Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oralna gavacja u noworodkowych myszy i funkcjonalna ocena integralności bariery jelitowej za pomocą komór

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69751

⸱

9 stycznia 2026

 ,  ,  , 
1INSERM U1149, Center of Research on Inflammation, Université Paris Cité, 2CHRU Nancy, IHU Infiny

W tym artykule

Podsumowanie

W tym artykule opisano: (1) dostarczanie cząsteczek testowych do noworodków już od DOL 6; oraz (2) ocenę ex vivo funkcji bariery nabłonkowej okrężnicy w biopsjach od DOL 10 do młodych odstawianych od odstawienia (DOL 20) poprzez ocenę przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej za pomocą komór Ussinga.

Streszczenie

Rosnące dowody podkreślają znaczenie pierwszych 1000 dni życia w kształtowaniu osi jelit-mikrobiom. To okno wczesnego życia jest kluczowe dla wyznaczania długoterminowych trajektorii fizjologicznych i adaptacji immunologicznych, potencjalnie wpływając na podatność na choroby związane z dysbiozą i dysfunkcją bariery. Głębsze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw wymaga kompleksowej oceny kluczowych parametrów fizjologicznych, w tym przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej jelita noworodkowego. Ocena tych parametrów jest kluczowa, aby wyjaśnić, jak wczesne narażenie na cząsteczki obce może wpływać na integralność jelit i długoterminowe wyniki zdrowotne. Dlatego pierwsza część tego artykułu opisuje doustne podawanie interesujących cząsteczek u młodych myszy już od wieku 6 lat, przy jednoczesnym minimalizowaniu stresu, ryzyka urazów i kanibalizmu. Do odcinania szczeniąt o wadze co najmniej 2,5 g używa się nawilżonych, zaokrąglonych igieł karmowych 24 g. Druga część przedstawia ocenę per vivo przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej z wykorzystaniem testów komorowych Ussinga na próbkach okrężnicy od młodych od DOL-10 do odstawienia. Bezszpilkowe slidery przystosowane do małych biopsji są stosowane w połączeniu z komorami Ussinga do montażu próbek okrężnicy noworodkowej. Na początku badania do przedziału wierzchołkowego układu dodaje się parakomórkowy sonda FITC-Dextran 4 kDa 4 kDa oraz transkomórkowy marker peroksydaza chrzanowa typu VI na początku badania. Próbki pobierane są w przedziale bazolateralnym w czasie 0 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, aby ilościowo określić przejście sondy. Przejście obu markerów jest ilościowe bezpośrednio (FITC) i pośrednio (HRP) za pomocą czytnika płyt, obliczane za pomocą krzywych standardowych i wyrażane jako strumień.

Wprowadzenie

Integralność bariery jelitowej odgrywa fundamentalną rolę w utrzymaniu ogólnego zdrowia poprzez koordynację odpowiedzi immunologicznej błony śluzowej oraz regulację selektywnej przepuszczalności nabłonka jelitowego. Ten system barierowy kontroluje przepływ składników odżywczych, jednocześnie zapobiegając translokacji patogenów, antygenów i toksyn do ogólnoustrojowego krążenia1. Przewlekłe zaburzenia tego interfejsu, związane ze zwiększoną przepuszczalnością jelit, powszechnie nazywane "przeciekającym jelitem", są obecnie identyfikowane nie tylko jako konsekwencja, ale także jako czynnik napędzający przewlekłe stany zapalne oraz szereg patologii pozajelitowych2.

Na przykład wykazano, że osłabiona funkcja bariery jelitowej jest kluczowym składnikiem chorób autoimmunologicznych i metabolicznych, takich jak zapalne choroby jelit (IBD), młodzieńcze idiopatyczne zapalenie stawów (JIA) oraz cukrzyca typu 1 (T1D). Podkreśla to stan bariery jelitowej jako kluczowy biomarker, ale także jako cel terapeutyczny, aby zapobiec jak najwcześniejszemu rozpoczęciu procesów patofizjologicznych oraz zapobiec postępowi ostrego stanu zapalnego do stanu przewlekłego 3,4,5,6.

W tym kontekście okres noworodkowy stanowi unikalne i bardzo wrażliwe okno rozwoju, podczas którego ustanowienie i dojrzewanie interfejsu jelita z mikrobiotą głęboko wpływa na całe życie na zdrowie jelit i układu7. Na tym wczesnym etapie nabłonek jelit i układ odpornościowy wykazują zwiększoną wrażliwość zarówno na czynniki endogenne, jak i egzogenne, przechodząc szybki wzrost i różnicowanie, jednocześnie adaptując się do kolonizacji mikroorganizmów i zmian żywieniowych. Zakłócenia osłabiające integralność bariery jelitowej w tym kluczowym oknie rozwojowym mogą odegrać kluczową rolę w pojawieniu się szerokiego spektrum ostrych i przewlekłych chorób w późniejszym życiu. Do tych schorzeń należą choroby immunologiczne, takie jak alergia pokarmowa, oraz poważniejsze choroby przewlekłe, takie jak IBD, JIA i T1D 7,8,9. Choroby te podkreślają, że procesy patofizjologiczne często pojawiają się wcześnie, ponieważ pierwotny początek zwykle następuje między dzieciństwem a wczesną dorosłością10,11. Dlatego zrozumienie mechanizmów regulujących funkcjonowanie bariery jelitowej u noworodków jest niezbędne do opracowania strategii profilaktycznych i terapeutycznych mających na celu zmniejszenie obciążenia wieloma chorobami przewlekłymi.

