Uproszczona metoda transformacji Phytophthora palmivora za pośrednictwem bakterii agrobakterii

Podsumowanie

Przedstawiamy prosty, skuteczny i powtarzalny protokół transformacji Phytophthora palmivora, pośredniczonego przez Agrobacterium, który jest również stosowany do P. capsici.

Streszczenie

Phytophthora to rodzaj oomycetów, który zawiera liczne niszczycielskie patogeny roślinne, wśród których jest gatunek o szerokim zasięgu żywiciela P. palmivora. Genomika funkcjonalna Phytophthora była ograniczona przez ograniczoną dostępność solidnych, łatwych do wdrożenia metod transformacji. Spośród dostępnych podejść szczególnie atrakcyjna jest transformacja mediowana przez Agrobakterie (AMT), ponieważ wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu i często generuje stabilne transformanty przy wszczepieniu genu z pojedynczą kopią. Większość protokołów AMT do transformacji grzybów i oomycetów wykorzystuje minimalną ilość soli medium (MM) w indukcji i współhodowli Agrobacterium . Przygotowanie tych mediów zazwyczaj polega na przygotowywaniu i mieszaniu wielu roztworów bulionowych, z których niektóre zawierają wiele składników w różnym stężeniu. Proces ten jest czasochłonny i podatny na błędy, co prowadzi do niespójnych sukcesów transformacji. Przedstawiamy tutaj uprostroniony, prosty i powtarzalny protokół AMT dla P. palmivora , który wykorzystuje komercyjnie dostępne podłoże bazalne Murashige i Skoog (MS) do przygotowania podłoża indukcyjnego i współhodowlanego Agrobacterium . Protokół ten został również skutecznie stosowany do transformacji P. capsici i może być stosowany także wobec innych gatunków Phytophthora .

Wprowadzenie

Phytophthora, rodzaj oomycetów, obejmuje wiele z najbardziej niszczycielskich patogenów roślinnych na świecie, odpowiedzialnych za poważne straty ekonomiczne ^1,2. Wśród nich Phytophthora palmivora jest patogenem o szerokim zasięgu żywiciela, który infekuje wiele upraw o znaczeniu gospodarczym, w tym kakao i papaję³. Jest to najbardziej rozpowszechniony czynnik przyczynowy zgnilizny czarnych strąków w kakao, tropikalnym drzewie wieloletnim, które jest głównym składnikiem wielomiliardowego przemysłu czekoladowego ^4,5,6. Zrozumienie mechanizmów patogenności molekularnej tego destrukcyjnego patogenu jest kluczowe dla projektowania nowych, skutecznych strategii kontroli chorób, a transformacja genetyczna jest kluczowym narzędziem umożliwiającym takie badania.

Opracowano kilka metod transformacji Phytophthora spp., w tym bombardowanie mikropociskami⁷, transformację protoplastów pośredniczoną przez glikol polietylenowy i dichlorek wapnia (PEG/CaCl₂) 8,9,10,11, elektroporację zoospor 12,13,14 oraz transformację pośredniczoną przez Agrobacterium (AMT)^15,16. Wśród tych podejść AMT oferuje kluczowe zalety, ponieważ zazwyczaj generuje integrację genów z pojedynczą kopią^15,16 i jest stosunkowo łatwy do wykonania bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.

Wcześniej opracowano protokół efektywnej transformacji P. palmivora z użyciem AMT.¹⁶. Tą metodą skutecznie przekształciliśmy P. palmivora za pomocą wielu konstrukcji^17,18. Metoda ta wykorzystuje podłoża indukcyjne i współuprawne na bazie soli minimalnej (MM), które są powszechnie stosowane do przemiany grzybów i oomycetów 15,16,19. Chociaż protokół transformacji oparty na MM okazał się skuteczny w generowaniu transformantów, przygotowanie wielu roztworów stockowych i łączenie ich w celu stworzenia mediów może być zadaniem zarówno czasochłonnym, jak i podatnym na błędy.

