Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł badawczy

Okrągłe RNA ZBTB46 tłumi apoptozę i stres oksydacyjny w komórkach śródbłonka ludzkiego uszkodzonym lipopolisacharydami poprzez modulację sygnalizacji ERBB2-AKT

242 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69765

⸱

13 lutego 2026

1Department of Emergency, Fuzhou University Affiliated Provincial Hospital, Fujian Provincial Hospital, 2Fujian Provincial Key Laboratory of Emergency Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Ostre uszkodzenie nerek związane z sepsą (SA-AKI) wiąże się ze znaczną śmiertelnością. Badanie to wykazało, że circZBTB46 jest obniżony w HUVEC wywołanych LPS (SA-AKI in vitro). Jego nadekspresja zwiększa żywotność HUVEC, zmniejsza apoptozę, stan zapalny i stres oksydacyjny w połączeniu z sygnalizacją ERBB2/AKT, co sugeruje potencjalny cel terapeutyczny istotny dla SA-AKI.

Streszczenie

Okrągłe RNA są nowymi regulatorami odpowiedzi stresowych, jednak ich rola w uszkodzeniu śródbłonka prowadzącym do ostrego uszkodzenia nerek związanego z sepsą pozostaje niedo do końca zdefiniowana. Wysunęliśmy hipotezę, że okrągłe RNA ZBTB46 (circZBTB46) zapewnia ochronę śródbłonka poprzez aktywację sygnalizacji ERBB2-AKT. Korzystając z modelu komórkowego, w którym ludzkie komórki śródbłonka żyły pępowiny były poddawane lipopolisacharyd, zidentyfikowaliśmy ekspresję circZBTB46 i przetestowaliśmy wpływ jej wymuszonej ekspresji na przeżycie, apoptozę, mediatory zapalne oraz homeostazę redoks. Testy żywotności komórek i cytometria przepływowa oceniały przeżywalność i apoptozę. Enzymatyczne testy immunosorbentne mierzyły interleukinę-6, czynnik martwicy nowotworów-α oraz interleukinę-1β, natomiast reaktywne odmiany tlenu, malondialdehyd, dismutaza nadtlenku i katalaza oceniano jako wskaźniki ulegania oksydacyjnego i zdolności antyoksydacyjnej. Aby zdefiniować mechanizm, przeprowadziliśmy profilowanie transkryptomu z analizą wzbogacenia zestawu genów, potwierdziliśmy białka szlaków za pomocą Western blottingu oraz oceniliśmy konieczność za pomocą inhibitora ERBB2 AG-825. Lipopolisacharydy tłumione circZBTB46. Nadmierna ekspresja CircZBTB46 zwiększyła żywotność, obniżyła apoptozę, zmniejszyła cytokiny prozapalne i reaktywne formy tlenu, zmniejszyła malondialdehyd oraz zwiększyła aktywność dismutazy nadtlenku i katalazy. Analizy transkryptomiczne i białkowe wspierały aktywację osi ERBB2-AKT, a farmakologiczna blokada ERBB2 stępiła cytoprotekcję i odwróciła zyski w równowadze redoks. Wyniki te wskazują, że circZBTB46 jest endogennym hamulcem uszkodzenia śródbłonka wywołanego lipopolisacharydami poprzez sygnalizację ERBB2-AKT i nominują circZBTB46 jako węzeł mechanistyczny i potencjalny cel terapeutyczny dla ostrego uszkodzenia nerek związanego z sepsą.

Wprowadzenie

Sepsa, zagrażająca życiu systemowa kaskada zapalna inicjowana przez inwazję patogenną, często kończy się niewydolnością wielonarządową1. W tym kluczowym kontekście SA-AKI wyłania się jako dominujące i klinicznie istotne powikłanie na oddziałach intensywnej terapii2. Charakteryzując się nagłym pogorszeniem zdolności filtracji nerek równolegle z infekcją ogólnoustrojową, ta choroba wykazuje śmiertelność przekraczającą liczbę przypadków nieseptycznej AKI o 38%-42% w kohortach klinicznych2. Około 60% osób u zdiagnozowanych z sepsą lub wstrząsem septycznym ma przewidywane rozwinięcie SA-AKI3. W związku z tym SA-AKI stała się poważnym wyzwaniem w intensywnej terapii, znacząco przyczyniając się do zachorowalności i śmiertelności4. Obecnie mechanizm SA-AKI pozostaje niew w pełni zrozumiany. Chociaż badania przedkliniczne obejmowały zaburzenia mikrokrążenia, zmiany w metabolizmie komórkowym oraz zaburzenia w układzie renina-angiotensyna-aldosteron (RAAS), dysfunkcję mitochondrialną oraz zaburzenia zapalne, mechanizm patofizjologiczny SA-AKI pozostaje nieuchwytny, a obecnie brakuje optymalnych środków wspierających wczesną diagnozę i dalsze leczenie 5,6,7,8 . SA-AKI charakteryzuje się zwiększoną apoptozą, nadmiernym stresem oksydacyjnym oraz stanem zapalnym9. W ramach tych badań lipopolisacharyd (LPS) został wykorzystany w systemie in vitro, aby naśladować objawy AKI związanej z sepsą w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) do wstępnej eksploracji celów5.

