowa u osób immunokompetentnych 5,6. Natomiast osoby z obniżoną odpornością występują częściej u osób z obniżoną odpornością, w tym niespecyficznymi objawami, takimi jak ogólne złe samopoczucie, gorączka, a także zapalenie mózgu i retinochorowitisis 6,7,8. Pomimo znaczenia klinicznego, obecne dostępne leczenie jest nieskuteczne przeciwko stadiju bradyzoitu Toxoplasma gondii (w fazie przewlekłej) i nie prowadzi do wyleczenia pasozytologicznego. Działania niepożądane obecnych leków również zmniejszają przestrzeganie leczenia 9,10,11. Dlatego konieczne jest znalezienie nowych, bezpieczniejszych i skuteczniejszych metod leczenia toksoplazmozy.

Rozwój nowych leków wymaga długiego okresu czasu, inwestycji o miliardy dolarów oraz wielu etapów badawczych. Ponieważ koszty rozwoju leków są wysokie, przemysł farmaceutyczny musi z wyprzedzeniem wybrać najlepszego kandydata na lek, 12,13,14,15. W badaniach przesiewowych można zastosować kilka podejść, w tym metody in silico, wykorzystanie sztucznej inteligencji oraz najczęściej stosowane metody biologiczne 16,17,18,19. Biologiczne badania in vitro polegają na wykorzystaniu bibliotek cząsteczek (chemobibliotek), aby udostępnić cząsteczki do identyfikacji aktywności biologicznej 20,21,22. Ponieważ te chemobiblioteki zawierają różnorodność cząsteczek, konieczne jest optymalizowanie zasobów i czasu. Dlatego test płytki nazębnej może być metodą pomagającą szybko przesiewać nowe bioaktywne cząsteczki przeciwko różnym patogenom, takim jak T. gondii.

Test płytkowy to metoda in vitro , która wykorzystuje cykl lityczny patogenów wewnątrzkomórkowych do ilościowego określenia stężenia patogenów w monowarstwie komórki, co skutkuje powstawaniem martwiczych blaszek w czasie23. Pierwsze badanie z użyciem techniki badania blaszkowego pochodzi z początku drugiej połowy XX wieku, kiedy zespół Renato Dulbecco wykorzystał monowarstwy fibroblastów kurczaków zakażonych wirusem zachodniego zapalenia mózgu końskiego, aby wykazać proporcjonalność między liczbą powstających nazębów a stężeniem wirusa16. Zastosowanie tej techniki u T. gondii zostało również dobrze opisane, jak wcześniej wyjaśnił Ufermann i współpracownicy23.

Jedno z pierwszych badań, które wykorzystało test płytki nazębnej do obserwowania odpowiedzi hamowania T. gondii na różne stężenia cząsteczek, przeprowadzili Roberts i in. w 1976 roku17. Chociaż test płytkowy jest szeroko stosowany do miareczkowania wirusów16,24, metoda ta została zastosowana tylko przez nieliczne grupy badawcze do oceny aktywności cząsteczek anty-T. gondii cząsteczek 21,22,25,26,27. Poszukując testu pozwalającego na testowanie bibliotek związków o wysokiej przepustowości, przy użyciu tanich materiałów i prostego laboratorium, badanie płytki nazębnej zostało rozważone jako alternatywa dla rutynowych badań laboratoryjnych na obecność leków. To doprowadziło do ustanowienia zoptymalizowanego protokołu, który umożliwia jednoczesną ocenę aktywności różnych cząsteczek przy użyciu prostych materiałów oraz systemu akwizycji obrazów, co daje szybkie i powtarzalne wyniki. W związku z tym opisujemy tutaj szczegółowy protokół, zatwierdzony w naszym laboratorium, mający na celu pomoc innym grupom w przesiewaniu nowych bioaktywnych cząsteczek przeciwko tachyzoitom T. gondii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manipulacja hodowlami pasożytów i komórek, a także utylizacja i przeznaczenie odpadów była wykonywana zgodnie z brazylijskim prawem, zgodnie z wymaganiami Narodowej Agencji Nadzoru Sanitarnego (ANVISA) RDC nr 222/2018. Wszystkie procedury były nadzorowane przez Wewnętrzny Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego (CIBio) z ICB-UFMG. Badanie to nie obejmuje użycia zwierząt, ludzi ani organizmów genetycznie zmodyfikowanych. Granty od CNPq, CAPES i FAPEMIG wspierały tę pracę. ESMD (CNPq 308082/2023-0) oraz RWAV (CNPq 305574/2021-3) są stypendystami CNPq ds. produktywności. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie uzupełnionego RPMI-1640 medium

UWAGA: Medium RPMI-1640 zostało pierwotnie opracowane do hodowli ludzkich komórek białaczki zarówno w zawiesinach, jak i monowarstwach. Jednak kolejne badania wykazały jego przydatność do różnych upraw komórek ssaków.

