Modulacja ligandu cholinergiczna sprzężenia fosforylacji oksydacyjnej w komórkach neuroblastooma BE(2)-C z cyfrytoninami

Summary

Przedstawiamy protokół selektywnego przepuszczania błony plazmatycznej, umożliwiając ukierunkowane dostarczanie substratów i inhibitorów do oceny mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w hodowanych komórkach, pokonując bariery transportowe błony plazmatycznej, które zazwyczaj utrudniają takie analizy. Stosując tę technikę, wykazaliśmy, jak funkcja OXPHOS jest modulowana przez agonistów muskarynowych i antagonistów.

Abstract

Celem tego badania było ocenenie funkcji fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS) w komórkach hodowanych przy użyciu określonych kombinacji substrat–inhibitor, przy jednoczesnym zachowaniu struktury komórkowej i kontekstu cytosolowego utraconego w izolowanych przygotowaniach mitochondrialnych. Ponieważ nienaruszone komórki są słabo przepuszczalne dla kilku pośrednich cyklów Krebsa, bezpośrednia ocena oddychania wspieranego przez podłoże przez specyficzne punkty wejścia łańcucha transportu elektronów (ETC) jest ograniczona. Aby temu zaradzić, zastosowaliśmy selektywną permeabilizację błony plazmatycznej za pośrednictwem digitoniny oraz przeprowadziliśmy sprzężenie i przepływ elektronów na podstawie analizatora strumienia zewnętrznego w komórkach neuroblastoma BE(2)-C. Aby określić zależność od typu komórki, digitoninę empirycznie zmierzono w komórkach HEK293 oraz w neuronach podstawowych szczurów grzbietowych korzeni (DRG), wykorzystując sukcynianu + rotenon do izolacji oddychania wywołanego kompleksem II–IV.

Oddychanie wspierane suktynacjami z inhibicją kompleksu I wykazało zwiększone zużycie tlenu napędzanego kompleksem II–IV (O₂) w komórkach przepustnych w porównaniu z komórkami nieprzepuszczalnymi, co odpowiadało lepszemu dostępowi substratu nieprzepuszczalnego do mitochondriów. Natomiast oddychanie wspierane przez substraty wchodzące przez endogenne szlaki transportowe (np. pirosurowat/malat) wykazało mniejsze różnice między warunkami. Korzystając z tej platformy do testowania ligandów muskarynicznych, zaobserwowaliśmy różnice w zużyciu O₂ powiązanych z agonistami w teście sprzężenia, podczas gdy test przepływu elektronów wykazał minimalne efekty związane z ligandami w testowanych warunkach. Wyniki te wskazują, że wykrywalne efekty ligandów były bardziej widoczne na poziomie stanów oddechowych zdefiniowanych przez sprzężenie niż maksymalna zdolność transferu elektronów. Ogólnie rzecz biorąc, selektywna permeabilizacja zwiększa dostępność substratów w bioenergetycznych testach komórek hodowlanych i umożliwia analizę farmakologicznej modulacji oddychania mitochondrialnego.

Introduction

Nieprawidłowości lub przeprogramowanie metabolizmu energii mitochondrialnej są kluczowe dla szerokiego spektrum zaburzeń, w tym neurodegeneracji, nowotworów, chorób zapalnych, schorzeń kardiometabolicznych oraz różnych zaburzeń genetycznych. Aby lepiej zrozumieć rolę metabolizmu mitochondrialnego w patogenezie chorób, opracowano kilka strategii analitycznych. Obejmują one pomiary tempa zużycia_O2 (OCR), tempa zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR), ilościowości ATP, wykorzystania substratów, profilowanie lub analizę metabolitów cyklu Krebsa oraz śledzenie izotopów¹. Wśród tych technik OCR pełni rolę kluczowego wskaźnika oddychania mitochondrialnego i można go oceniać za pomocą instrumentów takich jak wysokorozdzielcza respirometria (HRR; np. Oroboros O₂k)², elektroda typu Clark czy analizator strumienia zewnętrznego