Przedstawiamy tutaj znacznie uproszczoną metodę AMT P. palmivora , wykorzystując komercyjne podłoże bazalne Murashige i Skoog (MS) do zastąpienia składników na bazie soli MM w podłożu indukcyjnym i współuprawowym Agrobacterium ¹⁶. Ta metoda eliminuje konieczność przygotowywania wielu roztworów chemicznych, dzięki czemu proces jest mniej czasochłonny i bardzo powtarzalny. Co więcej, to podejście wydaje się dawać wyższą efektywność transformacji w porównaniu do wcześniej opisanej metody¹⁶ i jest również stosowane do P. capsici.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów zapasowych, mediów i innych materiałów niezbędnych do przekształcenia

1. Roztwory antybiotykowe
   1. Przygotuj roztwory zapasowe kanamycyny (50 mg/mL), G418 (15 mg/mL) i cefotaksji (100 mg/mL): Rozpuszcz odpowiednie ilości antybiotyków w wodzie, filtruj je sterylizacją, przygotuj aliquoty 1 mL i przechowuj je w temperaturze -20 °C.
   2. Przygotuj roztwór zapasowy ryfampicyny (15 mg/mL): Rozpuścić odpowiednią ilość ryfampicyny w DMSO, przygotować 1-mL aliquoty, owinąć je folią i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Upewnij się, że roztwory chemiczne przygotowane w DMSO są filtrowane i sterylizowane, używając filtrów strzykawkowych wykonanych z materiałów kompatybilnych z DMSO, takich jak nylon lub PTFE (teflon).
2. Podłoże do wzrostu Agrobacterium
   1. Medium ciekłe Luria-Bertani (LB): Aby przygotować 250 mL medium, dodaj 6,25 g LB proszku do 250 mL wody, podłącz roztwór do autoklawu i przechowuj w temperaturze pokojowej (RT).
   2. Medium agarowe LB: Aby przygotować 250 mL media, dodaj 6,25 g proszku LB i 3,75 g agaru do 250 mL wody, roztwór podkłuj w autoklawie i przechowuj w RT. Dodaj odpowiednie antybiotyki do roztopionego agaru LB przed przygotowaniem płytek. Przechowuj płytki uzupełnione antybiotykami w temperaturze 4 °C.
3. Podłoże dla wzrostu i transformacji P. palmivora
   1. Agar 10% V8: Aby przygotować 500 mL, dodaj 50 ml oryginalnego soku warzywnego V8 do 450 ml wody. Następnie dodaj 0,5 g CaCO₃ do zawiesiny i wymieszaj, aby dobrze wymieszać. Roztwór wylew w autoklawie i wlej go na talerze.
      UWAGA: Dodawaj odpowiednie antybiotyki, gdy jest to potrzebne. Przechowuj płytki uzupełnione antybiotykami w temperaturze 4 °C.
   2. Płynne medium Murashige i Skoog o pół mocy Murashige i Skoog: Dodaj 2,15 g podstawowego medium Murashige i Skoog do 950 ml wody, dostosuj pH do 5,6 przy 1 N KOH i dodaj wodę do 1 L. Użyj bezpośrednio do przygotowania 1/2 MS agaru (krok 1.3.3), autoklawuj pozostałą 1/2 MS płynu i przechowuj w RT.
   3. 1/2 MS agar do agaru współuprawy Agrobacterium-zoospore (AZCA): Aby przygotować 600 mL AZCA, wymieszaj 567 mL 1/2 MS płynu z etapu 1.3.2 z 9 g agaru. Roztwór w autoklawie i przechowuj w RT.
   4. 50% glicerolu: Wymieszaj 50 ml glicerolu z 50 ml wody, roztwór podkłucuj i przechowuj w stanie RT.
   5. 1M MES (pH 5,6): Aby przygotować 200 mL, dodaj 39,048 g hydratu MES do 160 ml wody, a następnie dostosuj pH do 5,6 za pomocą roztworu NaOH. Następnie dodaj wodę do 200 mL, przefiltruj roztwór i przechowuj w temperaturze RT w ciemnych warunkach.
