Artykuł metodologiczny

Nowatorska platforma do rozciągania i obrazowania komórkowego in vitro

DOI:

10.3791/69779

⸱

10 marca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, Northeastern University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj nowatorskie urządzenie, które stosuje fale izotropowe i jednoosiowe odkształcenia na komórkach, wspierając hodowlę na substratach o regulowanej sztywności i konfigurowalnych macierzach białkowych. Ta prosta, ekonomiczna platforma umożliwia badaczom badanie, jak mechaniczne sygnały regulują funkcjonowanie komórek zarówno w badaniach podstawowych, jak i w kontekstach związanych z chorobą.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki reagują na mechaniczne sygnały ze środowiska, takie jak zmiany sztywności macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) oraz cykliczne naprężenia, które regulują procesy komórkowe, w tym określanie losu komórek, komunikację międzykomórkową i rozwój. Zmiany w tych siłach przyczyniają się do postępu choroby w takich schorzeniach jak astma, nadciśnienie czy nowotwory. Chociaż istniejące urządzenia do rozciągania in vitro mogą wywierać naprężenia jednoosiowe lub izotropowe, często wykorzystują sztywności niefizjologiczne, ograniczają obrazowanie na żywo lub nie są w stanie osiągnąć dużych amplitud odkształceń istotnych dla warunków fizjologicznych i patologicznych. Tutaj prezentujemy kompaktowe, kompatybilne z mikroskopem urządzenie rozciągające, które stosuje kontrolowane odkształcenie izotropowe lub jednoosiowe na komórkach przylegających na naczyniach hodowlowych elastomerowych. Te anteny mają regulowany moduł Younga i są kompatybilne z różnymi powłokami białek matrycowych dla adhezji komórek, co pozwala na niezależną modulację sztywności podłoża i składu ECM. Co ważne, łatwość obsługi urządzenia ułatwia jego konstrukcja napędzana silnikiem krokowym, która umożliwia generowanie programowalnych cyklicznych przebiegów. Demonstrujemy możliwości urządzenia, ilościowo mierząc dynamikę wapnia wewnątrzkomórkowego oraz siły trakcyjne komórek komórkowych w pierwotnych komórkach gładkich dróg oddechowych człowieka pod mechanicznym rozciągiem. Ta platforma zapewnia wszechstronne narzędzie do badania wpływu sygnałów mechanicznych na funkcjonowanie komórek zarówno w kontekście zdrowym, jak i związanym z chorobą.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki doświadczają sił mechanicznych ze swojego otoczenia, które odgrywają kluczową rolę w regulacji wielu aspektów funkcjonowania komórek, w tym określają los komórek 1,2, komunikację międzykomórkową 3,4 oraz zdrowy wzrost 2,5. Dodatkowo, zmiany w tych siłach mechanicznych mogą prowadzić do zwiększonego postępu choroby i jej wystąpienia, w tym do przebudowy macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)6 oraz wzrostu guza 7,8,9,10. Komórki mogą wyczuwać i reagować na te sygnały mechaniczne, które obejmują zmiany sztywności ECM4, a także cykliczne obciążenia narządów takich jak serce, płuca i mięśnie11,12. Badania in vitro wykazały, że sztywność i skład ECM mogą wpływać na sztywność cytoszkieletu komórkowego, zarówno w spoczynku, jak i po ekspozycji na agonistów kurczliwych13. Liczne badania in vitro i in situ analizowały, jak szczepy przejściowe, statyczne i cykliczne wpływają na komórki i tkanki, wykazując, że odpowiedzi różnią się w zależności od typu szczepu, szybkości i amplitudy14. Na przykład najnowsze badania wykazały, że tymczasowe rozciągnięcie zmniejsza sztywność komórek przylegających proporcjonalnie do zastosowanego naprężenia, gdzie długotrwały wzrost naprężenia powoduje początkowy szybki wzrost sztywności, a następnie stopniowe rozluźnianie15. Dodatkowo, sygnalizacja wapnia, będąca głównym molekularnym regulatorem generowania siły, jest poddawana wpływom rozciągania i innym siłom mechanicznym 4,16,17,18,19,20. Badanie wpływu sztywności i naprężenia na szlaki mechanobiologiczne wymaga modulacji obu czynników oraz monitorowania odpowiedzi komórkowych. Dlatego opracowaliśmy nowatorski rozciągacz komórek kompatybilny z mikroskopem, zdolny do indukowania rozciągania zarówno izotropowego, jak i jednoosiowego, z niezależną kontrolą nad sztywnością podłoża, powłoką białka matrycowego oraz szeregiem programowalnych przebiegów fal.