W tym kontekście istnieje pilna potrzeba wiarygodnych, fizjologicznie istotnych narzędzi do badania integralności bariery jelitowej, mechanizmów chorób przewlekłych oraz stanów zapalnych, szczególnie w środowisku neonatologicznym. Takie narzędzia muszą umożliwiać replikację eksperymentalnych testów już udowodnionych w kontekście dorosłych, nie tracąc przy tym precyzji i skuteczności. Dodatkowo, coraz pilniejsze staje się badanie zarówno krótkoterminowych, jak i długoterminowych efektów wielu interesujących nas kandydatów molekularnych, które mają mieć korzystny lub szkodliwy wpływ na homeostazę jelit w kontekście noworodkowym. Wśród dostępnych narzędzi doustne podawanie gavage u noworodkowych myszy stanowi bardzo wiarygodną metodę dostarczania interesujących cząsteczek na określonym etapie rozwoju. Umożliwia kontrolowane badania wpływu różnych związków bioaktywnych, leków lub metabolitów mikroorganizmów na dojrzewanie jelit i funkcję bariery.

Pierwsza część tego artykułu opisuje metodę oddawania młodych myszy już od Day Of Life (DOL) 6, umożliwiającą badanie interwencji przed, w trakcie i po masowym rozszerzeniu liczby gatunków mikrobioty jelitowej wywołanej dywersyfikacją żywności. Dzięki temu technika ta umożliwia analizy podłużne wpływu leczenia na zdrowie jelit w miarę wzrostu i rozwoju młodych.

W drugiej części tego artykułu, uzupełniając to podejście, ex vivo ocena funkcji bariery nabłonkowej okrężnicy okrężnicowej z wykorzystaniem komór Ussinga dostarcza czułej i ilościowej miary charakterystyki przepuszczalności. Ocena przepuszczalności zarówno parakomórkowej, jak i transkomórkowej w biopsjach jelita grubego u noworodków myszy (np. młodych DOL 10) pozwala precyzyjnie określić wpływ kilku kluczowych kandydatów na integralność i funkcjonowanie bariery nabłonkowej. Transport parakomórkowy to zasadniczo pasywny mechanizm zachodzący w przestrzeni międzykomórkowej warstwy nabłonkowej. Pozwala na przepuszczenie małych substancji rozpuszczonych przez gradienty elektrochemiczne i osmotyczne z lumenu do strony bazolateralnej. Mechanizm ten jest głównie regulowany przez białka z rodziny złączy ścisłych, takie jak klaudyny i okklidyny. Transport transkomórkowy, w przeciwieństwie do tego, jest aktywnym mechanizmem, umożliwiającym wchłanianie większych substancji rozpuszczonych i zachodzącym przez komórki nabłonkowe za pośrednictwem określonych kanałów, nośników i pomp.

Fluoresceinowy izotiocjanian (FITC)-dekstran (4 kDa) przeważnie podlega transportowi parakomórkowemu ze względu na swój rozmiar, podczas gdy nadtlenek chrzanu (HRP; 44 kDa) jest selektywnie przekazywany na stronę bazolateralną drogami transkomórkowymi. Ilościowa identyfikacja tych nieendogennych markerów umożliwia zatem odrębną ocenę przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej, odpowiednio. Test komory Ussinga z FITC i HRP zachowuje architekturę tkanek i umożliwia pomiar w czasie rzeczywistym odpowiednio przepuszczalności parakomórkowej i transkomórkowej dowolnego odcinka przewodu jelitowego. To połączenie analizy komory noworodkowej i komory Ussinga oferuje potężną strategię badania, jak konkretne cząsteczki wpływają na funkcjonowanie bariery jelitowej zarówno natychmiast, jak i przez dłuższy czas, dostarczając strategii łagodzenia stanu zapalnego i zapobiegania chorobom przewlekłym od najwcześniejszych etapów życia.

Podsumowując, protokół ten opisuje dwie uzupełniające się procedury eksperymentalne umożliwiające: (1) podanie cząsteczek interesujących w okresie wczesnym noworodkowym u młodych myszy (krok 1); (2) ocenę zarówno przepuszczalności parakomórkowej, jak i transkomórkowej w segmentach przewodu jelitowego od noworodków do odstawiających młode za pomocą komór Ussinga (kroki 2-6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt przeprowadzono zgodnie z obowiązującymi krajowymi przepisami i zatwierdzono przez francuskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego, Badań i Innowacji za pośrednictwem platformy APAFIS (numer autoryzacji: APAFIS#23855) oraz grantów z Agence Nationale pour la Recherche (ANR): 11-IDEX-0005-02, ANR-24-CE15-7152 oraz 18-IDEX-0001. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Gavage noworodkowych myszy

UWAGA: Poniższa metoda została zaadaptowana z Francis i in.12. Podczas gdy pierwotny protokół zezwalał na odstraszanie myszy już od DOL 2, tutaj nie wykonywano gavage przed DOL 6, ponieważ wymagania techniczne w młodszym wieku znacznie utrudniają zabieg. Ponadto wykorzystywanie młodszych młodych utrudnia badania, ponieważ zwiększa ryzyko utraty zwierząt w pierwszych dniach leczenia, co wymaga większych grup.

