$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Badanie to objęło 30 pacjentów częściowo bezzębnych, którzy skorzystali z opieki protetycznej w Klinice Protetyki Stomatologicznej, Uniwersyteckim Centrum Klinicznym Stomatologii w Kosowie, w okresie od września 2021 do marca 2022 roku. Uzyskano etyczną zgodę od instytucjonalnej komisji przeglądowej (Zatwierdzenie nr 378/19), a wszystkie procedury były zgodne z zasadami Deklaracji Helsińskiej. Wszyscy uczestnicy uzyskali pisemną świadomą zgodę.
Wielkość próby została ustalona na podstawie wcześniejszych badań, które wskazują, że 11 do 30 uczestników wystarcza, aby uzyskać istotne wyniki w parametrach mikrobiologicznych i przyzębia u osób noszących RPD21,23. Zakładając dwustronny test t w parze z poziomem alfa 0,05, analiza mocy wskazała, że próba 28 uczestników zapewniłaby 80% mocy do wykrycia statystycznie istotnej różnicy o tej wielkości. Aby uwzględnić potencjalne rezygnacje, zgłosiliśmy 30 uczestników. Ponadto okres obserwacji wynoszący trzy miesiące wystarczył, aby zaobserwować wzrost obciążenia bakteryjnego u tych pacjentów24.
Kwalifikującymi się pacjentami byli pierwsi użytkownicy aparatów protetycznych, prezentujący się zarówno z naturalnym uzębieniem sąsiednim, jak i antagonistycznym. Kryteria wykluczenia obejmowały: głębokości sondowania >4 mm, status immunosłabiony (np. chemioterapia), stosowanie antybiotyków w ciągu ostatnich 90 dni, intensywne palenie (>25 papierosów/dzień) oraz zaburzenia poznawcze utrudniające zrozumienie procedur RPD.
Wszyscy uczestnicy otrzymali RPD z uchwytem wykonanymi z ramy metalowej kobalt-chrom oraz żywicy akrylowej (polimetylometakrylan). Projekt każdego RPD był dostosowany do klasyfikacji zębów, jakości grzbietu resztkowego oraz czynników biomechanicznych.
Procedura pobierania próbek
Pobieranie próbek wykonywano wyłącznie na przyczółkach wyjmowanych częściowych protez (RPD) pomiędzy punktami czasowymi T0 i T3. Uczestnicy zostali najpierw poproszeni o dokładne płukanie wody wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości jedzenia. Przed pobraniem próbki wybrany ząb przyczółka był izolowany za pomocą wałków watowych, aby utrzymać suche warunki pracy. Dwa sterylne końcówki papieru (nr 35; 04 zwężane) zostały wprowadzone do bruzdy dziąsł na mezjalnej i dalszej stronie powierzchni policzkowej zęba i pozostawione na miejscu przez 1 minutę. Papierowe punkty były następnie przenoszone do sterylnej mikrorurki zawierającej 1,5 mL normalnego roztworu soli fizjologicznej i transportowane do wyznaczonego laboratorium mikrobiologicznego. Próbki przechowywano w temperaturze -20°C aż do czasu procesu izolacji DNA.
Przygotowanie i amplifikacja DNA bakteryjnego:
Test Parodontoscreenowy (Tabela materiałów) został wykorzystany do identyfikacji T. denticola, T. forsythia i P. gingivalis za pomocą RT-PCR26. Test składa się z: przygotowania DNA; amplifikacja PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu specyficznych reagentów (mieszanina do uniwersalnej amplifikacji bakterii, mieszanina do amplifikacji oportunistycznej bakterii oraz mieszanina do amplifikacji genomu człowieka); oraz zapisywanie i interpretacja wyników wzmacniania.
Ekstrakcja DNA przeprowadzono za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA (Tabela materiałów), zgodnie z wytycznymi producenta, aby zapewnić optymalną jakość DNA. Test wykorzystuje jakościową analizę PCR w czasie rzeczywistym z mieszanką PCR z parafiną zamkniętą. Ta mieszanka obejmuje Wewnętrzną Kontrolę do weryfikacji ważności testu PCR oraz Kontrolę Pobierania Próbek (SIC) do oceny jakości ekstrakcji i potwierdzenia wystarczającej ilości DNA do dokładnej amplifikacji.