System Oroboros O₂k mierzy stężenie_O2 w szczelnej komorze za pomocą polarograficznego czujnika Clark O₂ (POS)^3,4,5 i jest odpowiedni dla próbek takich jak izolowane mitochondria, komórki przepuszczalne oraz homogenity tkankowe. Składa się z katody ze złota/platyny, anody srebrnej oraz zbiornika elektrolitowego KCl, oddzielonych od próbki_{przepuszczalną} i chemicznie odporną na fluorację etylen-propylenową o pojemności 25 μm, odporną chemicznie membraną z fluorowanego etylenpropylenu (FEP). Elektroda typu Clark³ pracuje również w zamkniętej komorze, wykrywając zmiany stężenia_O2 za pomocą elektrody czułej na_O2, i jest powszechnie stosowana do izolowanych mitochondriów lub zawiesin komórkowych. Dla porównania, analizator strumienia zewnątrzkomórkowego ilościowo ilościowo określa OCR i ECAR w żywych komórkach przylegających lub izolowanych mitochondriach za pomocą czujników fluorescencjowych wbudowanych w mikropłytki, co umożliwia wysokoprzepustowe profilowanie metaboliczne. Praktyczną zaletą platformy analizatora strumienia zewnętrznego jest zautomatyzowana, wieloparametryczna ocena równolegle dla wielu warunków, podczas gdy systemy zamkniętokomorowe (np. elektrody typu HRR lub Clark) zazwyczaj zapewniają niższą przepustowość i wymagają większej obsługi ręcznej.

Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego jest szczególnie przydatny do oceny funkcji mitochondriów w nienaruszonych komórek przylegających lub komórkach zawiesin, które osadzają się na dole mikropłytki. W testach z wykorzystaniem nienaruszonych komórek adherentnych metamorfozę mitochondrialną można profilować za pomocą substratów takich jak glukoza lub pirokrowinian⁶. Alternatywnie, testy wykorzystujące niewielkie ilości wzbogaconych frakcji mitochondrialnych pozwalają na sekwencyjne pomiary oddechu bazalnego, oddychania stymulowanego ADP (stan 3), oddechu spoczynkowego (stan 4) oraz oddychania stymulowanego przez niespojliwe z wykorzystaniem kombinacji substratów i inhibitorów⁷. Jednak w nienaruszonych układach komórkowych metabolity cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA), które nie są przepuszczalne dla komórek, nie mogą być użyte do bezpośredniej oceny ich metabolizmu. Natomiast izolowane mitochondria pozwalają na wykorzystanie takich metabolitów ze względu na brak barier z błony plazmatycznej. Analiza izolowanego wzbogaconego podejścia mitochondrialnego ma ograniczenia: struktura mitochondriów może ulegać zmianom podczas izolacji, a czynniki cytosolowe wpływające na metabolizm mitochondrialny i transport metabolitów są ograniczone lub nieobecne. W związku z tym selektywne metody permeabilizacji są często stosowane jako kompromis, który pozwala zachować elementy architektury komórkowej, jednocześnie umożliwiając kontrolowany dostęp do mitochondriów. Aby przezwyciężyć ograniczenia związane z wykorzystaniem nienaruszonych komórek lub izolowanych mitochondriów do testów metabolicznych, protokół ten opisuje metodę permeabilizacji komórek adherentnego neuroblastoma (BE(2)-C) za pomocą digitoniny. Takie podejście ułatwia import metabolitów, które nie były przenikliwe do komórek, przez błonę plazmatyczną, jednocześnie utrzymując funkcjonalne odpowiedzi mitochondrialne na określone substraty i inhibitory.

Selektywność digitoniny opiera się na różnicach w składzie lipidów błonowych: błona plazmatyczna jest bogata w cholesterol, podczas gdy błony mitochondrialne — szczególnie błona mitochondrialna wewnętrzna — zawierają bardzo mało cholesterolu^. W niskich stężeniach digitonina (lub saponina) selektywnie i całkowicie przepuszcza błonę plazmatową ze względu na wysoką zawartość cholesterolu, podczas gdy błony mitochondrialne są dotknięte tylko przy wyższych stężeniach ^9,10. Cyfrytonina wiąże się z cholesterolem i tworzy pory w błonie plazmatycznej, umożliwiając małym cząsteczkom, takim jak pośrednie składniki cyklu TCA, dostanie się do cytosolu bez zakłócania struktury lub funkcji mitochondriów, jeśli jest odpowiednio optymalizowana. To podejście najlepiej sprawdza się w komórkach hodowanych, które można powtórnie pokrywać jako przylegające monowarstwy w mikropłytce analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego i wymaga empirycznej miareczki stężenia digitoniny dla każdego typu komórki i gęstości zasiew. Wskaźniki operacyjne zachowanej integralności mitochondrialnej obejmują silne, na inhibitory wrażliwe odpowiedzi OCR (np. oczekiwane spadki przy rotenonie/antymycynie A oraz nienaruszone oddychanie sterowane kompleksem IV przy ascorbate/TMPD), a także brak zapadania się OCR, które sygnalizowałoby nadprzepuszczalność. Dlatego optymalizacja digitoniny powinna być przeprowadzona przed porównaniami eksperymentalnymi i powtarzana za każdym razem, gdy zmieniają się warunki hodowli lub gęstość komórek. Ponadto optymalne stężenie digitoniny różni się w zależności od typu komórki i musi być empirycznie określone, aby ustanowić okno permeabilizacji umożliwiające wejście substratów nieprzepustnych (np. sukcynanu), przy jednoczesnym zachowaniu funkcji mitochondriów wrażliwych na inhibitory. W niniejszym badaniu ilustrujemy tę zasadę, optymalizując digitoninę nie tylko w komórkach BE(2)-C, ale także w komórkach HEK293 oraz pierwotnych neuronach grzbietowych korzenia szczura (DRG).

