Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Streszczenie

Dostępność chromatyny odgrywa istotne role w transkrypcji, naprawie DNA i segregacji chromosomów. Hiperdostępne regiony zwykle korelują z aktywnymi promotorami i wzmacniaczami, ułatwiając wiązanie czynników transkrypcyjnych i aktywność regulacyjną. Test dostępności chromatyny za pomocą sekwencjonowania opartej na transpozytacji (ATAC-seq) umożliwia profilowaniu dostępności chromatyny w całym genomie przy użyciu bardzo niewielu komórek. Jednak jego zastosowanie w Caenorhabditis elegans jest ograniczone przez bogatą w kolagen kutikulę nicieni, która komplikuje dysocjację komórek. Przedstawiamy tutaj zoptymalizowany protokół wykonywania ATAC-seq w całych robakach na etapie L4. Procedura rozpoczyna się od synchronizowanych kultur i obejmuje zniszczenie kutikuły, dysocjację enzymatyczną i przygotowanie zawiesiny komórek. Permeabilizowane jądra są następnie poddawane transpozycji Tn5, a następnie amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i czyszczeniu bibliotek gotowych do sekwencjonowania nowej generacji (NGS). Ten protokół wymaga 30 μL osiadłych robaków, można go wykonać w jeden dzień i generuje 5 000–9 000 szczytów dostępności w odniesieniu do szczepu referencyjnego Bristol N2. Ten usprawnionony proces można dostosować do innych etapów rozwojowych lub populacji komórek wyodrębnionych FACS. Poprzez zmniejszenie barier technicznych w ATAC-seq w C. elegans, ta metoda rozszerza możliwości badania dostępności chromatyny w całym genomie w odpowiedzi na czynniki genetyczne i środowiskowe w kontekście całego organizmu.

Wprowadzenie

Genomy eukariotyczne są gęsto upakowane wewnątrz jądra komórkowego. Aby nadążyć za ograniczeniami przestrzennymi, DNA jest ciasno owinięte wokół nukleosomów, kompleksów wieloproteinowych złożonych z ośmiu histonów, które są silnie zachowane w różnych gromadach¹. Wzorce dostępności chromatyny różnią się w zależności od stanu komórkowego w tkankach i wzorców specyficznych dla genów^2,3,4. Dostępność nukleosomów silnie koreluje z aktywną transkrypcją, szczególnie na promotorach i odległych regionach regulacyjnych, takich jak wzmacniacze, które są dostępne dla czynników transkrypcyjnych⁵. Otwarte regiony chromatyny odgrywają również ważne role w naprawie DNA, replikacji i segregacji chromosomów³. Natomiast, zmniejszona dostępność zazwyczaj koreluje z ciszącym heterochromatyną i powtarzającymi się sekwencjami^6,7.

Mapowanie dostępności chromatyny było potężnym podejściem do zrozumienia regulacji genów. Różne techniki były stosowane do badania dostępności chromatyny. Wśród najwcześniejszych metod mikrokocytarna nukleaza (MNase) i trawienie DNAzą I były używane do mapowania pozycjonowania i dostępności nukleosomów w określonych loci^8,9. Te techniki zostały później zaimplementowane w badaniach na poziomie genomowym po połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji (NGS)^10,11. Jednakże, te techniki wymagają starannej kalibracji stężenia enzymu i czasu reakcji, wraz z znaczną liczbą komórek, dla udanej implementacji.

W 2013 roku laboratorium Greenleaf stworzyło test na dostępność chromatyny przez transpozytazę z użyciem sekwencjonowania (ATAC-seq) aby bezproblemowo mapować dostępność chromatyny na poziomie genomowym przy użyciu niewielkiej liczby komórek¹². ATAC-seq wykorzystuje komercyjnie dostępną transpozytazę Tn5 do preferencyjnego wstawiania krótkich sekwencji DNA (czyli kodów kreskowych) do otwartych regionów chromatyny, zazwyczaj pozbawionych nukleosomów, i koreluje z aktywnymi promotorami i wzmacniaczami. Protokół wymaga permeabilizacji komórek i izolację jąder, po czym następuje ograniczone trawienie Tn5 dla tagmentacji hiperdostępnej chromatyny. Później, uzupełniające indeksy są włączane podczas PCR, ułatwiając wielokrotne sekwencjonowanie próbek przed NGS¹³. ATAC-seq okazało się być solidnym protokołem, który również umożliwia in silico analizę śladów czynników transkrypcyjnych i został zaimplementowany na poziomie pojedynczych komórek^14,15,16,17. Oprócz próbek od myszy i ludzi, ATAC-seq został zaimplementowany w różnych systemach, w tym w rybkach i bezkręgowcach, takich jak Drosophila i nicienie Caenorhabditis elegans^18,19,20.