  1. Do butelki zawierającej 250 mL RPMI-1640 dodaj 2,5 mL 200 mM L-glutaminy (100x).
  2. Dodaj 2,5 mL antybiotyku przeciwmykotycznego (100x) do medium.
  3. Następnie dodaj 5,0 mL lub 25 ml płodowej surowicy bydłej (FBS) do butelki z RPMI-1640 (2% lub 10% FBS).
  4. Przechowuj w lodówce (2-8 °C).

2. Przygotowanie do PBS (1x)

UWAGA: Aby przygotować 1 L soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) przy pH 7,2 i 25 °C, należy postępować zgodnie z poniższymi krokami.

  1. Oddzielnie odmierz następujące ilości soli: 1,4 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4 oraz 8,5 g NaCl.
  2. Sole obciążone należy dodać osobno do 1-litrowej zlewki zawierającej 800 mL wody dejonizowanej. Mieszaj roztwór, aż wszystkie sole całkowicie się rozpuszczą.
  3. Zmierz pH roztworu za pomocą miernika pH. Powinno być 7.2. W razie potrzeby użyj 6 M kwasu solnego lub 3 M wodorotlenku sodu, aby podnieść pH do 7,2.
  4. Za pomocą szklanego pręta ilościowo przenieś powyższy roztwór do kolby objętościowej o pojemności 1 L.
  5. Dodaj wodę dejonizowaną do kolby objętościowej, aż całkowita objętość osiągnie 1 L, upewniając się, że łąkotka jest na właściwym poziomie.
  6. Wymieszaj roztwór w kolbie objętościowej, delikatnie go odwracając.
  7. Podziel ostateczny roztwór PBS na mniejsze szklane butelki (100-250 mL).
  8. Autoklawuj butelki w temperaturze 121 °C, 1,1 kg/cm2 przez 15 minut.
  9. Przechowuj roztwór PBS w lodówce (2-8 °C).
    UWAGA 1: Stosuj PBS w temperaturze 37 °C do wszystkich eksperymentów.

3. Przygotowanie roztworu 4% roztworu formaldehydu

  1. Wymieszaj 35,68 mL 1x PBS i 4,32 mL 37% P.A. formaldehydu.
  2. Roztwór przechowywać w plastikowej kolbie w temperaturze pokojowej (25 °C).

4. Przygotowanie roztworu zapasowego cząsteczek aktywnych

UWAGA: Sprawdź rozpuszczalność cząsteczek w DMSO, DMF, etanolu lub wodzie i wybierz najbardziej odpowiedni rozpuszczalnik. Aby zminimalizować potencjalne toksyczne efekty rozcieńczalników na pasożyty, roztwór podstawowy powinien być co najmniej 1000 razy bardziej skoncentrowany niż najwyższe stężenie testowanego związku. Na przykład, jeśli najwyższe stężenie do badania to 1 μM, roztwór bazowy powinien mieć co najmniej 1 mM. Aby przygotować roztwór wywarowy 10 mM, postępuj zgodnie z poniższymi krokami:

  1. Waż związek do testu za pomocą wagi analitycznej z precyzją 0,0001 g.
  2. Określ objętość rozcieńczalnika potrzebnego do uzyskania roztworu 10 mM, stosując następujący wzór:
    V (mL) = (Y MM) x 100
    Gdzie:
    Y: masa związku w miligramach (mg)
    MM: masa molowa związku
    V (mL): objętość rozpuszczalnika
  3. Dodaj rozcieńczalnik do biorki zawierającej ważony związek.
  4. Ujednolicz za pomocą mieszacza wirowego.
  5. Podziel roztwór na małe aliquoty i przechowuj w zamrażarce w temperaturze -20 °C.
  6. Przed użyciem pozwól roztworowi aliquot całkowicie się rozmrozić i ponownie ujednolicić za pomocą mieszacza wirowego.
    UWAGA: Aby przygotować roztwory podzapasowe o innych stężeniach, należy użyć następującego wzoru
    V (μL) = x mM × y μL/10 mM
    V (μL) ∶ objętość roztworu zapasowego potrzebnego do przygotowania nowego roztworu
    x mM: pożądane stężenie nowego roztworu.
    y (μL): pożądana objętość nowego rozwiązania.