W przeszłości naukowcy podobnie tworzyli urządzenia do wymuszania określonych ruchów i mechanicznych rozciągnięć na hodowle komórkowe i tkanki21,22. Najprostszy przypadek, ruch jednoosiowy, to mechaniczne rozciągnięcie nałożone na pojedynczy wymiar. Na przykład opracowano niektóre urządzenia, które wywierają mechaniczne rozciąganie i naciągnięcia na paski tkanek23 oraz włókna kolagenu24, lub do wyrównywania orientacji komórkowej i wywoływania migracji komórkowej25. Rozciągnięcie izotropowe odnosi się do rodzaju rozciągania, w którym na żel lub podłoże ze wszystkich kierunków działa równa siła, co skutkuje jednolitym odkształceniem na całym materiale. To rozciągnięcie symuluje równomierny rozkład siły, jakiego komórki doświadczają w określonych środowiskach fizjologicznych, takich jak pęcherzyki pęcherzykowe płuc, gdzie komórki są poddawane rozszerzaniu i kurczeniu się promienistego podczas procesu oddychania26,27.

Istniejące urządzenia do noszy mają kilka ograniczeń, które ograniczają ich zastosowanie w badaniach związanych z mechanobiologią. Wiele konstrukcji wykorzystuje wartości sztywności podłoża przekraczające typowy zakres fizjologiczny, aby wytrzymać naprężenia mechaniczne i utrzymać ciężar podłoża hodowlanego28. Jednak zastosowanie takiej sztywności niefizjologicznej może również wpływać na zachowanie komórek, potencjalnie ograniczając znaczenie modelu do naturalnych środowisk tkankowych29. Dodatkowo niektóre konstrukcje rozciągnięć zasłaniają ścieżkę obiektywu lub światła, uniemożliwiając obrazowanie, podczas gdy inne wykorzystują membrany zbyt grube do wyraźnej obserwacji28. Nawet gdy rozciągacze są kompatybilne z mikroskopami i używają cienkich podłoży, często pojawiają się problemy takie jak uginanie błony czy utrata ostrości. Platformy komercyjne, takie jak Flexcell, wykorzystują deformację opartą na próżni do rozciągania elastycznych membran. Chociaż takie podejście pozwala generować stabilne, jednorodne pola odkształcenia, nie jest zoptymalizowane do mikroskopii komórek żywych, a konfiguracje kompatybilne z mikroskopem wymagają kosztownych dodatkowych akcesoriów. Dodatkowo, te platformy mogą osiągnąć maksymalne odkształcenie tylko 21,8%30, podczas gdy głębokie wdechy mogą wywołać szczepy przekraczające 30%, a jeszcze wyższe szczepy obserwuje się w chorobach takich jak astma czy POChP31.

Dlatego zaprojektowaliśmy nowatorskie urządzenie do rozciągania komórek, które umożliwia precyzyjną kontrolę sztywności podłoża i składu ECM materiału, jednocześnie umożliwiając stosowanie zmiennych odkształceni izotropowych i jednoosiowych na komórkach przylegających. Ta platforma jest doskonale przystosowana dla badaczy badających zagadnienia mechanobiologiczne, które wymagają obrazowania na żywo podczas stymulacji mechanicznej z podłożami o fizjologicznie istotnej sztywności. Urządzenie wykorzystuje mechanicznie sterowane podejście inspirowane geometrią dwuwymiarowej sfery Hobermana, która rozszerza się i kurczy przez stawy nożycopodobne (Rysunek 1, Dodatkowy Rysunek 1). Pojedynczy silnik krokowy napędza 16 ramion ułożonych promieniście przez mechanizm łączący, umożliwiając skoordynowane rozszerzanie i kurczenie ośmiu słupów mocujących. Ta konfiguracja generuje jednorodne odkształcenie w płaszczyźnie poprzez jednoczesne zastosowanie równego przesunięcia radialnego na wszystkich słupach. Unikalna konstrukcja i kompaktowa powierzchnia urządzenia umożliwiają obrazowanie żywych komórek za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego podczas rozciągnięcia izotropowego i jednoosiowego w płaszczyźnie, przy ułamku kosztów komercyjnych alternatyw. Liniowy silnik krokowy jest sterowany niestandardowym kodem Arduino, umożliwiającym programowalne cykliczne przebiegi z regulowanymi okresami i amplitudami. W tym badaniu wykazujemy, że urządzenie generuje precyzyjne i powtarzalne odkształcenia w zakresie od mniej niż 1% do 15%, z możliwością geometryczną przekraczającą 200%. Dodatkowo ilościowo określamy wpływ mechanicznego rozciągnięcia na wewnątrzkomórkową dynamikę wapnia oraz siły trakcyjne komórek pierwotnych komórek gładkich dróg oddechowych u człowieka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pierwotne ludzkie komórki mięśni gładkich dróg oddechowych (ASMC) użyte w tym badaniu pochodzą z ATCC (Wirginia), a dane dawcy zostały zdeidentyfikowane zgodnie z wytycznymi NIH. Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Northeastern przed rozpoczęciem eksperymentów.

