Artykuł metodologiczny

Modelowanie insulinooporności adipocytów przy użyciu podskórnej frakcji naczyniowej pochodzenia tkankowego z myszy

DOI:

10.3791/69769

⸱

27 marca 2026

 ,  , 
1State Key Laboratory of Pathogenesis, Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia, Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology for Endemic Diseases, Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Xinjiang Medical University, 2Changzhou Third People's Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie przedstawia eksperymentalny protokół wykorzystujący frakcję naczyniową stromalną pochodzącą z podskórnej tkanki tłuszczowej myszy i leczoną deksametazonem w celu symulacji insulinooporności. Dzięki zachowaniu złożoności tkanki tłuszczowej oferuje fizjologicznie autentyczną platformę do badań mechanistycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insulinooporność tkanki tłuszczowej jest kluczową cechą zaburzeń metabolicznych, takich jak cukrzyca typu 2, jednak wiele modeli in vitro opiera się na uwiecznionych liniach komórkowych, które w niepełni odzwierciedlają złożoność komórkową rodzimej tkanki tłuszczowej. Celem tego protokołu jest ustanowienie powtarzalnej i eksperymentalnie dostępnej metody modelowania insulinooporności adipocytów z wykorzystaniem adipocytów pierwotnych pochodzących z frakcji naczyniowej stromalnej (SVF) podskórnej tkanki tłuszczowej myszy. Protokół opisuje izolację komórek SVF przez trawienie enzymatyczne, ich adipogeniczną różnicację do dojrzałych adipocytów bogatych w lipidy oraz późniejszą indukcję insulinooporności przy użyciu deksametazonu. Insulinooporność jest operacyjnie definiowana i weryfikowana poprzez odczyty funkcjonalne i molekularne, w tym zmniejszone pobieranie i spożycie glukozy stymulowane insuliną, a także zmniejszoną fosforylację kluczowych białek sygnalizujących insulinę w szlaku PI3K-AKT. Zachowując heterogeniczność komórek pochodzącą z SVF, podejście to zapewnia system oparty na komórkach pierwotnych, który wspiera badania sygnalizacji insuliny adipocytów w warunkach bardziej zbliżonych do fizjologii tkanki tłuszczowej niż konwencjonalne linie komórkowe. Protokół ten jest przeznaczony dla badaczy poszukujących standaryzowanej platformy do badania mechanizmów insulinooporności adipocytów lub oceny interwencji metabolicznych, przy jednoczesnym uwzględnieniu, że odczyty odzwierciedlają odpowiedzi z mieszanej kultury pochodzącej od SVF, a nie z populacji oczyszczonych adipocytów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cukrzyca typu 2 (T2DM) stała się jedną z najszybciej rosnących niezakaźnych chorób metabolicznych na świecie, z łączną liczbą pacjentów przekraczającą obecnie 537 milionów i prognozowanym wzrostem liczby pacjentów do 2045roku. Jego podstawowe cechy patofizjologiczne objawiają się insulinoopornością tkanek obwodowych (IR), któremu towarzyszy postępująca dysfunkcja β-komórek2. Istota IR tkwi w znacząco zmniejszonych efektach biologicznych wywołanych fizjologicznie skoncentrowaną insuliną w narządach docelowych, prowadzącymi do zmniejszonego pobierania glukozy, zwiększonej produkcji glukozy wątrobowej oraz zaburzeń inhibicji lipolizy3. Tkanka tłuszczowa jest jednym z najważniejszych narządów docelowych insuliny. Otyłość powoduje, że komórki tłuszczowe stają się niewrażliwe na insulinę, zmniejszając pobieranie glukozy, hamując syntezę trójglicerydów, jednocześnie zwiększając lipolizę i uwalniając więcej wolnych kwasów tłuszczowych, co nasila ogólnoustrojową insulinooporność 4,5.

