Artykuł metodologiczny

Intrathekalne wstrzykiwanie SOD1-ASO do lędźwia w celu precyzyjnego celowania i predykcyjnej skuteczności ośrodkowej układu nerwowego (CNS) u ludzkich myszy SOD1-G93A ALS

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/69788

⸱

24 lutego 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biogen

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje metody podawania wewnątrz OUN dla terapii ukierunkowanych na OUN u dorosłych myszy, ze szczególnym uwzględnieniem precyzji protokołu i umożliwienia powtarzanych wstrzykiwań. Zawiera wyniki badania walidacyjnego, w którym oligonukleotydy antysensowne zmniejszały ekspresję mutantnego SOD1 u modelowych myszy SOD1-ALS, co potwierdza przydatność tego podejścia w przedklinicznych badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi.

Streszczenie

Intrathecalne (IT) terapie ukierunkowane na ośrodkowy układ nerwowy (OUN) oferują minimalnie inwazyjną drogę bezpośredniego podawania leku do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), co ułatwia zwiększoność swoistości i zaangażowanie celów. Chociaż cewnikowanie IT jest standardem przy długotrwałym porodzie u szczurów, jego zastosowanie u myszy jest ograniczone przez ograniczenia anatomiczne oraz podwyższone ryzyko powikłań związanych z zabiegiem, w tym urazów kręgosłupa i infekcji. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, zastosowaliśmy technikę ostrego nakłucia igłą do podawania leków IT u dorosłych myszy, oferując powtarzalną i mniej inwazyjną alternatywę kompatybilną z pojedynczymi lub powtarzanymi schematami dawkowania. W transgenicznym modelu mysiego stwardnienia zanikowego bocznego (ALS) zawierającym mutację SOD1-G93A osiągnęliśmy efektywne dostarczanie oligonukleotydów antysensowych (ASO) ukierunkowanych na gen SOD1. To podejście skutecznie zmniejszyło ekspresję mutantów SOD1 i znacząco złagodziło fenotyp choroby, co potwierdzają oceny elektrofizjologiczne i biomarkerowe. Wyniki te potwierdzają zarówno metodę podawania IT, jak i skuteczność terapeutyczną, z wynikami porównywalnymi z podaniem w intrace-re-naczyniach (ICV). Co najważniejsze, technika ta odzwierciedla procedury stosowane w badaniach klinicznych na ludziach, oferując silne znaczenie translacyjne i użyteczność w przedklinicznej ocenie interwencji kierowanych przez OUN. Chociaż potrzebna jest wiedza techniczna, aby zapewnić spójność i uniknąć efektów poza celem, ta strategia dostarczania IT stanowi solidną, powtarzalną i klinicznie istotną metodologię dla rozwoju terapii w modelach małych zwierząt.

Wprowadzenie

W niniejszym badaniu opisujemy protokół iniekcji śródtężwiowej (IT), porównujemy go z podaniem wewnątrz-naczyniowo-naczyniowym (ICV) oraz oceniamy wyniki farmakodynamiczne i tolerancję, aby kierować rozwojem terapii ukierunkowanych na ośrodkowy układ nerwowy (OUN). Terapie ukierunkowane na RNA, szczególnie oligonukleotydy antysensowne (ASO), stanowią obiecującą metodę leczenia chorób OUN, umożliwiając modulację ekspresji genów po transkrypcji. Takie podejścia są szczególnie istotne w przypadku chorób neurodegeneracyjnych, gdzie postępująca utrata neuronów podkreśla potrzebę precyzyjnych, lokalnych i terminowych interwencji mających na celu potencjalną modyfikację postępu choroby. Tutaj bezpośrednio porównujemy skuteczność protokołu iniekcji IT z podaniem ICV w terapiach ASO.

W badaniach przedklinicznych iniekcje doroczne lędźwiowe u dorosłych myszy (samców lub kobiet, 30-70 dni, waga 13-20 g) były stosowane do podawania leków farmakologicznych lub wektorów biologicznych bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) dla OUN celującegow 1,2. Objętości zastrzyków 5-10 μL są zazwyczaj podawane powoli, aby ograniczyć przejściowe wzrosty ciśnienia w płynie mózgowo-rdzeniowym i refluks, z dostępem wewnątrzśrodkowym przez przestrzeń międzykręgową L5-L6 1,2. Sukces zabiegowy zależy od starannej techniki zapobiegania uszkodzeniom neurologicznym, przy czym wiek i masa ciała wpływają na objętość i sposób ich obsługi. Użycie igieł cienkogrubnych (np. igły 27-30 G sprzężonej ze strzykawką Hamiltona 25 μL) umożliwia niezawodne podanie2. Kluczowe wyzwania techniczne obejmują minimalizację strat w martwej przestrzeni, zapobieganie błędnym iniekcjom i wyciekom znieczulenia zewnątrzoponowego oraz ograniczenie zmienności zależnej od operatora, która może wpływać na dokładność dawkowania i dystrybucję płynu mózgowo-rdzeniowego.

Opracowanie skutecznych terapii dla zaburzeń OUN pozostaje poważnym wyzwaniem ze względu na złożoność strukturalną i heterogeniczność komórkową OUN. Te cechy utrudniają celowane dostarczanie leków i ograniczają biodystrybucję przez liczne bariery anatomiczne i fizjologiczne, co wymaga specjalistycznych strategii podawania. Kluczową przeszkodą są bariery fizjologiczne i anatomiczne w całym OUN, które ograniczają penetrację leków. Mózg i rdzeń kręgowy są otoczone trzema warstwami oponowymi: oponą twardą, pajęczynową mater i pia mater, które wraz z barierą krew-mózg (BBB) stanowią silną ochronę przed krążącymi terapiami i innymi cząsteczkami we krwi. Choć są niezbędne dla utrzymania stabilności OUN, te bariery znacząco utrudniają dostarczanie dużych, hydrofilowych cząsteczek, takich jak ASO, przeciwciała monoklonalne i wektory wirusowe 1,2,3,4. Zarządzanie IT umożliwia obejście tych ograniczeń poprzez wprowadzenie terapii bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego w przestrzeni podpajęczynówkowej. Ta droga dostarczania ułatwia dystrybucję leku między przedziałami OUN, promując szersze przenikanie tkanek i tym samym umożliwiając skuteczne zaangażowanie w cele wyrażane w różnych typach komórek w OUN. Od czasu pierwszego zastosowania przez Hyldena i Wilcoxa w 1980 roku do podawania morfiny u myszy1, iniekcje IT stały się powszechnie stosowaną metodą podawania różnych środków terapeutycznych, w tym małych cząsteczek, leków biologicznych, wektorów terapii genowej oraz ASO 5,6,7,8,9,10.

ASO to chemicznie inżynierowane jednoniciowe oligonukleotydy, zaprojektowane do wiązania komplementarnych sekwencji RNA oraz modulowania ekspresji genów poprzez mechanizmy takie jak degradacja pośredniczona przez RNazę, modulacja splice oraz steryczna hamowanie translacji 11,12,13,14,15. Chemiczne ulepszenia, takie jak modyfikacje szkieletu fosforotiatowego, substytucje 2'-O-metoksyetyla (2'-MOE) oraz ograniczone reszty etylowe, zwiększają ich stabilność, powinowactwo wiązania i odporność na nukleazy6. Te właściwości wspierały ich zastosowanie w zwalczaniu patogennych genów związanych z zaburzeniami neurogenetycznymi. Leczenie oparte na ASO stosowane downętrznie wykazało kliniczne korzyści kliniczne w chorobach takich jak zanik mięśni rdzenia (SMA) oraz stwardnienie zanikowe boczne (ALS)12,13,14,15. Na przykład Nusinersen (Spinraza) zwiększa inkluzję eksonu 7 w transkrypcjach SMN2, aby zrekompensować utratę SMN1 w SMA 7,14. Podobne strategie ukierunkowane na transkrypcje mutantów huntingtyny były również badane w przypadku choroby Huntingtona12,13. Chociaż te próby zakończono na początku16 roku, podkreślają one utrzymujące się zainteresowanie podejściami ASO kierowanymi przez CNS.

ALS to śmiertelna choroba neurodegeneracyjna, charakteryzująca się postępującą degeneracją zarówno górnych, jak i dolnych neuronów ruchowych. Choroba, dotykająca od 6 do 9 osób na 100 000 osób na świecie i występująca w tempie około 2 przypadków na 100 000 osób-lat, objawia się stopniowym pogarszeniem się osłabienia mięśni i spastyczności, przy czym większość pacjentów umiera na nerwowo-mięśniową niewydolność oddechową w ciągu 2 do 3 lat od pojawienia się objawów17 lat. Chociaż większość przypadków jest sporadyczna (sALS), około 10% to osoby rodzinne (fALS), co daje wgląd w genetyczne czynniki napędzające chorobę. Jednym z najczęściej badanych genów jest dysmutaza nadtlenku Cu/Zn 1 (SOD1), która odpowiada za prawie 15 do 20% fALS, mniej niż 2% sALS i jest dziedziczona w sposób autosomalnie dominujący18. SOD1 koduje enzym antyoksydacyjny cytoplazmatyczny, który detoksykuje reaktywne formy tlenu poprzez przekształcanie rodników nadtlenku w nadtlenek wodoru. Zmutowane formy SOD1, takie jak G93A, A4V i H46R, wykazują niestabilność konformacyjną, prowadzącą do agregacji białek i toksycznego zysku funkcji, co przyczynia się do stresu oksydacyjnego, dysfunkcji mitochondrialnych oraz ekscytotoksyczności 19,20,21,22,23,24,25 . Ponadto patologia ALS jest pogarszowana przez niekomórkowe mechanizmy autonomiczne obejmujące mikroglej i astrocyty, które przyczyniają się do przewlekłego środowiska zapalnego i postępującego uszkodzenia neuronów 26,27,28,29. Wyciszanie ekspresji SOD1 za pomocą ASO stanowi zatem obiecującą drogę terapeutyczną do łagodzenia patogenezy choroby.