UWAGA: Instrukcje dotyczące produkcji urządzenia oraz jego wymiarów znajdują się w pliku CAD dostępnym w naszym repozytorium GitHub: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging.

1. Projekt formy drukowanej w 3D

  1. Wymiary formy izotropowej
    1. Zewnętrzna średnica formy wynosi 37 mm.
    2. Zewnętrzna wysokość formy wynosi 4,1 mm.
    3. Grubość ściany zewnętrznej wynosi 2,1 mm.
    4. Grubość podstawy formy to 2 mm.
    5. Otwory mocujące znajdują się 2 mm od krawędzi.
    6. Obszar wewnętrznej hodowli komórkowej ma średnicę 20 mm i głębokość 1,9 mm.
      UWAGA: Gotowa forma PDMS powinna mieć grubość powierzchni hodowli komórkowej 200 μm.
  2. Wymiary formy jednoosiowej
    1. Wymiary zewnętrzne formy to 41 mm x 12 mm x 4 mm (L x S x V).
    2. Otwory mocujące znajdują się 3 mm od krawędzi szerokości i 4 mm od krawędzi długości, a głębokość słupka wynosi 1 mm.
    3. Grubość zewnętrznej ściany wynosi 1,5 mm na krawędzi szerokości i 2 mm na krawędzi długości.
    4. Wymiary dołka hodowli komórek wewnętrznych to 26 mm x 5,5 mm x 1 mm (L x S x V).
    5. Grubość bazy to 2 mm.
      UWAGA: Formy były projektowane w SolidWorks, drukowane w 3D przy użyciu systemu płynnej szarej żywicy FormLabs i wytwarzane w makerspace Northeastern University.
  3. Instrukcje dotyczące pierwszego użycia formy
    1. Przeszlifuj szorstkie krawędzie odwzoru formy.
    2. Powłokaj negatywną formę przezroczystym lakierem do paznokci, aby ułatwić późniejsze usunięcie pleśni PDMS po utwardzeniu. Pozwól formie wyschnąć na powietrzu przez 24 godziny.

2. Wytwarzanie optycznie przezroczystych, elastycznych żeli o sztywności podłoża do hodowli komórkowych

UWAGA: Noszenie odpowiedniej ochrony osobistej (rękawiczki, fartuch laboratoryjny, ochrona oczu) podczas obsługi PDMS i NuSil.

  1. Dodaj bazę Sylgard 184 i środek do utwardzania w proporcji 10:1 wagowej do plastikowej misy.
  2. Mieszaj energicznie z depresorem językowym (lub podobnym narzędziem) przez 2-3 minuty.
  3. Odgazuj mieszankę przez 1 godzinę.
  4. Wlej mieszankę PDMS do niestandardowej formy negatywu (rysunek 2A,B).
    1. Dodaj 1,3 g do izotropowej formy.
    2. Dodaj 0,5 g do formy jednoosiowej.
      UWAGA: Dbaj o równomierne rozprowadzenie żelu na formie.
  5. Odgazuj formę na 1 godzinę.
  6. Pozwól żelowi w formie osiąść na płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  7. Utwardzaj w 60 °C przez noc.
  8. Mieszaj w szklance części A i B NuSil Gel-8100 w równych proporcjach (1:1) przez 15 minut.
    1. Wymieszaj z crosslinkerem Sylgard 184 przy stężeniu 0,36% całkowitej objętości, aby uzyskać podłoże o sztywności 13 kPa 32.
    2. Nie dodaj krzyża, aby uzyskać podłoże o sztywności 0,3 kPa.
  9. Odgazuj mieszankę przez 30 minut.
  10. Ostrożnie usuń żel PDMS z niestandardowej formy. Umieść żel na pokrywce 40 mm.
    UWAGA: Uważaj, żeby nie rozerwać żeli, bo są delikatne.
  11. Wlej mieszankę NuSil na negatywny obszar żelu PDMS.
    1. Żel izotropowy: 100 μL.
    2. Żel jednoosiowy: 50 μL.
  12. Pokrywaj odpowiednie żele PDMS mieszaniną NuSil, używając preparatu spinowego przez 50 sekund przy pojemności 7 g , aby uzyskać jednolitą grubość podłoża 100 μm.
  13. Pozostawić żel na płaskiej, płaskiej powierzchni w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, zanim zostanie utwardzony w 60 °C przez noc.
    UWAGA: Prosimy o to, aby wszystkie etapy utwardzania były wykonywane na płaskiej powierzchni. Nierówny żel nie pozwoli, aby cały obszar zainteresowania pozostał w płaszczyźnie obrazowania mikroskopu. Jeśli obrazowanie ujawni zmienność ostrości w polu widzenia, żel mógł się utwardzić na nierównej powierzchni i powinien zostać ponownie wykonany.
  14. Przechowywać gotowe naczynia do hodowli komórkowych w zakrytych szalkach Petriego do czasu użycia (Rysunek 2D-E).

