Niniejszy artykuł opisuje badanie regulujące fibrozę włókniastych płuc za pomocą wywaru Wenyang Dingchuan poprzez hamowanie polaryzacji makrofagów M2.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
Niniejszy artykuł opisuje badanie regulujące fibrozę włókniastych płuc za pomocą wywaru Wenyang Dingchuan poprzez hamowanie polaryzacji makrofagów M2.
Badanie wpływu Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) na funkcjonowanie fibroblastów, przebudowywanie dróg oddechowych w astmie oraz mechanizm leżący. IL-4 został użyty do indukowania polaryzacji M2 makrofagów RAW264.7, a następnie makrofagi spolaryzowane zostały poddane leczeniu WYDCT, aby zbadać jego wpływ na fibroblasty płuc myszy. Spolaryzowane komórki RAW264.7 poddawano różnym zabiegom, a następnie współhodowano z fibroblastami. Oceniono poziomy markerów M1 i M2, morfologię komórek oraz stężenie IL-6. Analizowano poziom białka STAT3. Analizowano żywotność fibroblastów, proliferację, tworzenie kolonii, ekspresję PCNA oraz ekspresję fibronektyny, COL1A1 i α-SMA za pomocą różnych testów, w tym PCR w czasie rzeczywistym, Western blot, CCK-8, Edu, immunofluorescencji oraz formowania kolonii. WYDCT odwrócił morfologiczne zmiany wywołane przez IL-4 w komórkach RAW264.7, obniżył poziomy markerów M2 (Arg-1, CD206) i IL-6 oraz zmniejszył ekspresję STAT3 w komórkach RAW264.7, podczas gdy suplementacja IL-6 przywróciła efekt WYDCT na markery M2. Ponadto WYDCT hamował żywotność i proliferację fibroblastów, zmniejszał ekspresję PCNA oraz zmniejszał liczbę markerów włóknienia (fibronektyna, COL1A1, α-SMA), co sugeruje, że WYDCT hamuje żywotność, proliferację i włóknienie fibroblastów płucnych poprzez tłumienie polaryzacji makrofagów M2, w której szlak sygnalizacyjny IL-6/STAT3 może odgrywać kluczową rolę.
Astma, znana również jako astma oskrzelowa, to przewlekłe schorzenie zapalne dróg oddechowych1. Często kojarzony z narażeniem na alergeny, niskimi temperaturami oraz drażniącymi substancjami fizycznymi i chemicznymi, ten stan charakteryzuje się infiltracją komórek zapalnych, odwracalnym zwężeniem dróg oddechowych, wydzielaniem śluzu oraz skurczem oskrzelitypu 2. Obecnie na całym świecie jest co najmniej 300 milionów pacjentów z astmą, a częstość występowania rośnie z roku narok trzeci. W 2015 roku na astmę zmarło 400 000 osób, co czyni ją poważnym globalnym problemem zdrowotnym 4,5. Chiny również borykają się z tym samym problemem, a badania wykazały częstość występowania astmy na poziomie 4,2%, co odpowiada za około 45,7 miliona dorosłych pacjentów, przy niższych wskaźnikach kontrolnych w porównaniu do krajów rozwiniętych 6,7. Dobrostan osób dotkniętych tą chorobą jest znacznie zagrożony, co powoduje znaczne obciążenie finansowe dla rodzin.
Remodelacja dróg oddechowych jest uważana za kluczowy element leczenia astmy, którą trudno kontrolować8. Dlatego leczenie przewlekłej, przewlekłej astmy staje się kluczowym punktem. Praktyka kliniczna często polega na stosowaniu wziewnych kortykosteroidów w połączeniu z oskrzelowymi dylatatorami, które mogą skutecznie łagodzić objawy u pacjentów9. Jednak te metody leczenia mają pewne skutki uboczne i mogą być mniej skuteczne w poprawie objawów u niektórych pacjentów. Dodatkowo astma ma tendencję do nawrotu po odstawieniu leków. Badania wykazały, że aktywacja fibroblastów płucnych jest związana z przebudową dróg oddechowych podczas postępu astmy10. Po aktywacji fibroblasty płuc przechodzą transformację fenotypową i wydzielają kluczowe białka napędzające osadzanie macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) – kluczową cechę patologiczną remodelacji dróg oddechowych. Konkretnie, fibronektyna pełni rolę wczesnego rusztowania do montażu ECM, wspierając rekrutację i adhezję innych składników macierza; COL1A1 (łańcuch kolagenu typu I α1) jest głównym białkiem strukturalnym ECM, a jego nadmierne nagromadzenie prowadzi do pogrubienia i sztywności ścian dróg oddechowych; α-SMA (aktyna mięśni gładkich α) oznacza przemianę fibroblastów w miofibroblasty o silnych zdolnościach kurczliwych i wydzielniczych, co dodatkowo przyspiesza osadzanie się ECM i włóknienie dróg oddechowych.