W warunkach fizjologicznych insulina aktywuje szlak PI3K-AKT, który przenosi transporter glukozy 4 (GLUT4) do błony komórkowej, wspierając pobieranie glukozy i syntezę trójglicerydów w adipocytach. Jednocześnie insulina hamuje aktywność lipasy trójglicerydowej (ATGL) oraz lipazy hormonalnie wrażliwej (HSL) na powierzchni kropelek lipidów, blokując tym samym lipolizę6. Gdy występuje IR, zaburzone sygnalizowanie insuliny osłabia hamowanie lipolizy, prowadząc do masowego uwalniania wolnych kwasów tłuszczowych (FFA) do krwiobiegu. Powoduje to masowe uwalnianie FFA do krwiobiegu, powodując osadzanie trójglicerydów pozamaccznych w narządach takich jak wątroba, mięśnie szkieletowe i trzustka. Powoduje to toksyczność warg i przewlekły stan zapalny, co ostatecznie przyczynia się do rozwoju i postępu T2DM7. Dlatego ustanowienie dojrzałego modelu adipocytów, który odtwarza cechy IR in vivo , jest kluczowe dla wyjaśnienia molekularnych mechanizmów IR i opracowania nowych strategii interwencji.

Obecnie linia komórkowa fibroblastów embrionalnych myszy 3T3-L1 stała się klasycznym narzędziem do badań in vitro adipocytów IR ze względu na krótki cykl indukcji i dobrą powtarzalność 8,9. Jednak embrionalne pochodzenie komórek 3T3-L1, ich jednolite tło genetyczne oraz podatność na dryf fenotypowy po długotrwałym przejściu powodują istotne różnice w zachowaniach metabolicznych w porównaniu z dorosłymi adipocytami in situ, ograniczając ich wartość translacyjnąmedyczną 10,11. Natomiast frakcja naczyniowa stromalna (SVF) wyizolowana z podskórnej tkanki tłuszczowej gryzoni jest bogata w wielopotentne komórki tłuszczowe macierzyste (ASC). Dojrzałe adipocyty odróżnione od tych ASC wykazują cechy morfologiczne, funkcjonalne i transkrypcyjne, które bardziej przypominają cechy rodzimych białych adipocytów niż szeroko stosowaną linię komórkową 3T3-L1. Dzięki temu adipocyty pochodzące z SVF są modelem uzupełniającym do badania sygnalizacji i oporności insulinowej w kontekście lepiej przybliżającym złożoność tkanek pierwotnych12.

Protokół ten jest najbardziej odpowiedni dla badaczy dążących do badania działania insuliny w pierwotnym modelu adipocytów, który zachowuje większą heterogeniczność tkanek niż uwiecznione linie komórkowe. Jednak użytkownicy powinni pamiętać, że SVF to mieszana populacja zawierająca komórki śródbłonka i układu odpornościowego; Dlatego odczyty odzwierciedlają zachowanie kultury, w której adipocyty są głównym, ale nie wyłącznym składnikiem. Model ten może być mniej odpowiedni do badań wymagających czystej, zsynchronizowanej populacji adipocytów.

Niniejsze badanie proponuje protokół budowy modelu komórek insulinoopornych, wykorzystując dojrzałe adipocyty pochodzące z SVF. Protokół szczegółowo opisuje cały proces izolacji, hodowli, różnicowania i indukcji insulinooporności, skutecznie naśladując stan insulinooporności adipocytów in vivo. Ocena modelu zostanie przeprowadzona pod kątem poziomu zużycia glukozy, morfologii komórkowej oraz mechanizmów molekularnych. Stanowi to podstawę techniczną do badania molekularnych mechanizmów leżących u podstaw insulinooporności w adipocytach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Eksperymentalnej na Zwierzętach Uniwersytetu Medycznego w Xinjiangu (Etyczne Zatwierdzenie nr IAGUC-20240228-41).