      UWAGA: MES rozpuszcza się stopniowo wraz ze wzrostem pH. Na początku użyj 10 N NaOH, aby pH zbliżyło się do 5,6, co niemal rozpuści proszek. Następnie dodaj 1 N NaOH, aby pH było dokładnie 5,6.
   6. 20% glukozy: Rozpuścić 10 g glukozy w 40 mL wody, następnie dodać wodę do 50 mL, przefiltrować roztwór i przechowywać w stanie RT.
   7. 200 mM acetosyringonu (AS): Rozpuszcz 40 mg 4'-hydroksy-3',5'-dimetoksyacetofenonu w 1 mL DMSO (patrz UWAGA pod 1.1.2) i przykryj roztwór folią. Zrób świeżość w dniu przemiany.
   8. Medium indukcyjne agrobakterii (AIM): Aby przygotować 40 mL podłoża, należy dodać 400 μL 50% gliceru, 400 μL 20% glukozy, 1,6 mL 1 M MES (pH 5,6), 40 μL 200 mM AS do 37,6 mL roztworu 1/2 MS ciekłego (pH 5,6) (przygotowanego w kroku 1.3.2) w jałowej probówce o pojemności 50 mL. Dobrze wymieszaj roztwór, przykryj tubkę folią i użyj świeżej w ciągu kilku godzin.
   9. Agrobakteriowo-zoosporowy agar współhodowlaczy (AZCA): Aby przygotować 600 mL agaru, dodaj 6 mL 50% gliceru, 3 mL 20% glukozy, 24 mL 1 M MES (pH 5,6), 600 μL 200 mM AS do autoklawowanego i stopionego 567 mL 1/2 MS agaru (pH 5,6) (przygotowanego w kroku 1.3.3). Wlej roztwór do talerzy i przykryj je czarną szmatką, aby chronić je przed światłem.
      UWAGA: Dodaj roztwory chemiczne do stopionego agaru o pojemności 1/2 MS (krok 1.3.9) w temperaturze 55-60 °C. Wyłącz światła w okapie podczas kroków 1.3.7-1.3.9, ponieważ AS jest światłoczuły. Wykonaj te trzy kroki w dniu przemiany.
   10. Plich agar: Aby przygotować 1 L agaru w 950 mL wody, dodaj 0,5 g KH₂PO₄, 0,25 g MgSO₄·7H_2O, 1 g L-asparaginy, 5 g glukozy, 0,5 g ekstraktu drożdżowego, 10 μL tiaminy (100 mg/mL w wodzie, przechowywane w 4 °C), 10 mg β-sitosterolu (rozpuszcza się w 3 mL etanolu przed dodaniem). Wymieszaj roztwór, aby rozpuścić wszystkie składniki, a następnie dodaj wodę, aby objętość wzrosła do 1 L. Podziel roztwór na porcje po 500 mL i dodaj 7,5 g agaru do każdej 500 mL. Roztwór należy zautoklawić i dodać odpowiednie antybiotyki, gdy temperatura spadnie do 55 °C, a następnie wlej go do talerzy.
   11. Membrana Hybond N+: Przetnij membranę z ochronnymi arkuszami na kawałki o wymiarach 5 cm x 6 cm, owiń je folią aluminiową i podłącz do autoklawu. Podczas umieszczania membrany autoklawowanej na nośniku AZCA, obsługuj ją sterylnymi kleszczemi i wyrzuć ochronne arkusze.

2. Hodowla P. palmivora

1. Siedem do ośmiu dni przed przemianą uprawiaj izolat papai P1¹⁶ P. palmivora na świeżo przygotowanych płytkach agarowych z 10% V8, umieszczając jeden korek agarowy z wcześniej uprawianej kultury Phytophthora (lub z wywaru) na środku szalki Petriego.
   UWAGA: Aby uzyskać wyższe stężenie zoospor, ważne jest użycie świeżo przygotowanego, nieklarowanego agaru V8 o stężeniu 10%.
2. Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C w cyklu 12-godzinnym światłem i 12 godzin ciemności przez 7-8 dni, aż do przemiany.