Transgeniczny model myszy SOD1-G93A (szczep Jax #: 004435), który wyraża ludzką zmutowaną formę G93A SOD1 pod kontrolą endogennego ludzkiego promotora SOD1, wiernie odzwierciedla cechy kliniczne ALS, w tym wczesne deficyty ruchowe, neurodegenerację rdzenia kręgowego oraz skrócone przeżycie30. Wcześniejsze badania przedkliniczne wykazały, że podawanie ASO specyficznych dla SOD1 poprzez długotrwałe podanie downętrzne za pomocą pomp osmotycznych u szczurów SOD1-G93A w dniu 65 po porodzie przy dawce 100 μg przez 28 kolejnych dni skutkuje istotnym obniżeniem poziomu SOD1, zmniejszeniem odpowiedzi neurozapalnych, opóźnieniem pojawienia się objawów klinicznych oraz poprawą sprawności motorycznej31. Ponadto, wywołany przez ASO wyniszczenie SOD1 u osób żyjących z SOD1-ALS wiąże się ze spadkiem poziomu łańcucha lekkiego neurofilamentu (NfL), biomarkera krwi wskazującego na uszkodzenie aksonów32. W tym badaniu podaliśmy ASO ukierunkowane na SOD1 za pomocą iniekcji IT u myszy SOD1-G93A oraz oceniliśmy ich wpływ na odczyty molekularne, elektrofizjologiczne i biomarkerowe. Ilościowa analiza tkanek rdzenia kręgowego wykazała istotne obniżenie poziomu mRNA SOD1. Oceny elektrofizjologiczne złożonych potencjałów czynnościowych mięśni (CMAP) wykazały zachowaną funkcję nerwowo-mięśniową. Równocześnie poziom NfL w surowicy spadł, co odzwierciedla łagodzenie trwającego uszkodzenia neuronów.

Aby ocenić rozkład przestrzenny i względną skuteczność alternatywnych metod podawania OUN, uwzględniliśmy grupę porównawczą wykorzystującą iniekcję do śródmózgowo-naczyniowej (ICV), w której środek terapeutyczny jest wprowadzany do komór bocznych w celu dystrybucji poprzez przepływ płynu mózgowo-rdzeniowego wzdłuż przestrzeni przyłożowej i okołonaczyniowej33. Porównując ścieżki podawania IT i ICV, dążyliśmy do wyodrębnienia różnic w wynikach farmakodynamicznych i celowaniu tkankowym, tym samym doprecyzując strategie podawania terapii ASO kierowanych przez OUN. Dodatkowo, aby ocenić wykonalność translacji, przeprowadziliśmy niezależne badania tolerancji, obejmujące do czterech zastrzyków IT na zwierzę, odstępując osiem tygodni. We wszystkich testowanych schematach nie zaobserwowano wyraźnych oznak niepokoju ani zachorowalności, co potwierdza tolerancję dawkowania IT ASO w kontekście przeżycia. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi raportami wykazującymi tolerancję powtarzających się wstrzyknięć wewnątrztocznych u myszy34.

Kliniczne znaczenie dostarczania ASO IT potwierdzają także niedawne zatwierdzenia regulacyjne tofersen (QALSODY)® dla ALS35 powiązanego z SOD1. Badania kliniczne wykazały silne zaangażowanie w cel, co odzwierciedlono przez zmniejszenie poziomu białka SOD1 w mózgowordzeniu, a następnie spadki poziomu łańcucha lekkiego neurofilamentu, biomarkera uszkodzenia neuroaksonalnego. Chociaż główny punkt końcowy nie został osiągnięty w początkowym badaniu VALOR fazy 3, zintegrowane analizy, w tym rozszerzenie otwarte, sugerowały potencjalne korzyści z wcześniejszego rozpoczęcia leczenia35.

Łącznie dane tutaj pokazują, że dostarczanie ASO skierowanych do SOD1 w modelu myszy SOD1-G93A ALS pozwala na skuteczne molekularne obniżenie, poprawę biomarkerów oraz zachowanie funkcjonalne przy korzystnej tolerancji. Wyniki te wspierają dostarczanie IT ASO jako racjonalne i klinicznie wykonalne podejście dla zaburzeń genetycznych układu nerwowego oraz stanowią solidne ramy przedkliniczne dla dalszego rozwoju translacyjnego.

Protokół

Wszystkie procedury tutaj zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez IACUC oraz wytycznymi dotyczącymi higieny chemicznej i bezpieczeństwa biologicznego instytucji.
UWAGA: Przeprowadz badania na myszach transgenicznych C57BL/6J (JAX #000664) i SOD1-G93A (JAX #004435) umieszczonych w warunkach standardowych (12-godzinny cykl światła/ciemności, 22-24 °C, ad libitum dostęp do jedzenia i wody).

1. Stosowanie chemicznie zmodyfikowanych ASO do celowania w ludzki SOD1

  1. Zastosowanie zweryfikowanych antysensownych oligonukleotydów (ASO) do konkretnego celowania w nukleotydy 613-629 w obszarze 3' nieprzetłumaczonym (UTR) ludzkiego genu SOD1 (RefSeq: NM_000454.5)36: A*GoToG*T*T*T*A*A*T*G*T*ToToA*T*C
  2. Uwzględnić zweryfikowane modyfikacje chemiczne zwiększające stabilność i skuteczność, poprzez włączenie MOE (2'-O-Metoksyetylon) (oznaczony czcionką regularną), cEt (ograniczony etyl) (kursywa), DNA (pogrubione), wiązań fosforanowych (o) oraz wiązań fosforotioatowych (*), jak wcześniej opisano36. Plik uzupełniający 1 przedstawia chemię ASO z odpowiadającym im kolorystycznym kodowaniem.
  3. Przygotuj ASO kontrolne niecelujące, bez komplementarności do genomów ludzkich lub gryzoni, stosując ten sam schemat modyfikacji do użycia jako kontrola: C*CoToAoT*A*G*G*A*C*T*T*C*C*AoGoA*A

2. Przygotowywanie i obsługa roztworów ASO w warunkach sterylnych

  1. Rekonstytucja ASO w sterylnym sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym (aCSF; Tabela 1) do stężenia 10 mg/mL w warunkach sterylnych, z celem na końcową objętość zastrzyku 10 μL (100 μg) na zwierzę.
  2. Delikatnie mieszaj roztwór za pomocą sterylnej pipety, aby zachować integralność cząsteczkową, a następnie lekko wiruj przez 5-10 sekund, aby dobrze się wymieszać.
  3. Przefiltruj rozcieńczony roztwór przez sterylny filtr strzykawkowy o średnicy 0,2 mm, aby usunąć cząstki i zanieczyszczenia.
  4. Aseptycznie aliquotuj ostateczny roztwór do sterylnych rurek mikrowirówek i przechowywać w temperaturze 4 °C w monitorowanej, kontrolowanej temperaturze jednostce do tygodnia, unikając cykli zamarzania i rozmrażania, aby zachować stabilność.

3. Przygotowanie myszy przed podaniu dolotkowo

  1. Waż każdą mysz do najbliższego stężenia 0,1 g za pomocą wagi cyfrowej, następnie przenieś do stożka nosowego i indukuj znieczulenie izofluranem w stężeniu 2-2,5% tlenu; Monitorowanie głębokości w trybie ciągłym i potwierdzanie płaszczyzny chirurgicznej poprzez utratę odruchu pedałowego.
  2. Przygotuj termostatycznie sterowany termostatyczny poduszkę grzewczą i ustaw ją na 37 °C, aby wspierać myszy podczas przygotowań i regeneracji. Umieść fizyczną barierę między myszką a poduszką grzewczą, aby uniknąć bezpośredniego kontaktu.
  3. Natychmiast po indukcji znieczulenia nałóż smar okulistyczny na oba oczy, aby zapobiec wysychaniu rogówki. Następnie umieść mysz w pozycji brzusznej leżącej na poduszce grzewczej, aby zapobiec hipotermii, zminimalizować stres fizjologiczny oraz wspierać prawidłowe funkcje sercowo-naczyniowe i oddechowe przez cały zabieg.
  4. Podanie buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu wstrzyknięć do zastrzyków (1,3 mg/mL) podskórnie w dawce 3,25 mg/kg, używając sterylnej strzykawki z igłą 25 g i wstrzyknięcie 0,05 mL na 20 g masy ciała przed zabiegiem.
  5. Ogol okolicę lędźwiową od środkowej części do obwodu miednicy, następnie dezynfekuj obszar za pomocą naprzemiennych wymazów z alkoholem izopropylowym i jodem povidonowym, powtórz trzy razy i pozwól miejsca całkowicie wyschnąć na powietrzu.