1. Izolacja SVF

  1. Zwierzęta eksperymentalne: Używaj myszy o klasie SPF C57BL/6J ważących 9-11 g. Trzymaj je w temperaturze 22 ± 2 °C w ramach 12-godzinnego cyklu światła i ciemności, z darmowym dostępem do jedzenia i wody.
  2. Przygotowanie sterylne: Autoklawuj wszystkie instrumenty i materiały zużywalne w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Przed eksperymentami spryskaj laminarny okap 75% etanolem i napromieniuj UV przez ≥15 minut. Wszystkie procedury przeprowadzaj w szafie biobezpieczeństwa klasy II. Noś sterylne rękawiczki i maseczki.
  3. Pobieranie tkanek tłuszczowych: Eutanazja myszy przez inhalację dwutlenkiem węgla, a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Natychmiast zanurz w 75% etanolu na 10 minut w celu dezynfekcji powierzchni. Za pomocą sterylnych nożyczek okulistycznych wykonaj okrągłe nacięcie wzdłuż linii środkowej klatki piersiowej i brzucha. Wykonaj tępe rozwarstwienie, aby odsłonić obustronną białą tkankę tłuszczową pachwinową, znajdującą się na wewnętrznej stronie uda i wychodzącą w kierunku okolicy jąder w kształcie litery V. Ostrożnie usuń wszelkie widoczne węzły chłonne. Pobierz tkankę tłuszczową do wcześniej schłodzonego PBS i wykonaj trzy szybkie płukania.
  4. Trawienie kolagenazą: Natychmiast przenieś umytą tkankę tłuszczową do sterylnej misy hodowlowej i posiekaj na fragmenty o pojemności 1-2 mm³. Dodaj 0,2% kolagenazę typu II (rozpuszczoną w PBS Dulbecco, pH 7,4, podgrzaną do 37 °C) z objętością 1,5-2x większą niż objętość tkanki. Inkubuj w temperaturze 37 °C na shakerze o stałej temperaturze przy 100 obr./min przez 10 minut. Delikatnie odwracaj co 3 minuty, żeby uniknąć nadmiernego trawienia.
  5. Zakończenie i filtracja: Po zakończeniu trawienia należy dodać równą objętość podgrzanego kompletnego medium (DMEM/F-12 + 10% FBS + 1% penicylina-streptomycyny) w temperaturze 37 °C, aby zakończyć reakcję. Delikatnie pipetuj 5x-8x za pomocą końcówki 1 mL. Przefiltruj przez sitko komórkowe o pojemności 70 μm, aby usunąć niestrawione fragmenty tkanek i dojrzałe adipocyty.
  6. Wirowanie i mycie: Wiruj filtrat w 300 x g przez 5 minut w 25 °C. Ostrożnie wyrzucaj supernatant zawierający dojrzałe adipocyty. Ponownie zawiesij śrut w pełnym medium. Ponownie wiruj w 300 x g przez 5 minut w 25 °C. Powtarzaj ten proces mycia 2 razy, aby usunąć pozostałości kolagenazy i wszelkie dojrzałe adipocyty.
  7. Siew i hodowla: Ponownie zawiesz ostatni granulat w 1 mL kompletnego medium. Nasiona w gęstości 4 próbek tłuszczu pachwinowego myszy na miskę do hodowli komórek o pojemności 10 cm. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO₂. Pierwszą zmianę podłoża wykonaj po 24 godzinach, aby usunąć komórki nieprzywierające. Następnie zmieniaj medium co 48 godzin. Przepuszczaj komórki, gdy osiągną 80%-90% zbiegu.
    UWAGA: Nie przepuszczaj komórek, gdy konfluencja przekracza 90%, ponieważ komórki osiągnęły hamowanie kontaktu, a ich zdolność proliferacji jest zmniejszona.