IL-6 jest najważniejszym cytoplazmatycznym czynnikiem sygnalizacyjnym dla aktywacji szlaku STAT311. Podwyższony poziom IL-6 aktywuje szlak STAT3. W tkance płuc myszy astmatycznych istotnie zwiększają ekspresję mRNA i białek STAT3 oraz fosforylowane. Szlak sygnalizacyjny IL-6/STAT3 jest jednym z celów leczenia astmy. Badania potwierdziły, że aktywacja szlaku sygnalizacyjnego IL-6/STAT3 wiąże się ze stanem zapalnym dróg oddechowych w astmie, a hamowanie tego szlaku może zmniejszyć stan zapalny12,13. IL-6/STAT3 jest również powiązany z polaryzacją makrofagów M2. Badania zagraniczne wykazały, że ekspresja IL-6 znacząco zmniejsza aktywację STAT3 w dalszej fazie łańcuchowej, co koreluje ze zmniejszoną liczbą powierzchni guza, zmniejszoną proliferacją oraz obniżoną liczbą makrofagów M2 w wątrobie14.
Komórki odpornościowe zwane makrofagami można sklasyfikować na odrębne fenotypy, mianowicie aktywację klasyczną (M1) i aktywację alternatywną (M2), z których każda pełni unikalne role15. Makrofagi M1 mogą wywoływać reakcje zapalne i uszkodzenia tkanek, natomiast makrofagi M2 wspierają proliferację komórek oraz ułatwiają gojenie ran i naprawę tkanek. Badania wykazały, że przebudowa dróg oddechowych w astmie wiąże się z makrofagami M216. Eksperymenty in vitro wykazały, że indukowanie polaryzacji makrofagów M2 za pomocą IL-4 znacząco zwiększa zdolność proliferacji komórek α-SMA-dodatnich17. Hamowanie polaryzacji makrofagów M2 jest skutecznym podejściem do leczenia przebudowy dróg oddechowych w astmie.
Astma należy do kategorii "Xiao Bing" w tradycyjnej medycynie chińskiej. Czynniki patologiczne Xiao Binga dotyczą głównie flegmy. Produkcja flegmy wynika z nierównowagi między Yin a Yang w wnętrznościach, połączonej z czynnikami zewnętrznymi, takimi jak patogeny egzogenne, dieta i stany po chorobie, które wpływają na przepływ płynów ustrojowych, prowadząc do stagnacji i nagromadzenia. W związku z dalszymi badaniami mechanizmów tradycyjnej medycyny chińskiej w leczeniu astmy, coraz więcej badań wykazało, że tradycyjna medycyna chińska ma istotny wpływ na łagodzenie zapalenia dróg oddechowych, ograniczanie nadmiernego wydzielania śluzu oraz hamowanie przebudowy dróg oddechowych18,19. W Xiao Bing głównie dotknięte jest płuco, następnie śledziona i nerki. Pacjenci z Xiao Bing mają niedobór qi płuc oraz słabą obronę przed zewnętrznymi patogenami, co prowadzi do utraty dystrybucji qi płuc oraz długotrwałych, powtarzających się uszkodzeń yang qi, skutkujących niedoborem yang w płucach. Niedobór yang prowadzi do nieprawidłowego krążenia płynów ustrojowych, które kondensują się w flegmę. W przypadku długotrwałych ataków zimna flegma wpływa na yang śledziony i nerek, prowadząc do wzorca niedoboru yang płuca, śledziony i nerki, zaburzeń yin i yang, nadmiernej dominacji lub niedoboru konstytucji oraz nieprawidłowego krążenia płynów ustrojowych. Płuca nie mogą rozpraszać płynów, śledziona nie przekształca wody i esencji, a nerki nie mogą odparować i przekształcać płynów, co prowadzi do kondensacji