3. Powłoka białkowa matrycy

  1. Dodaj 500 μL poli-L-lizyny (PLL, 500 μg/mL) do każdego substratu.
  2. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  3. Opłucz podłoża 3 × 1 mL PBS, a następnie 3 × 1 mL buforu HEPES o wartości 10 mM (pH 8,0).
  4. Do każdego substratu dodano 500 μL mPEG-SVA (50 mg/mL).
  5. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  6. Przemyj podłoża 3 × 1 mL PBS.
  7. Zastąpić PBS 500 μL PLPP (14,5 mg/mL).
  8. Korzystając z systemu mikrowzorowania PRIMO z oprogramowaniem Leonardo, rzutuj zdefiniowany wzór na powierzchnię podłoża za pomocą światła UV przez 30 sekund.
  9. Przemyj podłoża 3 × 1 mL PBS i umieść pod UV przez 15 minut w celu sterylizacji.
  10. Do każdego substratu dodaj 500 μL żelatyny sprzężonej z fluoresceiną o stężeniu 0,1%.
  11. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  12. Przemyj 3 × z 1 mL PBS.
    UWAGA: Aby zobrazować wzory, inkubuj z żelatyną sprzężoną z fluoresceiną 0,1% przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  13. Kontynuuj badania obrazowe.

4. Hodowla komórek gładkich dróg oddechowych w elastycznych naczyniach

UWAGA: Wszystkie procedury hodowli komórkowej wykonuj w okapu bioasepcyjnym, stosując standardową technikę aseptyczną.

  1. Uzyskanie pierwotnych komórek gładkich dróg oddechowych (ASMC) od ATCC (Wirginia) i zapewnienie deidentyfikacji informacji o dawcy zgodnie z wytycznymi NIH. Potwierdź zatwierdzenie Komitetu ds. Bezpieczeństwa Instytucjonalnego przed eksperymentami.
  2. Użyj komórek od trzech zdrowych dawców ludzi, różnej płci i w różnym wieku, bez historii astmy czy chorób. Przykład: jedna kobieta (18 lat) i dwóch mężczyzn (34 i 59 lat).
  3. Hoduj komórki w warunkach standardowych (37 °C, 5% CO ₂) i używaj komórek do przepuszczenia 6 do wszystkich eksperymentów.
  4. Hoduj komórki w następującym kompletnym podłożu wzrostowym:
    1. DMEM/F12 (500 mL)
    2. 10% surowica bydła płodu (FBS) (50 mL)
    3. 1× penicylina/streptomycyna (5 mL)
    4. 1× MEM nieistotnych aminokwasów (5 mL)
    5. Amfocerycyna B (0,5 mL)
  5. Zmień komórki na medium bezsurowicowe co najmniej 24 godziny przed pomiarami. Przygotuj medium bezsurowicze z:
    1. F-12 Ham średni (500 mL)
    2. 1 × penicylina/streptomycyna (5 mL)
    3. Amfocerycyna B (50 μg/L)
    4. 1× MEM nieistotnych aminokwasów (5 mL)
  6. Ultra-sterylizacja UV rozciągliwych misek do hodowli komórek przez 15 minut.
  7. Inkubuj wysterylizowane naczynia z 0,1% żelatyną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej przed nasiewem (rysunek 2F).
    1. Dla podłoży wzorzyste:
      1. Komórki nasienne w elastycznej hodowli komórkowej studnią z gęstością 10–4 komórki/cm2.
      2. Inkubuj w pożywce o stężeniu surowicy 10% przez 10 minut, aby wspomóc przyczepność do wzorzystych miejsc.
      3. Przemyj studnie PBS, aby usunąć nieprzymocowane komórki.
      4. Napełnij dołki 10% surowicowym medium i inkubuj przez 24 godziny.
      5. Zamień go na medium bezsurowicze i inkubuj przez 24 godziny przed pomiarami.
    2. Dla podłoży niewzorzyste:
      1. Komórki nasienne o pożądanej gęstości: 102 komórki/cm 2 dla komórek izolowanych. 103 komórki/cm 2 dla komórek rzadkich. 104komórki/cm 2 dla komórek konfluentnych.
      2. Inkubuj w 10% surowicy przez 24 godziny.
      3. Zamień go na medium bezsurowicze i inkubuj przez 24 godziny przed pomiarami.