W ostatnich latach okrągłe RNA (cyrcRNA), niedawno zidentyfikowana kategoria niekodujących cząsteczek RNA, zyskały coraz większą uwagę ze względu na swoją rolę w różnych chorobach10. CircRNA posiadają stabilną, kołową strukturę i uczestniczą w procesach fizjologicznych i patologicznych komórek, pełniąc rolę molekularnych gąbek dla mikroRNA (miRNA), regulując transkrypcję genów lub angażując się w interakcje białkowe11. Badania wykazały, że cyrcRNA odgrywają kluczową rolę w modulacji stanu zapalnego, stresu oksydacyjnego oraz szlaków apoptotycznych, co zwiększa zainteresowanie ich możliwymi konsekwencjami w sepsie i pokrewnych schorzeniach, w tym w przypadku ostrego uszkodzenia nerek12. Na przykład hsa_circ_0072463 został zidentyfikowany jako obiecujący marker diagnostyczny i cel terapeutyczny dla SA-AKI13. Circ_001653 miało pomóc SA-AKI poprzez rekrutację BUD1314. Jednak funkcjonalne znaczenie cyrcRNA w SA-AKI pozostaje w dużej mierze niezbadane.

Badanie to zostało zaprojektowane w celu zbadania wpływu circZBTB46 na funkcjonowanie komórek śródbłonka, stres oksydacyjny oraz reakcje zapalne z wykorzystaniem systemu in vitro SA-AKI. Tworząc model HUVEC indukowany LPS, badaliśmy uszkodzenia śródbłonka pod stymulacją endotoksyny. Należy zauważyć, że HUVEC z problemem LPS stanowi redukcjonistyczny model stresu śródbłonkowego sterowany endotoksyną/TLR4, który jest istotny, ale nie równoważny, wieloczynnikowej patofizjologii ostrego uszkodzenia nerek związanego z sepsą. Model ten przede wszystkim obejmuje aktywację zapalną wywołaną przez TLR4, stres oksydacyjny oraz odpowiedzi śródbłonka związane z apoptozą, pomijając jednocześnie kluczowe elementy in vivo , takie jak zmiany hemodynamiczne, kaskady dopełnienia i krzepnięcia, wzorce molekularne związane z uszkodzeniami oraz niejednorodne bodźce mikrobiologiczne. W ramach tego eksperymentu badaliśmy, czy circZBTB46 łagodzi stres oksydacyjny i apoptozę wywołany LPS poprzez modulację szlaku sygnalizacyjnego ERBB2, chroniąc tym samym funkcję komórek śródbłonka. Z naszej wiedzy badanie to dostarcza pierwszych dowodów łączących circZBTB46 z odpowiedziami stresowymi śródbłonka w kontekście ostrego uszkodzenia nerek związanego z sepsą. Poprzez wyjaśnienie molekularnych mechanizmów leżących u podstaw ochrony śródbłonka pośredniczonej przez circZBTB46, badania te mogą pogłębić zrozumienie patogennych mechanizmów SA-AKI i utorować drogę innowacyjnym metodom terapeutycznym skoncentrowanym na circRNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół ten opisuje eksperymentalne procedury stosowane do badania wpływu modulacji circZBTB46 na sygnalizację zapalną, stres oksydacyjny oraz aktywację szlaków ERBB2-AKT u HUVEC.