Protokół ten został zademonstrowany przy użyciu komórek neuroblastoma BE(2)-C, które pierwotnie zostały wyizolowane z mózgu męskiego pacjenta z neuroblastomą. Komórki BE(2)-C wyrażają różne receptory muscarinowe, szczególnie receptor cholinergiczny muskarynowy typu 1 (CHRM1). W naszych wcześniejszych badaniach wykazaliśmy, że CHRM1 jest związany z mitochondriami zarówno w ciałach komórkowych, jak i neuritach hodowanych neuronów zwojowych grzbietowych szczurów, a także^{w komórkach} HEK293 transfekowanych przez CHRM1. Ponadto genetyczne usuwanie Chrm1 u myszy zmienia wiele aspektów struktury i funkcji mitochondriów^12,13. Dlatego zakładamy, że komórki BE(2)-C mogą być wykorzystane do badania modulacyjnych wpływów ligandów muskarynowych na funkcjonowanie OXPHOS. W tej demonstracji badaliśmy wpływ środków muskarynowych — w tym agonistycznej acetylocholiny, stronniczego antagonisty pirenzepiny¹⁴ oraz antagonisty atropiny — na oddychanie mitochondrialne w obecności sukcynianu lub pirosiernianu/malata jako substratów oraz porównaliśmy ich wpływ.

Protocol

1. Rozmrażanie i początkowe pokrycie

UWAGA: Podstawowym medium dla komórek BE(2)-C jest mieszanina 1:1 Minimalnego Essential Medium Eagle opracowanego przez ATCC oraz Medium F12, uzupełniona 10% surowicą bydła płodu (FBS).

1. Rozmroz zamrożone komórki BE(2)-C z kriovialu w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C. Po rozmrożeniu wiruj ogniwa 200 × g przez 5 minut, aby usunąć krioprotektant.
2. Ponownie zawiesić pellet komórkowy w pełnym ośrodku wzrostu i umieścić komórki w naczyniu do hodowli komórek o średnicy 10 cm. Inkubuj hodowlę w temperaturze 37 °C w nawilżonym inkubatorze z 5% CO₂ w powietrzu, aż komórki osiągną subkonfluencję.

2. Subkulturowanie

1. Podhoduj komórki przez 2–3 przejścia, aby zapewnić im stabilną, wykładniczą fazę wzrostu.

3. Trypsynizacja i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej

1. Gdy hodowla osiągnie 60–80% konfluentności, trypsynizuj komórki. Przepuszczenie zawiesiny komórki kilkakrotnie przez pipety transferowe z drobnymi końcówkami i polerowanymi końcówkami, aby rozdzielić grudki i uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
2. Dodaj świeże medium zawierające FBS, aby zneutralizować trypsynę. Wiruj ogniwa w 200 × g przez 5 minut, aby je rozpuścić.

4. Protokół siewu komórek dla mikropłyt hodowli komórek 24-dołkowych stosowanych w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego

1. Ponownie zawiesij granulek w pełnym medium przy końcowym stężeniu 10 000 komórek na 100 μL na dołek.
2. Nasiaj komórki z zoptymalizowaną gęstością, aby zapewnić ich pełne złączenie w ciągu 1–2 dni. Zostaw albo cztery narożne studnie, albo jedną narożną studnię pustą, w zależności od eksperymentalnego projektu. Te studnie będą służyć jako kontrolne tło.
   UWAGA: Może to wymagać prób i błędów, w tym regulacji głośności mediów i tempa.
3. Monitoruj hodowlę pod kątem zmian koloru podłoża — żółknięcie wskazuje na spadek pH i wymaga natychmiastowej wymiany świeżym podłożem, aby utrzymać zdrowie komórek.