5. Obrazowanie i analiza wapnia fluorescencyjne

  1. ASMC z głodem surowicy przez 24 godziny.
  2. Przygotuj barwnik FLIPR Ca2+ 6 zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Wymieszaj barwnik FLIPR Ca2+ 6 z medium bezsurowicowym w proporcji 1:1.
  4. Inkubuj komórki roztworem FLIPR Ca ²⁺ 6 w temperaturze 37 °C i 5% CO ₂ przez 2 godziny.

6. Przygotowanie obrazowania

  1. Użyj mikroskopu Leica DMi8 wyposażonego do:
    1. Aparat DFC6000 Leica
    2. Lekki silnik Leica LED8
    3. 5×/0.12 obiektyw na sucho
  2. Ustaw wzbudzenie na 480/40 nm i emisję na 527/50 nm.
  3. Pobieranie obrazów 16-bitowych z częstotliwością 2 Hz podczas eksperymentów stretch.

7. Analiza danych

  1. Importuj sekwencje obrazów do Fidżi (ImageJ) 33.
  2. Ręcznie zdefiniuj obszary zainteresowania (ROI) w cytoplazmie każdej komórki.
  3. Wyodrębnij średnie wartości intensywności w skali szarości dla każdego ROI w czasie.
  4. Przetwarzaj dane o intensywności fluorescencji za pomocą niestandardowego skryptu MATLAB.
    UWAGA: Intensywność fluorescencji jest proporcjonalna do cytosolowej [Ca2+].

8. Pomiary i analiza siły trakcyjnej

UWAGA: Wszystkie kody, w tym te do analizy obrazów, mikroskopii siły trakcyjnej oraz sterowania silnikiem, są dostępne w naszym repozytorium GitHub: https://github.com/Breathe-Lab/A-Novel-Platform-for-In-Vitro-Cellular-Stretching-and-Imaging

  1. Pokrywaj podłoża żelowe PDMS-NuSil warstwą fluorescencjowych kulek, które służą jako wskaźniki fiducial do mikroskopii siły trakcyjnej.
  2. Przygotuj roztwór 0,025% czerwonych fluorescencjowych mikrosfer modyfikowanych karboksylanem o średnicy 1 μm w HBSS, rozcieńczając do stosunku 1:4000.
  3. Wiruj roztwór koralików przez 10 sekund.
  4. Dodaj roztwór koralików do żelu.
    1. 880 μL do żelu izotropowego.
    2. 420 μL do żelu jednoosiowego.
  5. Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, aby koraliki mogły się przykleić.
  6. Po godzinie ostrożnie usuń roztwór.
    UWAGA: Delikatnie wylewaj roztwór koralików na miękkie żele. Nieprawidłowe usuwanie utrudnia prawidłowe rozprowadzenie kulek.
  7. Delikatnie przemyj resztki roztworu patyczką higieniczną lub kimwipe.
  8. Zrób zdjęcie kulek mikroskopem Leica DMi8 wyposażonym w obiektyw suchy 10x/0,32.
  9. Rejestruj zdjęcia w stanie przedrozciągającym i ciągłie przez cały protokół rozciągania.
    UWAGA: Wszystkie obrazy wykonuj w centrum podłoża, gdzie jednorodność odkształceń jest najwyższa. W razie potrzeby ponownie ustawij ostrość mikroskopu w pozycji rozciągniętej przed zrobieniem zdjęć.
  10. Przeanalizuj obrazy za pomocą niestandardowego kodu MATLAB opartego na mikroskopii siły trakcyjnej Fouriera, aby obliczyć wektory przemieszczeń i odpowiadające im płaskie pola odkształcenia 34.
  11. Przedstawiamy dane jako średnią N prób.

9. Kalibracja urządzenia do rozciągania komórek

  1. Dodaj do odwiertu 500 μL H₂O, aby symulować wagę pożywki hodowli komórkowej i utrzymać wzór białkowy wilgotny.
  2. Protokół dotyczący tworzenia specyficznych wzorców białkowych można znaleźć w sekcji 3 zatytułowanej "Powłoka białkowa matrycy".
  3. Obrazuj wzory fluorescencyjne co 400 μm przemieszczenia silnika, zwiększając do maksymalnie 2800 μm, a następnie wracając do zera w odwrotnych krokach po 400 μm.
  4. Scharakteryzować związek między liniowym przesunięciem od silnika krokowego a izotropową deformacją rozciągalnej misy hodowli komórek zarówno na skali makroskopowej, jak i regionalnej, poprzez pomiar zmian powierzchni i mimośrodu fluorescencyjnym literami białkowymi, które na elastycznym podłożu podczas rozciągania są "BREATHE". Użyj prostokątnego ramki ograniczającej wszystkie litery, aby obliczyć pole i mimośrod całego słowa.
  5. Zastosuj segmentację obrazów w MATLAB, aby określić te parametry dla każdej pojedynczej litery.
  6. Zdefiniuj zerowe przemieszczenie na podstawie nierozciągniętych wymiarów talerza hodowli komórkowej.
  7. Powtarzaj każdy eksperyment na dwóch do trzech niezależnie przygotowanych, rozciągliwych dołkach hodowli komórek, aby zapewnić powtarzalność.