Przez dekady, C. elegans był potężnym systemem modelowym w dziedzinach takich jak rozwój, biologia komórki i neuronauki, prowadząc do fundamentalnych odkryć, w tym identyfikacji mikro RNA i interferencji RNA (RNAi)^21,22. Ma kompaktowy 100 MB genom z około 20 000 genami kodującymi białka²³. Regulacja genów odbywa się poprzez aktywność promotorów, jak również dystalnych wzmacniaczy, które zostały skutecznie przemapowane przez ATAC-seq w różnych tkankach, stadiach rozwojowych i punktach czasowych starzenia się^24,18. Profilowanie dostępności chromatyny stało się zatem cennym narzędziem do zrozumienia regulacji genów w C. elegans. W związku z tym, ATAC-seq ma szczególne znaczenie dla badań nad krajobrazami epigenetycznymi w różnych warunkach środowiskowych lub dzikich izolatach, aby odkryć różnorodne reakcje transkrypcyjne. Ponadto, mógłby dostarczyć wglądu w architekturę chromatyny innych patogennych i niepatogennych nicieni.

Jednym z głównych wyzwań metodologicznych w C. elegans jest obecność bogatej w kolagen kutikuły, która musi zostać rozdzielona, aby uzyskać jednorodną zawiesinę komórek z całych robaków²⁵. Aby sprostać temu wyzwaniu, skompilowałyśmy i zoptymalizowały różne protokoły, aby rozdzielić nicienie, a następnie wykonać ATAC-seq w C. elegans^18,26. Preferowane jest używanie stadium larwalnego L4, ponieważ zwierzęta na tym etapie rozwoju mają transkrypcjonalnie aktywny zarodek, co przekłada się na otwartą chromatynę, zapewniając spójne i informacyjne źródło dostępności chromatyny w komórkach somatycznych. Przedstawiamy tutaj szybki i wydajny protokół do rozdzielania robaków i generowania zawiesiny komórkowej, umożliwiający ATAC-seq w C. elegans. Nas

Protokół

Zaleca się noszenie rękawiczek przez cały czas.

UWAGA: Dzień 1: Przygotowanie zsynchronizowanej populacji dżdżyczek. Wszystkie robaki były hodowane na płytkach NGM zasiedlonych E. coli OP50. Rzeczy potrzebne przed rozpoczęciem: (na próbkę lub szczep), Jedna płytka dorosłych robaków 90 mm lub dwie płytki 60 mm, Jedna płytka 90 mm lub dwie płytki 60 mm z pokarmem, sterylny bufor M9²⁷ (3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO₄, H₂O do 1 L. Sterilizować przez autoklawowanie)

1. Zbieranie robaków

1. Weź płytkę 90 mm (lub dwie 30 mm) z dorosłą populacją robaków.
2. Odzyskaj robaki z buforem M9 i przenieś je do 15 mL probówki do wirówki.
3. Powtórz poprzedni krok, aby odzyskać wszystkie robaki z płytki (płytek).
4. Pozwól, aby robaki osiedliły się w 15 mL probówce na minutę i ostrożnie usuń bufor M9.
5. Upewnij się, że masz ~1 mL robaków.

2. Wybielanie

1. Dodaj 5 mL buforu M9 + 650 μL NaOH 5M + 1300 μL domowego wybielacza (5% roztwór NaClO).
2. Wiruj z maksymalną prędkością przez 1-2 min (nie dłużej niż 2,5 min).
3. Wiruj w wirówce przy 1000 x g przez 1 min w temperaturze pokojowej (RT).
4. Usuń surnatę i dodaj 9 mL buforu M9.
5. Powtórz sekcje 2.3 i 2.4 pięć razy więcej.
6. Resuspenduj zarodki w 7 mL buforu M9.
   UWAGA: Protokół wybielania może różnić się pod względem efektywności w zależności od temperatury, rodzaju komercyjnego wybielacza²⁸.

3. M9 (ciekły) nocne wyklucie jaj

1. Upewnij się, że probówka z wybielonymi jajami jest odpowiednio zamknięta.
2. Umieść probówkę w wolnym ruchu w 20 °C (np. w shakerze wewnątrz pomieszczenia o temperaturze 20 °C).
3. Robaki wyklują się przez noc i zatrzymują w fazie L1.
   UWAGA: Nie zostawiaj probówki dłużej niż 12 godzin.

4. Dzień 2: wzrost robaków: odzyskiwanie robaków L1.

1. Weź probówkę z shakera i potwierdź pod mikroskopem, że są robaki L1.
2. Pozwól, aby probówka osiedliła się pionowo przez około 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
3. Usuń surnatę i przenieś ~300 L1 robaków na jedną płytkę 90 mm lub dwie płytki 30 mm z pokarmem.
4. Umieść je w inkubatorze 20 °C i pozwól im rosnąć przez 26 godzin, aby osiągnąć stadium L4.

5. Dzień 3: Przygotowanie roztworów stężonych: Następujące roztwory muszą być przygotowane, aby wytworzyć świeże roztwory w dniu 4

UWAGA: Można to zrobić w dniu 2 lub 3.

