Badanie to badało wpływ elektroakupunktury (EA) na dysfunkcje naczyń wywołane wysoką zawartością soli. EA odwróciła uszkodzenia naczyń i dysbiozę jelit, prawdopodobnie poprzez modulację konkretnych mikroorganizmów jelitowych.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
Badanie to badało wpływ elektroakupunktury (EA) na dysfunkcje naczyń wywołane wysoką zawartością soli. EA odwróciła uszkodzenia naczyń i dysbiozę jelit, prawdopodobnie poprzez modulację konkretnych mikroorganizmów jelitowych.
Celem tego badania jest zbadanie potencjału terapeutycznego i mechanizmów elektroakupunktury (EA) w łagodzeniu dysfunkcji naczyń wywołanych dietami bogatymi w sól, ze szczególnym uwzględnieniem modulacji mikrobioty jelitowej. Losowo podzieliliśmy 21 szczurów na grupy Normal Control, Model High-salt oraz Intervention EA (n = 7 na grupę). Model "zespołu stazy krwi o wysokiej zasoleniu" u szczurów Wistar został wywołany przez perfuzję w żołądku 12% NaCl. Zabiegi przeprowadzono między 17:00 a 19:00 czasu pekińskiego: szczury były unieruchomiane miękką szmatką, a następnie 20-minutowa stymulacja EA w BL23 i KI3. Po eksperymencie pobrano krew szczurów, naczynia krwionośne i próbki kału. Efekty naczyń oceniano za pomocą testu funkcji krzepnięcia, analizy hemoreologicznej oraz oceny histopatologicznej tętnic. Sekwencjonowanie rDNA 16S zostało wykorzystane do analizy zmian składu i liczebności mikrobioty jelitowej. Wyniki wykazały, że przewlekłe spożycie wysokiej ilości soli zaburza lepkość krwi, uszkadza integralność śródbłonka naczyniowego i powoduje dysbiozę mikroorganizmów jelitowych. Co zaskakujące, leczenie EA skutecznie odwróciło te patologiczne zmiany. Analiza korelacji dodatkowo zidentyfikowała specyficzną mikrobiotę jelitową (np. Lachnospiraceae i Ruminococcaceae), która silnie korelowała ze zmienionymi parametrami lepkości krwi (P < 0,05). W związku z tym niniejsze badanie stwierdza, że naczyństwo wywołane dietą wysokosolną można odwrócić dzięki leczeniu EA, co można przypisać zdolności EA do regulowania mikrobioty jelitowej zaangażowanej w metabolizm kwasów żółciowych i syntezę krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.
Sól w diecie odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu równowagi płynów i homeostazy komórkowej, jednak nadmierne spożycie stanowi dobrze znany czynnik ryzyka chorób sercowo-naczyniowych i mózgowych1. Światowa Organizacja Zdrowia zaleca ograniczenie dziennego spożycia sodu do mniej niż 5 gramów dla zdrowych dorosłych2. Badania wykazały, że dieta bogata w sól (HSD) zaburza funkcjonowanie naczyń oraz że choroby sercowo-naczyniowe (CVD), najpowszechniejsze na świecie, często towarzyszą naczyniom3. Wyniki te podkreślają, że naprawa uszkodzeń śródbłonka naczyń wywołanych przez HSD stanowi kluczową strategię zapobiegania postępowi choroby żywotnożycowej. "Zespół stagnacji krwi" (charakteryzujący się stagnacją krwi i wewnętrznym nagromadzeniem krwi) pokrywa się z mierzalną dysfunkcją krzepnięcia we współczesnej medycynie. Kluczowe biomarkery walidacyjne to istotnie skrócony czas protrombinowy (PT) oraz aktywowany czas częściowej tromboplastyny (APTT), a także wyraźnie podwyższony czas fibrynogenu (FIB) i trombinowy (TT). Wskaźniki te odzwierciedlają stan hiperkrzepnięcia, bezpośrednio odpowiadający patologicznym cechom stazy krwi.