5. Hodowla komórkowa

  1. Używaj komórek NHDF, delikatnie mieszając fiolkę w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Komórki NHDF mogą zostać zastąpione przez ludzkie fibroblasty napletkowe (HFF) lub inne linie komórkowe tworzące stabilną monowarstwę. Test płytki nazębnej sprawdza się tylko w liniach komórkowych tworzących stabilną monowarstwę, czyli komórkach, których wzrost zatrzymuje się w wyniku kontaktu. Linie komórkowe, które nie wykazują hamowania proliferacji, takie jak linie nowotworowe, nie mogą być używane, ponieważ komórki konkurują z pasożytami o składniki odżywcze w pożywce hodowlanej i uzupełniają obszar płytki nazębnej utworzony przez pasożyty.
  2. Natychmiast przenieś rozmrożone komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mL zawierającej 10 ml uzupełnionego medium RPMI-1640 (patrz krok 1).
  3. Wiruj ogniwa w dawce 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu cyklu wirowania na dnie rurki powinien być widoczny pellet komórkowy.
  4. Ostrożnie odrzucaj supernatant, aby zachować granulkę komórkową.
  5. Ponownie zawiesij pellet komórkowy z 12 mL uzupełnionym RPMI-1640 medium zawierającym 10% FBS i nasiew trzy kolby hodowlane o rozmiarze 25 cm2 lub jedną kolbę 75 cm2 . Po 2-3 dniach obejrzyj kolbę hodowlową za pomocą odwróconego mikroskopu kontrastowego fazowego, aby określić zdolność odzyskania proliferacji komórek (komórki powinny wykazywać co najmniej 40%-50% zbiegu komórek).
  6. Gdy komórki osiągną pełną monowarstwę (100% zbiegu), usuń ośrodek z kolby pipetą Pasteura. Usuń medium i pipetę.
  7. Dodaj 1-2 mL PBS 1x do piersiówki, odczekaj 1 minutę i wyjmij PBS.
  8. Dodaj 1 ml roztworu 0,05% trypsyny-wersyny do kolby i umieść ją w inkubatorze z 5%CO2, wilgotnością i temperaturą 37 °C na 2 minuty.
  9. Po 2 minutach obserwuj komórki za pomocą odwróconego mikroskopu, aby potwierdzić, że komórki się odłączyły.
  10. Ponownie zawiesij odłączone komórki z 24 mL uzupełnionym RPMI-1640 medium o 10% FBS, używając 10 mL serologicznej pipety i automatycznego dozownika pipet.
    UWAGA: Każda kolba hodowla o pojemności 25 lub 75 cm² z monowarstwą konfluentną jest zdolna do replikacji odpowiednio w 5 lub 15 innych butelkach hodowli o pojemności 25 cm².
  11. Po dodaniu potrzebnej objętości pożywki (24 mL) ujednolicz zawiesinę komórkową pipetą serologiczną.
  12. Przelej 4 mL zawiesiny ogniwowej w podłożu do każdej kolby o pojemności 25 cm2 lub 12 mL do 75 cm2 . Pamiętaj, aby zostawić 4 mL zawiesiny ogniwowej w początkowej kolbie.
  13. Umieść kolby w inkubatorze o stężeniu 5%CO2, wilgotności i temperaturze 37 °C.
  14. Poczekaj, aż uzyskasz pełną monowarstwę komórek (100% zbiegu komórek).
    UWAGA: Zidentyfikowaj każdą kolbę datą i numerem przejścia.

6. Przygotowanie płyt hodowlanych

  1. Sprawdź integralność monowarstwy komórki (100% konfluencja) w kolbie hodowlowej za pomocą mikroskopu odwróconego.
  2. Postępuj zgodnie z procedurą trypsynizacji opisaną powyżej (kroki 5.7-5.9).
  3. Używając pipety serologicznej o pojemności 5 mL, ponownie zawiesij odłączone komórki z medium RPMI o pojemności 4 mL i przenieś je do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
  4. Wiruj w temperaturze 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  5. Ostrożnie wyrzuć supernatant.
  6. Ponownie zawiesij pellet ogniwa z 1 mL świeżego medium RPMI-1640.
  7. Ujednolicz za pomocą mieszacza wirowego.
  8. Przelej 10 μL do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 490 μL roztworu 4% formaldehydu (rozcieńczenie 1:50) za pomocą mikropipety ze sterylnym końcówką.
    UWAGA: Czynnik rozcieńczenia = (całkowita objętość (μL)) / (objętość próbki (μL))
  9. Zorganizuj komorę Neubauer.
  10. Ujednolic roztwór utrwalający z pasożytami (przygotowanym w punkcie 6.8) za pomocą mieszacza wirowego.
  11. Dodaj 10 μL roztworu z pasożytami utrwalonymi do komory Neubauera.
  12. Policz cztery ćwiartki komnaty Neubauera, każdy składający się z 16 kwadratów.
  13. Określ liczbę komórek na mL:
    Liczba komórek (na mL) = [(n° komórek na kwadrat)/4] x Fd x 104
    Gdzie:
    Fd (czynnik rozcieńczenia) = 50
  14. Każdy dołek z płytki hodowlanej z 12 lub 6 dołkami należy zasiać odpowiednio5 × 104 lub 10 x 10 5 komórek, zawieszonych w 1 lub 2 ml podłoża uzupełnionego RPMI-1640 o 10% FBS.
  15. Umieść płytki w inkubatorze o stężeniu 5%CO2, wilgotnej atmosferze i temperaturze 37 °C.
  16. Poczekaj, aż monowarstwa komórkowa osiągnie 100% zbieżności.