flegmy i powstawania stazy, która objawia się astmą. Dlatego niedobór yang jest główną przyczyną Xiao Bing, a jego cechą jest stagnacja flegmy. Wen Yang Ding Chuan Tang składa się z 12 chińskich ziół leczniczych, w tym Epimedium (15 g), Ephedra (przetworzona) (10 g), żeń-szeń (15 g), Astragalus (15 g), miłorząb (15 g), Flos Farfarae (15 g), Jądro Gorzkiej Moruli (15 g), Pinellia ternata (przetworzona) (10 g), Schisandra chinensis (10 g), dżdżownica (10 g), Persica (10 g) oraz lukrecja (przetworzona) (10 g). Ta ziołowa formuła pochodzi z zmodyfikowanej formuły Ding Chuan Tang z książki "She Sheng Zhong Miao Fang" i działa na rozgrzewanie yang, wzmacnianie qi, rozwiązywanie flegmy, wspomaganie krążenia krwi oraz łagodzenie kaszlu i astmy. Kliniczna skuteczność tego leczenia została potwierdzona, co skłoniło do prowadzenia obecnych badań eksperymentalnych dotyczących mechanizmu leczenia przebudowy dróg oddechowych w astmie.
W porównaniu z obecnymi terapiami farmakologicznymi astmy, takimi jak wziewne kortykosteroidy, β2-agonisty oraz biologiczne leki na bazie przeciwciał monoklonalnych celujące w IgE lub IL-5, Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) oferuje potencjalną wielocelową i bezpieczniejszą strategię terapeutyczną. Konwencjonalne kortykosteroidy skutecznie łagodzą stan zapalny dróg oddechowych, ale często wiążą się ze skutkami ubocznymi, takimi jak immunosupresja, zaburzenia hormonalne czy nawrót po odstawieniu. Czynniki biologiczne, choć bardziej specyficzne, są kosztowne i ograniczone do konkretnych fenotypów astmy. Dla kontrastu, WYDCT, wywodzące się z tradycyjnej teorii medycyny chińskiej o "rozgrzewaniu yang i usuwaniu flegmy", wywiera kompleksowe efekty na regulację równowagi odpornościowej, zmniejszając stan zapalny dróg oddechowych oraz hamując przebudowę dróg oddechowych, co wykazano w badaniach klinicznych i eksperymentalnych20. Jego skład wieloskładnikowy może jednocześnie modulować polaryzację makrofagów, aktywację fibroblastów oraz uwalnianie cytokin, zapewniając szerszą i potencjalnie bardziej trwałą poprawę patologii astmy.
W tym badaniu ekstrakt wodny Wen Yang Ding Chuan Tang (WYDCT) został przygotowany z dwunastu ziół w stałym tradycyjnym stosunku, skoncentrowany do końcowego roztworu zapasowego o stężeniu 1 g/mL (odpowiednik surowego leku) i przefiltrowany do hodowli komórkowej. Ekstrakt zastosowano w stężeniach 50, 100 i 200 μg/mL, które zostały wybrane na podstawie wstępnych testów żywotności komórek, aby zapewnić niecytotoksyczność przy zachowaniu aktywności farmakologicznej. Model in vitro obejmował polaryzację makrofagów RAW264.7 indukowaną przez IL-4 makrofagów oraz współhodowlę z fibroblastami płuc myszy (komórkami L929), co pozwoliło ocenić wpływ makrofagów parakrynologicznych na aktywację fibroblastów i odpowiedzi związane z włóknieniem związane. Te szczegóły stanowią powtarzalne ramy dla przyszłych badań dotyczących charakterystyki dawka-odpowiedź oraz mechanistycznych szlaków WYDCT w przebudowie dróg oddechowych.