5. Przygotowanie do testu opartego na analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego

UWAGA: Formaty testów sprzężenia i przepływu elektronów użyte tutaj zgodnie z ustalonymi mikropłytkami opartymi na procesach oddychania mitochondrialnego⁷, z modyfikacjami takimi jak permeabilizacja komórek BE(2)-C przy użyciu titracji digitoniny oraz warunków leczenia ligandami muskariny.

1. Przygotuj roztwory stockowe oraz 2x roztwór do testów mitochondrialnych (MAS). Przygotuj 2x mieszanki MAS oraz roztwory zapasowe (substraty i inhibitory) (patrz Tabela 1, Tabela 2 i Tabela 3).
2. Przechowuj wszystkie roztwory i MAS w temperaturze -20 °C na przyszłość, co pozwala na efektywne przygotowanie testu.
   BEZPIECZEŃSTWO: Rotenon, antymycyna A, oligomycyna, FCCP, digitonina i TMPD są niebezpieczne i należy je traktować zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego. Wszystkie roztwory inhibitorów powinny być przygotowywane i stosowane w certyfikowanym chemicznym okapie do parów, przy użyciu odpowiedniego sprzętu ochronnego (fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i ochrona oczu). Roztwory zawierające te odczynniki, a także odpady zawierające DMSO, powinny być zbierane i utylizowane jako niebezpieczne odpady chemiczne zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi. Powierzchnie robocze powinny być odczyszczone po użyciu.
3. Nawilżanie wkładu sensorowego
   1. Noc przed eksperymentem nawilż wkład sensora analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego, dodając 1 ml buforu kalibracyjnego lub soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS, pH 7,4) do każdego otworu. Pozostawić wkład sensora na noc (12–18 h) w temperaturze pokojowej (20–25 °C).
      UWAGA: Inkubacja w inkubatorze niezawierającym CO₂ w temperaturze 37 °C nie jest konieczna, ponieważ wkład wyrównuje się do temperatury pokojowej podczas procesu ładowania. Po umieszczeniu w analizatorze strumienia zewnątrzkomórkowego w celu kalibracji, wkład osiągnie temperaturę 37 °C w ciągu około 15 minut.

6. Dzień eksperymentu

UWAGA: Przygotuj wszystkie roztwory na świeżo, dostosuj pH w razie potrzeby i trzymaj na lodzie aż do użycia.

1. Rozmrozić zamrożone podłoże i 2x MAS w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 15–30 minut lub w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 5–10 minut.
2. Przygotuj wszystkie podłoża i roztwory do wstrzykiwania (patrz Tabela 4, Tabela 5, Tabela 6 i Tabela 7) oraz sprawdź, że pH wynosi 7,4. Dostosuj w razie potrzeby i trzymaj roztwory na lodzie do czasu użycia. Do testu skojarzenia użyj Tabeli 4 i Tabeli 5 . Do testu przepływu elektronów użyj Tabeli 6 i Tabeli 7.
3. Załaduj inhibitory i substraty do odpowiednich portów na wkłady sensorowe i przygotuj się do przeprowadzenia testu. W zależności od rodzaju testu — testu sprzężenia lub testu przepływu elektronów ⁷ — można odnieść się do Tabeli 4 i Tabeli 5 lub Tabeli 6 i 7, odpowiednio.
4. Przygotuj wszystkie roztwory robocze podłoża i inhibitora do określonych objętości końcowych (mieszanki objęte: 15 mL; mieszanki do wtrysku wkładów: 2 mL na port). Oblicz stężenia, aby osiągnąć pożądane końcowe stężenia w otworze po wtrysku (objętość studni końcowa: 700 μL po porcie D).
5. Dodaj 450 μL przygotowanego roztworu testowego do każdego dołku 24-dołkowej płyty analizatora strumienia zewnętrznego zawierającego ligandy muscarinowe (końcowe stężenie ligandów: 1 μM; całkowita objętość studni: 500 μL). Upewnij się, że każda studnia zawiera już 50 μL buforu MAS i zanurzonych komórek.
   UWAGA: Wykonaj ten krok bezpośrednio przed załadowaniem płyty do analizatora.
6. Załaduj 50 μL każdego przygotowanego odczynnika do odpowiedniego portu wtryskowego wkładu sensora.