7. Uprawa tachyzoitu in vitro

UWAGA: Do testu płytkowego zalecamy szczep Rh T. gondii.

  1. Usuń stare medium z kolby o wymiarach25 cm 2 zawierającej pełną monowarstwę (100% zbiegu) komórek NHDF za pomocą pipety Pasteura. Następnie dodaj 4 mL świeżego medium RPMI-1640 do kolby.
  2. Przenieś 5 μL supernatantu zawierającego świeżo wypuszczone tachyzoity z poprzedniej kolby z lizowanym posiewem zakażonym. Objętość 5 μL pozwala na cykl lityczny trwający 6-7 dni na kolbę o pojemności 25 cm².
  3. Umieść nowo zainfekowaną kolbkę w inkubatorze z 5%CO2, wilgotną atmosferą i temperaturą 37 °C.

8. Ilościowość tachyzoitów

  1. Usuń podłoże z kolby z nowo wypuszczonymi pasożytami za pomocą pipety Pasteura i przelej do stożkowej probówki o pojemności 15 mL.
  2. Wiruj probówkę w temperaturze 760 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Po zakończeniu cyklu wirowania widoczny jest osad na dnie rurki.
  3. Ostrożnie wyrzuć supernatant.
  4. Ponownie zawiesij granulek pasożytów z 1 mL świeżego medium RPMI-1640 z 2% FBS.
  5. Ujednolic zawiesinę pasożytniczą za pomocą mieszacza wirowego.
  6. Przelej 10 μL zawiesiny pasożyta do probówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 490 μL roztworu 4% formacji formaldehydu (rozcieńczenie 1:50) pipetą ze sterylnym końcówką.
  7. Postępuj zgodnie z krokami opisanymi w wersjach 6.10 do 6.12.
  8. Określ liczbę tachyzoitów na 1 mL.
    UWAGA: Liczba tachyzoitów (na mL) = [(n° tachyzoitów kwadratu)/4] x Fd x 104
    Gdzie:
    Fd (czynnik rozcieńczenia) = 50

9. Przygotowanie testu płytkowego dla aktywnych cząsteczek z chemobiblioteki

UWAGA: Celem tego badania jest identyfikacja cząsteczek, które zmniejszają proliferację T. gondii o ponad 50% przy stężeniu 1 μM. Przed rozpoczęciem tego badania należy wykonać test cytotoksyczności (np. metodą MTS lub MTT), aby upewnić się, że stężenia związków użyte w teście płytkowym nie są toksyczne dla komórek gospodarza.

  1. Potwierdź, że hodowle komórkowe osiągnęły 100% zbieżności w płytkach 12- lub 6-dołkowe.
  2. Usuń starą podłoże i dodaj 1 lub 2 mL świeżego, uzupełnionego medium RPMI-1640 z 2% FBS do każdego odwiertu odpowiednio na płytach 12- i 6-dołowych.
  3. Dodaj do każdego odwiertu związki do testu w pożądanym stężeniu. Do wstępnego badania zaleca się stężenie 1 μM.
    UWAGA: Użyj poniższego wzoru, aby obliczyć objętość do każdego odwiertu.
    V (μL) = (Końcowe stężenie w studni (μM) x objętość wewnątrz studni (μL))/(Roztwór zapasowy (μM))
  4. Do każdej płytki należy dodać 600 tachyzoitów (dla płyty 12-dołkowej) lub 1000 tachyzoitów (dla płyty 6-dołkowej) szczepu RH do każdego dołku.
    UWAGA: Różnice w proliferacji pasożytów mogą wystąpić z powodu różnic w dostawcach pożywki hodowlanej lub FBS lub w stosowanych liniach komórkowych. Dlatego zaleca się przeprowadzenie eksperymentu pilotażowego, aby określić optymalną liczbę pasożytów dla każdego stanu laboratoryjnego. Jeśli zajdzie taka potrzeba, dostosuj ilość pasożyta użytego w tym eksperymencie.
  5. Umieść płytki w aninkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2 i wilgotnej atmosferze przez 7 dni bez zakłóceń.
    UWAGA: Płyty nie powinny być przesuwane ani dotykane podczas 7-dniowego okresu inkubacji. Jeśli tak się stanie, eksperyment zostanie zrujnowany.