  1. Przygotowanie i montaż rozwiązań gavage
    1. Waż każdego szczeniaka osobno.
    2. Dostosuj stężenie i objętość roztworu gavage tak, aby całkowita objętość nie przekraczała 20 μL na gram masy ciała.
      UWAGA: W standardowych warunkach młode myszy rzadko ważą mniej niż 2,5 g przy DOL 6.
    3. Przemyj igłę do podawania o pojemności 24 g z okrągłym końcówką, dokładnie ją przepłukuj wodą dejonizowaną, następnie podaj 70% etanolu strzykawką, a następnie autoklaw.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie osobnej igły do karmienia dla każdej grupy leczenia, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu.
    4. Połóż czyste ręczniki papierowe na zdezynfekowanej poduszce grzewczej, ustawionej na ~38 °C.
    5. Przed otwarciem klatek dla zwierząt myj rękawice w 70% etanolu, aby ograniczyć przenoszenie zapachów do szczeniąt i zmniejszyć ryzyko kanibalizacji.
    6. Przenieś matkę do osobnej klatki w innym pomieszczeniu, aby ograniczyć stres spowodowany możliwymi wokalizacjami szczeniąt.
    7. Pocieraj czyste rękawiczki materiałami do gniazdowania, aby ograniczyć ryzyko przenoszenia zewnętrznych zapachów na szczenięta podczas gavage.
    8. Zmierz długość między wyrostkiem keksfoidalnym (dolny koniec mostka) a pyskiem szczeniaka, aby oznaczyć maksymalną długość włożenia na igłę karmiącą (rysunek 1A,B).
  2. Śródprzełykowa gavage u młodych myszy
    1. Przymocuj główkę igły do strzykawki w sposób sterylny i pobierz więcej niż pożądana objętość roztworu gavage, aby podać całą wymaganą objętość bez ryzyka powstawania pęcherzyków powietrza, ponieważ znacznie zwiększają one ryzyko zachłysu.
      UWAGA: Alternatywnie, wyciągnij roztwór gavage, a następnie usuń pęcherzyki powietrza ze strzykawki, odwracając ją, ciągnąc tłok i ponownie wyciągając powietrze z lufy strzykawki. Następnie ustaw objętość roztworu gavage na dokładną objętość, którą należy podać.
    2. Kciukiem i palcem wskazującym niedominującej dłoni delikatnie uszczypnij skórę między łopatkami, aby unieść szczeniaka.
      UWAGA: Nie odrywaj zbyt dużej ilości skóry z grzbietu szczeniaka, ponieważ może to spowodować uduszenie.
    3. Trzymaj szczeniaka niemal poziomo i delikatnie wprowadzaj igłę do jamy ustnej, przesuwając ją prostopadle do gardła aż do tyłu gardła (Rysunek 1C).
    4. Zachowując ten sam kąt i głębokość, przesuń igłę w prawą lub lewą część jamy ustnej, aby uniknąć dotyku języka.
    5. Powoli reguluj kąt igły, delikatnie przechylając głowę szczeniaka do tyłu, aż strzykawka, główka i plecy będą wyrównane, z główką lekko pochyloną do tyłu (Rysunek 1D).
    6. Bez wywierania nacisku pozwól strzykawce powoli opaść pod własnym ciężarem, aż maksymalny punkt włożenia zbliży się do poziomu pyska (Rysunek 1E).
      UWAGA: Jeśli napotkasz opór, delikatnie obróć strzykawkę, przesuwając ją tam i z powrotem między palcami, aby ułatwić zejście. Jeśli strzykawka nadal nie przesuwa się do przodu, spróbuj zmienić kąt włożenia lub wznowić zabieg za pomocą igły do podawania nawilżonej roztworem gavage. Igła nie powinna pozostawać włożona dłużej niż 20 sekund, aby uniknąć uduszenia.
    7. Gdy osiągniesz lub zbliżysz się do maksymalnego znaku włożenia, szybko wydaj pożądaną objętość. Jeśli podczas podawania objętości napotkano opór, sprawdź ustawienie główki strzykawki i nieznacznie dostosuj głębokość włożenia.
      UWAGA: Zaleca się szybkie podawanie objętości, ponieważ długotrwałe wbijanie igły znacząco zwiększa ryzyko uduszenia, szarpaniny i potencjalnych urazów zwierzęcia.
    8. Po podaniu odpowiedniej objętości delikatnie wyciągnij igłę pod tym samym kątem, co do włożenia.
    9. Połóż szczeniaka na ręczniku papierowym, który wcześniej położył na poduszce grzewczej, i obserwuj regenerację. Prawidłowy rytm oddechu powinien wrócić w mniej niż 20 sekund.
      UWAGA: Pojawienie się bąbelków z nosa lub pyska zwierzęcia wskazuje na aspirację i wymaga natychmiastowej eutanazji u młodszych niż DOL 14. Obecność bardzo małej ilości krwi w pysku zwierzęcia spowodowanej zmianą między gardłem a przełykiem wymaga monitorowania zwierzęcia, ale nie systematycznej eutanazji. Jeśli powrót do zdrowia szczeniaka jest niepewny, połóż go na boku. Jeśli nie spróbuje się wyprostować, natychmiast uśpij.
    10. Gdy potwierdzi się powrót do zdrowia zwierzęcia, umieść młodego z powrotem w gnieździe i zgrupuj je z matką.
      UWAGA: Do poziomu DOL 10 szczenięta mają niską ruchomość i mogą pozostać na poduszce grzewczej, dopóki nie zakończy się gavage wszystkich szczeniąt w klatce. Starsze szczenięta nie mogą pozostawać bez opieki na podłodzie, ponieważ mogą próbować uciec.

Rysunek 1
Rysunek 1: Gavage noworodkowego szczeniaka myszy przy DOL 10. Odległość między pyskiem a wyrostkiem ksyfoidalnym jest mierzona (A), co pozwala na oznaczenie maksymalnej długości włożenia na igle podającej (B). Igła do karmienia jest wprowadzana w lewą lub prawą część jamy ustnej (C). Gdy dotrze się do tylnej części gardła, kąt igły jest regulowany, aż strzykawka, główka i grzbiet zwierzęcia są ustawione (D). Igła może delikatnie przesuwać się w dół bez oporu, aż do osiągnięcia lub osiągnięcia maksymalnego znaku włożenia (E). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