Na podstawie powyższych wyników spekulujemy, że Wen Yang Ding Chuan Tang wywiera swoje działanie przeciwprzebudowujące drogi oddechowe w astmie, hamując polaryzację makrofagów M2 i tłumiąc aktywację fibroblastów.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi, krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi humanitarnego traktowania zwierząt oraz zgodnie z odpowiednimi przepisami. Konkretnie, wszystkie procedury z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki Opieki nad Zwierzętami Trzeciego Szpitala Afiliowanego przy Qiqihar Medical College (AECC-2022-009). Myszy były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych z dostępem do jedzenia i wody ad libitum, a wszelkie wysiłki były dołożone, by zminimalizować cierpienie. Humanitarne punkty końcowe były ustalane i monitorowane przez cały czas badania.
1. Przygotowanie ekstraktu WYDCT
12 ziół Wen Yang Ding Chuan Tang ważono według tradycyjnego stosunku: Epimedium (15 g), przetworzona Efedra (10 g), żeń-szeń (15 g), Astragalus (15 g), Ginkgo biloba (15 g), Flos Farfarae (15 g), Pinella Mortter Morell (15 g), przetworzona Pinellia ternata (10 g), Schisandra chinensis (10 g), Dżdżownica (10 g), Persica (10 g), oraz lukrecję przetworzoną (10 g).
Dodano dziesięć razy większą objętość wody destylowanej i gotowano przez 30 minut. Ekstrakcja była powtarzana dwukrotnie, a filtraty łączono z nimi. Ekstrakt połączony został skoncentrowany pod obniżonym ciśnieniem do stężenia równoważnego surowego leku wynoszącego 1 g/mL. Ekstrakt był filtrowany przez membranę o pojemności 0,22 μm, alicytat i przechowywany w temperaturze −20 °C. Stężenia robocze (50, 100 i 200 μg/mL) przygotowywano przez rozcieńczenie tuż przed użyciem.
2. Hodowla komórkowa i polaryzacja M2
Komórki RAW264.7 (ATCC, USA) zostały rozmrożone i zasiane z gęstością 1 × 10⁶ komórek na naczynie o pojemności 10 cm w 10 mL DMEM uzupełnionym o 10% surowicę płodową bydła, 100 U/mL penicylinę oraz 100 μg/mL streptomycynę. Komórki inkubowano w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO₂ przez 24 godziny, aż osiągnięto konfluencję 80%-90%.
Następnie pożywka hodowla została zastąpiona świeżym DMEM zawierającym 20 ng/mL IL-4, a komórki były inkubowane przez dodatkowe 24 godziny, aby wywołać polaryzację M2. Po inkubacji komórki były dwukrotnie myte PBS, a następnie traktowane ekstraktem WYDCT (roztwór 10 mg/mL rozcieńczony do wskazanych końcowych stężeń) przez 24 godziny. W eksperymentach suplementacji IL-6 dodano 50 ng/mL IL-6 podczas leczenia WYDCT.
Komórki leczone 0,1% DMSO pełniły rolę kontroli negatywnej. Morfologia komórkowa była badana pod mikroskopem odwróconym, a reprezentatywne obrazy zostały uchwycone.
3. Izolacja i hodowla fibroblastów płuc myszy
Myszy zostały uśpione zgodnie z zatwierdzonymi protokołami etycznymi. Płaty płuc zostały zebrane i umieszczane w zimnym zrównoważonym roztworze soli Hanksa. Widoczne naczynia krwionośne i tkanka łączna zostały usunięte, a tkanka płuc podrobniona na małe kawałki (~1 mm3).
Fragmenty tkanek trawiono w stężeniu 0,25% trypsyny przez 40 minut w temperaturze 37 °C z delikatnym mieszaniem, po czym nastąpiło drugie trawienie z 0,25% trypsyną przez 30 minut. Zawiesina komórkowa była odwiana w 300 × g przez 5 minut, odrzucano supernatant, a pellet ponownie zawieszono w DMEM uzupełnionym o 10% surowicę płodową bydła.
Zawiesina była inkubowana przez 100 minut, aby fibroblasty mogły się przykleić, po czym komórki ponownie wirowano w 300 × g przez 5 minut, aby zwiększyć oczyszczanie. Oczyszczone fibroblasty zostały zasiewane do odpowiednich płytek hodowlanych i inkubowane w temperaturze 37 °C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO₂, aż osiągnięto około 80% konfluencji.