2. Przygotowanie roztworu roboczego kolagenazy typu II

  1. Odczynniki i materiały spalalne: Uzyskanie kolagenazy typu II (aktywność ≥ 120 U/mg); BSA (Beztłuszczowe ≥ 98%); HEPES; PBS Dulbecco (zawierający Ca²⁺ 1,8 mmol/L, Mg²⁺ 0,9 mmol/L), pH 7,2-7,4; 0,22 μm sterylny filtr o niskim wiązaniu białek.
  2. Przygotowanie roztworu kolagenazy typu II 0,2%: Ważyć 60 mg proszku kolagenazy typu II, 800 mg BSA i 48 mg HEPES w probówce wirówki o pojemności 50 mL. Rozcieńcz do 40 mL z PBS Dulbecco. Reguluj pH do 7,4 ± 0,1, używając 1 M NaOH lub HCl. Sterylizuj przez filtr przez filtr 0,22 μm. Należy zachować 5 mL w probówce i przechowywać w temperaturze -20 °C. Unikaj powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
  3. Indukuj różnicowanie, gdy komórki osiągną 100% zbiegu po przejściu. Optymalny stan różnicowania wskazuje morfologia przypominająca wiry. Przez pierwsze 48 godzin używaj roztworu indukcyjnego I, następnie przejdź do roztworu indukcyjnego II (Tabela 1).
  4. Potwierdź skuteczną różnicację według następujących kryteriów: do 4. dnia indukcji barwienie olejowym kolorem O ujawnia akumulację kropelek lipidowych w większości komórek (około 50%), a także statystycznie istotny wzrost (p < 0,05) ekspresji kluczowych markerów adipogenezy.

3. Ustanowienie modelu insulinooporności

  1. Wybierz dzień różnicowania 4 jako punkt wyjścia do wywołania insulinooporności. Potwierdź pod mikroskopem, że wszystkie komórki wykazują morfologiczne przejście od wrzecionowego do okrągłego, przy czym cytoplazma większości komórek wypełniona jest kroplami lipidów o wysokim współczynniku załamania.
  2. Zamień medium na medium indukcyjne II o pojemności 1 μmol/L Dex i kontynuuj kultywację przez 48 godzin (Tabela 1). Po tej procedurze rozważmy model adipocytów insulinoopornych. Należy zauważyć, że te komórki nie wykazują dalszych zmian morfologicznych. Używaj tych komórek bezpośrednio do testów pobierania/spożycia glukozy oraz do wykrywania białek szlaków sygnalizacyjnych insuliny.
  3. Kryteria skutecznego ustanowienia modelu insulinooporności: Po 48 godzinach leczenia deksametazonem potwierdzaj, że zdolność wychwytu glukozy w większości komórek stymulowanych insuliną 100 nM spada o około 40%. Potwierdzaj także statystycznie istotne zmniejszenie (p < 0,05) poziomu fosforylacji kluczowych białek szlaku sygnalizacyjnego insuliny.
    UWAGA: Proces ten wymaga ciągłego dodawania indukcyjnego medium utrzymania II.

4. Wykrywanie pozostałości glukozy w supernatancie hodowli

  1. Zbieraj supernatanty hodowli komórkowych w wyznaczonym momencie. Usuwanie komórek przez wirowanie w temperaturze 4 °C i 300 x g przez 5 minut.
  2. Zmierz stężenie glukozy w supernatantach za pomocą zestawu do testowania glukozoksydazy-peroksydazy (GOD-POD). Oblicz stężenia według wzoru:
    Stężenie glukozy (mmol/L) = (A(próbka) - A(pusty)) / (A(standardowy) - A(pusty)) * C(standardowy)
    Spożycie glukozy (mmol/L) = Stężenie glukozy w ośrodku wolnym od komórek (mmol/L) - Stężenie glukozy w supernatancie komórki (mmol/L)
    Znormalizowane spożycie glukozy (mmol/mg białka) = Surowe spożycie glukozy (mmol/L) / całkowite stężenie białka komórkowego (mg/L)