3. Przygotowanie Agrobacterium tumefaciens

1. Trzy dni przed transformacją pasmo A. tumefaciens wywołuje szczep EHA105 niosący pCB301TOR-GFP¹⁶ na płytce agarowej LB uzupełnionej ryfampicyną (15 μg/mL) i kanamycyną (50 μg/mL). Inkubuj płytkę w temperaturze 28 °C przez 2 dni.
   UWAGA: Początkowe przygotowanie Agrobacterium (krok 3.1) można wykonać tydzień przed przemianą, a płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C po upływie 2-dniowego okresu inkubacji.
2. Dzień przed transformacją weź niewielką ilość komórek Agrobacterium i rozłóż je na nowej płycie agarowej LB z antybiotykami (jak opisano w kroku 3.1), używając dna i płaskiej podstawy sterylnej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Dla łatwiejszego rozprowadzania dodaj 20 μL płynnego medium LB do środka płytki agarowej LB, wymieszaj komórki bakteryjne z medium LB, a następnie rozłóż je równomiernie na płytce. Inkubuj płytkę w 28 °C przez noc przez około 16-18 godzin.
3. Komórki wyhodowane przez noc nabieraj końcówką pipety o pojemności 1 mL i ponownie zawiesijuj je w 1 mL pożywce indukcyjnej Agrobacterium (AIM) poprzez pipetowanie w górę i w dół. Rozcieńcz komórki do OD₆₀₀ = 0,4 za pomocą AIM w sterylnej probówce 50 mL przykrytej folią. Przygotować minimum 5 ml do współinkubacji z zoosporami P. palmivora (krok 5.1).
   UWAGA: OD₆₀₀ w zakresie od 0,1 do 0,8 pozwoli na pomyślną transformację. OD₆₀₀ = 0,4 jest rutynowo stosowany, ponieważ to stężenie zapewniało najwyższą wydajność transformacji przy użyciu minimalnego medium (MM) na bazie soli (MM) do indukcji i współuprawy Agrobacterium do przemiany¹⁶.
4. Inkubuj bakterie w RT w ciemnych warunkach przez 1,5-2 godziny na platformie z delikatnym mieszaniem (około 70 obr./min).
   UWAGA: Zaleca się wyłączenie świateł na okapie podczas kroku 3.3 oraz poluzowanie koreka rurki 50 mL podczas inkubacji (krok 3.4).

4. Uwolnienie zoospor

1. Po 1 godzinie inkubacji Agrobacterium tumefaciens (krok 3.4) zalać 7-8-dniową płytkę P. palmivora 10 ml wody wstępnie schłodzonej w 4°C, usunąć pęcherzyki powietrza z powierzchni substratu delikatnie stukając końcówką pipety i inkubować płytkę w 4 °C przez 15 minut, a następnie przez 15 minut w RT pod światłem.
2. Delikatnie przenieś uwolnione zoospory (około 7-8 mL) do 15 mL sterylnej rurki wirówki z pipetą, nie naruszając grzybni i sporangów.
3. Aby zmierzyć stężenie zoospor, przelej część zawiesiny zoospory (np. 20 μL) do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL i rozcieńcz ją 10 razy wodą (180 μL H₂O dla 20 μL zoospor). Wykonaj vortex w rurce przez 1 minutę, aby zakryć zoospory i ułatwić liczenie, a następnie liczyć liczbę zoospor pod mikroskopem za pomocą hemacytometru. Pomnóż liczoną liczbę przez 10, aby określić stężenie zawiesiny zoospor przygotowanej w kroku 4.2.
   UWAGA: Stężenie zoospor jest mierzone do obliczania efektywności transformacji. Zazwyczaj stosujemy stężenia w zakresie od 1,5 × 10⁶ do 5 × 10^{6 zoospor} na mL, z sukcesem transformacji.