2. Eutanazja młodych noworodków i pobranie jelita grubego

  1. Przeprowadzaj eutanazję przy użyciu odpowiednich metod wymaganych przez prawo krajowe.
    UWAGA: Zaleca się odcięcie głowy młodym do DOL 10 oraz zwichnięcie szyjki szyjnej u młodych w wieku wyższym niż DOL 10. Eutanazja z użyciemCO2 lub znieczulenia nie jest zalecana, ponieważ szczenięta wykazują dużą tolerancję na te metody.
  2. Umieść uśpione zwierzę pod mikroskopem obulocznym.
  3. Nałóż 70% etanolu na odwłok zwierzęcia.
  4. Za pomocą kleszczy uszczypnij skórę brzucha i podłożną otrzewną oraz wykonaj duże poprzeczne nacięcie brzucha za pomocą cienkich nożyczek (prostopadle do osi rostralno-ogonowo-ogonowej), nie przecinając jelit.
  5. Delikatnie włóż cienkie nożyczki do nacięcia i wyciągnij cięcie bocznie przez otrzewną po obu stronach.
  6. Za pomocą kleszczy i cienkich nożyczek rozciń zarówno górne, jak i dolne części otrzewnej, od okolicy piersiowej do dolnej części miednicy (rysunek 2A).
  7. Zidentyfikuj dalszą część jelita grubego i wykonaj nacięcie równoległe do jego osi, w kierunku odbytnicy.
  8. Zrób nacięcie w części końcowej/odbytniczej jelita grubego, aby je zmobilizować.
  9. Delikatnie pociągnij jelito grube i przesuwaj się w kierunku naszywki, usuwając potencjalne fragmenty tkanki łącznej lub tłuszczowej.
  10. Uwolnij jelito grube od odwłoka, przecinając w miejscu połączenia kościowo-kościowego, powyżej ostrego (Rysunek 2B).
  11. Usuń cecum oraz pierwsze kilka milimetrów okrężnicy bliższej, a następnie pobierz jedną do dwóch próbek z okrężnika bliższego okrężnika większe niż apertura suwaka Ussinga (rysunek 2C).
    UWAGA: Zaleca się przeprowadzenie dwóch dużych biopsji, ponieważ noworodkowa jelita jest niezwykle delikatna i łatwo może zostać rozerwana, rozcięta lub przebita podczas czyszczenia i montażu.
  12. Z zamkniętymi nożyczkami delikatnie usuń zawartość kału z spłaszczonej biopsji, delikatnie naciskając i przesuwając od końca bliższego do dalszego.
  13. Umieść opróżniony fragment jelita w lodowatym buforze KRB.

Rysunek 2
Rysunek 2: Sekcja jelita jelita DOL 10. Epidermis i otrzewna młodego są przecinane i otwierane w dwóch etapach, aby uniknąć mimowolnego nacięcia jelita grubego, aż do odsłonięcia całej jamy brzusznej (A). Jelita gruba jest uwalniana z jamy brzusznej przez pierwsze cięcie sekcji dystalnej/odbytniczej, a następnie drugie cięcie nad cekum (B). Początkowe milimetry okrężnicy bliższej są odrzucane, a pobierane są od jednej do dwóch próbek jelita większego niż apertura suwaków Ussinga (C). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Test przepuszczalności okrężnicy z wykorzystaniem biopsji myszy w komorach Ussinga