Hodowla komórkowa
Komórki HUVECs użyte w tym badaniu pochodzą z komercyjnego źródła. HUVEC były wykorzystywane jako reprezentatywny model komórek śródbłonka ze względu na ich szeroką dostępność, powtarzalne warunki hodowlane oraz wysoką efektywność transfekcji, co ułatwia manipulacje genetyczne i mechanistyczne badania szlaków sygnalizacji śródbłonka pod stresem zapalnym15,16. HUVEC hodowano w DMEM z dodatkiem 10% (v/v) surowicy bydła płodu oraz koktajlu antybiotykowo-przeciwmikotycznego w stężeniu 1%. Wszystkie hodowle komórkowe były utrzymywane w standardowych warunkach fizjologicznych w nawilżonej komorze (37 °C, 5%CO2), co sprzyjało trwałej proliferacji komórek, jednocześnie zachowując żywotność >95%, co potwierdzono testem wykluczenia trypanowego niebieskiego. Chociaż medium specyficzne dla błony wendetelialnej (np. EGM-2 lub M199 uzupełnione suplementami wzrostowymi śródbłonka) są powszechnie zalecane do długoterminowego utrzymania HUVEC, w tym badaniu zastosowano DMEM, aby zapewnić spójność między eksperymentalnymi terapiami oraz kompatybilność ze stymulacją LPS i testami farmakologicznymi inhibitorów. W testach inhibitorów AG-825 inkubuj HUVEC świeżym DMEM zawierającym 10 μM AG-825 przez 1 godzinę. Następnie dodaj roztwór LPS do studni, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/mL, i kontynuuj hodowlę przez 24 godziny. Aby zminimalizować potencjalny dryf fenotypowy, HUVEC stosowano przy niskich liczbach przejściów i wystawiano na eksperymentalne warunki oparte na DMEM jedynie w krótkoterminowych testach. Wszystkie eksperymenty funkcjonalne przeprowadzano w określonych oknach leczenia, a nie podczas długotrwałej hodowli.

Transfekcja komórkowa
Aby wyjaśnić biologiczną rolę circZBTB46, zsyntetyzowano i zweryfikowano plazmidy nadekspresji (oe-circZBTB46) oraz dopasowane konstrukty kontroli negatywnej (oe-NC) za pomocą GenScript. HUVEC były zasiewane na płytkach 6-dołkowych o gęstości 1 x 10⁵ komórek/dołek i hodowane przez noc, aby osiągnąć ~70%-80% zbiegu w momencie transfekcji. Dla każdej dołki 2,5 μg plazmidowego DNA (oe-circZBTB46 lub oe-NC) rozcieńczono w 125 μL zredukowanego medium surowicowego i wymieszano z 2,5 μL odczynnika P3000 (Tube A). Równolegle rozcieńczono 3,75 μL Lipofektaminy 3000 w 125 μL zredukowanego medium surowicy (probówka B). Rurka A i rurka B zostały następnie połączone, delikatnie wymieszane i inkubowane w temperaturze pokojowej przez 15-20 minut, aby umożliwić powstawanie złożonego (ostateczna objętość złożona: 250 μL/studnia). Kompleksy były dodawane kropelo do komórek w bezantybiotykowym medium kompletnym. Po 6 godzinach inkubacji w temperaturze 37 °C, 5%CO2, podłoże transfekcyjne zostało zastąpione świeżym, kompletnym podłożem wzrostowym. Komórki były hodowane przez 48 godzin przed kolejnymi testami. Wszystkie procedury były zgodne z instrukcjami producenta.

Model indukowany LPS
Aby wygenerować model in vitro SA-AKI, HUVEC (5 x 10komórek/dołek) transfektowane oe-circZBTB46 lub NC zostały zasiewane w płytach 96-dołkowych i utrzymywane przez 24 godziny, aż osiągnięto 80% konfluencji. Następnie komórki te przeszły leczenie LPS w dawce 10 μg/mL przez 24 godziny. HUVEC bez leczenia LPS stanowiły grupę kontrolną.

qRT-PCR
Całkowita ekstrakcja RNA z HUVEC była wykorzystywana za pomocą komercyjnego odczynnika. Transkrypcja odwrotna do syntezy cDNA została przeprowadzona za pomocą komercyjnego zestawu odczynników. Ilościowy PCR (qPCR) był wykonywany w trzech egzemplarzach za pomocą systemu PCR w czasie rzeczywistym wraz z miksem master. Ilości ekspresji genów docelowych zostały skalibrowane względem U6, a analiza przeprowadzono metodą 2−ΔΔCT 17,18. Do analizy ekspresji circRNA jako wewnętrzne źródło normalizacji użyto małego jądrowego RNA U6, ponieważ jest powszechnie stosowane do ilościowej identyfikacji małych niekodujących RNA i wykazuje stosunkowo stabilną ekspresję w krótkoterminowych warunkach eksperymentalnych in vitro. Sekwencje pierwsze zastosowane w tym badaniu są wymienione następująco:

circZBTB46-Forward: 5'-CGGCGCTCATGAGTAAGAAC-3'

circZBTB46-Reverse: 5'-CGCCTCTTCTACAGACTGGG-3'

U6-Napastnik: 5'-TGCTATCACTTCAGCAGCA-3'

U6-Reverse: 5'-GAGGTCATGCTAATCTCTCTCTG-3'.