5. Western blot

  1. Stymuluj komórki w wyznaczonym momencie insuliną 100 nM w pełnym medium przez 10 minut w temperaturze 37 °C, aby aktywować szlak PI3K-AKT. Następnie do każdej miski hodowli o powierzchni 3,5 cm należy dodać 200 μL buforu lizy komórkowej. Inkubuj na lodzie przez 30 minut. Wirówka w 13 040 x g przez 10 minut w 4 °C. Przelej supernatant do nowej rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Ilościowo określ stężenie białka za pomocą roztworu roboczego BCA.
  2. Załaduj próbki na żel SDS-PAGE o stężeniu 8%. Uruchom żel na 80 V, aż próbki dotrą do granicy żelu układającego/separacyjnego. Zwiększ napięcie do 120 V i pracuj, aż pasma markerów będą w pełni rozdzielone. Wykonaj transfer przy stałym prądzie 200 mA przez 2 godziny.
  3. Inkubuj błonę w temperaturze pokojowej z 5% odtłuszczonego mleka lub BSA przez 2 godziny, aby ją zablokować. Umyj membranę 3 razy TBST. Następnie inkubuj z pierwotnym przeciwciałem przez noc w temperaturze 4 °C. Przeciwciała pierwotne (rozcieńczenie): AKT: 1:1000, p-AKT (Ser473): 1:1000, β-Akt: 1:1000, PI3K p110α: 1:1000, Phospho-PI3K s110: 1:1000, C/EBPα: 1:2000, FABP4: 1:2000.
  4. Umyj membranę 3 razy TBST. Następnie inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z HRP w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Przeciwciała wtórne (rozcieńczenie): IgG-HRP dla kóz przeciw myszym: 1:5000, przeciw kozom IgG-HRP: 1:5000.
  5. Wykrywaj sygnał za pomocą chemiluminescencji ECL. Wizualizuj i rejestruj wyniki eksperymentów za pomocą obrazowania Western Blot.
  6. Przeanalizuj wartości w skali szarości powstałych pasm za pomocą oprogramowania ImageJ.

6. Badanie barwienia wychwytu glukozy

  1. Ogniwa głodzić w dwóch określonych punktach przez 12 godzin osobno, używając RPMI 1640 zawierającego 1% FBS, aby wyeliminować zakłócenia wynikające z glukozy bazalnej.
  2. Po 10 minutach stymulacji insuliną 100 nM dodaj 1 ml 1 ml roztworu 2-NBDG do każdego dołku. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, chronioną przed światłem.
  3. Myj komórki 2x-3x. Dodaj 1 ml gotowego do użycia roztworu barwiącego Hoechst do każdego dołka. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C w ciemności przez 10 minut. Roztwór barwiący należy dodawać powoli wzdłuż bocznej ścianki naczynia hodowlanego, unikając bezpośredniego kontaktu z warstwą komórkową, aby zapobiec odłączaniu komórek.
  4. Umyj komórki 2x-3x, potem dodaj PBS. Wykonaj zdjęcia fluorescencyjne komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.
  5. Wykonaj analizę ilościową obrazów za pomocą oprogramowania ImageJ. Użyj ImageJ, aby oddzielić każdy kanał, izolując sygnał pochłaniania glukozy (zielony kanał) od sygnału fluorescencji jądrowej (niebieski kanał).
  6. Przekonwertuj wszystkie obrazy na 8-bitowe obrazy w skali szarości. Zastosuj domyślny algorytm automatycznego progowania do definiowania obszarów dodatniego sygnału.
  7. Zmierz średnią intensywność fluorescencji w tych wyznaczonych obszarach. Normalizuj sygnał fluorescencji pobierania glukozy, dzieląc średnią intensywność fluorescencji kanału zielonego przez odpowiadającą średnią intensywność fluorescencji kanału niebieskiego.