  1. Przygotowanie testu
    1. Dzień przed dniem eksperymentu Ussing. Aby zapewnić optymalne warunki testowania, zaleca się przygotowanie kilku roztworów dzień przed eksperymentem. Rozwiązania te są przygotowywane zgodnie z instrukcjami w Tabeli 1.
      UWAGA: poniższe tabele pokazują wymagane kwoty dla 12 komór Ussinga, przy czym KRB jest 10 razy znacznie wyższy, aby umożliwić alicytowanie.
      UWAGA: Roztwór KRB 10x można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 6-12 miesięcy.
    2. W dniu eksperymentu, 30 minut przed uśmiercieniem zwierząt:
      1. Przygotuj 400 mL bufora KRB, zgodnie z zaleceniami w Tabeli 2.
        UWAGA: KRB 10x, woda dejonizowana i wodorowęglan muszą być wstępnie wymieszane i bąbelkowane przy użyciu gazu węglowodanowego (95%O2; 5%CO2) przez 15 minut przed dodaniem CaCl2 , aby uniknąć opadów.
      2. Używając systemu węglowodanowego (95%O2; 5%CO2), bąbelkuj świeży bufor KRB przez 15 minut.
      3. Podziel 400 mL buforu KRB na dwie części i przygotuj 200 ml Krebs-Glucose, 200 mL Krebs-Mannitol oraz roztwór HRP, jak opisano w Tabeli 3.
    3. Konfiguracja systemu
      1. Podgrzej system Ussing do 37 °C.
      2. Złóż komory wstępnie w następujący sposób:
        1. Podnieś zatrzaski każdego szczeliny.
        2. Umieść komory w ich szczelinach, nie dokręcając systemu.
        3. Włóż dwie rurki gazowe do każdej części komór.
        4. Wprowadź cztery elektrody do przednich otworów (jeśli są dostępne – tutaj nie opisane) lub uszczelnij cztery otwory za pomocą stożków 200 μL wypełnionych klejem przed eksperymentem.
        5. Umieść tacy pod komorami, przewidując ewentualne przecieki.
      3. Montaż tkanek
        1. Lekko osusz wcześniej oczyszczoną próbkę jelita grubego ręcznikiem papierowym, aby usunąć nadmiar wilgoci.
        2. Umieść kawałek dwukropca pod lupą i bardzo delikatnie włóż jedno z ostrzy cienkich nożyczek do części świetlnej, aby ją rozciąć (rysunek 3A).
          UWAGA: Cięcie można wykonać jednym ruchem, gdy nożyczki są całkowicie włożone. Użyty fragment okrężnika musi być jak najbardziej prosty, unikając skrętu.
        3. Za pomocą cienkich kleszczy zamontuj tkankę na białej części suwaka, utrzymując luminalną część skierowaną w górę, w stronę operatora. Tkanka musi być wolna od śladów tłuszczu, kału, zmarszczek, perforacji i rozcięć oraz musi szeroko pokrywać otwór (Rysunek 3B).
        4. Zamknij suwak pod mikroskopem binokularnym i sprawdź możliwe przemieszczenie tkanki. Niewielka deformacja tkanki musi być widoczna przy nacisku na suwak, co wskazuje, że suwak jest szczelnie zamknięty.
          UWAGA: Zamontuj suwaki w komorze Ussinga (rysunek 4) i rozpocznij etap równoważenia indywidualnie, gdy tylko będzie gotowy, aby zapobiec odwodnieniu próbki.
        5. Utrzymując lekki nacisk na suwak, aby utrzymać go zamkniętego, włóż go do komory Ussinga, upewniając się, że lumen (przezroczysta część suwaka) jest skierowany w lewo.
        6. Zamknij oba zatrzaski i dokręć śrubę po prawej stronie, aż komora będzie szczelna i suwak nie będzie mógł się poruszać.
      4. Ostateczne przygotowanie i balans
        1. Dodaj 4 mL Krebs-Mannitolu do lewej (apikalnej) komory komory.
        2. Dodaj 4 mL glukozy Krebsa do prawej (bazolateralnej) komory komory.
        3. Umieść mały kawałek parafilmu między obiema przedziałami, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
        4. Otwórz wlot gazu (95%O2 / 5%CO2) i ustaw wylot między 1-2 bąbelkami na sekundę.
        5. Usuń wszelkie duże pęcherzyki znajdujące się na tkance lub w organizmie za pomocą pipety Pasteura.
        6. Pozwól systemowi się zbalansować przez 20-30 minut.
        7. Przygotuj roztwór FITC 4kDa + HRP + Mannitol zgodnie z Tabelą 4.
  2. Rozpoczęcie badania przepuszczalności okrężnicy
    1. Po osiągnięciu równowagi układu należy zastąpić 200 μL Krebs-Mannitolu z przedziału wierzchołkowego (po lewej) na 200 μL roztworu FITC 4Kd + HRP + Mannitol i natychmiast uruchomić timer. Umyć końcówkę, wykonując delikatne ruchy w komorze i odrzucać końcówkę między komorami.
    2. Dla każdej komory pobierz 2 x 100 μL (duplikaty) z przedziału podstawowego (prawego) i umieść objętości w czarnej płycie z 96 dołkami. Okryj płytkę folią aluminiową, aby uniknąć fotodegradacji obecnej na płycie FITC.
    3. Natychmiast zastąpić wcześniej zebrane 200 μL 200 μL świeżej glukozy Krebsa.
    4. Powtarzaj kroki (2) i (3) co 30 minut, aż osiągniesz punkt czasu 2 godzin, aby uzyskać punkty czasowe: T0, T30, T60, T90 i T120.
    5. Uszczelnij płytę folią aluminiową, aby uniknąć fotodegradacji FITC, a następnie przejdź do ilościfikacji FITC.
MgCl2 1M
MW (g/mol)Ostateczny wolumen = 20 mLOstateczna koncentracja
mili-Q H2OPrzejdź do ostatniego tomu
MgCl2, 6H2O203.34,066 g1 M
KRB 10X
MW (g/mol)Ostateczny tom = 1LOstateczna koncentracja
mili-Q H20Przejdź do ostatniego tomu
NaCl58.4470 g1,198 M
KCl74.553,4 g45,6 mM
Na2HPO4 , 2H2O177.991 g5,62 mM
NaH2PO4 , 2H2O156.012,3 g14,7 mM
MgCl2 1M5 mL5 mM
Wodorowęglan 750 mM
MW (g/mol)Ostateczny tom = 250 mLOstateczna koncentracja
mili-Q H2OPrzejdź do ostatniego tomu
NaHCO38415,75 g750 mM
CaCl2 2M
MW (g/mol)Ostateczny tom = 50 mLOstateczna koncentracja
mili-Q H2OPrzejdź do ostatniego tomu
CaCl211111,098 g2 M

Tabela 1: Przygotowanie roztworu dzień przed eksperymentem Ussing.

Bufor KRB (400 mL)
VolumyOstateczna koncentracja
KRB 10X40 mL1X
H2O (mili-Q)352 mL
Wodorowęglan 750 mM8 mL15 mM
CaCl2 2M240 μL1,2 mM

Tabela 2: Przygotowanie bufora KRB w dniu eksperymentu Ussing.

Krebs-glukoza/mannitol (200 mL każda)
Ostateczny woluminat = 200 mLOstateczna koncentracja
Bufor KRBPrzejdź do ostatniego tomu
Glukoza360 mg10 mM
lub
Mannitol364 mg10 mM
Rozwiązanie HRP
Ostateczny objętość = 1480 μLOstateczna koncentracja
Krebs-MannitolPrzejdź do ostatniego tomu
HRP13 mg8,8 mg/mL

Tabela 3: Przygotowanie roztworów glukozy Krebsa/mannitolu i HRP w dniu eksperymentu Ussinga.

Roztwór FITC 4kDa + HRP + mannitol
Dla 12 komnatVolumyOstateczna koncentracja
HRP (8,8mg/ml)1345 μL
Krebs-Mannitol1155 μL
FITC 4Kd166,6 mg16,66 mM

Tabela 4: Przygotowanie roztworu FITC 4 kDa + HRP + mannitol w dniu eksperymentu Ussinga.

Rysunek 3
Rysunek 3: Montaż próbki jelita grubego z DOL 9. Jedno ostrze nożyczek cienkich jest wkładane do segmentu świetlnego próbki, aby przeciąć go jednym ruchem (A). Otwarta próbka jest zamontowana na aperturze suwaka Ussinga, z stroną świetlną skierowaną w stronę operatora (B). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4
Rysunek 4: Zdjęcie w pełni przygotowanych komór Ussinga. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Ocena przepuszczalności parakomórkowej okrężnicy okrężnej za pomocą ilościowania FITC