Test CCK-8
Opłacalność HUVEC oceniano za pomocą CCK-8 zakupionego komercyjnie. W skrócie, komórki zostały zasiewane do płyty z 96 dołkami, a komórki poddawane hodowli adhezji przez 24 godziny. Następnie do każdego dołku dodawano 10 μL roztworu CCK-8, a komórki były dalej inkubowane w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Do pomiaru gęstości optycznej (OD) przy długości fali 450 nm użyto czytnika mikropłyt. Wstępne obserwacje wykazały, że 10 μg/mL LPS istotnie zmniejszało żywotność HUVEC, co doprowadziło do wyboru tego stężenia do kolejnych procesów eksperymentalnych.

Cytometria przepływowa
Początkowo HUVEC były odłączane trypsyną wolną od EDTA zgodnie ze standardowymi procedurami. Zgodnie z wytycznymi producenta dla zestawu do badania apoptozy Annexin V-APC/PI, ZAWIESINY KOMÓRKOWE BYŁY WIROWANE W DAWCE 1000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, po dysocjacji enzymatycznej. Osadzone w granulkach były następnie myte 2 razy lodowatym PBS w identycznych warunkach i ponownie zawieszone w 100 μL buforu 1x wiążącego. Każda próbka była traktowana 5 μL konjugatu Annexin V-FITC oraz 5 μL roztworu barwiącego jodek propidiu (PI), po czym nastąpiła 10-minutowa inkubacja w ciemności w temperaturze pokojowej (20-25 °C). Na koniec do wszystkich próbek dodano 400 μL buforu wiążącego 1x, a apoptoza została przeanalizowana w ciągu 1 godziny za pomocą cytometru przepływowego. Zdarzenia były początkowo blokowane przez FSC/SSC, aby wykluczyć gruz. Do analizy apoptozy zastosowano następnie bramki kwadrantowe na wykresie Annexin V-FITC vs PI z wykorzystaniem odpowiednich kontrol (niebarwionych i pojedynczych barwionych/kompensacyjnych) do zdefiniowania populacji żywych (Annexin V-/PI-), wczesnych apoptotycznych (Annexin V+/PI-), późnych (Annexin V+/PI+) oraz nekrottycznych (Annexin V-/PI+). Na wszystkich próbkach zastosowano ten sam szablon bramkowania i progi.

Badanie ELISA
Stężenia czynników zapalnych – czynnika martwiczego guza-α (TNF-α), interleukiny-6 (IL-6) oraz interleukiny-1β (IL-1β)-w supernatancie hodowanych HUVEC mierzono za pomocą komercyjnie dostępnych zestawów ELISA. Konkretnie, zgodnie z instrukcjami producenta, użyto zestawów Human TNF-α ELISA, Human IL-6 ELISA Kit oraz Human IL-1β ELISA Kit. Do każdego testu ładowano 50 μL nierozcieńczonego supernatantu hodowli komórkowej na dołek. Standardowe krzywe generowano przy użyciu dostarczonych szeregowych rozcieńczeń (TNF-α: 0-1000 pg/mL; IL-6: 0-500 pg/mL; IL-1β: 0-200 pg/mL). Po próbce i standardowym uzupełnieniu płyty inkubowano w temperaturze 37 °C przez 90 minut, po czym następowało pięć płukań z buforem płukania. Następnie dodano przeciwciało wykrywające sprzężone z biotyną, które inkubowano w temperaturze 37 °C przez 60 minut. Po kolejnym etapie płukania dodano streptawidynę-HRP i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po końcowym płukaniu dodano podłoże 3,3',5,5'-tetrametylobenzydydyny (TMB) i inkubowano w temperaturze 37 °C w ciemności przez 15 minut. Reakcja została zakończona roztworem stopowym, a absorpcja natychmiast zmierzona przy 450 nm przy długości fali referencyjnej 630 nm. Każda próbka i standard były testowane w duplikacie, a wszystkie eksperymenty obejmowały trzy niezależne biologiczne repliki. Poziomy markerów stresu oksydacyjnego – malondialdehydu (MDA), dismutazy nadtlenkowej (SOD) i katalazy (CAT) – w supernatancie zostały ocenione odpowiednio za pomocą zestawu MDA ELISA, zestawu SOD ELISA i zestawu CAT ELISA, zgodnie z protokołami19, 20, 21. Do testów MDA i SOD stosowano 40 μL supernatantu na dołek bez rozcieńczania; dla CAT próbki były rozcieńczane w stosunku 1:10 buforem testowym przed załadowaniem. Standardowe krzywe przygotowywano zgodnie ze specyfikacją zestawu (MDA: 0-60 nmol/mL; SOD: 0-100 U/mL; CAT: 0-100 U/mL). Etapy inkubacji wykonywano następująco: MDA - 60 min w 37 °C; SOD - 60 min przy 37 °C; KOTA – 30 minut w temperaturze 37 °C. Płytki były myte 4 razy między kluczowymi etapami inkubacji. Wywoływanie koloru osiągano poprzez dodanie odpowiednich substratów i inkubację w temperaturze 37 °C (MDA: 15 min; SOD: 20 min; CAT: 15 min). Absorpcja była odczytana na poziomie 450 nm dla SOD i CAT oraz przy 532 nm dla MDA. Wszystkie pomiary przeprowadzono w duplikatach studni i powtórzono na trzech niezależnych biologicznych replikacjach.