4. Bezpośrednie podanie dolotkowo

  1. Po znieczuleniu i przygotowaniu miejsca operacji przenieś mysz do czystego miejsca do wstrzyknięcia i umieść ją w pozycji brzusznej na poduszce grzewczej.
  2. Umieść mysz w pozycji wygiętej kręgosłupem, aby ułatwić palpację i zastrzyk. Umieść zakrzywioną szpatułkę pod brzuchem na poziomie dolnej części klatki piersiowej do górnej lędźwiowej, aby wywołać łagodne zgięcie kręgosłupa i poszerzyć przestrzenie międzykręgowe lędźwiowe pomiędzy piątą a szóstą (preferowane L5-L6) lub czwartą i piątą (L4-L5) warstwą.
  3. Stabilizuj obręcz miednicy, delikatnie chwytając obręcz między kciukiem a palcem wskazującym jednej ręki i dotykając grzbietowej linii środkowej drugą ręką, aby zlokalizować docelową przestrzeń międzykręgową między L4-L5 lub L5-L6.
  4. Ustaw sterylną strzykawkę insulinową o pojemności 0,3 mL wyposażoną w igłę 29-G, 1/2 cala, prostopadle do powierzchni grzbietowej skóry lub pod kątem 70-80°, z fazą skierowaną czaszkowo. Przesuwaj igłę aż do lekkiego oporu podczas penetracji rdzenia twardego, a następnie kontynuuj w przestrzeń wewnątrztekalną.
  5. Wprowadzaj stopniowo, aż czubek wejdzie do przestrzeni wewnątrzśrodkowej, co potwierdza odruch machnięcia ogonem wskazujący na udaną penetrację wewnątrzśrodka.
  6. Jeśli napotkasz znaczący opór lub nie zaobserwuje się odruchu machnięcia ogonem, wyciągnij igłę, ponownie zidentyfikuj punkty orientacyjne anatomiczne i dostosuj umiejscowienie igły przed ponownym wkłuciem. Jeśli pierwsza próba została wykonana w przestrzeni międzykręgowej L5-L6, następna jest w przestrzeni międzykręgowej L4-L5.
  7. Wstrzyknij 10 μL roztworu ASO powoli (przez 10 s), aby zminimalizować zmiany ciśnienia i uniknąć refluksu płynowo-rdzeniowego. Igła może być utrzymywana na miejscu przez dodatkowe 10 sekund po wstrzyknięciu.
  8. Ostrożnie wyciągnij igłę pionowo i płynnie, aby zapobiec uszkodzeniom tkanek i cofaniu się.

5. Monitorowanie myszy i wspieranie powrotu do zdrowia po wstrzyknięciu

  1. Umieść każdą mysz w osobnej lub dobrze rozmieszczonej komorze w komorze regeneracyjnej utrzymywanej w temperaturze 37 °C. Zadbaj o wyraźną widoczność.
  2. Utrzymuj temperaturę komory pod kontrolą podczas rekonwalescencji znieczulającej, aby zapobiec hipotermii.
  3. Monitoruj nieprzerwanie częstość oddechu i wzorzec, postawę oraz reakcję na bodźce dotykowe.
  4. Obserwuj mysz, aż odzyska odruch wyprostowania i zacznie się koordynować.
  5. Dokumentuj wszystkie istotne szczegóły proceduralne, w tym miejsce wkłucia, dawkę ASO, objętość zastrzyku oraz wszelkie obserwacje behawioralne lub fizjologiczne podczas i po zabiegu, zgodnie z protokołami IACUC.

6. Określenie kryteriów powrotu do klatki domowej

  1. Potwierdź, że mysz jest stabilna i zsynchronizowana, spontanicznie się poruszając, zanim wróci do swojej klatki.
  2. Upewnij się, że nie ma oznak niepokoju, w tym ciężkiego lub nieregularnego oddychania, wokalizacji i długotrwałej niereakcji.
  3. Zapewnij delikatne wsparcie odżywcze, takie jak suplement diety z pełnym składnikiem odżywczym, aby pomóc utrzymać nawodnienie i spożycie kalorii przy minimalnym wysiłku.

7. Prowadzenie obserwacji myszy po odzyskaniu

  1. Sprawdź normalne zachowania, takie jak eksploracja, pielęgnacja i interakcje społeczne, jeśli myszy są trzymane w grupie.
  2. Nieustannie monitoruj wszelkie objawy nieprawidłowego powrotu do zdrowia, takie jak nietypowa postawa, osłabienie lub paraliż, nieregularne oddychanie czy zmniejszona reakcja, i szybko ponownie oceniaj, jeśli te objawy się pojawią.
  3. Zgłoś się do weterynarza, jeśli powrót do zdrowia jest opóźniony lub zagrożony.

8. Intrace-urząd komorowy w komorę boczną z wykorzystaniem chirurgii stereotaksyjnej i opieki pooperacyjnej

UWAGA: Uwzględnić grupę porównawczą wykorzystującą iniekcję do śródmózgowo-komorowej (ICV) do oceny rozkładu przestrzennego i względnej skuteczności, dostarczając ASO do komór bocznych w celu dystrybucji za pomocą mózgowo-naczyniowego i porównania z podaniem wewnątrztokowym. Wykonaj iniekcje ICV zgodnie z dobrze ustalonymi, standaryzowanymi protokołami dla myszy37.

  1. Znieczulić mysz izofluranem w stężeniu tlenu 2-2,5% dla unieruchomienia i ustawić mysz w pozycji brzusznej na poduszce grzewczej, a następnie podać buprenorfinę o przedłużonym uwalnianiu wstrzykiwalną (1,3 mg/ml buprenorfiny) podskórnie w dawce 3,25 mg/kg, używając sterylnej strzykawki 1 mL z igłą 25 g o stężeniu 0,05 mL na 20 g masy ciała przed zabiegiem. Ogol skórę głowy myszy maszynką do cięcia.
  2. Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonuj w znieczuleniu. Potwierdź głębokość znieczulenia, potwierdzając brak odruchu cofania się pedału (szczypanie palca). Utrzymuj sterylne pole aseptyczne przez cały zabieg ICV. Używaj wyłącznie narzędzi sterylnych i obchodzić się z nimi ostrożnie, aby zapobiec kontaktu z powierzchniami niesterylnymi.
  3. Zabezpiecz mysz w stereotaksycznej ramie z cyfrową konsolą wyświetlającą w standardowej pozycji leżącej. Umieść przednie zęby w drążku myszego adaptera, aby unieruchomić głowę, a następnie zabezpiecz adapter rurkami do oddychania wdechowego i wydechowego, które dostarczają izofluran. Włóż drążki do uszu i dokręć śruby, aby mocno ustabilizować głowę.
  4. Dezynfekuj obszar za pomocą naprzemiennych wymazów z alkoholem izopropylowym i jodem povidonowym, powtarzaj trzy razy, a następnie wykonaj nacięcie środkowe sterylnym skalpelem, aby odsłonić czaszkę. Użyj sterylnej bawełnianej końcówki, aby usunąć tkanki miękkie i upewnij się, że bregma jest wyraźnie widoczna.
  5. Zaznacz bregmę na czaszce. Umieść strzykawkę zawierającą ASO igłą (26-G, 26s/2"/2, w stylu punktowym) tuż nad bregmą. Wyrównaj igłę z współrzędnymi celu: AP -0,3 mm, ML ±1,0 mm, DV -3 mm od powierzchni czaszki. Oznacz czaszkę na współrzędnych AP i ML.
  6. Stwórz otwór na zaznaczonych współrzędnych, a następnie użyj ramy stereotaktycznej, aby opuścić igłę strzykawki na głębokość -3 mm od powierzchni czaszki. Wstrzykuj roztwór z częstotliwością 10 μL/min, aż do uzyskania całkowitej objętości 10 μL. Po zakończeniu zastrzyku przytrzymaj igłę na miejscu przez 4 minuty, a następnie powoli ją wyjmij, aby zminimalizować refluks.
  7. Zszyj nacięcie na skórze głowy, umieść mysz w komorze regeneracyjnej o temperaturze 37 °C aż do pełnej przytomności i po potwierdzeniu stabilności wróć ją do klatki domowej. Zapewnij suplement diety żelowej w postaci kompletnej wartości odżywczej i nieustannie monitoruj oznaki nieprawidłowej regeneracji, takie jak nietypowa postawa, osłabienie lub paraliż, nieregularne oddychanie lub zmniejszona reakcja; Szybko oceń ponownie, jeśli pojawią się te objawy.

9. Oceny elektrofizjologiczne złożonych potencjałów czynnościowych mięśni (CMAP)

  1. Upewnij się, że eksperymentatorzy są ślepi na genotyp i grupę leczoną każdej myszy, aby wyeliminować błędy podczas zbierania i analizy danych.
  2. Znieczulaj mysz izofluranem dla unieruchomienia i komfortu oraz utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C.
  3. Potwierdź odpowiednią znieczulenie, zapewniając utratę odruchu pedałowego.
  4. Używaj jednorazowych elektrod igiełowych o masie 28 g monopolarnych zarówno do stymulacji, jak i nagrywania. Elektrodę rejestrującą włóż 1 mm w mięsień piszczelowy przedni.
  5. Stymuluj nerw kulszowy w pobliżu wcięcia kulszowego za pomocą monofazowych impulsów prostokątnych o długości 0,1 ms, dostarczanych co 2 s, zaczynając od 1,0 mA i zwiększając o 0,5 mA, aż osiągniesz odpowiedź supramaksymalną (zazwyczaj 1,5-3,5 mA).
  6. Po ustaleniu progu supramaksymalnego, rejestruj odpowiedzi CMAP o wartości 0,5 mA powyżej tego poziomu. Zmierz amplitudę CMAP (szczyt-szczyt) na 0,8 ms po bodźcu, aby wykluczyć opóźnienia i uśrednić amplitudy z lewej i prawej nogi dla każdej myszy.

10. Pomiar poziomu pNFH w surowicy

  1. Pobierz 100 μL pełnej krwi poprzez nakłucie żył twarzy za pomocą kapilarnych probówek z aktywatorem zakrzepów i żelem separacyjnym surowicy w wyznaczonych punktach czasu.
  2. Próbki krwi w wirówce z dawką 2000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby wyizolować surowicę.
  3. Ilościowe określenie poziomów ciężkiego łańcucha neurofilamentu w surowicy (pNFH) za pomocą zweryfikowanych odczynników immunoaseju do pomiaru pNFH w próbkach biologicznych na w pełni zautomatyzowanym, wkładowym mikrofluidycznym analizatorze immunotestowym.

11. Izolacja RNA i wykonanie RT-qPCR

  1. Rozdrobnić tkanki rdzenia kręgowego myszy/piersiowego myszy za pomocą stalowej kulki o średnicy 6 mm w kriogenicznym, programowalnym, wysokoenergetycznym oscylacyjnym młynie kulkowym do rozdrobnienia próbek z prędkością 1 000-1 200 uderzeń na minutę przez 30-40 sekund.
  2. Homogenizacja rozdrobnionej tkanki (15 mg) za pomocą 2,8 mm kulek ceramicznych w lizie na bazie 700 μL na bazie fenol-guanidynianu tiocyjanianu oraz odczynnika ekstrakcyjnego RNA, używając programowalnego, szybkiego mechanicznego homogenizatora opartego na kulkach z prędkością 5,62 m/s przez dwa cykle po 30 sekund.
  3. Całkowite RNA należy wyodrębnić metodą, w tym zabieg DNazą na kolumnie, zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Synteza cDNA za pomocą systemu odczynnika odwrotnego transkrypcyjnego o dużej pojemności do syntezy cDNA.
  5. Do wykrywania qPCR projektuj niestandardowe zestawy zapalników/sond do wykrywania interesującego genu skierowanego na ekson 4 ludzkiego genu SOD1:
    forward primer (5′-TGGTGTGGCCGATGTGTGTCTA-3′),
    Reverse primer (5′-ATGATGCAATGGTCTCCTGAGA-3′)
    sonda (5′-6FAM-TGAAGATTCTGTGATCTCA-MGB/NFQ-3′)
  6. Użyj myszy GAPDH (TaqMan Assay ID: Mm99999915_g1) jako genu gospodarstwa domowego.
  7. Wykonanie qPCR na wysokoprzepustowym przyrządzie ilościowym w czasie rzeczywistym (qPCR), wykorzystując 20 ng cDNA na reakcję, szybkocyklową mieszankę qPCR opartą na sondzie, zapalniki genetyczne oraz fluorescencyjne sondy hydrolizowe do wykrywania transkryptów housekeeping (VIC/MGB) i docelowych (FAM/MGB).

12. Analiza statystyczna danych

  1. Przedstawiamy dane z pomiarów życiowych (CMAP), pNFH w surowicy oraz analizy ekspresji genów jako średnią ± odchylenia standardowego (SD).
  2. Oceń istotność statystyczną między średnimi grupowymi za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie test wielokrotnych porównań Tukeya, uwzględniając p < 0,05 jako statystycznie istotne.
  3. Używaj odpowiedniego oprogramowania do analizy statystycznej do generowania wykresów i wykonywania wszystkich analiz, zgodnie z tymi przeprowadzonymi w badaniu.

Wyniki

Aby rygorystycznie scharakteryzować precyzję i efektywność podawania downętrznego (IT) u dorosłych myszy, najpierw przeprowadziliśmy eksperymenty walidacyjne z wykorzystaniem niebieskiego barwnika Evansa (0,5%) jako wizualnego znacznika przepływu płynu mózgowo-płynowego i przenikania tkanek. Dorosłe dzikie myszy typu C57BL/6J (szczep #000664; waga 25-30g) zostały znieczulone izofluranem (2-2,5%) w tlenie, aby wyeliminować artefakty ruchu, a obszar lędźwiowy przygotowywano w warunkach aseptycznych. Zastrzyki z IT wykonywano poprzez punkcję lędźwiową do przestrzeni podpajęczynowej w pojedynczych dawkach wzrostowych 20 μL, 30 μL i 50 μL w celu oceny dawki do objętości oraz zależności intensywności barwienia. Prawidłowe umieszczenie igły potwierdzono poprzez zaobserwowanie ruchów ogonem lub ujemnego oporu podczas wstrzyknięcia.

W ciągu 5 minut od podania barwnika myszy zostały przezserdialnie przeniesione zimną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS), aby usunąć resztki barwnika z naczyń. Następnie delikatnie wyciągano rdzenie kręgowe i fotografowano je przy standardowym oświetleniu na neutralnym tle. Inspekcja wizualna wykazała spójny i jednolity rozkład błękitu Evansa od grzbietu do brzucha u wszystkich myszy, które otrzymały barwnik. Wyższe objętości wstrzykiwania korelowały ze zwiększonym nasyceniem barwnika wzdłuż osi rostrocaudalnej, choć nawet mysz wstrzyknięta objętością 20 μL wykazywała silne barwienie. Dla porównania, myszy, które nie otrzymały barwnika niebieskiego Evansa (grupa kontrolna wstrzyknięta bezpłodną solą fizjologiczną), nie wykazywały widocznego zabarwienia ani przebarwienia tła w tkance rdzenia kręgowego (Rysunek 1). Wyniki te pokazują, że zastrzyki z IT u myszy umożliwiają szybkie, powtarzalne dostarczanie substancji rozpuszczonej wzdłuż rdzenia kręgowego. Ograniczenia tych eksperymentów obejmują brak ilościowej oceny rozkładu barwnika oraz brak analizy rozmieszczenia barwnika przy objętości 10 μL przy objętości wtrysku 10 μL używanej do podawania ASO. Jednak kwantyfikacja została przeprowadzona w kolejnych pomiarach zaangażowania celu na poziomie ekspresji genów u myszy SOD1-G93A u ludzi, wykorzystując analizę ekspresji genów specyficzną dla człowieka SOD1. Objętość zastrzyków 10 μL używana w kolejnych eksperymentach do podawania ASO została wybrana w celu zapewnienia bezpiecznego i dobrze tolerowanego dawkowania u myszy i oczekuje się, że zapewni odpowiednią ekspozycję na OUN na podstawie wcześniejszych badań38.

Bazując na tej walidacji anatomicznej, oceniliśmy funkcjonalne znaczenie dostarczania IT za pomocą ASO skierowanych na mutanta SOD1, zweryfikowaną strategię terapeutyczną w modelach SOD1-ALS. Hemizygotyczne transgeniczne myszy SOD1-G93A, posiadające ludzki mutant gen SOD1 , wykazują przewidywalną degenerację neuronów ruchowych i spadek nerwowo-mięśniowy, co czyni je uznanym modelem przedklinicznym. W wieku 5 tygodni, przed pojawieniem się objawów, myszy otrzymały pojedynczy bolus IT ASO specyficznego dla SOD1 w stężeniu 100 μg w 10 μL. Dawka ta została wybrana na podstawie wcześniejszych badań optymalizacyjnych przeprowadzonych z użyciem ICV u myszy, jak podali McCampbell i in. (2018)36. Aby porównać skuteczność między podawaniem IT a ICV, osobna grupa otrzymała zastrzyki ICV tej samej dawki ASO przy użyciu stereotaktycznego podawania. Sterowanie otrzymywało Inactive ASO (niecelowanie) ścieżką IT.

Pięć tygodni po leczeniu (w wieku 10 tygodni) myszy przeszły badania złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) pod lekką znieczuleniem izofluranem. Nagrania CMAP z mięśni kończyn tylnych uzyskane przez standaryzowane protokoły stymulacji nerwu kulszowego wykazały istotne zachowanie amplitudy zarówno w grupach leczonych IT, jak i ICV w porównaniu z kontrolami leczonymi nieaktywnymi (s. < 0,0001 poprzez jednokierunkową ANOVA z testem pooperacyjnym Tukey'a). Co istotne, zachowanie amplitudy nie różniło się istotnie między metodami podawania IT i ICV (s. > 0,05), co wskazuje na porównywalną ochronę neuromięśniową (Rysunek 2A).

Aby ocenić ogólnoustrojowe biomarkery integralności neuronów, zmierzono poziomy ciężkiego łańcucha neurofilamentu fosforylowanego w surowicy (pNFH) za pomocą bardzo czułego testu elektrochemiluminescencji. Próbki krwi pobrane w okresie 5 tygodni po podaniu wykazały >40% spadek stężenia pNFH u myszy leczonych ASO w porównaniu do kontrolnych leczonych przez nosiciela (p < 0,0001), bez istotnych różnic między metodami IT i ICV (Rysunek 2B). Jednolita odpowiedź molekularnych biomarkerów potwierdza dane elektrofizjologiczne, sugerując, że dostarczanie IT skutecznie łagodzi procesy neurodegeneracyjne w tym modelu ALS.

Aby ocenić docelowe zaangażowanie SOD1-ASO na poziomie molekularnym, przeprowadziliśmy transkrypcję odwrotną ilościową PCR (RT-qPCR) na rozciętych tkankach rdzenia kręgowego szyjki i klatki piersiowej. Całkowite RNA było ekstrahowane za pomocą protokołu opartego na kolumnie, zapewniającego wysoką czystość (A260/A280>1.8), a następnie synteza cDNA z losowym primowaniem heksamerów. Ilościowe wzmocnienie PCR skierowane na ludzkie transkrypty SOD1, znormalizowane do GAPDH, wykazało średni spadek wynoszący 60% po porodzie IT i 35% po podaniu ICV, co jest istotne w porównaniu do nieaktywnych kontrolnych ASO (s. < 0,0001 dla obu). Bezpośrednie porównanie między trasami dostarczania wykazało istotnie większe powalenie przy dostawie IT (s. < 0,0001), co wskazuje na skuteczniejsze zaangażowanie celu w rdzeniu kręgowym poprzez bezpośredni dostęp do kręgosłupa (Rysunek 3). Potrzebne są dalsze badania, aby ocenić zaangażowanie celów w innych regionach OUN.

Łącznie te kompleksowe dane oferują przekonujące potwierdzenie zastrzyków IT jako precyzyjnej, powtarzalnej i minimalnie inwazyjnej techniki dostarczania ASO do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w modelach myszych. Przeprowadzenie IT wykazało skuteczność terapeutyczną na poziomie podawania ICV w szerokim spektrum miar wyników, w tym trwałe zachowanie funkcji neurologicznych (CMAP), normalizację biomarkerów istotnych dla chorób (pNFH) oraz solidne molekularne obniżenie transkrypcji SOD1 u ludzi w docelowych regionach OUN. Wyniki te podkreślają wszechstronność dostarczania IT jako klinicznie przekładalnej drogi terapii ASO ukierunkowanej na CNS, oferując skuteczność równoważną ICV, zachowując prostotę proceduralną i zmniejszoną inwazyjną aktywność. Dlatego dostarczanie IT i ICV są równie realnymi podejściami do interwencji ukierunkowanych na OUN, oferując elastyczność w warunkach przedklinicznych w zależności od dostępności anatomicznej, wykonalności procedur oraz kontekstu terapeutycznego. To pozycjonuje dostarczanie IT jako obiecującą platformę tłumaczącą dla przyszłych terapii ukierunkowanych na CNS. Aby wesprzeć wysiłki translacyjne, sugerujemy prowadzenie dalszych badań przedklinicznych mających na celu ocenę rozkładu farmakokinetycznego w obrębie płynu mózgowo-rdzeniowego, różnych regionach OUN oraz wychwytu komórek docelowych z wykorzystaniem technik takich jak hybrydyzacja in situ fluorescencji lub immunofluorescencja.

Rysunek 1
Rysunek 1: Wizualizacja rozkładu barwnika niebieskiego Evans po wstrzyknięciu domięśniowym u dorosłych myszy. Barwnik Evans Blue (0,5%) był podawany bezpośrednim iniekcjom domięśniowym (IT) u dorosłych myszy w celu jakościowej oceny rozkładu w rdzeniu kręgowym. Trzy różne objętości barwnika: 20 μL, 30 μL i 50 μL, zostały dostarczone w oddzielnych grupach eksperymentalnych (stan n = 1 mysz na objętość). Po wstrzyknięciu pobrano i przepłukano rdzeń kręgowy, aby ocenić penetrację barwnika na podstawie intensywności barwienia na tkance. Obrazy tkanki rdzenia kręgowego pokazują zakres rozproszenia barwnika przy każdej objętości zastrzyku, co pokazuje zależny od dawki wzrost pokrycia i intensywność barwienia w całym rdzeniu kręgowym. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2
Rysunek 2: Terapia antysensowna oligonukleotydowa ukierunkowana na SOD1 przywraca funkcje motoryczne i obniża patologiczne poziomy neurofilamentów u myszy. Dorosłe myszy transgeniczne SOD1-G93A otrzymały pojedynczą dawkę aktywnego oligonukleotydu antysensownego (SOD1-ASO) ukierunkowanego na SOD1 (SOD1-ASO) w formie intrateku (IT) lub intracerebroventrikularnego (ICV) w wieku 5 tygodni, lub nieaktywnego ASO kontrolowanego przez zastrzyk IT. Wpływ terapeutyczny oceniano w wieku 10 tygodni, co odpowiada 5 tygodniom po leczeniu. (A) Uzyskano nagrania złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) w celu oceny funkcji nerwowo-mięśniowej u leczonych zwierząt. Grupy leczone SOD1-ASO (n = 5 - 6 w grupie) wykazały odwrócenie spadku CMAP w porównaniu do grupy kontrolnej, co wskazuje na funkcjonalne zdrowie. (B) Obwodowe poziomy ciężkiego łańcucha fosforylowanego neurofilamentu (pNFH), biomarkera neurodegeneracji, zostały ilościowo określone na podstawie surowicy pobranej w 10. tygodniu (n = 5 - 8 na grupę). Leczenie SOD1-ASO doprowadziło do istotnego zmniejszenia poziomu pNFH w obiegu w porównaniu z grupą kontrolną, co sugeruje osłabienie uszkodzenia neuronów związanych z chorobą. Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± SD. Istotność statystyczna została określona za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya, gdzie wartości p ≤ 0,0001 wskazują na solidne różnice między grupami leczonymi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3
Rysunek 3: Podawanie SOD1-ASO istotnie hamuje ekspresję ludzkiego mRNA SOD1 w transgenicznym rdzeniu kręgowym myszy SOD1-G93A. Aby ocenić skuteczność celowania antysensownego oligonukleotydu (SOD1-ASO) ukierunkowanego na SOD1 (SOD1-ASO) podawanego przez intratekalne (IT) lub intracereventrikulum (ICV), przekrój szyjny/piersiowy tkanki rdzenia kręgowego od transgenicznych myszy SOD1-G93A uśpionych w wieku 10 tygodni (5 tygodni po podaniu) został przeanalizowany pod kątem ekspresji ludzkiego mRNA SOD1 za pomocą odwrotnej transkrypcji ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy łańcuchowej (RT-qPCR). Poziomy transkrypcji SOD1 u ludzi zostały zmierzone i znormalizowane w odniesieniu do ekspresji w grupie nieaktywnej leczonej ASO. Rysunek przedstawia zmianę fałdów w ludzkim mRNA SOD1 (znormalizowanym do GAPDH) dla każdej grupy leczonej (n = 5-7 myszy w grupie), podkreślając znaczne obniżenie stężenia w odpowiedzi na podanie SOD1-ASO. Dane prezentowane są jako średnia ± SD. Różnice statystyczne między grupami zostały określone za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya, gdzie wartości p ≤ 0,0001 wskazują na solidne różnice między grupami leczonymi. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

SkładnikFWIlość dodatków (na L lub kg)Jednostki
Jednozasadowy dihydrat fosforanu sodu0.034g
Fosforan sodu bezwodny1420.111g
Chlorek sodu58.448.766g
Chlorek potasu74.560.224g
Chlorek wapnia dihydrat147.020.206g
Chlorek magnezu – heksahydrat0.163g
Woda (Milli-Q)993g
Poloxamer 1880.01g

Tabela 1: skład aCSF.

Rysunek uzupełniający 1: Ustawianie myszy do wstrzyknięcia do lędźwiowego doczynności . Zakrzywiona łopatka lub łopatka umieszczona pod brzuchem zgina kręgosłup, poszerzając przestrzeń międzykręgową. Zastrzyk jest skierowany na poziom L4-L5 lub L5-L6, z prawidłowym ustawieniem wzdłuż osi przyśrodkowej kręgosłupa, jak pokazano. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Plik uzupełniający 1: Sekwencja ASO i chemia. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Technika bezpośredniego wstrzyknięcia wewnątrz (IT) przedstawiona tutaj stanowi minimalnie inwazyjną, lecz bardzo skuteczną metodę dostarczania środków terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), szczególnie u małych modeli gryzoni, takich jak myszy. Ta procedura ślepego wkłucia jest technicznie wymagająca, ale okazała się zarówno powtarzalna, jak i klinicznie istotna, gdy wykonuje ją wykwalifikowany iniektor. Metoda ta wykorzystuje precyzyjną anatomię i efektywną technikę, umożliwiając szybki dostęp do OUN bez konieczności cewnikowania, co jest ważnym uproszczeniem i znaczącymi korzyściami dla rozwoju badań przedklinicznych; jednak jej znaczenie translacyjne skorzysta na dalszej ocenie ilościowej i standaryzowanej walidacji metodologicznej 5,8,10.

Skuteczne wstrzykiwanie IT zależy od kilku kluczowych kroków. Niezbędna jest staranna przygotowanie zwierząt: najpierw indukuje się znieczulenie za pomocą komory i utrzymuje się za pomocą stożka nosa, następnie goli się okolice lędźwiowej i podaje leki przeciwbólowe, aby zapewnić zwierzęciu komfort. Prawidłowe ustawienie myszy osiąga się poprzez umieszczenie zakrzywionej łopatki pod brzuchem, zginając kręgosłup w celu poszerzenia przestrzeni międzykręgowej (Rysunek Uzupełniający 1). Celem opisanego tutaj iniekcji wewnątrz rdzenia jest umieszczenie fazy igły w zbiorniku lędźwiowym poprzez przesunięcie jej między warstwami na odpowiednim poziomie kręgowym. Precyzyjne celowanie przestrzeni międzykręgowej pomiędzy warstwami L4 i L5 lub, najlepiej L5 i L6, jest kluczowe dla dostępu do przestrzeni podpajęczynowej 5,10. Przestrzeń podpajęczynkowa, zwana także przestrzenią wewnątrztekową, znajduje się pomiędzy pajęczynkiem a pia mater39. Ponieważ rdzeń kręgowy jest krótszy niż kanał kręgowy, segmenty rdzenia ogonowego znajdują się bardziej rosttralnie względem odpowiadających im poziomów kręgowych. Aby uniknąć niejasności, miejsca wstrzykiwania są oznaczone według przestrzeni międzykręgowej, a nie poziomu rdzenia kręgowego. Warto zauważyć, że istnieje znaczna zmienność segmentacji kręgów lędźwiowych u myszy, zarówno wewnątrz, jak i pomiędzy szczepami40. Zastrzyk musi być wykonywany wzdłuż linii środkowej kręgosłupa, aby uniknąć bocznego odchylenia, które może prowadzić do porażenia kończyny tylnej lub, w ciężkich przypadkach, do paraliżu spowodowanego urazem rdzenia kręgowego. Gdy jest wykonywana w odpowiednim miejscu anatomicznym, ryzyko bezpośredniego uszkodzenia rdzenia kręgowego jest minimalne. Jednak ryzyko podrażnienia lub uszkodzenia korzenia nerwowego pozostaje niewielkie, co podkreśla znaczenie odpowiedniego szkolenia operatora i biegłości proceduralnej, aby zminimalizować negatywne skutki. Odruch machnięcia ogonem jest pomocnym wskaźnikiem skutecznego umieszczenia igły, pozwalając wtryskiwaczowi ocenić głębokość i uniknąć powierzchownego lub zbyt głębokiego penetrowania. Ta technika wymaga praktyki, by ją opanować, a także stałej kontroli głębokości, kąta i objętości zastrzyku, aby uniknąć cofania się i przecieków do otaczających tkanek. Chociaż zalecamy utrzymanie objętości zastrzyków ≤10 μL, oceniliśmy do 20 μL bez skutków niepożądanych. Wcześniejsze badania wykazały, że objętość zastrzyku downętrznego 10 μL jest optymalna dla podawania leku38. Chociaż stanowi to 25-30% całkowitej objętości płynu mózgowo-płynowego u myszy41,42, maksymalna dopuszczalna objętość zastrzyku wewnątrztekowego u dorosłych myszy wynosiła 30 μL10. Objętości zastrzyków przekraczające zalecane limity mogą zakłócać dynamikę płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF), prowadząc do zmiany ciśnienia płynu mózgowo-rdzeniowego i zwiększonego ryzyka działań niepożądanych. Całkowita objętość CSF u myszy szacowana jest na 35-40 μL i obróca się 12-13 razy dziennie41,42, co odpowiada całkowitemu odnowieniu mniej więcej co 1,8 h42,43. Biorąc pod uwagę szybki wymian płynu mózgowo-rdzeniowego i obserwacje empiryczne, a także wcześniejsze badania wykazujące bezpieczne stosowanie objętości do 20-30 μL bez powikłań, objętość zastrzyku 10 μL nie przewiduje się wywołania skutków niepożądanych10,44.

Skalowalność jest istotną zaletą tej techniki. Po opanowaniu wytrenowani iniektorzy mogą leczyć 10-12 zwierząt na godzinę, ułatwiając większe badania przedkliniczne bez logistycznych obciążeń związanych z wszczepianiem cewnika czy bardziej inwazyjnymi metodami chirurgicznymi. Procedura ta unika skomplikowanej instrumentacji, zmniejsza stres zwierzęcia i skraca czas rekonwalescencji w porównaniu z przewlekłą cewnikową, co czyni ją odpowiednią do badań podłużnych wymagających wielokrotnego podawania. Aby symulować kliniczne schematy dawkowania, zweryfikowaliśmy seryjne podawanie IT u myszy, podając do czterech dawek w odstępach ośmiu tygodni. Zastrzyki te były dobrze tolerowane, bez oznak niepokoju, zmian zachowań czy objawów choroby, zgodnie z wcześniejszymi badaniami, które nie wykazały istotnych zmian w dynamice płynu mózgowo-rdzeniowego ani architekturze rdzenia kręgowego po wielokrotnych zabiegach IT34,45. W związku z tym nasze badania potwierdzają, że powtarzane dawkowanie IT jest możliwe w odpowiednich odstępach czasu, co jest zgodne z paradygmatami leczenia ludzi, gdzie dla korzyści terapeutycznych konieczne jest trwałe zaangażowanie w cel. Z naszego doświadczenia wynika, że te powtarzające się iniekcje IT były skutecznie wykonywane w szerokim przedziale wiekowym od 5 do 29 tygodni. Chociaż wzrost wieku i masy ciała może nieco wpłynąć na dostępność rdzenia kręgowego z powodu większej tkanki podskórnej, skuteczne podanie pozostaje możliwe przy posiadaniu doświadczonego operatora, który zna tę technikę i zna się na wkładzie igły. Zauważamy jednak, że kilka czynników poza miejscem wstrzyku i objętością bolusu, w szczególności prędkość wstrzyku oraz właściwości fizyczne roztworu wstrzykniętego, takie jak gęstość względem CSF, może znacząco wpływać na rozkład substancji rozpuszczonych w OUN. Chociaż te parametry nie były bezpośrednio mierzone ani manipulowane w niniejszym badaniu, najnowsze badania Linningera i in. (2023) wykazują za pomocą mechanistycznego modelu farmakokinetycznego, że takie czynniki istotnie wpływają na biodystrybucję antysensownych oligonukleotydów (ASO) oraz celowanie w tkanki46. W związku z tym uznajemy to za ograniczenie naszego badania i podkreślamy prędkość wstrzykiwania oraz właściwości roztwóru jako ważne zmienne dla przyszłych badań, aby zoptymalizować dostarczanie OUN i znaczenie translacyjne. Razem wyniki te podkreślają wiarygodność i wykonalność powtarzanego dawkowania IT w wielodawkowych paradygmatach przedklinicznych, wspierając jego zastosowanie do długotrwałego zaangażowania celów oraz translacyjnego modelowania ludzkich schematów terapeutycznych.

Podejście IT zapewnia również elastyczność w testowaniu terapeutycznym. Obejmuje szeroki zakres modalności, w tym ASO, małe cząsteczki, peptydy i wektory wirusowe, umożliwiając bezpośrednią ocenę interwencji ukierunkowanych na OUN. Możliwość dostarczania precyzyjnych, kontrolowanych ilości leków do zbiornika lędźwiowego zapewnia skuteczną ekspozycję rdzenia kręgowego i szerszego narażenia na OUN, jednocześnie ograniczając przelew ogólnoustrojowy. Odruch machnięcia ogonem oraz inne proceduralne sygnały pozwalają na weryfikację skutecznego podania wewnątrztekalnego w czasie rzeczywistym, co dodatkowo zwiększa powtarzalność i zmniejsza wskaźniki awarii eksperymentalnych 5,6,8,47.

Wcześniejsze badania na myszach SOD1-G93A wykazały, że patologia choroby dotyczy głównie rdzenia kręgowego, zwłaszcza okolicy lędźwiowej, niż kory29,48. Dlatego ta technika jest szczególnie istotna w kontekście SOD1-ALS, genetycznej formy ALS spowodowanej mutacjami w genie dismutazy nadtlenkowej 1 (SOD1). Mutacje te powodują nieprawidłowo sfałdowane agregaty białek SOD1, co prowadzi do toksycznego wzrostu funkcji w neuronach ruchowych, prowadząc do postępującego spadku nerwowo-mięśniowego49,50. W tym badaniu zastosowaliśmy ASO ukierunkowane na SOD1, aby wykazać skuteczne zaangażowanie w docelowe mRNA oraz funkcjonalne odzyskiwanie zdrowia. Analiza RT-qPCR wykazała istotne zahamowanie ludzkiego transkryptu SOD1 w rdzeniu kręgowym po podaniu IT, podczas gdy zapisy CMAP wskazywały na odwrócenie dysfunkcji neuronów ruchowych. Ponadto analiza surowicy wykazała spadek poziomu fosforylowanego łańcucha nerwowego (pNFH), biomarkera neurodegeneracji, co wzmacnia skuteczność strategii terapeutycznej.

Znaczenie kliniczne tego modelu podkreśla niedawna zgoda FDA na tofersen (QALSODY),® ASO zaprojektowane do celowania w mRNA SOD1 w leczeniu SOD1-ALS35. Tofersen jest podawany downętrznie osobom żyjącym z SOD1-ALS i wykazuje wyraźną aktywność farmakodynamiczną, w tym obniżenie całkowitego poziomu białka SOD1 w CSF (pośredni marker zaangażowania celu) oraz NfL w osocze (marker uszkodzenia aksonu i neurodegeneracji). W zintegrowanych analizach fazy 3 badania VALOR i jego OLE, wcześniejsze rozpoczęcie leczenia tofersenem wiązało się ze zmniejszeniem spadku miar funkcji klinicznej, siły i jakości życia, a także ze zmniejszeniem ryzyka zdarzeń równoważnych śmierci35. Dane te potwierdzają drogę intrathekalną jako potężną drogę terapii ASO ukierunkowanej na ośrodkowy układ nerwowy i nadają silną wagę translacyjną badaniom przedklinicznym stosującym podobne strategie podawania.

Oprócz zastosowania w ALS, metoda IT wykazała sukces w przypadku zaniku mięśni kręgosłupa (SMA)14,51,52, gdzie podany przez IT ASO Nusinersen (Spinraza®) był pierwszą zatwierdzoną terapią 14,51,52. Zastrzyki IT omijają barierę krew-mózg i umożliwiają szeroko rozległą biodystrybucję OUN53, co jest kluczowe dla chorób charakteryzujących się rozproszoną patologią neuronów. Chociaż powtarzalne dawkowanie stanowi wyzwania logistyczne i tolerancyjne, postępy w formułowaniu i metodach podawania nadal sprawiają, że administracja IT jest bardziej opłacalna dla długoterminowego leczenia.