  1. Przygotowanie do standardów FITC
    1. Rozcieńcz roztwór FITC 4Kd + HRP + Mannitol w Krebs-Glucose, aby przygotować standardowe rozcieńczenia opisane w Tabeli 5 i Rysunku 5.
    2. Na płytę nałóż 2 x 100 μL (duplikat) każdego standardowego rozcieńczenia od nr 1 do n°7. Uszczelnij płytkę folią aluminiową, aby chronić ją przed światłem do czasu rozpoczęcia odczytu płyty.
  2. Pozyskiwanie danych: Za pomocą czytnika płyt ustaw długość fali wzbudzenia na 485 nm i emisję na 535 nm i odczytuj płytę tak szybko, jak to możliwe.
    UWAGA: Zaleca się odczyt płyty zarówno z optymalnym wzmocnieniem, jak i ręcznie ustawionym wzmocnieniem, aby ułatwić porównanie wartości między płytami i umożliwić interpolację danych w przypadku błędu podczas rozcieńczeń standardów.
  3. Przechowywanie na płytach: Po zapisaniu danych ilościowych FITC, przechowywać płytki zamknięte folią aluminiową w temperaturze 4 °C na noc, jeśli w kolejnych dniach ma być przeprowadzona ilościowa ilościowa procedura HRP, lub zamrożone w temperaturze -80 °C na dłuższe przechowywanie.

Rysunek 5
Rysunek 5: Wizualna prezentacja przygotowania do rozcieńczeń standardu FITC. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rozcieńczenia standardowe FTIC
N°1234567
Rozcieńczenie1:10000 roztworu FITC stock1:2 rozcieńczenia nr 11:2 rozcieńczenia nr 21:10 rozcieńczenia nr 11:2 rozcieńczenia nr 41:2 rozcieńczenia nr 5
Krebs-Glukoza
FITC (μM)1.660.830.4150.1660.0830.04150

Tabela 5: Przygotowanie rozcieńczeń standardowych FITC w dniu eksperymentu Ussing.

5. Ocena przepuszczalności transkomórkowej okrężnicy za pomocą ilościowości HRP

  1. Dzień poprzedzający dzień testu ilościowego HRP:
    1. Zapewnij optymalne warunki w dniu badania; przygotowanie kilku roztworów jest wymagane dzień przed eksperymentem. Rozwiązania te są przygotowywane zgodnie z opisem w Tabeli 6.
      UWAGA: Poniższe tabele wskazują wymagane ilości dla jednej płyty 96-dołkowej. Standardy HRP mogą być alicytowane i przechowywane w temperaturze -20 °C lub -80 °C przez nawet kilka miesięcy. Ze względu na niestabilność używaj wyłącznie świeżych buforów węglanowych lub wodorowęglanowych.
    2. Po przygotowaniu roztworu przeciwciał anty-HRP natychmiast pokryj przezroczystą mikropłytkę Clear Flat Bottom High Binding o pojemności 100 μL na dołek o 96 dołkach. Owiń ją w folię aluminiową i inkubuj przez noc w 4 °C.
  2. W dniu testu ilościowego HRP:
    1. Przygotuj 5% bufor blokujący BSA, jak opisano w Tabeli 7.
    2. Wyrzuć zawartość talerza i przeprać 280 μL PBS Tween 4 razy, z 1 minutą potrząsania przy 350 obr./min między każdym myciem.
    3. Dodaj 200 μL bufora blokującego BSA do każdego otworu.
    4. Uszczelnij płytę folią aluminiową i inkubuj na shakerze przy 500 obr./min przez co najmniej 1 godzinę. W międzyczasie rozmrażaj i rozcieńczaj próbki (1:10 lub 1:50) oraz przygotowuj rozcieńczenia standardowe, jak opisano w Tabeli 8.
    5. Wyrzuć zawartość talerza i przeprać 280 μL PBS Tween 4 razy, z 1 minutą potrząsania przy 350 obr./min między każdym myciem.
    6. Dodaj 50 μL standardowych lub rozcieńczonych próbek, zamknij płytę i inkubuj w 300 obr./min przez 1 godzinę w RT.
    7. Podczas inkubacji przynieś odczynniki QuantaBlu do RT i przygotować roztwór roboczy zgodnie z Tabelą 9.
    8. Wyrzuć zawartość talerza i przeprać 280 μL PBS Tween 4 razy, z 1 minutą potrząsania przy 350 obr./min między każdym myciem.
    9. Do każdego otworu należy dodać 100 μL roztworu roboczego QuantaBlu przy RT lub 37 °C (średnio 1,5-90 min, 30 min).
      UWAGA: Postęp badania może być następowany pojawieniem się silnej niebieskiej fluorescencji pod wpływem źródła światła UV.
    10. Dodaj 100 μL roztworu QuantaBlu Stop do każdego dołku, aby zatrzymać aktywność nadoksydazy. Uszczelnij płytę i inkubuj przez 10 minut na RT pod mieszaniem przy 350 obr./min.
    11. Za pomocą czytnika płyt ustaw długość fali wzbudzenia na 315 nm i emisję na 470 nm. Przeczytaj tablicę jak najszybciej.
      UWAGA: Zaleca się odczyt płyty zarówno z optymalnym wzmocnieniem, jak i ręcznie ustawionym wzmocnieniem, aby ułatwić porównanie wartości między płytami i umożliwić interpolację danych w przypadku błędu podczas rozcieńczeń standardów. Alternatywnie dla zestawu QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate można stosować inne substraty peroksydazy, takie jak tetrametylobenzydyna (mierzone odpowiednio przy 450 lub 650 nm z użyciem lub bez roztworu stop), ale stosowanie tej alternatywy wiąże się z niższą czułością.
Rozwiązanie BSA
MW (g/mol)Ostateczny tom = 12,7 mLOstateczna koncentracja
Milli-Q H2OPrzejdź do ostatniego tomu
BSA664301,27 g100 mg/mL
Krebs-Glukoza + BSA
MW (g/mol)Ostateczny wolumin = 30 mLOstateczna koncentracja
Krebs-GlukozaPrzejdź do ostatniego tomu
Rozwiązanie BSA60 μL0,2 mg/mL
PBS Tween
MW (g/mol)Ostateczny wolumen = 500 mLOstateczna koncentracja
PBS 1XPrzejdź do ostatniego tomu
Tween-20500 μL0.1%
Sol węglanu sodu.
MW (g/mol)Ostateczny wolumen = 3,22 mLOstateczna koncentracja
Milli-Q H2OPrzejdź do ostatniego tomu
Na2CO3105.9934,13 mg0,1 M
Sol wodorowęglan sodu.
MW (g/mol)Ostateczny tom = 12,7 mLOstateczna koncentracja
Milli-Q H2OPrzejdź do ostatniego tomu
NaHCO384106,68 mg0,1 M
Powłoka buforowa pH 9,6
Ostatni tom ≈ 11 mL
Sol węglanu sodu.2,58 mL
Sol wodorowęglan sodu.Dodawaj, aż pH = 9,6 (~8,4 mL)
Standard HRP 10 μM
Początkowa koncentracjaOstateczny tom = 5 mLOstateczna koncentracja
Krebs-GlukozaPrzejdź do ostatniego tomu
Rozwiązanie HRP8,8 mg/mL50 μL0,088 mg/mL
Rozwiązanie BSA100 mg/mL10 μL0,2 mg/mL
Standard HRP 1,5 nM
Początkowa koncentracjaOstateczny wolumen = 15 mLOstateczna koncentracja
Krebs-GlukozaPrzejdź do ostatniego tomu
Standard HRP 2,0 μM0,088 mg/mL2,25 μL13,2 ng/mL
Rozwiązanie BSA0,2 mg/mL3 μL40 ng/mL
Roztwór przeciwciał anty-HRP
Początkowa koncentracjaOstateczny tom = 10 mLOstateczna koncentracja
Bufor powłokowyPrzejdź do ostatniego tomu
Przeciwciała przeciw HRP5,6 mg/mL8,93 μL5 μg/mL