Amplifikacja PCR wykonano za pomocą specjalistycznych pasków i kapsułów, z odczynnikami takimi jak roztwór polimerazy Taq, mieszanka główna pod warstwą parafiny, próbka DNA oraz olej mineralny. Program PCR obejmuje: (i) początkowa denaturacja w 80 °C przez 30 s, (ii) denaturacja w 94 °C przez 1 minutę 30 s, (iii) 5 cykli po 30 s przy 94 °C (denaturacja), 15 s przy 64 °C (wiązanie i wydłużenie smarów, wykrywanie fluorescencji), (iv) 45 cykli po 10 s przy 94 °C (denaturacja), 15 s przy 64°C (wiązanie i wydłużenie smarunków, wykrywanie fluorescencji), (v) 5 s przy 94 °C (ostateczna denaturacja).
Detekcja fluorescencji była wykonywana na kanałach Fam i Hex, z wyjątkiem rurki nr 5, która zawierała marker (gdzie fluorescencja była wykrywana na kanałach Fam i Rox). Proces wzmacniania przeprowadzono za pomocą cyklerów termicznych w czasie rzeczywistym (Tabela materiałów). Oprogramowanie RealTime dla instrumentu (wersja 7.9) zostało użyte do automatycznej rejestracji, interpretacji i analizy ilościowej danych amplifikacji PCR, umożliwiając precyzyjne oszacowanie ładunku patogenów.
Ładunki mikrobiologiczne przedstawiano jako "Lg (równoważniki genomu/próbka)". Wyniki przedstawiono w trzech zakresach raportu z testu przesiewowego Parodonto-dla każdego pacjenta, na podstawie poziomów obciążenia bakteryjnego, w następujący sposób: P. gingivalis (prawidłowy <5,0; umiarkowany ≥5,0; ciężki >6,0); T. forsythia (prawidłowe <5,0; umiarkowane ≥5,0; ciężkie >5,5); oraz T. denticola (prawidłowe <3,5; umiarkowane ≥3,5; ciężkie >5,0).
Badanie kliniczne
Badanie kliniczne obejmowało szczegółowe badanie stanu przyzębia zębów przyczółkowych i nieprzyczółkowych w T0 i T3. Indeks płytki nazębnej (PI) został oceniony za pomocą sondy dentystycznej zgodnie z kryteriami Silness-Loe (0-3)27. Stan dziąseł oceniono w sześciu punktach na powierzchni zęba z użyciem indeksu dziąseł (GI) według następujących kryteriów: 0, brak zapalenia; 1, łagodne zapalenie; 2, stan zapalny z krwawieniem dziąseł podczas sondy; 3, ciężkie zapalenie z możliwym samoistnym krwawieniem dziąseł28.
Głębokość sondowania (PD) zmierzono sondą Williamsa od marginesu dziąseł do końca klinicznej głębokościkieszeni 29. Ruchomość zębów (TM) była określana przez palpację dwuręczną w kierunku poziomym i pionowym, zgodnie z kryterium Milleranr 30.
Wszyscy uczestnicy badania otrzymali odpowiednie niechirurgiczne leczenie przyzębia przed badaniem klinicznym, w tym usunięcie płytki nazębnej i kamienia nazębnego za pomocą ultradźwiękowego skalowania. Uczestnicy byli również szkoleni w procedurach higieny jamy ustnej, takich jak mycie zębów i czyszczenie protez, a także otrzymywali porady dotyczące zdejmowania protez na noc.
Analiza statystyczna
Dane analizowano za pomocą Microsoft Excel oraz IBM SPSS Statistics for Windows. Statystyki opisowe (średnia, odchylenie standardowe i zakres) zostały obliczone dla wieku, obciążeń mikroorganizmów oraz indeksów przyzębia, w tym PI, GI, PD i TM. Zmiany parametrów klinicznych i mikrobiologicznych między okresem przed (T0) a 3 miesiącami po wszczepieniu (T3) oceniano za pomocą testu Wilcoxona z zakresem rangi znakowego dla danych nieparametrycznych w parach. Test dokładnego Fishera (symulacja Monte Carlo, dwustronny) został wykorzystany do oceny danych kategorycznych związanych z klasyfikacją obciążenia mikroorganizmów. Współczynnik korelacji rangi Spearmana (ρ) został wykorzystany do oceny zależności między obciążeniami mikroorganizmów a parametrami przyzębia. Wartość p < 0,05 została uznana za statystycznie istotną dla wszystkich analiz.