Administracja IT ma większe znaczenie translacyjne dla ludzkiej praktyki klinicznej niż zastrzyki ICV. Zastrzyki ICV i IT u dorosłych myszy różnią się przede wszystkim celowym miejscem w OUN oraz rozmieszczeniem i efektami podawanej substancji. Zastrzyki ICV dostarczają substancje bezpośrednio do płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) w komorach bocznych mózgu, głównie celując w miejsca nadrdzeniowe. Natomiast zastrzyki z IT dostarczają substancje do płynu mózgowo-rdzeniowego w przestrzeni podpajęczynuszowej kręgosłupa, głównie celując w rdzeń kręgowy. Obie metody omijają barierę krew-mózg i umożliwiają bezpośrednie dostarczanie przez OUN, jednak podanie IT może wydłużyć czas działania54 dla niektórych związków i zazwyczaj skutkuje silniejszą transdukcją w rdzeniu kręgowym, podczas gdy ICV może osiągnąć wysokie lokalne stężenia w obszarach mózgu przylegających do komory bocznej54. Warto jednak zauważyć, że związki podawane do rdzenia mózgowo-rdzeniowego mogą dotrzeć do mózgu, choć tempo transportu jest bardzo wolne1. Różnice te odzwierciedlają się także w ryzyku proceduralnym. Zastrzyki ICV niosą ze sobą wyższe ryzyko skażenia, jeśli sterylność zostanie naruszona, podczas gdy zastrzyki IT, choć nie są bezpieczne, mają mniej podatności związanych z urządzeniami. Po zabiegu zastrzyki z ICV mogą powodować przejściowy dyskomfort lub reakcje związane z kończynami tylnymi, podczas gdy zastrzyki ICV wiążą się z mniejszym natychmiastowym dyskomfortem, choć miejscowe podrażnienie czaszki pozostaje możliwe.

Przyszłe zastosowania tej techniki wykraczają poza obecne badania przedkliniczne. Dostarczanie IT może być wykorzystywane do oceny terapii ukierunkowanej na CNS nowej generacji, w tym narzędzi do edycji genów (np. systemy CRISPR/Cas), modalności interferencji RNA oraz terapii genowych opartych na wektorach wirusowych. Podejście to jest adaptowalne do terapii kombinowanych ukierunkowanych na wiele szlaków OUN, umożliwiając ocenę interakcji farmakodynamicznych w czasie rzeczywistym55,56. Ponadto administracja IT może być integrowana z modalnościami obrazowania, aby śledzić dystrybucję i zaangażowanie celów in vivo, przyspieszając procesy translacyjne. Technika ta stanowi również platformę do badania strategii medycyny precyzyjnej na genetycznie zdefiniowanych mysich modelach chorób neurologicznych, ułatwiając odkrywanie biomarkerów, podłużne oceny funkcjonalne oraz oceny bezpieczeństwa przed klinicznym tłumaczeniem.

Podsumowując, technika bezpośredniego zastrzyku IT-odcinka lędźwiowego z użyciem znieczulenia izofluranowego stanowi minimalnie inwazyjną, szybką i klinicznie przekładalną metodą podawania terapii do mysiego OUN. Jego skuteczne zastosowanie w modelach SOD1-ALS oraz kompatybilność z seryjnym dawkowaniem stanowią solidne podstawy do szerszego wykorzystania w badaniach translacyjnej neurobiologii. W miarę rozwoju tej dziedziny z rosnącym naciskiem na modulację genów OUN, terapie ukierunkowane na RNA oraz medycynę precyzyjną, ścieżka IT pozostanie kluczową strategią dostarczania leków, łącząc modele przedkliniczne z sukcesem klinicznym.

Oświadczenia

SM i S-C L są obecnymi pracownikami Biogen, Inc., natomiast TC, DF, YL, JD i MZ to byli pracownicy firmy. Oligonukleotydy antysensowe omawiane w tym artykule zostały dostarczone autorom przez Ionis Pharmaceuticals. Tofersen (QALSODY) to produkt opracowany wspólnie przez Biogen i Ionis Pharmaceuticals.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować firmie Ionis Pharmaceuticals za dostarczanie ASO opisanych w artykule. Jesteśmy wdzięczni Ryanowi Gamble'owi, Steve'owi Garafalo, Adrii Martig, Isabel Isaza, Tarasowi Tuczkewyczowi oraz Davidowi Koske z Biogen za ich eksperckie wkłady, które znacząco wzbogaciły rękopis poprzez ich merytoryczne poprawki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,3 mL 29 G, 1/2 cala insulinowej strzykawki do zastrzyku z IT,Smiths Medical4429-3
Sterylny żar wiertlarski o średnicy 0,5 mmNarzędzia Nauki Fine-Science (FST) lub odpowiednik1900705
Szew monofilamentowy 5-0 ProleneEthicon 8870H 
Pałeczki alkoholoweDynarex1203
Pałeczki alkoholoweDynarex1203
Środek analgetyczny – buprenorfina o przedłużonym uwalnianiuWymagana recepta
Klipr zwierzęcyWahl08787-450A
Zestaw do transkrypcji odwróconej cDNA o wysokiej pojemności BiosystemsFisher Scientific43-688-14
Homogenizator Bead Ruptor 24Omni International, Inc.19-070
Pobieranie krwi i probówki do separacji surowicyBeckton Dickinson (BD)365967
Chlorek wapnia dihydratJT Baker1335
Cyfrowa pompa strzykawkowaAparat Harvarda70-4507
Zautomatyzowany System Immunotestów EllaR& D Systems600-100
Maść do oczu-puralubaDecra17033-211-38
Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
Germinator 500 Suchy sterylizatorBraintree Scientific lub odpowiednikGER 5287-120V
Strzykawka Hamilton z igłą (26s/2"/2 (typu grotowego)Hamilton8030026s/2"/2:                                                                                              26 s: 26 G;                                                                                                             długość 2";                                                                                                                             2: styl punktowy
Mieszanka homogenizująca twardych tkanek 2,8 mm ceramika (2 mL wzmocnione rurki) (50/pk)Fisher Scientific50-280-9286Dostawca: Revvity Health Sciences Inc
Poduszka grzewczaK& H Manufacturing1060
Platforma ICVStoelting502063
Komora izofluranowa z systemem skavanginguVetEquip901820
Chlorek magnezu heahydratEMD Chemicals1.05832
Nożyce MetzenbaumNarzędzia Nauki Fine-Science (FST) lub odpowiednik14016-14
Identyfikator testu TaqMan na mysz GAPDH Mm99999915_g1ThermoFisher Scientific4331182
Elektrody igły do CMAP, 28 GNatus Medical (marka Teca)#902-DMF25-TP
NutraGel: Pełna dietaBio ServNGB-2
Uchwyt na igły Olsen-HegarNarzędzia Nauki Fine-Science (FST) lub odpowiednik12502-12
Poloxamer 188Mutchler
Chlorek potasuJT Baker3045
Przedwzmacniacz (dla CMAP)Światowe Precyzyjne Przyrządy (WPI)SYS-DAM50
Zestaw pNFH ProteinSimpleR& D SystemsSPCKB-PS-000519
Patyczki do wymazów z providone-jodykiemDynarex1201
QIAzol Lysis Reagent Qiagen79306
System QuantStudio 12K FlexBiosystemy stosowane4471087
ScoopulaFisherbrand01-257-567
Signal v6.04Cambridge Elektroniczne ProjektowanieNumer seryjny 061144CMAP Software 
Komora do odzyskiwania małych zwierzątPrzenośne jednostki intensywnej terapii zwierząt Thermocare Model FW-1FW-1 
Stereotaksowa rama dla małych zwierząt z cyfrową konsolą wyświetlaczaKOPFModel 940 
Myszy SOD1 G93ALaboratorium JacksonaStock # 004435
Chlorek soduEMD Chemicals1.16224
Fosforan sodu bezwodnySigma Aldrich55136
Jednozasadowy dihydrat fosforanu soduSigma Aldrich3819
Sterylny skalpel jednorazowyMed Vet International lub odpowiednikMIL4410
Sterylna tkaninaDynarex4410
Sterylne gazyDynarex lub odpowiednikDRX-3354
Sól fizjologiczna sterylnaThermoFisher Scientific14190094
Sterylne rękawice chirurgiczneAnsell lub odpowiednik20277290
Izolator bodźca (dla CMAP)Światowe Precyzyjne Przyrządy (WPI)SYS-A365D
Stoelting Micro Drill Stoelting58610
Chirurgiczne wygięte kleszcze (Kleszcze Graefe - Tytan)Narzędzia Nauki Fine-Science (FST) lub odpowiednik11652-10
Chirurgiczne szczypce sztywne (Kleszcze Graefe - tytan)Narzędzia Nauki Fine-Science (FST) lub odpowiednik11650-10
Taśma chirurgicznaDynarex lub odpowiednik3572
Strzykawka do podskórnego wstrzyknięcia środka przeciwbólowegoBD309582
TaqMan Szybki Zaawansowany Blender MixThermoFisher Scientific4444556
Woda (Milli-Q)
WagaMettler Toledo                                        Model XSR2002S23-112795
Myszy typu dzikiego typu C57BL/6JLaboratorium JacksonaStock # 000664