7. Barwienie olejowoczerwone O

  1. Rozcieńcz roztwór Oil Red O wodą wolną od RNazy w proporcji 3:2. Przefiltruj roztwór sekwencyjnie przez papier filtracyjny i filtr 0,22 μm, aby przygotować roztwór roboczy.
  2. Aspiruj podłoże z hodowli komórkowych i delikatnie przemyj komórki 2 razy PBS. Dodaj 4% paradehydu do każdego dołka i unieruchom komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Dodaj utrwalacz i umyj komórki podwójnie destylowaną wodą. Dodaj 1 ml roztworu roboczego Oil Red O do każdego odwiertu. Inkubuj talerz w temperaturze pokojowej w ciemności przez 25 minut.
  4. Po barwieniu zasysaj roztwór barwiący. Dokładnie umyj komórki wodą destylowaną, aby usunąć tło i zabarwić artefakty. Dodaj 1 mL wody destylowanej, aby pokryć komórki. Natychmiast uchwyć obrazy w jasnym polu za pomocą mikroskopu odwróconego.

8. BODIPY

  1. Rozcieńcz roztwór BODIPY wodą sterylną w stosunku objętościowym 1:200, aby przygotować roztwór roboczy.
  2. Umyj pokrywki komórek sterylnym PBS. Dodaj 30 μL 4% roztworu paraformaldehydu do każdego pokrywaka i utrwal w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  3. Aspiruj utrwalacz i myj 3 razy PBS. Dodaj 30 μL roztworu roboczego BODIPY do każdego pokrywaka komórki. Inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut.
  4. Okładki wyprać 3 razy PBS. Dodaj 30 μL bejcy DAPI do każdego slipu. Inkubuj w temperaturze pokojowej w ciemności przez 10 minut, aby oznaczać jądra komórkowe.
  5. Okładki wyprać jeszcze trzy razy PBS. Przystąpić do montażu: Dodaj 10 μL medium antyfade na czyste szkiełko mikroskopowe. Za pomocą kleszczy delikatnie odwróć pokrywę komórki (od strony komórki do dołu) na nośnik montażowy. Pozwól montantowi wyschnąć w ciemności.
  6. Natychmiast wykonuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego z laserowym skaningiem.

9. Analiza statystyczna

  1. Każdy eksperyment obejmował trzy biologiczne repliki. Analizuj dane za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 10.0. Przedstawienie danych ilościowych spełniających kryteria rozkładu normalnego jako średnia ± odchylenia standardowego (średnia ± SD). Dla dwóch grup spełniających normalność i jednorodność wariancji należy zastosować niezależny test t-test. Dla wielu grup wykonaj jednokierunkową ANOVA, p < 0,05 jest uznane za istotne statystycznie.