5. Współinkubacja Agrobacterium i zoospor

1. Dodaj 5 ml Agrobacterium (przygotowanego w kroku 3.4) do 5 ml zawiesiny zoospor (przygotowanej w kroku 4.2) do sterylnej probówki 50 mL pokrytej folią. Delikatnie wymieszaj i inkubuj tubkę na RT przez 2 godziny w ciemności. Trzymaj pokrywkę luźną i nie potrząsaj tubką podczas współinkubacji.
2. W okresie współinkubacji (krok 5.1) przygotuj płytki AZCA (krok 1.3.9). Gdy medium zastygnie, na każdej płytki AZCA umieść jeden kawałek sterylnej membrany Hybond N⁺ (przygotowanej w kroku 1.3.11) i trzymaj płytki w ciemności.
3. Po 2 godzinach współinkubacji Agrobakterii i zoospory (krok 5.1) rozprowadz 300 μL mieszaniny na każdą membranę Hybond N⁺ umieszczoną na płytkach AZCA (krok 5.2) końcówką pipety, pozostawiając marginesy wolne od cieczy.
4. Pozostawij mieszankę do wyschnięcia na powietrzu przez około 10 minut w okapu, zostawiając szalki Petriego odkryte. Zakrywaj płytki, gdy tylko roztwór na membranie przestanie się rozprzestrzeniać.
   UWAGA: Podczas kroków 5.1-5.4 trzymaj światła na masce wyłączone. W razie potrzeby używaj świateł podczas dodawania i rozprowadzania mieszanki na membranach (krok 5.3).
5. Po wyschnięciu na powietrzu inkubuj płytki w temperaturze 25 °C w ciemności przez 2 dni.

6. Wybór transformantów odpornych na G418

1. Po 48 godzinach współinkubacji (krok 5.5) przenieś błony Hybond N⁺ do góry nogami za pomocą sterylnych kleszczy na płytki agaru Plich uzupełnione G418 (30 μg/mL) oraz cefotaksim (100 μg/mL). Podczas umieszczania membran na płytach nie przeciągaj ich po powierzchni medium.
   UWAGA: Stężenie G418 do wyboru transformantów dla każdego izolatu P. palmivora musi być określone, ponieważ dla różnych izolatów obserwuje się różne poziomy czułości. Aby to osiągnąć, umieść korek grzybni o średnicy 0,5 cm w centrum płyt agarowych plich uzupełniony serią stężeń G418 w przyrostach 5 μg/mL, zaczynając od zera. Przygotuj trzy płytki replikacyjne dla każdego stężenia. Inkubuj płytki w temperaturze 25 °C przez 7 dni. Zidentyfikuj najniższe stężenie G418, które całkowicie hamuje wzrost izolatu Phytophthora i wykorzystaj je do selekcji przekształcaczy.
2. Użyj płaskiej podstawy rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, aby delikatnie naciskać i przesuwać po powierzchni membrany, aby upewnić się, że jest ona blisko kontaktu z podłożem. Obserwuj spód płytek, aby sprawdzić obecność pęcherzyków powietrza między błoną a ośrodkiem. Delikatnie wyciśnij pęcherzyk powietrza, jeśli występuje, używając płaskiej podstawy tej samej rurki mikrowirówki.
3. Inkubuj płytki w cyklu 12-godzinnym światłem i 12-godzinnym ciemnym w temperaturze 25 °C przez 2-3 dni.
4. Po 3 dniach inkubacji usuń błony za pomocą sterylnych kleszczy i kontynuuj inkubację płytek w tych samych warunkach. Błony można usunąć po 2 dniach, jeśli na płytkach pojawią się widoczne kolonie.
   UWAGA: Transformanty zazwyczaj pojawiają się w ciągu 1-3 dni po usunięciu błony, ale niektóre kolonie mogą pojawić się później. Aby uzyskać więcej transformantów, monitoruj płytki przez około tydzień po usunięciu błon.
5. Przenieś transformanty na płytki agarowe o stężeniu V8 o 10% stężeniu G418 lub stężenie zmniejszone o 30%.