7. Programowanie instrumentów i wykonywanie testów

1. Włącz analizator strumienia zewnątrzkomórkowego co najmniej 1–2 godziny przed eksperymentem, aby inkubator wewnętrzny ustabilizował się na 37 °C. Utrzymuj komorę na 37 °C przez cały czas kalibracji i testu.
2. Zaprogramuj analizator tak, aby wykonywał odpowiednie cykle mieszania, oczekiwania i pomiaru zgodnie z Tabelą 8.
3. Oznaczaj studnie i grupy eksperymentalne w oprogramowaniu zgodnie z projektem eksperymentalnym.
4. Rozpocznij przebieg testu. Pozwól instrumentowi skalibrować wkład sensora (~15 min).
5. Przygotuj płytkę testową do ładowania podczas kalibracji wkładu. Opóźnić ładowanie, jeśli to konieczne; wkład czujnika pozostanie stabilny w temperaturze 37 °C wewnątrz instrumentu.
6. Zakończ badanie po zakończeniu ostatniego cyklu pomiarowego po wstrzyknięciu do portu D. Natychmiast przejdź do normalizacji po analizie i analizie danych.

8. Przygotowanie płytek komórkowych do analizatora strumienia zewnętrznego

1. Rozpocznij przygotowanie płytki komórkowej natychmiast po umieszczeniu wkładu czujnika do analizatora w celu kalibracji. Do każdej dołki zawierającej komórki adherentne dodaj 700 μL buforu 1x MAS. Inkubuj w temperaturze pokojowej (20–25 °C) przez 1 minutę.
2. Ostrożnie zasysaj bufor, nie naruszając przyłączonych komórek. Powtarzaj proces mycia przez co najmniej 3 x 1 minutę, aby usunąć pozostałe medium hodowlane i zakończ wszystkie płukania w ciągu 10 minut.
3. Dodaj 50 μL bufora MAS 1x do wyznaczonej studni tła (bez komórek), aby ustanowić wizualną referencję objętościową.
4. Aspiruj bufor z odwiertów eksperymentalnych, pozostawiając około 50 μL buforu resztkowego w każdym odwiercie.
5. Inkubuj płytkę w 37 °C w kąpieli wodnej, utrzymując ją nad powierzchnią wody, aby zapobiec parowaniu. Utrzymuj temperaturę 37 °C przez 10 minut (maksymalnie 20 minut) przed załadunkiem.
6. Bezpośrednio przed załadowaniem płyty należy dodać 450 μL buforu 1x MAS zawierającego odpowiednie podłoża do każdego otworu, aby uzyskać końcową objętość 500 μL.
7. Włóż płytkę do analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego.

9. Koniec analizy analizy i testowania danych

1. Po zakończeniu pracy wyjmij płytkę komórkową i wkład czujnika z analizatora.
2. Normalizuj wartości OCR na odwiert, używając ilościowej ilościowej ilościowości białka lub całkowitej liczby komórek. Komórki lizy z buforem RIPA i ilościowo określają całkowite białko za pomocą testu Bradforda lub innego spektrofotometrycznego testu białkowego.
3. Normalizuj wartości OCR za pomocą oprogramowania analitycznego i eksportuj dane w razie potrzeby.
4. Stosuj następujące kryteria akceptacji: potwierdzenie stabilności OCR na poziomie wyjściowym (dryf ≤15% w dwóch kolejnych cyklach pomiarowych) oraz potwierdzenie redukcji OCR o ≥60% po zastrzyku z rotenonu, oligomycyny lub antymycyny A.
5. Wyklucz przebiegi, które nie spełniają tych kryteriów, i w razie potrzeby ponownie optymalizuj stężenie przepuszczalnika lub gęstość zasiewów komórek.

10. Eksport wyników

1. Włóż pendrive do instrumentu.
2. Wyeksportuj dane z testu.

11. Przetwarzanie danych

1. Analizuj dane za pomocą oprogramowania instrumentów.
2. Eksportuj przetworzone dane w formatach zgodnych z wybranym oprogramowaniem analitycznym do dalszej analizy i wizualizacji.