10. Prezentacja danych i testowanie statystyczne

  1. W eksperymentach kalibracyjnych rozciągających definiuj próby jako liczbę cykli.
  2. Pokaż każdą próbę osobno, zamiast łączyć je w jedną krzywą, aby pokazać powtarzalność systemu.
  3. Wskaż paski błędu jako odchylenie standardowe.
  4. Użyj jednokierunkowej ANOVA, aby sprawdzić istotne różnice w zbiorach danych z trzema lub więcej grupami wpływanymi przez jeden niezależny czynnik.
  5. Stosuj dwukierunkowe ANOVA, a następnie porównania parowe po hoc, aby sprawdzić istotne różnice w zbiorach danych pod wpływem dwóch niezależnych czynników.
  6. Stosuj test t do porównań parowych, gdy dane są normalnie rozproszone.
  7. Stosuj test sumy rang Manna-Whitneya do porównania wartości mediany, gdy dane nie są normalnie rozłożone.
  8. Zgłoś konkretne użyte testy, liczbę próbek oraz odpowiadające im wartości P, wraz z wynikami.
  9. Użyj progu wartości P 0,05, aby określić statystycznie istotne różnice między zbiorami danych.
  10. Wykonuj testy statystyczne w SigmaStat.
  11. Wykresy w GraphPad Prism i MATLAB.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozciągacz komórek wywołuje makroskopowe zmiany powierzchni, które odzwierciedlają lokalne deformacje. Aby ocenić zachowanie izotropowe, zmierzyliśmy zmiany powierzchni wzoru fluorescencyjnego białka żelatynowego tworzącego słowo "BREATHE" na rozciągalnej hodowli komórkowej, wraz z jej pojedynczymi literami, na podłożu izotropowym. Nasze wyniki wykazały, że zarówno słowo, jak i poszczególne litery wykazywały równoważne zmiany w obszarze (Rysunek 3A,B). N...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisujemy projektowanie, opracowanie, walidację i wdrożenie nowatorskiego rozciągacza komórek kompatybilnego z mikroskopem, który może naśladować naciągi izotropowe i jednoosiowe, jednocześnie obrazując żywe komórki. Urządzenie to jest kompaktowe i może zamontować się na podłożu mikroskopu Leica DMi8, ograniczając wszystkie ruchome części do jednej płaszczyzny, umożliwiając obrazowanie na żywo, jednocześnie zachowując koncentrację na podłożu i komórkach leżących. Dokonano tego za pomocą skośnych ramion in...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma żadnych konkurujących interesów do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują panu Noah Josephowi za pomoc w tworzeniu form. Autorzy dziękują Heitorowi Mourato i Glennowi Thayerowi z Boston University Scientific Instrument Facility za pomoc przy obróbce urządzenia. Prace te zostały wsparte przez grant Career #2047207 National Science Foundation (NSF), przyznany Harikrishnanowi Parameswaranowi. H.P. wymyślił te badania. S.E.S. i S.R.P. opracowały ogólny projekt urządzenia, a S.E.S. i H.P. zaprojektowały eksperymenty izotropowe. S.E.S przeprowadził eksperymenty z formami izotropowymi, analizował dane eksperymentalne i interpretował wyniki, a H.P. V.C. zaprojektował formy jednoosiowe, zoptymalizował przygotowanie żelu i nabijanie koralików. B.M.G przeprowadził eksperymenty z żelem jednoosiowym, przeanalizował dane eksperymentalne i zinterpretował wyniki wraz z H.P. I V.C. S.E.S. i B.M.G przygotowały dane. B.M.G, S.E.S, V.C. i H.P. przyczynili się do opracowania i redagowania rękopisu. H.P. zatwierdził ostateczną wersję rękopisu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
  Dulbecco' zmodyfikowanego Eagle' S średni/F12Fisher Scientific12634010500 mL 
(4-benzoylbenzyl) trimetyloammonium chlorek (PLPP)Alvé oleNie ma14,5 mg/mL
0,1% żelatyna sprzężona z fluoresceiną, czyli sprzężona z fluoresceiną;InvitrogenG13187
Roztwór żelatyny 0,1%Sigma-AldrichES-006500 mL 
1 μ Mikrosfery o średnicy m Czerwonej Fluorescencji Zmodyfikowanej KarboksylanemFluoSpheresF8816
1&razy; Roztwór aminokwasów nieistotnych MEMSigma-AldrichM7145100 mL
1&razy; Penicylina/streptomycynaFisher Scientific15-140-122100 mL
10% surowica bydła płoduTermonaukoweA5256701500 mL 
Rurka 15 mLFisher Scientific14-959-53A
1x glutamina Fisher ScientificMT10010CM
1x suplement wzrostu insuliny-transferyny-selenuCorning Life Sciences25-800-CR
Amfoterycyna BSigma-AldrichA294225 μ g/litr
Łożyska kulkoweMcMaster-Carr Nie ma
Chlorek wapnia dihydratSigma-Aldrich223506
Szyna wagonowaMcMaster-Carr Nie ma
FLIPR Ca2+ 6Urządzenia molekularneR8190
GraphPad PrismDotmatykaNie ma
Szynka' F-12 średniSigma-AldrichN8641500 mL 
Zrównoważony roztwór soli Hanksa;Termonaukowe14025092500 mL 
HEPES buffer Termonaukowe15630080100 mL
Leonardo SoftwareAlvé oleNie ma
MatlabMathworksNie ma
metaksyl polietylenowy & ndash; Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)Laysan Bio IncNie ma50 mg/mL
Nusil Gel-8100Nusil Nie ma
Szalki PetriegoTermonaukowe26399190 mm 
sól fizjologiczna z buforem fosforanowym Sigma-Aldrich10010023500 mL 
poli-L-lizyna (PLL)Sigma-AldrichP8920500μ g/mL
Podstawowe komórki gładkich dróg oddechowych u człowieka;ATCCPCS-130-011
moduł optyczny PRIMO Alvé oleNie ma
ŚrubyMcMaster-Carr Nie ma
SigmaStatOprogramowanie SystatNie ma
Preparat do powrociaLaurellModel WS-650MZ-23NPPB
Elementy montażowe i podkładowe do sceny;Obiekt Instrumentów Naukowych Uniwersytetu BostońskiegoNie maStal nierdzewna
Zestaw Sylgard 184 bazowego elastomeru i środka utwardzającegoDowH047J8Q026
Kolba do hodowli tkanek T-25 – kapsel wentylacyjny, sterylnyCellTreat229331
Środek na zgarnianie języka Termonaukowe22-363-154