Wyniki

Stosując ten protokół, przeprowadziliśmy dwa niezależne eksperymenty transformujące P. palmivora przy użyciu A. tumefaciens EHA105 przenoszącego pCB301TOR-GFP¹⁶. Jak można się spodziewać, współinkubacja zoospor z Agrobacterium dała kolonie odporne na G418 na płytkach agarowych plich uzupełnionych 30 μg/mL G418, podczas gdy na płytach kontrolnych nie zaobserwowano kolonii bez zakażenia Agrobacterium (Rysunek 1A). Liczba transformantów odpornych na G418 na 10⁷ zoospor wyprodukowanych w tych dwóch eksperymentach wyniosła odpowiednio 55 i 50 (Tabela 1), co jest niemal dwukrotnie wyższą liczbą (27 ± 5) wcześniej uzyskaną przy użyciu wcześniejszego protokołu¹⁶.

Prawdziwe transformanty zweryfikowano dwoma metodami: po pierwsze, obserwacją fluorescencji GFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, a po drugie, amplifikacją PCR fragmentu genu EGFP o mocy 550 bp za pomocą Taq 2X Master Mix (NEB) z parą primerów EGFP-F2 (5'- GACGTAACGGCCACAAGTTC-3') i EGFP-R2 (5'-GGGTGCTCAGGTAGTGGTTG-3'). W eksperymencie (Exp) 1, 15 z 18 transformantów odpornych na G418, a w Exp 2, 17 z 21 transformantów wykazywało fluorescencję GFP (Tabela 1, Rysunek 1B). Dla siedmiu transformantów odpornych na G418, które nie wykazały fluorescencji w obu eksperymentach, trzy zostały potwierdzone jako prawdziwe transformanty za pomocą PCR (rysunek 1C). Łącznie odsetek prawdziwych transformantów oszacowano na 90%.

Ponadto udało nam się również pomyślnie przekształcić izolat dyni P. capsici , PC2024-14sz, używając A. tumefaciens EHA105 niosącego pCB301TOR-GFP, zgodnie z protokołem z drobnymi modyfikacjami w przygotowaniu zawiesin zoospor (okres inkubacji w temperaturze 4 °C po zalaniu 7-dniowej płytki P. capsici wstępnie schłodzoną wodą został wydłużony do 30 minut). Liczba transformantów odpornych na G418 (30 μg/mL) na 10⁷ z jednego eksperymentu wynosiła 13. Dziewięć transformantów zaobserwowano pod mikroskopem fluorescencyjnym i wszystkie wywołały fluorescencję (Plik Uzupełniający 1), co sugeruje, że są to prawdziwe transformanty.

Rysunek 1: Transformacja P. palmivora przy użyciu A. tumefaciens EHA105 niosącego pCB301TOR-GFP. (A) Pojawienie się transformantów odpornych na G418 P. palmivora na agarze Plich uzupełnionym o stężeniu 30 μg/mL G418. (B) Wykrywanie ekspresji GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym u reprezentatywnego transformanta i szczepu P . palmivora typu dzikiego (WT). Zdjęcia wykonywano zarówno pod kanałami fluorescencji jasnego pola (BF), jak i GFP. (C) Amplifikacja EGFP PCR z czterech transformantów z wykrywalną fluorescencją GFP i siedmiu bez fluorescencji GFP. Uniwersalna para zapalników ITS4/ITS5²⁰ została użyta do amplifikacji wewnętrznego obszaru transkrybowanego spacera (ITS) w celu sprawdzenia integralności DNA. Transformanty bez fluorescencji GFP są podkreślone pogrubionym, podkreślonym tekstem. Skróty: M = NEB 100 bp drabina DNA; WT = dziki typ P. palmivora P1; N = ujemna kontrola PCR z użyciem H_2Ojako szablonu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Eksperyment	OD600 Agrobacterium	Stężenie zoospor (/mL)	Objętość zoospor (mL)	Liczba transformantów odpornych na G418	Liczba transformantów z wykrywalnym sygnałem GFP (Wykryte / Obserwowane)	Liczba transformantów odpornych na G418 / 107 zoospor
1	0.4	1.8 x 106	4.3	43	15/18	55
2	0.4	2.9 x 106	4.6	67	17/21	50

Tabela 1: Efektywność transformacji P. palmivora za pośrednictwem agrobakterii przy użyciu A. tumefaciens EHA105 niosącego pCB301TOR-GFP.

Plik uzupełniający 1: Ekspresja GFP pod mikroskopem fluorescencyjnym u dzikiego typu (WT) P. capsici oraz reprezentatywnego transformanta generowanego przy użyciu A. tumefaciens EHA105 niosącego pCB301TOR-GFP. Zdjęcia wykonywano zarówno pod kanałami fluorescencji jasnego pola (BF), jak i GFP. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten wykorzystuje podstawowe podłoże Murashige i Skoog o połowie mocy (1/2 MS) do zastąpienia składników soli minimalnego medium (MM), które są powszechnie stosowane w indukcji i współkultywacji Agrobacterium do transformacji oomycetów i grzybów. Przygotowanie mediów na bazie soli MM wymaga przygotowania wielu roztworów z różnych pojedynczych chemikaliów, a następnie łączenia tych roztworów¹⁹. 1/2 MS zawiera także wiele składników chemicznych; jednakże, ponieważ MS jest powszechnie dostępny komercyjnie jako gotowy proszek, przygotowanie medium jest uproszczone do rozpuszczania proszku w wodzie. Ta modyfikacja znacznie skraca czas przygotowania mediów i minimalizuje ryzyko błędów ludzkich. Ponadto protokół poprawia efektywność transformacji, dając większą liczbę transformantów w porównaniu do wcześniej opisanej metody^{AMT 16}. Jest również skuteczny w transformacji P. capsici i prawdopodobnie nadaje się do innych gatunków Phytophthora . Dodatkowo wspierając jego potencjalne szersze zastosowanie, podłoże oparte na SM było wcześniej wykorzystywane do współhodowli szczepów Agrobacterium tumefaciens wyrażających Zarody AtVIP1 (Arabidopsis thaliana VirE2-interagujące białko 1) oraz P. infestans , umożliwiając skuteczną transformację P. infestans²¹.

Ważne jest, aby zauważyć, że ten protokół może generować niski procent fałszywie pozytywnych wyników. Spośród 39 transformantów odpornych na G418, które zostały przetestowane za pomocą obserwacji fluorescencji GFP (PCR), cztery nie wykazały ani fluorescencji, ani amplifikacji EGFP (Tabela 1, Rysunek 1C). Ponieważ częściowa integracja T-DNA podczas transformacji wywołanej przez Agrobacterium nie jest rzadkością^22,23, możliwe jest, że tylko część T-DNA zawierająca gen NPTII z plazmidu pCB301TOR-GFP¹⁶ została zintegrowana z genomem P. palmivora. Alternatywnie, fałszywie pozytywne wyniki mogą wynikać z niewystarczającego kontaktu membrany z ośrodkiem selektywnym, co pozwala uniknąć selekcji G418. Dlatego zapewnienie, że błona pozostaje w pełnym kontakcie z podłożem (krok 6.2), jest zatem niezbędne.