4. Współhodowla fibroblastów z warunkowanym podłożem
Supernatant pobierano z obtworzonych komórek RAW264.7 i wirowano w dawce 3000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Nośnik fibroblastowy został zastąpiony zebranym podłożem kondycjonowanym makrofagiem. Fibroblasty inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% CO₂ przed przeprowadzeniem testów funkcjonalnych. Po inkubacji pobrano fibroblasty do ekstrakcji RNA i białek do kolejnych analiz qRT-PCR oraz Western blot.
5. Żywotność komórek (test CCK-8)
Fibroblasty były zasiewane z gęstością 5 × 10³ komórek na odwiert w płytach 96-dołkowych zawierających 100 μL pożywki hodowlanej. Komórki poddawano wskazanym zabiegom przez 24 godziny. Następnie do każdego otworu dodano 10 μL odczynnika CCK-8, a płytki inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Gęstość optyczna (OD) została zmierzona na poziomie 450 nm za pomocą czytnika mikropłyt. Żywotność komórek obliczono jako (OD_treated / OD_control) × 100%. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z użyciem trzech biologicznych replik.
6. Test formowania kolonii
Komórki były zasiane z gęstością 1 × 10³ komórek na odwiert w płytach 6-dołkow, przy czym na każde warunki trzy dołki replikacyjne. Płyty były inkubowane przez 10-14 dni, aż pojawiły się widoczne kolonie. Kolonie były barwione 0,1% kryształowym fioletem przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po barwieniu kolonie zostały umyte i sfotografowane. Barwnik związany był rozpuszczany w kwasie octowym 30% przez 15 minut, a gęstość optyczna mierzono na poziomie 590 nm. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty.
7. Badanie proliferacji EdU
Komórki były leczone zgodnie z wskazaniami przez 24 godziny. Następnie do każdego otworu dodano 100 μL 50 μM EdU, a komórki były inkubowane przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Komórki były utrwalane w 4% paradehydu przez 30 minut i hartowane 2 mg/mL glicyny przez 5 minut. Komórki zostały przepermeabilizowane 0,5% Tritonem X-100 w PBS, przemyte i inkubowane roztworem barwienia Apollo przez 30 minut. Jądra były barwione Hoechst 33342 (1×) przez 30 minut. Komórki EdU dodatnie były obserwowane i obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
8. ELISA dla IL-6
Supernatant ogniwa RAW264,7 był wirowany w dawce 3000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Poziomy IL-6 mierzono za pomocą zestawu Beyotime ELISA zgodnie z instrukcjami producenta. Absorpcję mierzono za pomocą czytnika mikropłyt, a stężenia IL-6 obliczono na podstawie standardowej krzywej.
9. Immunofluorescencja
Fibroblasty utrwalano w wcześniej schłodzonym acetonie na 10 minut i myto trzykrotnie PBS. Komórki były przepuszczane 0,1% Triton X-100 przez 10 minut i blokowane 1% BSA w PBS przez 30 minut. Komórki były następnie inkubowane z pierwotnym przeciwciałem przeciwko PCNA (1:100) przez noc w temperaturze 4 °C. Po trzech myciach PBS komórki były inkubowane przeciwciałem wtórnym sprzężonym z FITC (1:200) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Jądra były kontrbarwowane DAPI, myte i obrazowane mikroskopem fluorescencyjnym.
10. qRT-PCR
Całkowite RNA zostało wyekstrahowane za pomocą odczynnika Trizol (Beyotime, Chiny) zgodnie z protokołem producenta. Transkrypcja odwrotna została przeprowadzona za pomocą zestawu syntezy cDNA przy użyciu 2 μg RNA oraz przypadkowych primerów. Reakcje PCR przygotowywano w objętości 20 μL zawierającej 10 μL SYBR Green Master Mix, 0,5 μL każdego gene-specyficznego primeru (końcowe stężenie 0,5 μM) oraz 1 μL matrycy cDNA. Używano starterów m.in. CD16, iNOS, Arg-1, CD206, fibronektyny, COL1A1, α-SMA oraz GAPDH (podane sekwencje).