Sekwencjonowanie RNA
Całkowite RNA było ekstrahowane z HUVEC przy użyciu komercyjnych odczynników zgodnie z instrukcjami producenta. Czystość i stężenie RNA oceniono za pomocą spektrofotometru poprzez pomiar absorpcji na 260 nm i 280 nm (A260/A280), a integralność RNA oceniono za pomocą bioanalizatora. Do późniejszego przygotowania bibliotecznego użyto tylko próbek RNA o liczbie integralności RNA (RIN) ≥ 7. RNA rybosomalne zostało usunięte podczas przygotowań bibliotecznych za pomocą standardowej procedury wyczerpania rRNA przeprowadzonej przez firmę komercyjną. Tam, gdzie wskazano, przed budową biblioteki zastosowano zabieg RNazą R, aby selektywnie trawić liniowe RNA i wzbogacać okrągłe gatunki RNA. Następnie fragmentacja RNA była przeprowadzana w warunkach podwyższonych temperatur, zgodnie ze standardowym protokołem podręcznika RNA Library Preparation Kit, aby uzyskać fragmenty RNA o odpowiedniej wielkości. Biblioteki sekwencjonowania były przygotowywane przy użyciu zestawu RNA Library Preparation Kit zgodnie z instrukcjami producenta i sekwencjonowane na platformie Illumina, stosując strategię sekwencjonowania parowanego na końcu i długość odczytu 150 bp (PE150). Głębokość sekwencjonowania była wystarczająca, by wspierać analizę całego transkryptomu. Surowe odczyty sekwencjonowania były przetwarzane przy użyciu standardowych procedur kontroli jakości, aby usunąć sekwencje adaptorów i odczyty niskiej jakości. Czyste odczyty zostały dostosowane do ludzkiego genomu referencyjnego, a poziomy ekspresji genów zostały odpowiednio zmierzone napoziomie 22,23. Różnicowo ekspresyjne geny (DEG) między HUVEC nadekspresyjnymi circZBTB46 a HUVEC leczonymi NC pod stymulacją LPS zostały zidentyfikowane przy użyciu ustalonych metod statystycznych. Przeprowadzono analizę wzbogacenia zestawów genów (GSEA) w celu identyfikacji szlaków sygnalizacyjnych związanych z nadekspresją circZBTB46. Geny były klasyfikowane na podstawie różnic ekspresji między grupami eksperymentalnymi. Do analizy wzbogacenia wykorzystano wyselekcjonowane zestawy genów z Molecular Signatures Database (MSigDB). Istotność wzbogacenia oceniono na podstawie znormalizowanego wyniku wzbogacenia (NES) oraz wskaźnika fałszywych odkryć (FDR), przy czym statystycznie uznano < FDR 0,25. Sekwencjonowanie CircRNA oraz wszystkie powiązane analizy bioinformatyczne zostały zlecone na zewnątrz.

Identyfikacja DEG
Aby przeprowadzić DEG, poziomy ekspresji między dwiema odrębnymi grupami zostały porównane za pomocą pakietu oprogramowania DESeq (2012) R. Progi istotności statystycznej zostały zdefiniowane jako p < 0,05 z |log2FC| wartość przekraczająca 0,58. Mapa ciepła była generowana przez pakiet pheatmap R, a wykres wulkanu wykorzystywał pakiet R Goplot2 do rysowania.

Analiza wzbogacania funkcjonalnego
Analizy wzbogacania GO i KEGG pochodzące z liniowych transkrypcji przeprowadzono za pomocą platformy internetowej EnrichR, a wykres bąbelków został narysowany na podstawie pakietu GOplot R. Wykorzystano oprogramowanie GSEA, oparte na macierzy ekspresji i plikach zestawu genów dostarczonych przez bazę danych MSigDB, z ustalonym parametrami analizy (np. liczbą permutacji i metodami statystycznymi). Wzbogacenie zestawów genów oceniano przy użyciu normalizowanego wyniku wzbogacenia (NES), wartości P oraz wartości FDR, co pozwoliło na dogłębną analizę funkcji i potencjalnych mechanizmów biologicznych genów wyrażanych różnicowo.