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alvarez, Y., Smutny, M. Emerging role of mechanical forces in cell fate acquisition. Front Cell Dev Biol. 10, 864522(2022).
  2. Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nat Rev Mol Cell Biol. 18, 728-742 (2017).
  3. Liu, M., Tanswell, A. K., Post, M. Mechanical force-induced signal transduction in lung cells. Am J Physiol. 277, L667-L683 (1999).
  4. Stasiak, S. E., Jamieson, R. R., Bouffard, J., Cram, E. J., Parameswaran, H. Intercellular communication controls agonist-induced calcium oscillations independently of gap junctions in smooth muscle cells. Sci Adv. 6 (32), eaba1149(2020).
  5. Riley, D. J., Rannels, D. E., Low, R. B., Jensen, L., Jacobs, T. P. NHLBI workshop summary: effect of physical forces on lung structure, function, and metabolism. Am Rev Respir Dis. 142, 910-914 (1990).
  6. Humphrey, J. D., Dufresne, E. R., Schwartz, M. A. Mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 802-812 (2014).
  7. Gong, F., et al. An overview of the role of mechanical stretching in the progression of lung cancer. Front Cell Dev Biol. 9, 781828(2021).
  8. Jaalouk, D. E., Lammerding, J. Mechanotransduction gone awry. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 63-73 (2009).
  9. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5, e12905(2010).
  10. Hannezo, E., Heisenberg, C. -P. Mechanochemical feedback loops in development and disease. Cell. 178, 12-25 (2019).
  11. Das, S., Ippolito, A., McGarry, P., Deshpande, V. S. Cell reorientation on a cyclically strained substrate. PNAS Nexus. 1, pgac199(2022).
  12. Dartsch, P. C., Hämmerle, H., Betz, E. Orientation of cultured arterial smooth muscle cells growing on cyclically stretched substrates. Acta Anat. 125, 108-113 (1986).
  13. An, S. S., et al. Cell stiffness, contractile stress and the role of extracellular matrix. Biochem Biophys Res Commun. 382, 697-703 (2009).
  14. Arold, S. P., Bartolák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  15. Trepat, X., et al. Universal physical responses to stretch in the living cell. Nature. 447, 592-595 (2007).
  16. Benavides Damm, T., Egli, M. Calcium 's role in mechanotransduction during muscle development. Cell Physiol Biochem. 33, 249-272 (2014).
  17. Ito, S., et al. A novel Ca2+ influx pathway activated by mechanical stretch in human airway smooth muscle cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 407-413 (2008).
  18. Ito, S. Stretch-activated calcium mobilization in airway smooth muscle and pathophysiology of asthma. Curr Opin Physiol. 21, 65-70 (2021).
  19. Ito, S., et al. Actin cytoskeleton regulates stretch-activated Ca2+ influx in human pulmonary microvascular endothelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, 26-34 (2010).
  20. Tanaka, Y., Hata, S., Ishiro, H., Ishii, K., Nakayama, K. Quick stretch increases the production of inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3) in porcine coronary artery. Life Sci. 55, 227-235 (1994).
  21. Brown, T. D. Techniques for mechanical stimulation of cells in vitro: a review. J Biomech. 33, 3-14 (2000).
  22. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: engineering and biological considerations. Lab Chip. 16, 3193-3203 (2016).
  23. Fredberg, J. J., Bunk, D., Ingenito, E., Shore, S. A. Tissue resistance and the contractile state of lung parenchyma. J Appl Physiol. 74, 1387-1397 (1993).
  24. Shen, Z. L., Dodge, M. R., Kahn, H., Ballarini, R., Eppell, S. J. Stress-strain experiments on individual collagen fibrils. Biophys J. 95, 3956-3963 (2008).
  25. Atcha, H., et al. A low-cost mechanical stretching device for uniaxial strain of cells: a platform for pedagogy in mechanobiology. J Biomech Eng. 140, 0810051-0810059 (2018).
  26. Tschumperlin, D. J., Margulies, S. S. Equibiaxial deformation-induced injury of alveolar epithelial cells in vitro. Am J Physiol. 275, L1173-L1183 (1998).
  27. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech Eng. 138, 4032550(2016).
  28. Ursekar, C. P., et al. Design and construction of an equibiaxial cell stretching system that is improved for biochemical analysis. PLoS One. 9, e90665(2014).
  29. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 13661-13665 (1997).
  30. Cell stretching bioreactor FAQs. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com/resources/faq (2024).
  31. Bossé, Y. The strain on airway smooth muscle during a deep inspiration to total lung capacity. J Eng Sci Med Diagn Ther. 2, 010802(2019).
  32. Yoshie, H., et al. Traction force screening enabled by compliant PDMS elastomers. Biophys J. 114, 2194-2199 (2018).
  33. Schindelin, J., et al. Fiji: an open source platform for biological image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  34. Butler, J. P., Toli ć-Nørrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. Am J Physiol Cell Physiol. 282, C595-C605 (2002).
  35. Dessalles, C. A., Leclech, C., Castagnino, A., Barakat, A. I. Integration of substrate- and flow-derived stresses in endothelial cell mechanobiology. Commun Biol. 4, 764(2021).
  36. Ji, G., Barsotti, R. J., Feldman, M. E., Kotlikoff, M. I. Stretch-induced calcium release in smooth muscle. J Gen Physiol. 119, 533-543 (2002).
  37. Davis, M. J., Meininger, G. A., Zawieja, D. C. Stretch-induced increases in intracellular calcium of isolated vascular smooth muscle cells. Am J Physiol. 263, H1292-H1299 (1992).
  38. Naruse, K., Sokabe, M. Involvement of stretch-activated ion channels in Ca2+ mobilization to mechanical stretch in endothelial cells. Am J Physiol. 264, C1037-C1044 (1993).
  39. Arold, S. P., Bartol ák-Suki, E., Suki, B. Variable stretch pattern enhances surfactant secretion in alveolar type II cells in culture. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L574-L581 (2009).
  40. Cell stretching bioreactors. , Flexcell International. https://www.flexcellint.com (2024).
  41. Mitrossilis, D., et al. Single-cell response to stiffness exhibits muscle-like behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18243-18248 (2009).
  42. Parameswaran, H., Lutchen, K. R., Suki, B. A computational model of the response of adherent cells to stretch and changes in substrate stiffness. J Appl Physiol. 116, 825-834 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Rozci ganie kom rekbod ce mechanicznemikroskopia si trakcyjnychobrazowanie wewn trzkom rkowego wapniasztywno pod o aodkszta cenie izotropoweodkszta cenie jednowymiaroweludzkie mi nie g adkie dr g oddechowychobrazowanie ywych kom rekelastomerowa szalka hodowlana

Powiązane artykuły