Warunki cyklicznego termicznego polegały na początkowej denaturacji w 95 °C przez 5 minut, następnie 40 cyklach 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s oraz 72 °C przez 30 s. Analiza krzywej topnienia została przeprowadzona w zakresie od 60 °C do 95 °C w krokach 0,5 °C, aby zweryfikować specyficzność amplifikacji.
Analiza danych: Wyrażenie względne zostało obliczone metodą 2^−ΔΔCT i znormalizowane do GAPDH. Primery były następujące: CD16 (mysz): 5′- AGGAGCTGAGGAGGAGAGGAGGAGG-3′ i 5′- TGAGGAGGAGGAGGAGGAGC-3′, iNOS (mysz): 5′-TGCTCCCCAGGAGATGTGT-3′ oraz 5′-TGGTCTGGTAGGCTGTACGG-3′, Arg-1 (mysz): 5′- GCTCCAGGAGATGTGTGTGTAGGG-3′, Arg-1 (mysz): 5′- GCTCTCCAGGAGATGTGTGTGTGT-3′ gctgctgctgctgctgctg-3′ i 5′- GGTGGCTTTGCTGGTGTGTGTC-3′, CD206 (mysz): 5′- GGCTTCTATGAGCTGTGTGA-3′ oraz 5′- CTGGGCTTCTGGATGTGTTGTT-3′, fibronectin (mysz): 5'-CGTGGTGAAGGTGTTTCTGC-3' oraz 5& #39;-GAGGTCAGTGGTTTCTT-3', COL1A1 (mysz): 5'-CCCTGGACACCTGGCTTT-3' oraz 5'-GCGGGTCACCTTCTCTTCTC-3', α-SMA (mysz): 5'-CTGGAACAGCACAGCTTCTC-3' oraz 5'-GGGACATAGCACAGCTTCTC-3', GAPDH (mysz): 5′- TGTGTCCGTCGTGGATCTGA -3′ oraz 5′- CCTGCTTCACCACCTTCTTTGAT-3′.
11. Western blot
Komórki były lizowane za pomocą inhibitorów proteazy zawierających bufor RIVA. Stężenia białek określono za pomocą testu BCA. W SDS-PAGE do każdej ścieżki żelu poliakrylamidowego załadowano 60 μg białka i rozdzielano pod napięciem 120 V przez 1,5-2 godziny. Białka były przenoszone na membranę PVDF metodą mokrego transferu przy napięciu 100 V przez 1 godzinę. Po zablokowaniu przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę mlekiem beztłuszczowym w TBS-T, błona była inkubowana przez noc z pierwotnymi przeciwciałami (rozcieńczenie 1:1000) w temperaturze 4 °C. Po płukaniu TBS-T błona była inkubowana przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP (rozcieńczenie 1:5000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po kolejnych płukaniach wykryto pasma białkowe za pomocą odczynnika chemiluminescencyjnego ECL i zobrazowano za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego. Intensywności pasmowe zostały zmierzone za pomocą oprogramowania ImageJ, a poziomy białek znormalizowano do GAPDH jako wewnętrznej kontroli.
12. Analiza statystyczna
Dane zostały przeanalizowane za pomocą SPSS 17.0. Zmienne ciągłe wyrażano jako średnią ± odchylenie standardowe (SD). Porównania między dwiema grupami przeprowadzono za pomocą niesparowanego testu t, natomiast porównania między wieloma grupami stosowano za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu post hoc LSD. Wartość p poniżej 0,05 uznano za istotną statystycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wpływ WYDCT na polaryzację makrofagów komórek M2 w RAW264.7
Obserwowaliśmy morfologię komórek RAW264.7 za pomocą mikroskopu świetlnego. Jak pokazano na rysunku 1A, stymulacja IL-4 powodowała wydłużenie komórek, co skutkowało bardziej wydłużonym, wrzecionowatym kształtem w porównaniu z komórkami nieleczonymi. Dodatkowo komórki stymulowane IL-4 wykazywały zwiększoną ziarnistość cytoplazmatyczną i lepszą przyczepność do substratu hodowlanego. Te zmia...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Celem tego badania było zbadanie wpływu WYDCT na aktywność fibroblastów i przebudowę dróg oddechowych w astmie, a także mechanizmów leżących u podstaw. Obecne wyniki pokazują, że WYDCT może hamować polaryzację makrofagów RAW264.7 przez M2, co wpływa na żywotność, proliferację i włóknienie fibroblastów płuc myszy. Ponadto szlak sygnalizacyjny IL-6/STAT3 odegrał kluczową rolę w pośredniczeniu tych efektów.