Western blot
Całkowite białko zostało wyekstrahowane z HUVEC (około 1 x 10⁶ komórek) za pomocą buforu lizy RIPA wzbogaconego o inhibitory proteazy i fosfatazy. Stężenie białka zmierzono za pomocą zestawu do ilościowania białek BCA. Równe ilości białka (20 μg na tor) zostały rozdzielone elektroforezą na żelach 10% sodu dodecylowo-poliakrylamidowych (SDS-PAGE) przy napięciu 80 V przez 30 minut, a następnie 120 V przez 60 minut. Następnie białka były przenoszone do membran poliwinylidenfluorku (PVDF) za pomocą systemu transferu mokrego przy napięciu 100 V przez 90 minut w 4 °C. Błony blokowano 5% mlekiem beztłuszczowym w soli fizjologicznej z buforem Tris i 0,1% Tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie inkubowano z przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w tym samym buforze blokującym (zazwyczaj 1:1000 dla białek docelowych i 1:5000 dla GAPDH) w temperaturze 4 °C przez noc. Główne przeciwciała użyte to: ERBB2, p-AKT, AKT i GAPDH. Po inkubacji błony były myte 3 razy (10 minut na płukanie) metodą TBST, a następnie inkubowane przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przeciwciałem IgG przeciw królikom koziczym (HRP) sprzężonym z nadkrzepksianem chrzanem (1:5000 buforu blokującego). Po trzech kolejnych płukaniach TBST (każde po 10 minut) zwizualizowano pasma białkowe za pomocą zestawu Enhanced Chemiluminescence (ECL) Western Blotting Substrate Kit i obrazowano za pomocą systemu obrazowania. Intensywność pasm była ilościowano za pomocą oprogramowania.

Analiza statystyczna
Analizy statystyczne przeprowadzono za pomocą GraphPad Prism 10. Dane są wyświetlane jako średnie ± błędu standardowego średnich (SEM). Zdefiniowano wartość p < 0,05, aby wskazać istotność statystyczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza ekspresji circZBTB46 qRT-PCR w modelu in vitro SA-AKI
Ten zestaw eksperymentów został przeprowadzony w celu przetestowania hipotezy, że ekspresja circZBTB46 ulega zmianie pod wpływem stymulacji LPS oraz że modulacja circZBTB46 wpływa na żywotność komórek śródbłonka i apoptozę w modelu in vitro SA-AKI. Początkowo ekspresję circZBTB46 badało w warunkach kontrolnych oraz w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Podczas sepsy wzorce molekularne związane z patogenami (PAMP), takie jak LPS uwalniane przez patogeny, aktywują receptory podobne do Toll-a (np. TLR4), inicjując ogólnoustrojową odpowiedź zapalną26. Proces ten wywołuje wydzielanie wielu prozapalnych mediatorów, takich jak TNF-α, IL-6 i IL-1β, co skutkuje burzą cytokinową27. Jednocześnie LPS bezpośrednio uszkadza komórki śródbłonka naczyniowego, prowadząc do zaburzeń mikrokrążenia, zwiększonej przepuszczalności naczyniowej o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów. Autorzy deklarują, że główne wyniki przedstawione w tym rękopisie nie zostały wcześniej opublikowane i nie są rozpatrywane pod kątem publikacji w innych miejscach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AG-825 (inhibitor ErbB2)MedChemExpressHY-1019710 μ M jak blokada ścieżki
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BAIntegralność RNA (RIN≥ 7)
Przeciwciało AKTProteintech60203-2-IgWB (1:15000)
Zestaw apoptozowy Annexin V-APC/PIElabscienceE-CK-A327Wykrywanie apoptozy
Antybiotyk przeciwmykotycznyGibco152400621% stężenia
Zestaw do ilościowania białek BCABeyotimeP0012Stężenie białka
KOT ELISA KitMEIMIANMM-0897H2Enzym antyoksydacyjny
Zestaw CCK-8DojindoCK04Badanie żywotności komórki
Seq CircRNAFuzhou Huarong Kehui Biotechnology Co., Ltd.PE150Sekwencjonowanie CircRNA i wszystkie powiązane analizy bioinformatyczne
Cytometr przepływowy CytoFLEXBeckman CoulterB53000Analiza apoptozy
DMEMGibco (Invitrogen)11965092Pożywka hodowla komórkowa
Zestaw podłoża ECLMilliporeWBKLS0100Detekcja białek
Przeciwciało ERBB2Sino Biological100271-T32WB (1:10000)
Serum bydła płodu (FBS)Przemysł biologiczny04-001-1ACSSuplement 10% (v/v)
Przeciwciało GAPDHProteintech60004-1-IgWB (1:50000)
HUVEC-yUkład procelowyCP-H082Źródło linii komórkowej
IL-1β Zestaw ELISAMEIMIANMM-0181H2Czynnik zapalny
Zestaw IL-6 ELISAMEIMIANMM-0049H2Czynnik zapalny
Illumina NovaSeq 6000Illumina20012850Sekwencjonowanie RNA
Lipofektamina 3000InvitrogenL3000008Odczynnik transfekcyjny
LPS (E. coli O111:B4)Sigma-AldrichL263010 μ g/mL dla modelu SA-AKI
MDA ELISA KitMEIMIANMM-2037H2Marker stresu oksydacyjnego
NanoDrop 2000Thermo FisherND-2000Ilościowość RNA
Zestaw biblioteki RNA NEB Ext Ultra IINEBE7770SPrzygotowanie biblioteki RNA-seq
Plazmid oe-circZBTB46GenScriptSynteza niestandardowawektor nadekspresji circZBTB46
Plazmid OE-NCGenScriptSynteza niestandardowaWektor kontroli ujemnej
przeciwciało p-AKT (Ser473)Proteintech66444-1-IgWB (1:1200)
PrimeScript RT Reagent KitTakaraRR047ASynteza cDNA
Membrany PVDFMilliporeIPVH00010Zachodni transfer blot
QuantStudio 5 SystemThermo FisherA28137PCR w czasie rzeczywistym
Rybonukleaza RLucygenRNR07250Usuwanie rRNA
Bufor lizy RIPABeyotimeP0013BEkstrakcja białek
RNAiso PlusTakara9109Całkowita ekstrakcja RNA
SOD ELISA KitMEIMIANMM-25469H2Enzym antyoksydacyjny
TB Green Premix Ex TaqTakaraRR420Aodczynnik qPCR
TNF-α Zestaw ELISAMEIMIANMM-0122H2Czynnik zapalny