Mikrobiota jelit, występująca w całym przewodzie pokarmowym, pełni rolę kluczowych regulatorów procesów immunometlicznych i homeostazy jelit, jednocześnie wpływając na różnorodne szlaki fizjologiczne i patologiczne4. Pojawiające się dowody wskazują, że nadmierne spożycie soli powoduje dysbiozę jelitową i zaburzenia odżywienia, wywołując prozapalną aktywację odpornościową, która objawia się miejscowym stanem zapalnym, a jednocześnie sprzyjają uszkodzeniom mikrokrążenia, przebudowie naczyń oraz ogólnoustrojowej dysfunkcji śródbłonka 1,5. Przewlekłe HSD wykazuje względny wzrost poziomu Bacteroides intestinalis, Aspergillus i Prevotella spp. u myszy, a także wiąże się z przyczynianiem się do rozwoju nadciśnienia i zapalenia naczyń6.
Akupunktura, będąca fundamentem tradycyjnej medycyny chińskiej (TCM), wykorzystuje precyzyjne wkłucanie igieł w określone punkty punktowe jako opartą na dowodach terapię uzupełniającą i alternatywną w praktyce klinicznej. Narodowe Instytuty Zdrowia (NIH) oraz Światowa Organizacja Zdrowia (WHO) uznają akupunkturę za klinicznie potwierdzoną interwencję w leczeniu wielu schorzeń patologicznych. Pojawiające się dowody wskazują, że akupunktura ma podwójny mechanizm terapeutyczny 7,8, modulując skład mikrobioty jelitowej przy jednoczesnym tłumieniu mediatorów zapalnych naczyń, co łącznie łagodzi postęp patologiczny w pokrewnych zaburzeniach. Co istotne, akupunktura jest skuteczna w obniżaniu ciśnienia krwi i przywracaniu funkcji śródbłonka w uszkodzonych naczyniach krwionośnych9.
EA została wybrana zamiast akupunktury manualnej ze względu na ustandaryzowane i mierzalne parametry stymulacji, które zmniejszają zmienność zależną od operatora i poprawiają powtarzalność wyników. Dlatego badaliśmy wpływ leczenia EA na mikrobiotę jelitową u szczurów z modelem zespołu stazy krwi o wysokiej zawartości soli (HSBS) oraz oceniliśmy skuteczność EA w leczeniu wysoko solnych indukowanych waskulopatii na podstawie reologii krwi i zmian histopatologicznych naczyń. Aby lepiej zrozumieć rolę mikrobioty jelitowej w poprawie zmian naczyniowych dzięki terapii EA, przeprowadziliśmy analizę korelacji między różnymi rodzajami mikrobioty jelitowej a tempem przecięcia pełnej krwi oraz sedymentacją krwi.
W związku z tym wysunęliśmy hipotezę, że EA łagodzi waskulopatię wywołaną przez HSD poprzez przywrócenie homeostazy mikrobioty jelitowej. Aby to przetestować, dążyliśmy do: (i) ilościowego określenia ochronnych efektów EA na funkcję i strukturę naczyń oraz (ii) identyfikacji specyficznych taksonów mikrobiologicznych jelitowych modulowanych przez EA, które korelują z tymi ulepszeniami. Ponadto analiza korelacji Pearsona wykazała istotne powiązania mikrobiota z naczyniami, szczególnie między różnicowo licznymi fluktuacjami rodzajów a nieprawidłowościami hemoreologicznymi. Z naszej wiedzy jest to pierwsze badanie badające mechanizmy ochronne EA w poprawie naczyń wywołanych dietą wysokosolną z perspektywy mikrobioty jelitowej. Projekt eksperymentalny tego badania przedstawiono na Rysunku 1.