10. Barwienie płyt fioletowym kryształowym i akwizycja obrazu

  1. Po 7 dniach usuń podłoże z każdego dołku.
  2. Każdą jamkę dokładnie umyj 1x PBS w temperaturze pokojowej.
  3. Usuń PBS i ostrożnie dodaj 1 ml alkoholu 70% ° do każdego dołku. Zostaw w temperaturze pokojowej na 15 minut, potem wyrzuć z tego miejsca na 15 minut.
  4. Dodaj 0,5% roztwór wodny fioletu kryształowego i pozostawij go na 30 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Usuń roztwór kryształowego fioletu.
  6. Każdą studnię dokładnie przemyj raz wodą dejonizowaną.
    UWAGA: Podczas usuwania medium lub PBS podczas płukania nie dotykaj dna dołka końcówką pipety, ponieważ może to uszkodzić integralność monowarstwy. Podczas procesu mycia nie wylewaj strumienia PBS ani alkoholu bezpośrednio na komórki. Dokładnie dodaj je wzdłuż brzegu studni.
  7. Połóż talerz twarzą do dołu na chłonnym papierze, aby odprowadzić nadmiar wody i pozwól wyschnąć w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.
  8. Fotografuj płyty za pomocą wysokorozdzielczego skanerapłaskiego 28,29 lub systemu dokumentacji obrazów skonfigurowanego dla opcji żelu Coomassie blue 21,22,30.

11. Badanie odwracalności

UWAGA: Głównym celem testu odwracalności z użyciem tachyzoitów T. gondii jest ustalenie, czy zdolność proliferacji leczonych pasożytów została całkowicie zniesiona lub zmniejszona po usunięciu związków z pożywki hodowlanej31.

  1. Zasiej płytę z 6 dołkami komórkami NHDF, jak opisano w kroku 6. Do każdego otworu należy dodać 1 x 105 komórek zawieszonych w 2 ml uzupełnionego RPMI-1640 z 10% FBS.
    UWAGA: Gdy monowarstwa komórki osiągnie 100% zbiegu w każdej studni, płytka jest gotowa do badania płytki.
  2. Usuń podłoże i dodaj 1 x 104 tachyzoitesów w 2 mL świeżego medium z 2% FBS do każdego dołku.
  3. Po pozwoleniu tachyzoitom na interakcję z komórkami NHDF przez 1 godzinę, dodaj wybrane związki w końcowym stężeniu zbliżonym do wartości 90% stężenia hamującego (IC90). Jako dodatnia kontrola używa się studni zawierającej wyłącznie rozcieńczalnik leku.
  4. Leczenie tachyzoitów przez 4 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5%CO2 i wilgotną atmosferą.
  5. Po 4-dniowym okresie leczenia myj płytkę trzykrotnie 1x PBS w temperaturze 37 °C, aby zapewnić całkowite usunięcie związków.
  6. Do każdego dołka dodaj 2 mL świeżego medium bez związków i utrzymuj płytkę w inkubatorze przez dodatkowe 7 dni.
  7. Pobejcie płytkę barwnikiem krystalicznie fioletowym i sfotografujcie zgodnie z krokiem 10.

12. Analiza obrazów z użyciem oprogramowania ImageJ

  1. Otwórz obrazy za pomocą oprogramowania ImageJ32.
  2. Wybierz obszar odpowiadający jednemu dołkowi za pomocą narzędzia do wyboru owalnego (rysunek 1A,B).
    UWAGA: Podczas wyboru należy pominąć obszary na granicach studni, które wykazują defekty. Zazwyczaj znajdują się one na krawędziach studni.
  3. Skopiuj i utwórz nowy obraz: skopiuj wybrany obszar, naciskając Ctrl + C; utworzenie nowego pliku obrazu, naciskając Ctrl + N; wklej skopiowany obraz do nowego czarnego okna za pomocą Ctrl + V.
    UWAGA: Przy tworzeniu nowego obrazu należy ustawić domyślnie: 8-bitowy, wypełnij czarnym kolorem, 512 x 512 pikseli oraz jeden wycinek (Rysunek 1C).
  4. Przejdź do: Obraz > Dostosuj > próg lub naciśnij Ctrl + Shift + T (Rysunek 1D).
  5. W oknie Threshold wybierz opcje Huang i Red , a następnie kliknij Auto (Rysunek 1E).
  6. Kliknij Analizuj, a następnie wybierz Analizuj cząstki (Rysunek 1F). Zostaw domyślne opcje w oknie, które się pojawia, i kliknij OK (Rysunek 1G).
  7. Otworzy się nowe okno. Skopiuj wartość wyświetlaną w %Area (podświetlona czerwonym prostokątem na Rysunku 1H), aby obliczyć procent proliferacji lub hamowania pasożytów.
  8. Powtórz te kroki dla każdego dołka na talerzu.
  9. Aby obliczyć procent proliferacji, użyj następującego wzoru:
    % proliferacji = (%Obszar dobrze opatrzony/%Kontrola obszaru) × 100
  10. Aby obliczyć procent hamowania, użyj następującego wzoru:
    % hamowania = [1- (%Obszar dobrze traktowany/%Dobrze kontrolujący obszar)] × 100

Rysunek 1
Rysunek 1: Analiza krok po kroku wyników w oprogramowaniu ImageJ. (A) Wybór narzędzi "owalnych". (B) Wybór obszaru zainteresowania na obrazie. (C) Nowe okno obrazu (Ctrl + N) z zalecanymi ustawieniami. (D) Kroki "analizy progowej po wklejeniu obszaru zainteresowania w nowym oknie obrazu. (E) Huang i czerwony wybór opcji w oknie Threshold, co skutkuje tym, że wszystkie białe obszary są wypełnione na czerwono. (F) Sekwencja kroków używanych w "Analizie cząstek". (G) Środowisko używane do analizy cząstek. (H) Wynik procentowy całkowitego zniszczonego obszaru jest pokazany w oknie podsumowania. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

13. Analiza statystyczna

  1. Po obliczeniu procentu hamowania proliferacji zorganizuj dane w arkuszu Excel w oprogramowaniu Office.
  2. Otwórz oprogramowanie GraphPad Prism 5.0 i kliknij XY (poniżej Nowa tabela i wykres).
  3. W sekcji Y (poniżej "X:error bar") wpisz liczbę powtórzeń danych (zazwyczaj trzy biologiczne repliki). Ta liczba może się różnić w zależności od liczby wykonanych powtórzeń.
  4. Wybierz Średnią tylko obok wykresu i NIE wybieraj "Wprowadź i wykreśl błędy już obliczone gdzie indziej", a następnie kliknij Stwórz.
  5. Umieść dane stężenia na osi X, a dane procentowe hamowania proliferacji w kolumnach A, A:Y1, A:Y2, A:Y3, A:Y4, A:Y5.
  6. Kliknij = Analizuj, a następnie kliknij Przetransformuj, a następnie OK. Otworzy się nowe okno. W tym nowym oknie kliknij Transformuj wartości X używając X = Log(X), następnie kliknij Utwórz nowy wykres z wynikami i OK.
  7. Kliknij = Analizuj , a następnie Normalizuj. Otworzy się nowe okno. W sekcji Jak jest zdefiniowane 0%?, kliknij i ustaw Y = 0.0. W sekcji Jak jest zdefiniowane 100%?, kliknij i ustaw Y = 100; wybierz Procenty i kliknij Utwórz nowy wykres wyników.
  8. Kliknij na symbol: Dopasuj krzywą z regresją nieliniową umieszczoną powyżej = Analizuj. Kliknij na Dawka-odpowiedź - Hamowanie, następnie na log (inhibitor) vs. odpowiedź znormalizowana - Zmienny nachylenie, a następnie kliknij OK.
    UWAGA: Otworzy się okno wyświetlające następujące wyniki: IC50 (stężenie hamujące 50%), przedział ufności 95% oraz wartość R2. Te wartości są kluczowe i powinny być uwzględnione w tabeli wyników w eseju.
  9. Aby oszacować inne stężenia hamujące, takie jak IC25,IC 90 lubIC 95, użyj linku (https://www.graphpad.com/quickcalcs/Ecanything1.cfm), Quick Calcs - GraphPad; EC: efektywna koncentracja. Raportuj IC50 oraz HillSlope uzyskane przez oprogramowanie Prism dla każdego testowanego leku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Do oceny testu płytki po leczeniu kluczowe są zarówno pozytywne (komórki zakażone tachyzoitami i nieleczone), jak i negatywne (niezainfekowane komórki z 0,1% DMSO). Na końcu eksperymentu studnia kontroli dodatniej powinna wykazywać dobrze zdefiniowane puste przestrzenie z pozostałościami przyklejonych komórek (Rysunek 2). Natomiast studnia kontroli ujemnej powinna wyświetlać nienaruszoną monowarstwę bez pustych przestrzeni. Negatywna kontrola jest kluczowa dla potwierdzenia integralności mon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standaryzacja nowych protokołów testów antyproliferacyjnych jest kluczowym krokiem w rozwoju badań naukowych nad identyfikacją przyszłych leków. Przedstawiony tutaj protokół oferuje alternatywne podejście do oceny aktywności bioaktywnych cząsteczek wobec tachyzoitów T. gondii. Ponieważ T. gondii jest pasożytem obligatornym wewnątrzkomórkowym, który porusza się poprzez ślizgową ruchliwość, gdy pasożyty wydostają się z komórki zlikwidowanej, zaatakują komórki znajdujące się w pobliżu wcześniej za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują również finansowaniu przez Conselho Nacional de Desenvolvimento e Pesquisa (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) oraz CAPES/PROEX. Autorzy pragną podziękować Pró-Reitoria de Pesquisa z Universidade Federal de Minas Gerais za wsparcie tych badań. ESMD (CNPq 308082/2023-0) oraz RWAV (CNPq 305574/2021-3) są stypendystami CNPq ds. produktywności.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% trypsyna-EDTATechnologie życia25300-062
10 mL pipeta serologicznaOlenK17-110
Wirówka z rurą sokola 15 mLFanemModel: 206
5 mL pipeta serologicznaOlenK17-115
Płyta hodowla z 6 dołkamiSarstedt833920
Bilans analitycznyMettler Toledo Model: AB204 Numer seryjny: 1116473813
Antybiotyk przeciwmykotyczny (100X)Technologie życia15240-062
Pipeta automatycznaKasviK1-AID
WirówkaEppendorfModel 5415 R Nr seryjny: 0023591
CO2 InkubatorKorporacja PHCNumer modelu: MCO-230AICUVL-PA Numer seryjny: 210360090
Butelka hodowla 25 cm2Sarstedt833910
Dimetylsulfoxid (DMSO) P.A.Merck 1,02,95,21,000
Ethanol P.AMerck1,00,98,31,000
Serum bydła płodu (FBS)Technologie życia12657-029
Formaldehyd 37-38%Panreac131328
GraphPad Prism Oprogramowanie GraphPad-Wersja 8.0.1
ImageJ  software --Wersja 1.52e
Systemy dokumentacji obrazowaniaBio-RadModel:  ChemiDoc MP Imaging System Nr seryjny: 734BR2249
Laminarny okapVeco do BrasilModel: VLFS-09
L-glutamina 200 mM (100X)Technologie życia25030-081
Mikrorurka 0,5 mLSarstedt72,699
Neonatologiczny prawidłowy ludzki fibroblast skóry (NHDF)LonzaCC-3132Hojnie udostępnione przez dr Sheilę Nardelli z Fiocruz Paraná, Brazylia
Komora Neubauera 0,100 mm 0,0025 mm2Nowe optyki7301-1
pHmeterMikronalnyModel: B374 Numer seryjny: 30/37
Pipette 20-200 & micro; LKasvi basic22032893
Pipette 2-20 & micro; LLabmate Pro656630226
Pipette  0,2-2 & mikro; LLabmate Pro556610114
Pipette  1000-5.000 & mikro; LUniscienceYM4A021482
Pipette  100-1000 & mikro; LEppendorf Research plusQ34354C
Fosforan potasu monozasadowy  (KH2PO4) P.A Syntezator01F2002.01.AF
RPMI-1640 średniSigma-Aldrich R0883
Chlorek sodu (NaCl) P.A. Cromoline Quí mica Fina -
Fosforan sodu (Na2HPO4) P.A.CRQ Produtos Quimicos ÉireliR2715920500
Wskazówka 1.000 & mikro; LSarstedt7,01,186
Wskazówka 10 i mikro; LSarstedt7,03,010
Wskazówka 5.000 & mikro; LSarstedt70,11,83,001
Wskazówki  200 & mikro; LSarstedt7,03,030
Pipeta transferowa   (3,5 mL) i nie przekłada;Sarstedt86,11,71,001
Rurka 15 mLSarstedt6,25,54,502
Kryształ FioletowyMerck101408
Mieszacz wirowyPhoenixModel: AP56 Numer seryjny: 6633
Kąpiel wodnaHemoquimica do BrasilModel: HM1003 Numer seryjny: 700001556

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molan, A., Nosaka, K., Hunter, M., Wang, W. Global status of Toxoplasma gondii infection: systematic review and prevalence snapshots. Trop Biomed. 36 (4), 898-925 (2019).
  2. Bigna, J. J., et al. Global, regional, and country seroprevalence of Toxoplasma gondii in pregnant women: A systematic review, modelling and meta-analysis. Sci Rep. 10 (1), 12102(2020).
  3. Dian, S., Ganiem, A. R., Ekawardhani, S. Cerebral toxoplasmosis in HIV-infected patients: A review. Pathog Glob Health. 117 (1), 14-23 (2023).
  4. Wang, Z. -D., et al. Toxoplasma gondii Infection in Immunocompromised Patients: A Systematic Review and Meta-Analysis. Front Microbiol. 8, 389(2017).
  5. Layton, J., et al. Clinical spectrum, radiological findings, and outcomes of severe toxoplasmosis in immunocompetent hosts: A systematic review. Pathogens. 12 (4), 543(2023).
  6. Weiss, L. M., Dubey,, Jitender, P. Toxoplasmosis: A history of clinical observations. Int J Parasitology. 39 (8), 895-901 (2009).
  7. Fabiani, S., et al. Ocular toxoplasmosis, an overview focusing on clinical aspects. Acta Trop. 225, 106180(2022).
  8. Butler, N. J., Furtado, J. M., Winthrop, K. L., Smith, J. R. Ocular toxoplasmosis II: Clinical features, pathology and management. Clin Exp Ophthalmol. 41 (1), 95-108 (2013).
  9. Dunay, I. R., Gajurel, K., Dhakal, R., Liesenfeld, O., Montoya, J. G. Treatment of Toxoplasmosis: Historical perspective, animal models, and current clinical practice. Clin Microbiol Rev. 31 (4), e00057-e00117 (2018).
  10. Wei, H. -X., Wei, S. -S., Lindsay, D. S., Peng, H. -J. A systematic review and meta-analysis of the efficacy of anti-Toxoplasma gondii medicines in humans. PloS One. 10 (9), e0138204(2015).
  11. Shammaa, A. M., Powell, T. G., Benmerzouga, I. Adverse outcomes associated with the treatment of Toxoplasma infections. Sci Rep. 11 (1), 1035(2021).
  12. Hay, M., Thomas, D. W., Craighead, J. L., Economides, C., Rosenthal, J. Clinical development success rates for investigational drugs. Nat Biotechnol. 32 (1), 40-51 (2014).
  13. Paul, S. M., et al. How to improve R&D productivity: The pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 9 (3), 203-214 (2010).
  14. Andrade, E. L., et al. Non-clinical studies required for new drug development - Part I: Early in silico and in vitro studies, new target discovery and validation, proof of principles and robustness of animal studies. Braz J Med Biol Res. 49 (11), e5644(2016).
  15. Brodniewicz, T., Grynkiewicz, G. Preclinical drug development. Acta Poloniae Pharmaceutica. 67 (6), 578-585 (2010).
  16. Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 38 (8), 747-752 (1952).
  17. Roberts, C. O., Chaparas, S. D., McLaughlin, D. The use of the plaque assay in chemotherapeutic and dermal hypersensitivity studies on Toxoplasma gondii. Trans Am Microsc Soc. 95 (3), 470(1976).
  18. Mo, J., et al. Effect of the Pseudomonas metabolites HQNO on the Toxoplasma gondii RH strain in vitro and in vivo. Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 21, 74-80 (2023).
  19. Barbosa, B. F., et al. Enrofloxacin is able to control Toxoplasma gondii infection in both in vitro and in vivo experimental models. Vet Parasitol. 187 (1-2), 44-52 (2012).
  20. Wall, G., Lopez-Ribot, J. L. Screening repurposing libraries for identification of drugs with novel antifungal activity. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), e00924-e01020 (2020).
  21. dos Santos, M., et al. Medicines for malaria venture pandemic box in vitro screening identifies compounds highly active against the tachyzoite stage of Toxoplasma gondii. Trop Med Infect Dis. 8 (12), (2023).
  22. Costa, A. L. O., et al. Antiproliferative and morphological analysis triggered by drugs contained in the medicines for malaria venture COVID-box against Toxoplasma gondii tachyzoites. Microorganisms. 12 (12), 2602(2024).
  23. Ufermann, C. -M., Müller, F., Frohnecke, N., Laue, M., Seeber, F. Toxoplasma gondii plaque assays revisited: Improvements for ultrastructural and quantitative evaluation of lytic parasite growth. Exp Parasitol. 180, 19-26 (2017).
  24. Condit, R. C. Principles of virology. Fields Virology. I, 25-57 (2007).
  25. Montazeri, M., et al. In vitro and in vivo evaluation of kojic acid against Toxoplasma gondii in experimental models of acute toxoplasmosis. Exp Parasitol. 200, 7-12 (2019).
  26. Ke, O. Y., Krug, E. C., Marr, J. J., Berens, R. L. Inhibition of growth of Toxoplasma gondii by qinghaosu and derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 34 (10), 1961-1965 (1990).
  27. Liu, X., et al. Anti-Toxoplasma gondii effects of lipopeptide derivatives of Lycosin-I. Toxins. 15 (8), 477(2023).
  28. Emi, A., et al. Development of an automated plaque-counting program for the quantification of the Chikungunya virus. Sci Rep. 15 (1), 12429(2025).
  29. Sullivan, K., et al. High throughput virus plaque quantitation using a flatbed scanner. J Virol Methods. 179 (1), 81-89 (2012).
  30. Pereira Filho, A. A., et al. In vitro activity of essential oils from piper species (Piperaceae) against tachyzoites of Toxoplasma gondii. Metabolites. 13 (1), 95(2023).
  31. Martins-Duarte, E. S., et al. In vitro activity of N-phenyl-1,10-phenanthroline-2-amines against tachyzoites and bradyzoites of Toxoplasma gondii. Bioorg Medl Chem. 50, 116467(2021).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Subramanian, G., et al. Targeted phenotypic screening in Plasmodium falciparum and Toxoplasma gondii reveals novel modes of action of medicines for malaria venture malaria box molecules. mSphere. 3 (1), e00534(2018).
  34. Dans, M. G., et al. Screening the medicines for malaria venture pathogen box for invasion and egress inhibitors of the blood stage of Plasmodium falciparum reveals several inhibitory compounds. Int J Parasitol. 50 (3), 235-252 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przesiewanie antyproliferacyjnewewn trzkom rkowy paso yttest tachyzoit wprzesiewanie lek wmonowarstwa kom rkowaproliferacja paso yt wprotok in vitro

Powiązane artykuły