Bibliografia

  1. Vincent, J. L. Current sepsis therapeutics. EBioMedicine. 86, 104318(2022).
  2. White, K. C., et al. Sepsis-associated acute kidney injury in the intensive care unit: incidence, patient characteristics, timing, trajectory, treatment, and associated outcomes. Intensive Care Med. 49 (9), 1079-1079 (2023).
  3. Poston, J. T., Koyner, J. L. Sepsis-associated acute kidney injury. BMJ. 364, k4891(2019).
  4. Bora, E. S., Arda, D. B., Erbas, O. The renoprotective effect of tibolone in sepsis-induced acute kidney injury. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub. 168 (4), 311-318 (2024).
  5. van der Slikke, E. C., et al. Sepsis is associated with mitochondrial DNA damage and a reduced mitochondrial mass in the kidney of patients with sepsis-AKI. Crit. Care. 25 (1), 36(2021).
  6. Kuwabara, S., Goggins, E., Okusa, M. D. The pathophysiology of sepsis-associated AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 17 (7), 1050-1069 (2022).
  7. Pais, T., Jorge, S., Lopes, J. A. Acute kidney injury in sepsis. Int J Mol Sci. 25 (11), 5924(2024).
  8. Sun, J., et al. Mitochondria in sepsis-induced AKI. J Am Soc Nephrol. 30 (7), 1151-1161 (2019).
  9. Zheng, Q., et al. PRDM16 suppresses ferroptosis to protect against sepsis-associated acute kidney injury by targeting the NRF2/GPX4 axis. Redox Biol. 78, 103417(2024).
  10. Beltrán-García, J., et al. Circular RNAs in sepsis: biogenesis, function, and clinical significance. Cells. 9 (6), 1544(2020).
  11. Xu, X., et al. CircRNA inhibits DNA damage repair by interacting with host gene. Mol Cancer. 19 (1), 128(2020).
  12. Chen, Y., et al. Non-coding RNAs in sepsis-associated acute kidney injury. Front Physiol. 13, 830924(2022).
  13. Peng, X., et al. Discovery and verification of mmu_Circ_26986/hsa_Circ_0072463 as a potential biomarker and intervention target for sepsis-associated acute kidney injury. Cell Mol Life Sci. 81 (1), 154(2024).
  14. Li, X., et al. Circ_001653 alleviates sepsis-associated acute kidney injury by recruiting BUD13 to regulate KEAP1/NRF2/HO-1 signaling pathway. J Inflamm (Lond). 21 (1), 37(2024).
  15. Hunt, M. A., Currie, M. J., Robinson, B. A., Dachs, G. U. Optimizing transfection of primary human umbilical vein endothelial cells using commercially available chemical transfection reagents. J Biomol Tech. 21 (2), 66-72 (2010).
  16. Kocherova, I., et al. Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) co-culture with osteogenic cells: from molecular communication to engineering prevascularised bone grafts. J Cell Mol Med. 23 (8), 5253-5267 (2019).
  17. Duan, Z. Y., et al. U6 can be used as a housekeeping gene for urinary sediment miRNA studies of IgA nephropathy. Sci Rep. 8 (1), 10875(2018).
  18. Veryaskina, Y. A., Titov, S. E., Zhimulev, I. F. Reference genes for qPCR-based miRNA expression profiling in 14 human tissues. Med Princ Pract. 31 (4), 322-332 (2022).
  19. Demirci-Çekiç, S., et al. Biomarkers of oxidative stress and antioxidant defense. Arch Biochem Biophys. 724, 109077(2022).
  20. Ighodaro, O. M., Akinloye, O. A. First line defence antioxidants—superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx): their fundamental role in the entire antioxidant defence grid. Alexandria J Med. 54 (4), 287-293 (2018).