Rysunek 1: Eksperymentalny schemat techniczny. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Cały eksperyment przeprowadzono w Centrum Eksperymentalnym Podstawowej Szkoły Medycznej Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu. Wszystkie procedury dotyczące dobrostanu zwierząt i eksperymentów zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Etyki Dobrostanu Zwierząt Laboratoryjnego Uniwersytetu Tradycyjnej Medycyny Chińskiej w Chengdu (Etyka nr 2024078). Eksperymenty przeprowadzano ściśle zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (rewizja z 1986 roku, publikacja 86-23).
Zwierzęta i dieta
Samce i samice szczurów Wistar wolnych od patogenów specyficznych (SPF), w wieku 6-8 tygodni, ważyły 200 ± 20 g. Wszystkie szczury były trzymane w dobrze wentylowanych pomieszczeniach z 12-godzinnym cyklem światła-ciemności i miały swobodny dostęp do jedzenia i wody.
Modele i grupy
Modele zwierzęce zostały indukowane na podstawie wcześniejszych doświadczeńbadawczych 10. Po 7-dniowym okresie aklimatyzacji losowo przypisano 21 szczurów Wistar (50% rozkład samców/samic) do trzech grup eksperymentalnych (n = 7 na grupę) za pomocą generatora liczb losowych w Excelu, przy czym liczba samców i samic w każdej grupie była mniej więcej zrównoważona, aby zminimalizować wpływ płci na wyniki11. Kontrola normalna (NC): Codziennie otrzymywano dawkę żołądkową (1 mL/100 g) oczyszczonej wody. Model wysokosolny (HS) i interwencja EA (EA): Podawano roztwór 12% NaCl (1 mL/100 g) codziennie w formie dawcy. Wszystkie interwencje były utrzymywane przez 30 kolejnych dni.
Leczenie EA
Leczenie rozpoczęto dzień po udanym modelingu. EA została wybrana zamiast akupunktury manualnej ze względu na ustandaryzowane i mierzalne parametry stymulacji, które zmniejszają zmienność zależną od operatora i poprawiają powtarzalność wyników. Lokalizacje BL23 (Shenshu, południk pęcherza) i KI3 (Taixi, południk nerkowy) zostały określone na podstawie kryteriów lokalizacji punktów akupunktury szczurów Chińskiego Towarzystwa Akupunktury i Koksybustji12. BL23 znajduje się 6 mm bocznie od linii środkowej grzbietowej, poniżej drugiego kręgu lędźwiowego. KI3 znajdował się w środkowym zagłębieniu między najwyższym punktem młotka przyśrodkowego a tylną granicą ścięgna Achillesa. Miejscowe włosy w punktach akupunkturowych zostały usunięte i wysterylizowane. Jednorazowe sterylne igły akupunkturowe (0,18 mm × 13 mm) były używane do pionowego przekłucia punktów akupunkturowych, z głębokością wkłucia 4-6 mm dla BL23 i 3-5 mm dla KI3. Dodatni klips elektrody urządzenia elektroakupunkturowego był podłączony z uchwytem igły na BL23 z jednej strony, a ujemnym klipsem elektrody do tego na KI3 po tej samej stronie. Parametry urządzenia elektroakupunkturowego: Przebieg fali: Gęsto-rzadka fala (10/50 Hz); Częstotliwość: 5 s dla fali rzadkiej, 10 s dla fali gęstej; Intensywność: 1-2 mA, dostosowana do drgawkowych i bolesnych reakcji szczurów (krzyki, zachowania oporowe); Szerokość impulsu: ≤ 1 stwardnienia rozsianego. Protokół stymulacji: Interwencja była wykonywana codziennie od 17:00 do 19:00 (czasu pekińskiego), trwająca za każdym razem 20 minut. Cykl: Jeden cykl leczenia trwał 7 dni, z łącznie 4 cyklami i 1 dniem odpoczynku między każdym cyklem. Konkretny proces przedstawiono na Rysunku 2 (Utworzono BioGDP.com13).