1. 1 mL 10% SDS.
2. 50 mL 1M HEPES pH 8 (autoklawa).
3. 250 mL 20% sacharozy (autoklawa).
4. 100 mL 2M NaCl: przygotować (autoklawa).
5. 50 mL 2M KCl (autoklawa).
6. 10 mL 1M CaCl₂ (autoklawa).
7. 10 mL 1M MgCl₂ (autoklawa).
8. 100 mL 1M Tris, pH 7,4.
9. 5 mL 5M NaCl (autoklawa).
10. 500 μL 10% Tween-20.
11. 500 μL 10% Nonidet P40/IGEPAL.
12. 100 μL 5% Digitonin (należy podgrzać do 65 °C, aby się rozpuścić).
13. 500 μL 10% BSA (przefiltrowane przez 0,22 μm), przechowywane w 4 °C.
    Dzień 4: Robaki L4 na ATAC
    UWAGA: Przed rozpoczęciem, upewnij się, że masz inkubator w 25 °C, gotową 4 °C wirówkę, podgrzej Digitonin do 65 °C (dla świeżego buforu), masz sterylny bufor M9, sterylną H2O i 20 μm filtry.

6. Przygotowanie roztworu

1. Przygotuj świeże roztwory (patrz Tabela 1). Zawsze obsługuj L-15 10% FBS i bufor jajeczny w sterylnych warunkach i trzymaj je na zimno.

Tabela 1: Stożek dla przygotowania świeżego roztworu. Przepisy na przygotowanie stożka dla protokołu dysocjacji nematod i zawiesiny komórek (sekcje 6 i 7). Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Wyniki

Kontrola jakości po tagmentacji zapewnia dokładną przygotowanie biblioteki
Podczas protokołu ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na qPCR wykonane po tagmentacji chromatyny (sekcja 9), ponieważ jest to kluczowy krok do oceny jakości DNA i wydajności eksperymentu. Rysunek 1A przedstawia dwie krzywe amplifikacyjne; lewa (poniżej 15 cykli) przedstawia materiał dobrej jakości, co pokazuje, że wszystko było pomyślne do tego punktu, więc można kontynuować. Krzywa po prawej...

Dyskusja

Tu opisujemy zoptymalizowany protokół profilowania dostępności chromatinu na poziomie genomu przez ATAC-seq w całych robakach Caenorhabditis elegans w stadium L4. Dostępność chromatinu bezpośrednio wpływa na ekspresję genów, naprawę DNA, replikację i rekombinację, a chociaż ATAC-seq stał się standardowym podejściem dla próbek komórek i tkanek, jego zastosowanie do całych organizmów stwarza unikalne wyzwania techniczne, szczególnie w przypadku nicieni z nieprzepuszczalną, bogatą w kolagen kutikulą. Jednocześnie o...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
250 mL, 0.22 µm PES	Ultra Curz	sc-200253
Agar	BD	214010
Agencourt AMPURE XP	Nalgene	A63886
Bovine Serum Albumin	Maplica	200100
Calcium Chloride	Sigma	C5670-100G
CellTrics 20 µm	Sysmex	04-0042-2315
Cholesterol	Sigma	C8503-25G
Digitonin	Sigma	D141-500 mg
Disposable gloves	Microflex	94-243
DL-Dithiothreitol	sigma	D0632-10G	Szkodliwy
Ethyl alcohol, pure	Sigma	1003661421
Fetal Bovine Serum	biowest	S181S-500
HEPES	Sigma	H3375-250 G
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer (large Kit)	Illumina	20034211
Kapa Syber 50 mL	Sigma	KK4618
L-15 Medium (Leivobitz)	sigma	L4386-10L
Magnesium Chloride anhydrous	Sigma	M8266-100G
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma	M1880-500G
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Sigma	M1880-500G
MinElute PCR Purification Kit (50 preps)	Qiagen	28004
NEBNext® High-Fidelity 2X PCR Master Mix	NEB	M0541S
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74835-1L
Pen Strep	Gibco	15140-122
Peptone	BD	211677
Petri dish 60 mm	Tritech	T3308
Petri dish 90 mm	Interlux	C9015-2C
Pipet tips 10 µL, filter	Cellpro	800108
Pipet tips 20 µL, filter	Cellpro	800708
Pipet tips 200 µL, filter	Cellpro	800608
Potassium Chloride	Sigma	P9541 -500G
Potassium Phosphate Dibasic Powder	J.T. Baker	3252-01
Potassium Phosphate Monobasic, Crystal	J.T. Baker	3246-01 500G
Sodium Chloride	JT Baker	3624-01
Sodium dodecyl sulfate	sigma	L4509-100G
Sodium Hydroxide	Macron	7708-10
Sodium Hypochlorite	Cloralex	544394479
Sodium Phosphate Dibasic 7-Hydrated Crystal	J.T. Baker	3824-01
SPRIselect	Beckman	B23318
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Syringe Filter PVDF 0.22 µm	Ultra Curz	Sc-358812
Trizma base	Sigma	T1503 1KG
Tween 20	Sigma	P9416-50ML