Bibliografia

  1. Hylden, J. L., Wilcox, G. L. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).
  2. Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice. J Vis Exp. (144), e58565(2019).
  3. Banks, W. A. Characteristics of compounds that cross the blood-brain barrier. BMC Neurol. 9 Suppl 1 (Suppl 1), S3(2009).
  4. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: bottleneck in brain drug development. NeuroRx. 2 (1), 3-14 (2005).
  5. Ajeeb, R., Clegg, J. R. Intrathecal delivery of macromolecules: clinical status and emerging technologies. Adv Drug Deliv Rev. 199, 114949(2023).
  6. Bennett, C. F., Swayze, E. E. RNA targeting therapeutics: molecular mechanisms of antisense oligonucleotides as a therapeutic platform. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 50, 259-293 (2010).
  7. Corey, D. R. Nusinersen, an antisense oligonucleotide drug for spinal muscular atrophy. Nat Neurosci. 20 (4), 497-499 (2017).
  8. Bey, K., et al. Efficient CNS targeting in adult mice by intrathecal infusion of single-stranded AAV9-GFP for gene therapy of neurological disorders. Gene Ther. 24 (5), 325-332 (2017).
  9. Kennedy, Z., Gilbert, J. W., Godinho, B. Intrathecal delivery of therapeutic oligonucleotides for potent modulation of gene expression in the central nervous system. Methods Mol Biol. 2434, 345-353 (2022).
  10. Stavrou, M., Georgiou, E., Kleopa, K. A. Lumbar intrathecal injection in adult and neonatal mice. Curr Protoc. 4 (6), e1091(2024).
  11. Zou, Z. Y., Liu, C. Y., Che, C. H., Huang, H. P. Toward precision medicine in amyotrophic lateral sclerosis. Ann Transl Med. 4 (2), 27(2016).
  12. Quemener, A. M., et al. The powerful world of antisense oligonucleotides: from bench to bedside. Wiley Interdiscip Rev RNA. 11 (5), e1594(2020).
  13. Rook, M. E., Southwell, A. L. Antisense oligonucleotide therapy: from design to the Huntington disease clinic. BioDrugs. 36 (2), 105-119 (2022).
  14. Neil, E. E., Bisaccia, E. K. Nusinersen: a novel antisense oligonucleotide for the treatment of spinal muscular atrophy. J Pediatr Pharmacol Ther. 24 (3), 194-203 (2019).
  15. Amanat, M., Nemeth, C. L., Fine, A. S., Leung, D. G., Fatemi, A. Antisense oligonucleotide therapy for the nervous system: from bench to bedside with emphasis on pediatric neurology. Pharmaceutics. 14 (11), 2389(2022).
  16. Kingwell, K. Double setback for ASO trials in Huntington disease. Nat Rev Drug Discov. 20 (6), 412-413 (2021).
  17. Mead, R. J., Shan, N., Reiser, H. J., Marshall, F., Shaw, P. J. Amyotrophic lateral sclerosis: a neurodegenerative disorder poised for successful therapeutic translation. Nat Rev Drug Discov. 22 (3), 185-212 (2023).
  18. Gros-Louis, F., Gaspar, C., Rouleau, G. A. Genetics of familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1762 (11-12), 956-972 (2006).
  19. Valentine, J. S., Hart, P. J. Misfolded CuZnSOD and amyotrophic lateral sclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3617-3622 (2003).
  20. Rotunno, M. S., Bosco, D. A. An emerging role for misfolded wild-type SOD1 in sporadic ALS pathogenesis. Front Cell Neurosci. 7, 253(2013).
  21. Winkler, D. D., et al. Structural and biophysical properties of the pathogenic SOD1 variant H46R/H48Q. Biochemistry. 48 (15), 3436-3447 (2009).
  22. Kaur, S. J., McKeown, S. R., Rashid, S. Mutant SOD1 mediated pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Gene. 577 (2), 109-118 (2016).
  23. Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
  24. Bruijn, L. I., et al. Aggregation and motor neuron toxicity of an ALS-linked SOD1 mutant independent from wild-type SOD1. Science. 281 (5384), 1851-1854 (1998).
  25. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu, Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
  26. Peggion, C., et al. SOD1 in ALS: taking stock in pathogenic mechanisms and the role of glial and muscle cells. Antioxidants (Basel). 11 (4), 614(2022).
  27. Beers, D. R., et al. Endogenous regulatory T lymphocytes ameliorate amyotrophic lateral sclerosis in mice and correlate with disease progression in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 134 (Pt 5), 1293-1314 (2011).
  28. Marchetto, M. C., et al. Non-cell-autonomous effect of human SOD1 G37R astrocytes on motor neurons derived from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 3 (6), 649-657 (2008).
  29. Filipi, T., et al. Cortical glia in SOD1(G93A) mice are subtly affected by ALS-like pathology. Sci Rep. 13 (1), 6538(2023).
  30. Turner, B. J., Talbot, K. Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS. Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).
  31. Smith, R. A., et al. Antisense oligonucleotide therapy for neurodegenerative disease. J Clin Invest. 116 (8), 2290-2296 (2006).
  32. Simonini, C., et al. Neurodegenerative and neuroinflammatory changes in SOD1-ALS patients receiving tofersen. Sci Rep. 15 (1), 11034(2025).
  33. Naseri Kouzehgarani, G., et al. Harnessing cerebrospinal fluid circulation for drug delivery to brain tissues. Adv Drug Deliv Rev. 173, 20-59 (2021).
  34. Duan, C., et al. Intrathecal administration of a novel siRNA modality extends survival and improves motor function in the SOD1(G93A) ALS mouse model. Mol Ther Nucleic Acids. 35 (1), 102147(2024).
  35. Miller, T. M., et al. Trial of antisense oligonucleotide tofersen for SOD1 ALS. N Engl J Med. 387 (12), 1099-1110 (2022).
  36. McCampbell, A., et al. Antisense oligonucleotides extend survival and reverse decrement in muscle response in ALS models. J Clin Invest. 128 (8), 3558-3567 (2018).
  37. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. (75), e50326(2013).
  38. Bhusal, A., Suk, K. Protocol for delivering proteins, peptides, and shRNAs via the intrathecal route in the experimental allergic encephalomyelitis mouse model. STAR Protoc. 5 (3), 103219(2024).
  39. Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. Epidural and intrathecal drug delivery in rats and mice for experimental research: fundamental concepts, techniques, precaution, and application. Biomedicines. 11 (5), 1413(2023).
  40. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  41. Simon, M. J., Iliff, J. J. Regulation of cerebrospinal fluid (CSF) flow in neurodegenerative, neurovascular and neuroinflammatory disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 442-451 (2016).
  42. Law, V., et al. A murine Ommaya xenograft model to study direct-targeted therapy of leptomeningeal disease. J Vis Exp. (167), e62033(2021).
  43. Christensen, J., Li, C., Mychasiuk, R. Choroid plexus function in neurological homeostasis and disorders: the awakening of the circadian clocks and orexins. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (7), 1163-1175 (2022).
  44. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  45. Shi, L., et al. Repeated intrathecal administration of plasmid DNA complexed with polyethylene glycol-grafted polyethylenimine led to prolonged transgene expression in the spinal cord. Gene Ther. 10 (14), 1179-1188 (2003).
  46. Linninger, A. A., Barua, D., Hang, Y., Iadevaia, S., Vakilynejad, M. A mechanistic pharmacokinetic model for intrathecal administration of antisense oligonucleotides. Front Physiol. 14, 1130925(2023).
  47. Chen, Y., et al. Intrathecal delivery of antisense oligonucleotides in the rat central nervous system. J Vis Exp. 152, e60274(2019).
  48. Molnar-Kasza, A., et al. Evaluation of neuropathological features in the SOD1-G93A low copy number transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Front Mol Neurosci. 14, 681868(2021).
  49. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  50. Une, M., et al. SOD1-interacting proteins: roles of aggregation cores and protein degradation systems. Neurosci Res. 170, 295-305 (2021).
  51. Gidaro, T., Servais, L. Nusinersen treatment of spinal muscular atrophy: current knowledge and existing gaps. Dev Med Child Neurol. 61 (1), 19-24 (2019).
  52. Hoy, S. M. Nusinersen: first global approval. Drugs. 77 (4), 473-479 (2017).
  53. Metz, T., et al. Biodistribution of radioactively labeled splice-modulating antisense oligonucleotides after intracerebroventricular and intrathecal injection in mice. Nucleic Acid Ther. 34 (1), 26-34 (2024).
  54. Adank, D. N., et al. Comparative intracerebroventricular and intrathecal administration of a nanomolar macrocyclic melanocortin receptor agonist MDE6-5-2c (c[Pro-His-DPhe-Arg-Trp-Dap-Ala-DPro]) decreases food intake in mice. ACS Chem Neurosci. 11 (19), 3051-3063 (2020).
  55. Sharma, A., et al. Multiple doses of cell therapy and neurorehabilitation in amyotrophic lateral sclerosis: a case report. Clin Pract. 10 (3), 1242(2020).
  56. Modol-Caballero, G., et al. Gene therapy overexpressing neuregulin 1 type I in combination with neuregulin 1 type III promotes functional improvement in the SOD1(G93A) ALS mice. Front Neurol. 12, 693309(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oligonukleotydy antysensowne SOD1model myszy z ALSpodawanie do p ynu m zgowo rdzeniowegowstrzykni cie do rdzenia kr gowegowstrzykni cie doprzewodoweocena elektrofizjologicznabiomarker neurofilamentuilo ciowa PCR
Intrathekalne wstrzykiwanie SOD1-ASO do lędźwia w celu precyzyjnego celowania i predykcyjnej skuteczności ośrodkowej układu nerwowego (CNS) u ludzkich myszy SOD1-G93A ALS
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.