Polaryzacja makrofagów jest kluczowym procesem w patogenezie astmy i włóknienia
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Serdecznie dziękujemy wszystkim partnerom, którzy przyczynili się do tego projektu badawczego. Prace te zostały wsparte przez Uniwersytet Podstawowy Koszt Badań Naukowych w prowincji Heilongjiang w 2022 roku (nr 2022-KYYWF-0827), za co jesteśmy wdzięczni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Hybrydyzacyjny reagent Apollo 643 | Guangzhou RiboBio Co., Ltd. | C10371-2 | |
| Arginaza-1 (E4U1I) mysz mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 43933T | |
| Zestaw do określania stężenia białek BCA | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | P0012 | |
| BeyoBlot HRP-sprzężona mysz antykrólicza, rodzima IgG (H+L) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | A0210 | |
| Inkubator dwutlenku węgla | Shanghai Lishen Scientific Equipment Co., Ltd. | HF240 | |
| CD206/MRC1 (E6T5J) XP® Rabbit mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 24595T | |
| Zestaw do liczenia komórek-8 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C0037 | |
| COL1A1 (E8F4L) XP Rabbit mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 72026T | |
| Dimetylsulfenoxid | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | ST038-100ml | |
| Medium o wysokiej zawartości cukru DMEM | Firma Biologiczna Grand Island | 11965092 | |
| EDU | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | ST067-250mg | |
| Fcγ RIII/CD16 (F6K6G) Królik mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 71345T | |
| Serum łydki płodu | Firma Biologiczna Grand Island | A5256701 | |
| Przeciwciało fibronektyna/FN1 | Cell Signaling Technology, Inc | 63779S | |
| IgG (H+L) sprzężony z kozą z FITC | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | A0568 | |
| Fluorescencyjne ilościowe urządzenie PCR | Yarui Biotechnology Co., Ltd. | MA-6000 | |
| Hoechst 33342 Roztwór do barwienia komórek żywych (100X) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | C1029 | |
| iNOS (E1W4J) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 70706 SF | |
| Mikroskop odwrócony | Guangzhou Mingmei Optoelectronics Technology Co., Ltd. | MI52-N | |
| LRRK2 T1348N mut RAW 264.7 | ATCC | SC-6005 | |
| mmunostaining Permeabilization Buffer (z Tritonem X-100) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | P0096-100ml | |
| Zestaw ELISA IL-6 Mouse | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | PI326 | |
| Mysie komórki fibroblastów płucnych | Wuhan Procell Life Technology Co., Ltd. | CP-M006 | |
| PCNA (PC10) Mysz mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 2586T | |
| Penicylina-streptomycyna | Firma Biologiczna Grand Island | 15140148 | |
| Rekombinowany Murine IL-4 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | P5916-5μ g | |
| Rekombinowany Murine IL-6 | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | P5925-10μ g | |
| Urządzenie do etykietowania enzymu redu | Rayto Life Sciences | RT-6100 | |
| Stat3 (124H6) Mysz mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 9139T | |
| Superclean bench | Jinan BioBase Biotech Co., Ltd. | BBS-SDC | |
| SynGAP-α 2 (E4Y6I) królik mAb | Cell Signaling Technology, Inc. | 56927T | |
| Thermo Fisher Scientific Liza i Bufor Ekstrakcyjny RIPA | ThermoFisher | 89901 | |
| Trizol (Całkowity odczynnik do ekstrakcji RNA) | Beyotime Biotechnology Co., Ltd. | R0016 | |
| β-Przeciwciało aktynowe | Cell Signaling Technology, Inc. | 4967S |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.