10. Bezpieczeństwo i utylizacja odpadów

  1. Obsługa tkanek zwierzęcych
    1. Wszystkie procedury z udziałem komórek pierwotnych w szafce biologicznej klasy II w warunkach sterylnych wykonuje się wszystkie procedury z udziałem komórek pierwotnych.
    2. Klasyfikować wszystkie odpady tkankowe zwierzęce, nieużywane organy oraz skażone materiały zużywalne jako odpady biologicznie niebezpieczne. Takie odpady umieszczaj w wyznaczonych workach biologicznych, przetwarzaj je przez autoklaw, a następnie utylizuj.
  2. Obsługa deksametazonu
    1. Zakładaj rękawiczki, maski medyczne i fartuchy laboratoryjne podczas ważenia proszku Dex. Przygotowanie roztworu przeprowadz w okapie chemicznym.
    2. Zbieraj odpady skażone Dex osobno i utylizuj je jako odpady chemiczne.
  3. Obsługa materiałów biologicznych niebezpiecznych
    1. Dokładnie zdezynfekuj powierzchnie robocze oraz wnętrze szafek biosafety 70% etanolem przed rozpoczęciem procedur eksperymentalnych.
    2. Upewnij się, że wszystkie ciekłe odpady powstałe z hodowli komórkowej są autoklawowe, aby stały się niezakaźne przed utylizacją.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki SVF wyizolowane z iWAT myszy C57BL/6J wykazywały punktowaną zawieszinę podczas pierwszego wysiewania w naczyniach hodowlanych. Około 40% komórek zakończyło pierwotne przyczepienie po 18 godzinach siewu; do 5. dnia po zasiewaniu komórki były w pełni rozprzestrzenione, a zbieg sięgał 95% (Rysunek 1A,B). Gdy komórki osiągały zbieg i wykazywały charakterystyczny układ przypominający wiry, ośrodek różnicujący był zastępowany. Do czwartego dnia indukcji w komórkach widoczn...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szerokie badania wskazują, że modele oparte na komórkach SVF oferują unikalną wartość w symulacji cech patologicznych tkanki tłuszczowej. Jednak długi cykl budowy tych modeli, który zazwyczaj wymaga około 14 dni na izolację tkanek, hodowlę pierwotną, indukowaną różnicację i leczenie Dex, stanowi wyzwanie dla ciągłości eksperymentu i stabilności stanu komórkowego. Aby sprostać tym wyzwaniom, badanie przyjęło i zoptymalizowało eksperymentalny workflow oparty na następujących kluczowych kryteriach: (1) Wybór zdrowych młodyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują konfliktu interesów w tej pracy.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82260177) oraz Państwowe Kluczowe Laboratorium Patogenezy, Prewencii i Leczenia Chorób o wysokiej zachorowalności w programie Azji Centralnej (SKL-HIDCA-2023-20). Agencja finansująca nie miała wpływu na projekt, realizację ani interpretację tego badania. Agencja finansująca nie brała udziału w pisaniu ani zgłaszaniu tego rękopisu do publikacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,22 μ Filtr mBiosharpBSF-XS-0232-01
2-NBDGBeyotimeS0561M
3-izobutyl-1-metyloksantynaSigma15879
4% poliformaldehyduBiosharpBL1278A
70 & mu; Sitnik komórek MBiosharpBS-70-CS
Anti-AKTProteintech10175
Anti-C/EBP&alfa;AbcloneAB40764
Anti-FABP4Technologia Sygnalizacji Komórkowej (Technologia Sygnalizacji Komórkowej );LATA 2120.
Anti-pAKT (Ser473)Proteintech28731
Anti-PI3K Bioss10657R
Anti-pPI3K (s. 110)Bioss6417R
Anti-β-ACTINProteintech60008
Zestaw do testowania białek BCAThermo Fisher23225
BODIPY 493/503InvitrogenD3922
BSA SigmaA7030
Plasterki wspinające się po komórkach Biosharp BiosharpBS-14-RC
Talerz do hodowli komórek, 100mm x 20mmCorning430167
Talerz do hodowli komórek, 35 mm x 10 mmCorning430165
Rozwiązanie DAPISolarbio28718-90-3
DeksametazonSigmaD2915
DMEM/F-12GibcoC11330500BT
Dulbecco' s PBSCytivaSH30264.02
Rurka EppendorfaCorningMCT-175-C 
FBSLife-iLabAC03L0555
Mikroskop fluorescencyjnyLeicaDMi8
Oksydaza glukoza-peroksydazaNankin, JianchengF006-1-1
IgG-HRP przeciwmyszy dla kózPekin Zhongshan JinqiaoZB-2305
IgG-HRP przeciwkrólikowy dla kózPekin Zhongshan JinqiaoZB-2301
GraphPad PrismWersja 10.0.0/
HepesBioFroxx1112GR025
HochestbiosharpBL803A
ImageJWersja 1.54p/
InsulinaSolarbio18040
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalnyNikon  Ti-E
Montaż Medium antyfadingSolarbioS2100
Roztwór barwienia olejowoczerwonym OSigmaO0625-25G
Penicylina-StreptomycynaHiklonSV30010
Bufor RIPAThermo Fisher89901
RosiglitazonSigmaR2408
RPMI 1640VivaCellC3010-0500
Mleko odtłuszczone w proszkuBioFroxx1132GR500
Bufor TBSSolarbioT1060
Kolagenaza typu IISigmaC6885