Protokół ten może zostać dodatkowo uproszczony. Na przykład MES w ośrodku indukcyjnym Agrobacterium (AIM) oraz agar współhodowlaczy Agrobacterium-zoospore (AZCA) mogą zostać potencjalnie pominięte. MES jest powszechnie stosowany jako środek buforujący w eksperymentach biochemicznych i biologii molekularnej w celu utrzymania stabilnego pH; jednak przygotowanie roztworu bulwarowego MES o pojemności 1 M przy pH 5,6 zajmuje wystarczająco dużo czasu i zwiększa koszty. W AMT roślin, takich jak słodka bazylia²⁴ i papaja²⁵, zastosowano podobne podłoże indukcyjne i współhodowlane oparte na MS Agobacterium bez MES, co sugeruje, że MES może nie być niezbędny do transformacji P. palmivora . Potrzebne są dalsze eksperymenty, aby potwierdzić, że pominięcie MES nie narusza efektywności transformacji.

Ogólnie rzecz biorąc, ten uproszczony protokół stanowi praktyczną i dostępną platformę do rutynowej manipulacji genetycznej P. palmivora, P. capsici oraz potencjalnie innych oomycetów. Wspiera szeroki zakres badań fundamentalnych, z których niektóre mają potencjał translacyjny, w tym znakowanie patogenów fluorescencyjne w celu śledzenia dynamiki infekcji, oznaczanie białek do badania lokalizacji subkomórkowej oraz analizy funkcjonalne poprzez ukierunkowane zmiany ekspresji genów lub sekwencji kodujących białka. W połączeniu z edycją genomu opartą na CRISPR, protokół ten ma przyspieszyć analizę mechanizmów patogenności i identyfikację kluczowych czynników zjadliwości w tych destrukcyjnych patogenach. Uzyskane wnioski z kolei umożliwią opracowanie nowych, mechanizmowych strategii kontroli chorób.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL	VWR	525-1126
4'-Hydroksy-3',5' dimetoksiacetofenon	TCI	D2666	Acetosyringon (AS)
Rurka 50 mL	Greiner Bio-one	227261
Absolute Ethanol	BioReagenty Fishera	BP28184
Agar	BioReagenty Fishera	BP1423-500
Folia aluminiowa
Błona Hybond-N+ (30 cm i razy; 3 m)	Cytiva	RPN303B
Węglan wapnia	Sigma-Aldrich	239216-500G	CaCO3
Sól sodowa cefotaksymu	Chemikalia termonaukowe	AAJ6269006
D-(+)-glukoza	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
Zestaw mikrobiologiczny DNeasy PowerLyzer	Qiagen	12255-50
Kleszcze
Mikroskop fluorescencyjny	Zeiss		Mikroskop fluorescencyjny ZEISS Axioscope 5 z filtrem 38 HE
Siarczan G418	Chemikalia termonaukowe	AC329400010
Glicerol	Sigma-Aldrich	911046-1L
Hemacytometr (Jasna linia)	Hausser Scientific
Siarczan kanamicyny	Santa Cruz Biotechnology	SC-257635
L-Asparagine bezwodny	MP Biomedicals	ICN10079425
LB Broth, Miller	BioReagenty Fishera	BP1426-2
Heptahydrat siarczanu magnezu	Sigma-Aldrich	63138-250G	MgSO4· 7H2O
MES Hydrate	Sigma-Aldrich	M2933-100G
Murashige i Skoog Bazal Medium	Sigma-Aldrich	M5519-50L
Szalka Petriego (100 mm x 15 mm)	VWR	25384-342
Fosforan diwodoru potasu	Sigma-Aldrich	1370391000	KH2PO4
Ryfampycyna	Santa Cruz Biotechnology	SC-200910
Taq 2X Master Mix	NEB	M0270L
Chlorek tiaminy	Sigma-Aldrich	T4625-5G
Spektrofotometr widzialny UV	Fisher Scientific	14-385-355
V8 Oryginalny 100% sok warzywny	Campbell Soup Company
Vortexer	Fisher Scientific	14-955-163
Woda			Klasa biologii molekularnej, oczyszczona za pomocą systemu oczyszczania wody Mill-Q
Ekstrakt drożdżowy	ACROS	611805000	Obecnie dostępne przez Thermo Scientific Chemicals
β-Sitosterol	Sigma-Aldrich	85451-100G