  21. Del Rio, D., Stewart, A. J., Pellegrini, N. A review of recent studies on malondialdehyde as toxic molecule and biological marker of oxidative stress. Nutr Metab Cardiovasc Dis. 15 (4), 316-328 (2005).
  22. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows–Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  23. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. , https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2026).
  24. Dauphinee, S. M., Karsan, A. Lipopolysaccharide signaling in endothelial cells. Lab Invest. 86 (1), 9-22 (2006).
  25. Li, F., et al. Qiliqiangxin alleviates Ang II-induced CMEC apoptosis by downregulating autophagy via the ErbB2–AKT–FoxO3a axis. Life Sci. 273, 119239(2021).
  26. Cicchinelli, S., et al. PAMPs and DAMPs in sepsis: a review of their molecular features and potential clinical implications. Int J Mol Sci. 25 (2), 962(2024).
  27. Das, U. N. Infection, inflammation, and immunity in sepsis. Biomolecules. 13 (9), 1322(2023).
  28. Zhou, W. Y., et al. Circular RNA: metabolism, functions and interactions with proteins. Mol Cancer. 19 (1), 172(2020).
  29. Li, S., et al. CircZBTB46 predicts poor prognosis and promotes disease progression of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukemia. Clin Exp Med. 23 (8), 4649-4664 (2023).
  30. Fu, Y., et al. Circular RNA ZBTB46 depletion alleviates the progression of atherosclerosis by regulating the ubiquitination and degradation of hnRNPA2B1 via the AKT/mTOR pathway. Immun. Ageing. 20 (1), 66(2023).
  31. Long, F., et al. CircZBTB46 protects acute myeloid leukemia cells from ferroptotic cell death by upregulating SCD. Cancers (Basel). 15 (2), 459(2023).
  32. Uckun, F. M., Qazi, S. Upregulated expression of ERBB2/HER2 in multiple myeloma as a predictor of poor survival outcomes. Int J Mol Sci. 24 (12), 9943(2023).
  33. Moutafi, M., et al. Quantitative measurement of HER2 expression to subclassify ERBB2-unamplified breast cancer. Lab Invest. 102 (10), 1101(2022).
  34. Wei, D., et al. KIF11 promotes cell proliferation via ERBB2/PI3K/AKT signaling pathway in gallbladder cancer. Int J Biol Sci. 17 (2), 514-526 (2021).
  35. Fan, K., et al. ERBB2 S310F mutation independently activates PI3K/AKT and MAPK pathways through homodimers to contribute to gallbladder carcinoma growth. Med Oncol. 39 (5), 64(2022).
  36. Zhu, W., et al. Macrophage migration inhibitory factor facilitates the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cell-derived exosomes in acute myocardial infarction through upregulating miR-133a-3p. J Nanobiotechnol. 19 (1), 61(2021).
  37. Du, H., et al. Anti-leukemia activity of polysaccharide from Sargassum fusiforme via the PI3K/AKT/BAD pathway in vivo and in vitro. Mar Drugs. 21 (5), 289(2023).
  38. Wang, W., et al. Hydroxysafflor yellow A ameliorates alcohol-induced liver injury through PI3K/Akt and STAT3/NF-κB signaling pathways. Phytomedicine. 132, 155814(2024).
  39. Yao, L., et al. Finerenone ameliorates mitochondrial dysfunction via PI3K/Akt/eNOS signaling pathway in diabetic tubulopathy. Redox Biol. 68, 102946(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

CircZBTB46uszkodzenie lipopolisacharydoweregulacja apoptozytest żywotności komórekcytometria przepływowaostre uszkodzenie nerek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.