Tabela 6: Przygotowanie roztworu dzień przed eksperymentem HRP.

Bufor blokujący BSA
Początkowa koncentracjaOstateczny wolumin = 25 mLOstateczna koncentracja
PBS 1X12,5 mL
Rozwiązanie BSA100 mg/mL12,5 mL50 mg/mL

Tabela 7: BSA blokujące przygotowanie bufora w dniu eksperymentu HRP.

StandardKrebs-Glukoza + BSAStandard HRP 1,5 nMFmol HRP/50 μL
Pusta1000 μL0 μL0
1993,75 μL6,25 μL0.09375
2987,5 μL12,5 μL0.1875
3975 μL25 μL0.375
4950 μL50 μL0.75
5900 μL100 μL1.5
6850 μL150 μL2.25
7800 μL200 μL3
8700 μL300 μL4.5
9600 μL400 μL6
10400 μL600 μL9
11200 μL800 μL12

Tabela 8: Standardowe przygotowanie HRP w dniu eksperymentu HRP.

Rozwiązanie robocze QuantaBlu
Ostateczny wolumen = 12 mL
Roztwór podłoża QuantaBlu10,8 mL
Roztwór nadtlenku stabilnego QuantaBlu1,2 mL

Tabela 9: Przygotowanie roztworu roboczego QuantaBlu w dniu eksperymentu HRP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Kwantyfikacja na podstawie krzywej standardowej i stężenia studni
Średnia wartość blanków była odejmowana od każdego wgłębienia płyty. Przy wartościach absorpcji na osi Y i stężeniach na osi X, utworzono standardową krzywą za pomocą funkcji "Interpoluj krzywą standardową" z GraphPad Prism. Jeśli wszystkie punkty standardowe są wyrównane, najlepsze wyniki daje model "liniowy". Alternatywnie, model "Sigmoidal, 4 PL, X to koncentracja" oferuje dużą elastyczność i dokładność dzięki nieliniowej interpolacj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Doustne gavage umożliwia powtarzane podawanie precyzyjnej, określonej dawki luminalnej pojedynczym noworodkowym myszom. Natomiast dobrowolne karmienie, choć jest realną alternatywą, wymaga dłuższego czasu podawania na zwierzę, aby dostarczyć niższą ilość związku i zmniejszoną precyzją dawkowania12. Ponadto doustny gavage przyjmuje większe ilości niż możliwe za pomocą iniekcji, co ułatwia wyższe całkowite dawki przy niższych stężeniach i minimalizuje potencjalną toksyczność przy podaniu

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konkurujących ze sobą interesów finansowych.