Results

Optymalizacja stężenia digitoniny dla permeabilizacji komórek BE(2) C w teście sprzężenia
Na początku tego protokołu ustandaryzowaliśmy optymalne stężenie cyfrytoniny wymagane do skutecznej permeabilizacji komórek bez naruszania oddychania mitochondrialnego. W tym protokole badaliśmy stężenia początkowe 5 μM i 10 μM digitoniny oraz przeprowadziliśmy test sprzężenia. Test ten ocenia stopień sprzężenia między ETC a mechanizmem OXPHOS, pozwalając rozróżnić oddychanie napędzane przez ETC- i OXPHOS. Rote...

Discussion

Niniejsze badanie wprowadza szybki i efektywny kosztowo protokół oceny modulacji OXPHOS za pośrednictwem ligandów muskarynowych w hodowlowanych komórkach neuroblastoma. Dzięki zastosowaniu selektywnej przepuszczalności membrany plazmatycznej digitoniny w połączeniu z określonymi parami substrat-inhibitor umożliwiliśmy ukierunkowane dostarczanie substratów metabolicznych, takich jak sukcynian, bezpośrednio do mitochondriów in situ. To podejście przezwycięża ograniczenia nienaruszonych błon komórkowych, które zazw...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorek acetylocholiny	MilliporeSigma	A6625	Agonista muskarinowy
ADP	MP Biomedicals, Inc	ICN19014901	Akceptor elektronów, podłoże do syntezy ATP.
Antymycyna A	AAJ63522MA	Thermo Scientific	Hamuje kompleks mitochondrialny III
Atropina	MilliporeSigma	1044990	Muskaryński antagonista
Komórki Be2C	Kolekcja Amerykańskiej Kultury Typowej	CRL-2268	Komórka neuroblastu wyizolowana z mózgu męskiego pacjenta z neuroblastomią, wyraża receptor mięśniowy
Digitonin	MilliporeSigma	D141	Łagodny detergent, przepuszczalnik błony.
D-Mannitol	Chemikalia termonaukowe	AA3334236	Niemetabolizowalny alkohol cukrowy, stosowany do stabilizacji osmotycznej i ochrony błony
EGTA	MilliporeSigma	E0396	Chelacja wapnia zapobiega aktywacji proteaz zależnych od wapnia oraz innych enzymów, które mogłyby degradować białka mitochondrialne.
BSA bez kwasów tłuszczowych	MilliporeSigma	126575	Zapobiega niekontrolowanemu działaniu kwasów tłuszczowych, stabilizuje mitochondria
FCCP	Cayman Chemical	NC0904863	Protonofor i rozwiązujący utleniającą fosforylację w mitochondriach
HEPES	MilliporeSigma	391340	Buforowanie pH, zgodność z funkcją mitochondriów
L-Ascorbate	TCI America	A053925G	Podłoże cyklu TCA pośredniego, podłoże OXPHOS
Chlorek magnezu	MilliporeSigma	M8266	Dla równowagi jonowej wsparcie aktywności enzymatycznej
N1,N1,N1,N1-tetrametylo-1,4-fenylendiamina (TMPD)			Donor elektronów do cytochromu c, ocena funkcji zespolonej IV poprzez pominięcie kompleksów I i II, TMPD/askorbat umożliwia bezpośredni pomiar zużycia tlenu zależnego od kompleksu IV
Oligomicyna	MilliporeSigma	1404-19-9	Hamuje syntezę ATP mitochondrialnego, kompleks V
Pirenzepinowy dichlorek	MilliporeSigma	P7412	Agonista muskaryniczny o tendencji
Kwas piruwinowy	Chemikalia termonaukowe	AC132155000	Podłoże cyklu TCA
Rotenone	MilliporeSigma	557368	Hamuje kompleks mitochondrialny I
Seahorse XF24 V7 Mikropłyty do kultury komórek PS	Agilent	102340-100	Mikropłyty hodowli komórkowych
Analizator Seahorse XFe24	Agilent	S7801BR	Analizatory Agilent Seahorse XFe24 mierzą tempo zużycia tlenu (OCR) oraz szybkość zakwaszenia zewnątrzkomórkowego (ECAR) komórek żywych w formacie płytki 24-dołkowej.
Kwas succynowy	Fisher Chemical	AC158742500	Podłoże cyklu TCA pośredniego, podłoże OXPHOS
Bufor kalibracyjny kartridży sensora XFe24	Agilent	102340100	pH buforowe PBS 7,2
Wkłady sensorowe XFe24	Agilent	102340-100	czujnik do pomiarów OCR i ECAR