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. NCD Risk Factor Collaboration (NCD-RisC). Worldwide trends in underweight and obesity from 1990 to 2022: a pooled analysis of 3663 population-representative studies with 222 million children, adolescents, and adults. Lancet. 403 (10431), 1027-1050 (2024).
  2. Stumvoll, M., Goldstein, B. J., van Haeften, T. W. Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy. Lancet. 365 (9467), 1333-1346 (2005).
  3. Arkan, M. C., et al. IKK-beta links inflammation to obesity-induced insulin resistance. Nat Med. 11 (2), 191-198 (2005).
  4. Li, M., et al. Trends in insulin resistance: insights into mechanisms and therapeutic strategy. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 216(2022).
  5. Miao, Z., et al. The causal effect of obesity on prediabetes and insulin resistance reveals the important role of adipose tissue in insulin resistance. PLoS Genet. 16 (9), e1009018(2020).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Segalla, L., Chirumbolo, S., Sbarbati, A. Dermal white adipose tissue: Much more than a metabolic, lipid-storage organ. Tissue Cell. 71, 101583(2021).
  8. Hoehn, K. L., et al. IRS1-independent defects define major nodes of insulin resistance. Cell Metab. 7 (5), 421-433 (2008).
  9. Zhou, X., Wang, L. L., Tang, W. J., Tang, B. Astragaloside IV inhibits protein tyrosine phosphatase 1B and improves insulin resistance in insulin-resistant HepG2 cells and triglyceride accumulation in oleic acid (OA)-treated HepG2 cells. J Ethnopharmacol. 268, 113556(2021).
  10. Liu, X., Liu, X. N., Li, T. J., Liu, B. Research Progress of the Differentiation of 3T3-L1 Preadipocytes into Mature Adipocytes. Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 39 (5), 727-731 (2017).
  11. Rosen, E. D., Spiegelman, B. M. What we talk about when we talk about fat. Cell. 156 (1-2), 20-44 (2014).
  12. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 7 (2), 211-228 (2001).
  13. Tan, S. X., et al. Selective insulin resistance in adipocytes. J Biol Chem. 290 (18), 11337-11348 (2015).
  14. Zebisch, K., Voigt, V., Wabitsch, M., Brandsch, M. Protocol for effective differentiation of 3T3-L1 cells to adipocytes. Anal Biochem. 425 (1), 88-90 (2012).
  15. Wang, T., Sharma, A. K., Wolfrum, C. Novel insights into adipose tissue heterogeneity. Rev Endocr Metab Disord. 23 (1), 5-12 (2022).
  16. Taniguchi, C. M., et al. Divergent regulation of hepatic glucose and lipid metabolism by phosphoinositide 3-kinase via Akt and PKClambda/zeta. Cell Metab. 3 (5), 343-353 (2006).
  17. Jacinto, E., et al. SIN1/MIP1 maintains rictor-mTOR complex integrity and regulates Akt phosphorylation and substrate specificity. Cell. 127 (1), 125-137 (2006).
  18. Cozzone, D., et al. Isoform-specific defects of insulin stimulation of Akt/protein kinase B (PKB) in skeletal muscle cells from type 2 diabetic patients. Diabetologia. 51 (3), 512-521 (2008).
  19. Sakoda, H., et al. Dexamethasone-induced insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes is due to inhibition of glucose transport rather than insulin signal transduction. Diabetes. 49 (10), 1700-1708 (2000).
  20. Burén, J., Liu, H. X., Jensen, J., Eriksson, J. W. Dexamethasone impairs insulin signalling and glucose transport by depletion of insulin receptor substrate-1, phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B in primary cultured rat adipocytes. Eur J Endocrinol. 146 (3), 419-429 (2002).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sygnalizacja insulinowar nicowanie adipogennepob r glukozymodel insulinooporno ciszlak PI3K AKTindukcja deksametazonempierwotne adipocyty

Powiązane artykuły