Podziękowania

Prace te zostały wykonane przy wsparciu finansowym ANR-11-IDEX-0005-02 Laboratoire d'excellence INFLAMEX, nagrody przyznanej przez Fondation de l'avenir (2025, AP-RM-24-012) oraz grantów ANR Diab1GUT (ANR-24-CE15-7152). Badanie zostało przeprowadzone w ramach konsorcjum INFIBREX i skorzystało z wsparcia planu inwestycyjnego "France 2030", uruchomionego przez rząd francuski i realizowanego przez Université Paris Cité w ramach programu "Initiative of Excellence" IdEx (ANR-18-IDEX-0001). Z wdzięcznością dziękujemy Ussing Chamber Technical Platform w Inflammation Research Center za ich nieocenione wsparcie oraz składamy szczególne podziękowania Alexandrze Willemtz i Maude Le Gall za ich fachową pomoc. Chcielibyśmy również wyrazić szczere podziękowania dla Platformy Obiektów Zwierząt w Centrum Badań nad Zapaleniem za ich niezbędne wsparcie, ze szczególnym podziękowaniem dla Isabelle Renault i Guillaume'a Anselmeta.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x DPBS bez Ca i Ca MgDulbeccos14200091
Przeciwciała przeciw HRPNordic BiositeGTX10183Monoklonalna peroksydaza chrzanowa IgG [2H11]
Lupa lornetkiOlympus SZ61Nie wymaga specyfikacji.
płytka z płytą 96 dołków o płaskim dnieThermoFisher Scientific137101Płytki muszą być czarne i dostosowane do odczytów fluorescencji. Pokrywka musi być zdjęta podczas czytania.
BSAMerckA4503
Myszy C57BL/6JRzeka Charles632C57BL/6J 
CaCl2Merck2382
Przezroczyste 96-dołkowe płaskie wiązanieCorning9018
D-(+)-glukozaMerckG8270 
Destylowany H2O
D-MannitolMerckM4125
Kleszcze cienkieFST11445-12
Fine ScissorsFST14058-09
FITC-Dextran 4KdFD4TdB LabsWrażliwy na fotodegradację.
Poduszka grzewczaMinerve20 031 01
HRPMerckP8375
MgCl2, 6H2OMerckM2670 
Milli-Q H2O
System i system EasyMount Ussing P2300 Izba IzbInstrumenty fizjologiczneEM6-C-CESystemy, komory i suwaki muszą być kompatybilne.
P2306 Suwak komory UssingInstrumenty fizjologicznePI-P2306Dostępne są różne modele suwaków dla różnych rozmiarów i form tkanek.
Zestaw podłoża QuantaBlu do fluorogenowej peroksydazyThermoFisher Scientific15169
Igły do karmienia wielorazowego użytku z okrągłym końcówkąFST18061-24Kaliber 24, średnica grotu 1,25 mm, końcówka okrągła. Trzeba go umyć sterylną wodą, poddać 70% etanolowi i poddać autoklawowi przed użyciem.
Wodorowęglan soduMerckS6297
Węglan soduMerckS7795
SpektrofotometrTECAN Spark 10MCzytnik tablic z możliwością pozyskania od góry jest wymagany, jeśli używa się 137101 czarnych płytek.
Tween-20MerckP7949

Bibliografia

  1. Di Vincenzo, F., Del Gaudio, A., Petito, V., Lopetuso, L. R., Scaldaferri, F. Gut microbiota, intestinal permeability, and systemic inflammation: A narrative review. Intern Emerg Med. 19 (2), 275-293 (2024).
  2. Mu, Q., Kirby, J., Reilly, C. M., Luo, X. M. Leaky gut as a danger signal for autoimmune diseases. Front Immunol. 8, 598(2017).
  3. Sorini, C., et al. Loss of gut barrier integrity triggers activation of islet-reactive T cells and autoimmune diabetes. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (30), 15140-15149 (2019).
  4. An, J., et al. The role of intestinal mucosal barrier in autoimmune disease: a potential target. Front Immunol. 13, 871713(2022).
  5. Picco, P., et al. Increased gut permeability in juvenile chronic arthritides: a multivariate analysis of the diagnostic parameters. Clin Exp Rheumatol. 18 (6), 773-778 (2000).
  6. Dunleavy, K. A., Raffals, L. E., Camilleri, M. Intestinal barrier dysfunction in inflammatory bowel disease: underpinning pathogenesis and therapeutics. Dig Dis Sci. 68 (12), 4306-4320 (2023).
  7. Borrego-Ruiz, A., Borrego, J. J. Early-life gut microbiome development and its potential long-term impact on health outcomes. Microbiome Res Rep. 4 (2), 20(2025).
  8. Di Costanzo, M., De Paulis, N., Biasucci, G. Butyrate: A link between early life nutrition and gut microbiome in the development of food allergy. Life (Basel). 11 (5), 384(2021).
  9. Kindgren, E., Ahrens, A. P., Triplett, E. W., Ludvigsson, J. Infant gut microbiota and environment associate with juvenile idiopathic arthritis many years prior to disease onset, especially in genetically vulnerable children. eBioMedicine. 93, 104654(2023).
  10. Borowitz, S. M. The epidemiology of inflammatory bowel disease: clues to pathogenesis. Front Pediatr. 10, 1103713(2023).
  11. Leete, P., et al. The effect of age on the progression and severity of type 1 diabetes: potential effects on disease mechanisms. Curr Diab Rep. 18 (11), 115(2018).
  12. Francis, F., et al. Probiotic studies in neonatal mice using gavage. J Vis Exp. (143), e59074(2019).
  13. McClain, R. M., et al. Neonatal mouse model: review of methods and results. Toxicol Pathol. 29 (Suppl), 128-137 (2001).
  14. Thomson, A., et al. The Ussing chamber system for measuring intestinal permeability in health and disease. BMC Gastroenterol. 19, 98(2019).
  15. Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
  16. Westerhout, J., Wortelboer, H., Verhoeckx, K. Ussing chamber. The Impact of Food Bioactives on Health: in vitro and ex vivo models. , (2015).
  17. Hempstock, W., Ishizuka, N., Hayashi, H. Functional assessment of intestinal tight junction barrier and ion permeability in native tissue by Ussing chamber technique. J Vis Exp. (171), e62468(2021).
  18. Sjögren, E., Eriksson, J., Vedin, C., Breitholtz, K., Hilgendorf, C. Excised segments of rat small intestine in Ussing chamber studies: A comparison of native and stripped tissue viability and permeability to drugs. Int J Pharm. 505 (1), 361-368 (2016).
  19. Moussaoui, N., et al. Changes in intestinal glucocorticoid sensitivity in early life shape the risk of epithelial barrier defect in maternal-deprived rats. PLoS One. 9 (2), e88382(2014).
  20. Gleeson, J. P., et al. The enhanced intestinal permeability of infant mice enables oral protein and macromolecular absorption without delivery technology. Int J Pharm. 593, 120120(2021).
  21. Birchenough, G. M. H., et al. Postnatal development of the small intestinal mucosa drives age-dependent, regio-selective susceptibility to Escherichia coli K1 infection. Sci Rep. 7 (1), 83(2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przepuszczalność jelita grubegotest z FITC-dekstranemperoksydaza chrzanowaprzepuszczalność parakomórkowaprzepuszczalność transkomórkowaterapeutyki mikroRNA
Oralna gavacja u noworodkowych myszy i funkcjonalna ocena integralności bariery jelitowej za pomocą komór
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.