Rysunek 2: Oś czasu eksperymentu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
Pobieranie próbek i przygotowanie
Miesiąc po gavage, przed interwencją EA pobrano od szczurów krew żylną oczodołu. Próbki osocza pobierano przez wirowanie w 1 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Na koniec zabiegu pobierano świeże odchody z każdej grupy szczurów. Szczury były znieczulone 10% emulgowanym izofluranem (30 mg/kg) i uśpione. Otwarto jamę brzuszną, a około 5 ml krwi pobrano z aorty brzusznej w celu pomiaru lepkości ścinania całej krwi (WBSRV) w ciągu 4 godzin. Tkanki aorty brzusznej zostały pobrane do analizy histopatologicznej. Wszystkie próbki przechowywano w temperaturze -80 °C do dalszego użytku.
Test WBSRV
Po zakończeniu modelowania pobrano około 4-5 ml pełnej krwi z aorty brzusznej szczurów za pomocą igły pobierającej krew i umieszczono je w rurkach z heparyną sodową antykoagulantem. Probówki były delikatnie potrząsane, aby zapewnić dokładne wymieszanie próbek krwi z antykoagulantem. W ciągu 4 godzin zmierzono WBSRV oraz tempo sedymentacji erytrocytów (ESR) za pomocą w pełni zautomatyzowanego analizatora hemorheologicznego.
Histopatologia naczyń
Tkanki naczyniowe były utrwalane w roztworze 4% paraformaldehydu przez co najmniej 24 godziny i przecinane na grubości 3 μm w celu barwienia hematoksylinowo-eozynowego (HE). Zdjęcia zostały wykonane przy powiększeniach 100× i 400×.
Sekwencjonowanie rDNA 16S
DNA genomowe zostało wyodrębnione z próbek kału każdej grupy. Sekwencje primerów V3-V4 (341F: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'; 805R: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') zostały użyte do amplifikacji PCR całkowitego DNA. Program amplifikacji PCR wyglądał następująco: predenaturacja w 98 °C przez 30 s, denaturacja w 98 °C przez 10 s, wyżarzanie w 54 °C przez 30 s oraz przedłużenie w 72 °C przez 45 s, łącznie 32 cykle, a następnie ostateczne przedłużenie przy 72 °C przez 10 minut. Produkty PCR zostały oczyszczone i ilościowo zidentyfikowane. Sekwencjonowanie parowe (2×250 bp) było wykonywane na platformie sekwencjonowania NovaSeq 6000. Odczyty parowe były łączone i filtrowane, aby uzyskać dane wysokiej jakości. Za pomocą wtyczki DADA2 w QIIME 2 przeprowadzono filtrowanie długości i odmurywanie. Proces ten generował warianty sekwencji ampliconowych (ASV) oraz tabele liczebności ASV, a następnie usunięto ASV pojedynczych tonów. Przeprowadzono adnotacje taksonomiczne i profilowanie liczebności na podstawie pliku sekwencji ASV z wykorzystaniem bazy SILVA do badania różnic gatunkowych i składu społeczności między próbkami. Różnorodność gatunkowa oraz zmiany w względnej liczebności oceniano za pomocą analiz α-różnorodności i β-różnorodności, a wizualizacja danych przeprowadzono na tej stronie (https://www.omicstudio.cn/home).
Analizy statystyczne
Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu SPSS 26.0. Wartość P < 0,05 została uznana za statystycznie istotną. Dla danych z jednorodnymi wariancjami zastosowano jednokierunkową ANOVA do porównań międzygrupowych, a następnie testy najmniejszej istotnej różnic (LSD) po pośrednim roku, jeśli istotne różnice zostały znalezione. Dla danych z heterogenicznymi wariancjami zastosowano nieparametryczną jednokierunkową ANOVA Kruskala-Wallisa według rang. Analiza testu Mann-Whitney U została zastosowana do oceny zmian w składzie mikrobioty jelitowej i strukturze społeczności. Analiza korelacji rang Pearsona została wykorzystana do oceny korelacji między różnicowo licznymi bakteriami jelitowymi a innymi wskaźnikami. Zastosowano analizę korelacji Pearsona, ponieważ dane były zgodne z założeniami normalności i liniowości, które zostały potwierdzone testem Shapiro-Wilka oraz testem Durbin-Watsona. Wykresy statystyczne i mapy ciepła były generowane za pomocą GraphPad Prism 10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Walidacja modelu zwierzęcego
Cztery parametry krzepnięcia odgrywają kluczową rolę w badaniach nad zmianami naczyniowymi poprzez monitorowanie nieprawidłowości funkcji krzepnięcia ściśle powiązanych ze zmianami patologicznymi naczyń. Ocena po modelowaniu krwi splotu żylnego za oczodołem wykazała istotne zmiany w parametrach krzepnięcia (PT, APTT, FIB, TT) pomiędzy grupami HS/EA a kontrolami NC (Rysunek 3). Szczegółowe wartości testów podano w Tabeli Uzupełniającej ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zmiany naczyniowe są kluczowym czynnikiem w rozwoju i patologicznych objawach różnych zaburzeń CVD i metabolicznych. Ich szkodliwe skutki obejmują dysfunkcję naczyń krwi, nieprawidłowe krzepnięcie krwi, osadzanie lipidów oraz tworzenie blaszek, co może prowadzić do podwyższonego ciśnienia krwi, zakrzepicy i rozwoju płytki miażdżycowej, ostatecznie prowadząc do różnych CVD14, 15, 16. Dlatego terminowa interwencja w celu zatrzyman...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Badania te zostały sfinansowane przez Prowincjonalny Departament Nauki i Technologii Syczuan (Grant nr 2024NSFSC0717). Dziękujemy Figdraw za pomoc przy przygotowaniu figurki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Igły akupunkturowe | Suzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd. | 242059 | 0,18 & razy; 13 mm |
| Zestaw do testowania aktywowanego częściowego czasu tromboplastyny (APTT) (metoda krzepnięcia) | Beijing Successer Technology Inc. | R21D24C4 | |
| Koraliki XP AMPure | Genomika Beckmana Coultera | A63881 | |
| Automatyczny analizator krzepnięcia | Beijing Successer Technology Inc. | SF-8050 | |
| Zestaw do testowania fibrynogenu (FIB) (metoda zakrzepnięcia) | Beijing Successer Technology Inc. | R31D24D2 | |
| W pełni automatyczny tester reologii krwi | Beijing Successer Technology Inc. | SA-5600 | |
| GraphPad Prism 10 | GraphPad Software, Inc. | ||
| H& Roztwór barwienia E | Wuhan Saiweier Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| Zestaw do ilościowania biblioteki Illumina | Kapa Biosciences | 7960166001 | |
| Izofluran | Nauki o życiu z napędem na tylne koła | R510-22-10 | 100 mL |
| Zestaw do ekstrakcji genomowej DNA z kawałków magnetycznych | Biotek | AU46111-96 | |
| Mikroskop białego światła pionowego Nikon Eclipse Ci-L | Nikon | ||
| QIIME 2 | https://qiime2.org/ | ||
| Elektroniczny aparat akupunkturowy SDZ-II Huatuo | Suzhou Medical Supplies Factory Co., Ltd. | SDZ-II | |
| Baza danych SILVA | Wydanie 138, https://www.arb-silva.de/ | ||
| Chlorek sodu | Chengdu Jinshan Chemical Reagent, Ltd. | 20231008 | 500 g |
| Szczury Wistar z SPF | SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. | SCXK (Pekin) 2024-0001 | |
| Zestaw do testowania czasu trombiny (TT) (metoda krzepnięcia) | Beijing Successer Technology Inc. | R4D24E1 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie