Ustanowienie modelu szczura ostrego odrzucenia pośredniczonego przeciwciałami w przeszczepach nerek

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje ustanowienie modelu szczura ostrego odrzucenia pośredniczonego przeciwciałami (AAMR) w przeszczepie nerki. Model ten jest indukowany przez presensytyzację szczurów Lewis biorców za pomocą przeszczepów skórnych dawczyńców Brown Norway na 14 dni przed przeszczepem nerki, co stanowi solidną podstawę do badania patofizjologii AAMR.

Streszczenie

Ostre odrzucenie podlegane przeciwciałom (AAMR) pozostaje poważną przeszkodą dla długoterminowego przeżycia przeszczepu w przeszczepach nerki. Patofizjologia AAMR jest przede wszystkim napędzana przez przeciwciała specyficzne dla dawcy (DSA), które wywołują aktywację dopełnienia, prowadząc do uszkodzenia komórek śródbłonka, zapalenia naczyń oraz dysfunkcji przeszczepów. Pomimo postępów w terapiach immunosupresyjnych, leczenie AAMR pozostaje nieoptymalne. Dlatego opracowanie wiarygodnych modeli zwierzęcych dla AAMR jest kluczowe dla zrozumienia jego mechanizmów i oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych. W tym badaniu opracowano model AAMR szczura poprzez uwrażliwienie biorców szczurów Lewisa za pomocą przeszczepów skóry szczura norweskiego brunatnego przez 14 dni przed przeszczepem nerki. Przez cały czas badania nie podawano biorcom środków immunosupresyjnych. Analiza przeżycia wykazała istotnie zmniejszoną przeżywalność przeszczepu w grupie presensyfikowanej allogenicznej w porównaniu z grupą nieprzewrażliwioną (6,2 ± 1,1 dzień vs 10,0 ± 0,7 d, P < 0,001). Poziomy surowicy DSA-IgG znacząco wzrosły od 7 dnia po przeszczepie skóry i kontynuowały wzrost do 5. dnia po przeszczepie nerki, a poziomy DSA-IgM w surowicy znacząco wzrosły w 7. i 14. dniu po przeszczepie skóry. Od 6 godzin po przeszczepie nerki przeszczepy allogenne zaczęły wykazywać objawy zapalenia kłębeka, zapalenia naczyń włosowatych okołowodowych oraz osadzania się C4d w naczyniach włosowatych. Od 3 dni po przeszczepie nerki obserwowano znaczące uszkodzenia przeszczepu i martwicę rurówek. Zmiany te stopniowo się pogarszały z czasem i są zgodne z charakterystyką AAMR. Model ten skutecznie odtwarza kluczowe cechy AAMR, zapewniając solidną platformę do przyszłych badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw i potencjalnymi terapiami.

Wprowadzenie

Przeszczep nerki (KT) stał się kluczowym podejściem terapeutycznym w końcowym stadium choroby nerek ^1,2. Jednak odrzucenie przeszczepu pozostaje głównym czynnikiem wpływającym na długoterminowe przeżycie allograftów nerek ^3,4. Główne typy odrzucenia obserwowane klinicznie to ostre odrzucenie (AR) oraz przewlekłe odrzucenie (CR). Odrzucenie ostre dzieli się dalej na ostre odrzucenie pośredniczone limfocytami T (TCMR) oraz ostre odrzucenie pośredniczone przez przeciwciała (AAMR)^5,6,7. W ostatnich latach, wraz z rozwojem i stosowaniem środków immunosupresyjnych, częstość występowania TCMR została skutecznie kontrolowana. Jednak AAMR pozostaje jedną z głównych przyczyn dysfunkcji przeszczepu ^8,9.

Powszechnie uważa się, że patofizjologia AAMR jest wywoływana przez przeciwciała specyficzne dla dawcy (DSA) produkowane przed lub po przeszczepie¹⁰. Gdy DSA wiąże się z antygenami komórek śródbłonka naczyniowego przeszczepów allotlicznych, aktywowana jest klasyczna kaskada dopełnienia, prowadząca do powstawania kompleksów atakujących błon i późniejszego uszkodzenia przeszczepu¹¹. Podczas aktywacji komplementu fragment rozszczepienia C4d kowalencyjnie wiąże się z powierzchniami komórek śródbłonka kapilary allotransplantu. Dodatkowo, chemoatraktanty, takie jak produkty rozszczepienia dopełniającego C3a i C5a, rekrutują komórki zapalne (np. makrofagi) do infiltracji naczyń włosowatych przeszczepów, co prowadzi do zapalenia kapilar i dalszego uszkodzenia przeszczepu^12,13. Dlatego diagnoza kliniczna AAMR opiera się głównie na dowodach na podwyższone poziomy DSA w surowicy, zapalenie naczyń włosowatych, martwicę rurówek oraz osadzanie się C4d w kapilarach przeszczepów 14,15,16. Obecne strategie terapeutyczne AAMR polegają głównie na hamowaniu aktywności komórek B lub plazmocytów, usuwaniu krążącego DSA oraz hamowaniu aktywacji dopełnienia. Należą do nich plazmafereza, immunoadsorpcja, przeciwciało monoklonalne CD20 (rytuksimab), inhibitory proteasomów (bortezomib), inhibitory komplementu (eculizumab) oraz enzym degradujący IgG (IdeS)17,18,19,20,21,22,23,24,25. Jednak ogólna skuteczność leczenia pozostaje suboptymalna, ponieważ żadna standaryzowana terapia nie została udowodniona jako solidna w randomizowanych badaniach. Ponadto obecne strategie immunosupresyjne często wiążą się ze znacznym obciążeniem skutków niepożądanych, zwłaszcza ze zwiększoną podatnością na poważne powikłania zakaźne oraz nowotwory 21,25,26,27. Dlatego potrzebne są dalsze badania, aby wyjaśnić patofizjologię AAMR i opracować skuteczniejsze podejścia terapeutyczne.

Badanie mechanizmów chorób i nowe strategie zapobiegania opierają się na modelach małych zwierząt, co czyni ustanowienie wiarygodnego modelu AAMR w KT niezbędnym. Nasza grupa badawcza ma szerokie doświadczenie w konstruowaniu modeli rat KT AAMR²⁸. W tym badaniu przeprowadzono KT z użyciem szczura Brown Norway (BN) na szczurze Lewisa. Szczury BN (RT1ⁿ) i Lewis (RT1^l) stanowią w pełni niedopasowaną parę MHC, co stanowi silną podstawę genetyczną dla odrzucenia allogenicznego²⁹. W porównaniu z alternatywnymi podejściami modelowania, stosowana tutaj strategia presensytyzacji przeszczepów skóry oferuje wyraźne korzyści pod względem odporności i istotności fizjologicznej. W przeciwieństwie do pasywnych modeli transferu przeciwciał, które opierają się na iniekcjach przejściowych i nie angażują immunologicznego gospodarza, to podejście do aktywnej sensytyzacji ustanawia długoterminową pamięć immunologiczną, ściśle naśladując scenariusz kliniczny pacjentów o wysokiej wrażliwości³⁰. Ponadto, w przeciwieństwie do innych metod uwrażliwiania, takich jak specyficzna transfuzja krwi dawcy, która może dawać zmienne miany przeciwciał lub nawet wywoływać tolerancję w zależności od protokołu, przeszczep skóry zapewnia pojedynczy, silny i wysoce immunogenny bodziec²⁹. Gwarantuje to powtarzalną generację wysokomiareczkowego DSA oraz spójną manifestację fenotypów AAMR (np. zapalenie kapilar, osadzanie C4d) w określonym okresie od 5 do 7 dni, co czyni ją wysoce realną platformą do oceny skuteczności terapeutycznej. Model AAMR ustaliłeśmy, wykonując KT u tych allogenicznych szczurów po dwóch tygodniach presensytyzacji przeszczepów skóry i oceniliśmy model za pomocą analiz serologicznych, histologicznych i immunologicznych.

Jeśli chodzi o zastosowanie modelu, użytkownicy tego protokołu mogą spodziewać się powtarzalnego wystąpienia fenotypów AAMR między 5. a 7. dniem po przeszczepie. Główne odczyty niezbędne do weryfikacji tego modelu obejmują kinetykę produkcji DSA w surowicy (IgG i IgM), dowody histologiczne stanu zapalnego mikronaczyniowego (kłębuszenie i zapalenie naczyń okołorurkowych) oraz rozproszone osadzanie C4d w naczyniach włosowatych wokół rurówek. Jednak czytelnicy powinni być świadomi fundamentalnego ograniczenia: metoda presensytyzacji skóry wywołuje szeroką odpowiedź alloimmunologiczną obejmującą zarówno ramiona humoralne, jak i komórkowe. W konsekwencji ten model zazwyczaj objawia się jako mieszana patologia odrzucenia — charakteryzująca się dominującymi cechami AAMR z towarzyszącym TCMR, a nie izolowanym procesem pośredniczonym przez przeciwciała.

Protokół

Wszystkie zabiegi na zwierzętach były przeprowadzane w ścisłej zgodności z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet Etyki Zwierząt Pierwszego Uniwersytetu Medycznego w Shandong oraz Szpitala Prowincjonalnego Qianfoshan w Shandong. Wszystkie procedury były zgodne z zasadą 3R oraz Deklaracją Helsińską (Zatwierdzenie nr JENNIO-IACUC-2024-A066). Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są szczegółowo opisane w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Trzymaj dorosłych samców szczurów BN (RT1ⁿ) i Lewis (RT1^l) (200-250 g) w specyficznych placówkach wolnych od patogenów (SPF). Jako szczepy inbredne, osobniki w tym samym szczepie są genetycznie identyczne, co zapewnia jednolitość dawców.
2. Podziel szczury na cztery grupy eksperymentalne, jak opisano na Rysunku 1: (1) KT syngeneiczne, (2) KT syngeneiczne po przeszczepie skóry (ST), (3) KT allogeniczne oraz (4) Allogeniczne KT po ST.
   UWAGA: Wszystkie zabiegi chirurgiczne wykonuj na sali operacyjnej z SPF pod stereomikroskopem. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 °C za pomocą termostatycznego stołu chirurgicznego przez cały czas trwania zabiegów.
3. Indukować znieczulenie z 4%-5% izofluranem przenoszonym przez 100% tlenu z przepływem 1,0 L/min w komoře indukcyjnej (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi). Po indukcji utrzymuj znieczulenie z 1,5%-2% izofluranem przez stożek nosowy. Głębokość znieczulenia była monitorowana poprzez weryfikację utraty odruchu cofania się pedałów podczas całego zabiegu.

2. Presensytyzacja przez ST (dla grup 2 i 4)

1. Pobierz przeszczep skóry o wymiarach 2 cm x 2 cm o pełnej grubości z ogona szczura-dawcy (Lewis dla grupy 2; BN dla Grupy 4).
   UWAGA: Szczur dawca użyty do przeszczepu skóry to inny osobnik niż kolejny dawca nerki, choć pochodzą z tej samej linii sobnej (inbred).
2. Przygotuj łóżko szczepień o tej samej wielkości na grzbiecie szczura biorcego.
3. Umieść przeszczep skóry dawcy na przygotowanym łóżku i zabezpiecz je za pomocą szwów przerwanych, jak opisano^{wcześniej 31}.
4. Przed przeszczepem nerki należy odczekać 14 dni na uwrażliwienie.

3. Operacja dawcy dla KT

1. Znieczulonić szczura-dawcę (Lewis dla grup 1 i 2; BN dla grup 3 i 4).
2. Umieść szczura w pozycji leżącej i wykonaj laparotomię środkową rozciągającą się od wyrostka keksfoidalnego do współstyki łonowej (około 3-4 cm długości), aby w pełni odsłonić narządy brzuszne³².
3. Delikatnie cofnij jelita, aby zobaczyć lewą nerkę i powiązane z nią naczynia.
4. Wyizolować lewą tętnicę nerkową u jej źródła od aorty brzusznej oraz lewą żyłę nerkową w miejscu połączenia z żyłą szczelną dolną.
   UWAGA: Decydujemy się izolować i przeciąć naczynia bezpośrednio w ich ostiach, bez pobierania plamy aorty lub żyły kościowej (łata Carrela). Chociaż technika ta wymaga precyzyjnych umiejętności mikrochirurgicznych przy anastomozze, wolimy ją zminimalizować rozległość arteriotomii aorty biorcy oraz zmniejszyć ryzyko zakrzepicy wywołanej turbulencjami związanej z rekonstrukcją plastry.
5. Przekrąż lewą nerkę około 2 ml zimnej (4 °C) soli heparynowej (125 U/mL) przez aortę brzuszną, aż nerka stanie się blada³¹.
6. Przeciąć lewą żyłę nerkową, a następnie lewą tętnicę nerkową.
7. Przetnij moczowód, upewniając się, że mały fragment pęcherza pozostaje przymocowany.
8. Pobierz nerkę i natychmiast umieść ją w 0,5-1,0 ml zimnego, hipertonicznego cytrynianu, adeniny (HCA) na lodzie.

4. Operacja odbiorcy dla KT

1. Znieczulaj szczura Lewisa biorcą.
2. Wykonaj laparotomię środkową i odsłoń aortę brzuszną oraz żyłę głęboką dolną poniżej poziomu naczyń nerkowych.
3. Wyizoluj segment aorty brzusznej oraz żyłę dolną.
4. Zacisnąć izolowany segment naczyniowy za pomocą zacisków typu waskularnego buldoga.
5. Wykonaj małe nacięcie podłużne (około 1,0-1,5 mm długości, odpowiadające średnicy tętnicy nerkowej dawcy) w aorcie brzusznej i wykonaj zespolenie od strony do boku tętnicy nerkowej dawcy, używając szwów nylonowych 10-0 w sposób ciągły.
6. Wykonaj odpowiednie nacięcie w żyłie głównej dolnej i wykonaj anastomozę od końca do boku żyłą nerkową dawcy za pomocą 8-0 Szwy nylonowe.
   UWAGA: Ogólnoustrojowa heparynizacja nie jest wykonywana u biorcy w celu zapobiegania nadmiernemu krwawieniu.
7. Najpierw należy usunąć zacisk naczyniowy z żyły głównej dolnej w celu ustanowienia wypływu żylnego. Następnie powoli usuń zacisk tętnicowy z aorty brzusznej, aby przywrócić przepływ krwi do przeszczepu.
8. Sprawdź hemostazę i oceniaj przeszczep. Uciśnij drobne miejsca krwawienia patyczkami do waty.
   UWAGA: Nierka skutecznie przeperfuzowana powinna natychmiast przybrać różowy i stwardniony kolor.
9. Przeprowadz rekonstrukcję dróg moczowych, anastomozując plastrz pęcherza dawcy do kopuły pęcherza biorcy za pomocą szwów nylonowych 10-0.
10. Wyciąć obie rodzime nerki szczura biorcy, aby zapewnić, że przeżycie zależy wyłącznie od funkcji przeszczepu.
    UWAGA: Przez cały zabieg całkowity czas zimnej niedokrwienia (od pobrania od dawcy do reperfuzji) był utrzymywany poniżej 60 minut, a czas ciepłej niedokrwienia (podczas rozlotu) poniżej 30 minut, aby zminimalizować ryzyko uszkodzenia niedokrwiennego.
11. Zamykaj nacięcie brzucha warstwami, używając szwów jedwabnych 5-0.
12. Bezpośrednio po zamknięciu rany podaj buprenorfinę (0,05 mg/kg) podskórnie w celu leczenia przeciwbólu oraz penicylinę (40 000 U/kg) domięśniowo, aby zapobiec infekcji. Podaj 1-2 mL ciepłej, sterylnej soli fizjologicznej podskórnie, aby zapobiec odwodnieniu.

5. Opieka pooperacyjna i monitorowanie

1. Codziennie monitoruj szczury biorce pod kątem przeżywalności, zachowania (czujność, mobilność) oraz stanu fizjologicznego (spożycie pożywienia, wydalanie).
2. Codziennie sprawdzaj nacięcie chirurgiczne pod kątem oznak infekcji lub dehiscencji.
3. Obserwuj szczury co godzinę przez pierwsze 24 godziny po operacji, co najmniej trzy razy dziennie przez 2-3 dni, a potem raz lub dwa razy dziennie.
4. Wykluczyć biorców, którzy umierają w ciągu 24 godzin po przeszczepie z powodu powikłań technicznych, takich jak zakrzepica naczyniowa, wyciek moczu czy krwotocz, z ostatecznej analizy. W tym badaniu ogólny wskaźnik sukcesu chirurgicznego wynosił około 90%.

6. Oceny po przeszczepie

1. Wykrywanie poziomów DSA
   1. Pobieranie próbek krwi z żyły ogonowej w dniach 0, 3, 7 i 14 po ST oraz w dniach 1, 3 i 5 po KT.
   2. Wiruj próbki w ~1500 x g przez 10 minut, aby oddzielić surowicę i przechowywać w -20 °C do czasu analizy.
   3. Pobierz śledzionę od szczura-dawcy i mechanicznie rozłóż ją przez sitko komórkowe o pojemności 70 μm na zimną sól fosforanową z buforem fizjologicznym (PBS). Lizuj czerwone krwinki za pomocą buforu lizyjskiego ACK przez 5 minut, następnie myj komórki dwukrotnie PBS (wirówka 300 × g przez 5 minut). Policz komórki i dostosuj końcowe stężenie do 1 × 10^{7 komórek}/mL.
   4. Rozcieńcz surowicę w 1:25 z PBS.
   5. Inkubuj 50 μL rozcieńczonej surowicy z 5 × 10 5 splenocytów szczurów dawcy przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
   6. Przemyj ogniwa dwukrotnie 2 mL PBS, wirując w 400 × g przez 5 minut w 4 °C
   7. Inkubuj komórki z przeciwciałami anty-szczurzymi IgG sprzężonymi z FITC oraz przeciw szczurom IgM (patrz Tabela materiałów dla konkretnych klonów) przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
   8. Przemyj komórki i ponownie zawiesij w PBS do stężenia 5 × 10⁶ komórek/mL.
   9. Przeanalizuj próbki za pomocą cytometru przepływowego, aby ilościowo określić średnią intensywność fluorescencji (MFI) DSA-IgG i IgM.
2. Badanie patologiczne przeszczepów nerek
   1. Pobieranie przeszczepów nerek w określonych momentach (pobieranie 5. dnia po KT dla syngeneicznego KT po grupie ST; 6 h, 12 h, 1 d, 2 dni, 3 dni, 4 dni i 5 dni po KT dla allogenicznego KT po grupie ST).
   2. Utrwalaj próbki tkanek w 4% paradehydu na 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po odwodnieniu i oczyszczeniu należy osadzić tkanki w blokach parafiny i pociąć na przekroje o pojemności 4 μm.
   3. Wykonaj barwienie hematoksylin-eozyny (HE) oraz okresowego kwasowo-schiffowego (PAS) na przekrojach.
   4. W immunohistochemii wykonuj pobieranie antygenów, zanurzając fragmenty w buforze EDTA (pH 9,0) i podgrzewając w szybkowarze. Po osiągnięciu pełnego ciśnienia utrzymuj przez 5 minut, po czym naturalnie schłodź do temperatury pokojowej.
   5. Traktuj fragmenty nadtlenkiem wodoru 3% przez 10 minut.
   6. Inkubuj sekcje przez noc w temperaturze 4 °C z pierwotnymi przeciwciałami przeciwko CD31 i C4d.
   7. Dla wizualizacji nałóż chromogen DAB+ na 30 sekund w temperaturze pokojowej.
   8. Zeskanuj zabarwione fragmenty za pomocą cyfrowego skanera preparatów.

7. Analiza statystyczna

1. Dane ilościowe przedstawiane są jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Analizy statystyczne przeprowadzano przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego.
2. Oceń wskaźniki przeżycia biorców za pomocą analizy Kaplan-Meier.
3. Porównaj dane ilościowe między grupami za pomocą testu Student's t.
   UWAGA: Wartość P < 0,05 jest uznawana za statystycznie istotną.

Wyniki

Czas przeżycia przeszczepu nerkowego
Odbiorcy zarówno syngeneicznej KT, jak i syngeneicznej KT po ST przeżyli długoterminowo bez odrzucenia przez cały miesięczny okres obserwacji. Natomiast czas przeżycia przeszczepów allogennych w grupie KT allogenicznej i allogenicznej KT po grupie ST wynosił odpowiednio (10,0 ± 0,7) dni i (6,2 ± 1,1) dnia, z istotną różnicą statystycznie istotną między tymi grupami (Rysunek 2A).

Poziomy DSA (IgG i ...

Dyskusja

AAMR pozostaje istotnym wyzwaniem w KT ze względu na szybki postęp i niekorzystne wyniki kliniczne^{33, 34, 35, 36}. Nawet przy skutecznych obecnych terapiach przeciwodrzutowych, które odwracają ostre epizody, ponad 40% pacjentów przechodzi w przewlekłą AMR. Po przewlekłej diagnozie AMR wskaźnik przeżycia przeszczepu przez pięć lat często spada poniżej 50%. Wskaźnik przeżycia przeszczepu przez 4 l...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Przeciwciało monoklonalne przeciw CD31	Abcam (Wielka Brytania)	ab64543	Dla immunohistochemii (znakowanie komórek śródbłonka naczyniowego) Numer klonu: TLD-3A12
Anti-C4d  Przeciwciała	Hycult Biotech (Holandia)	HP8034	Dla immunohistochemii (wykrywania depozycji komplementowej) rozcieńczenie wynosi 1:50 Liczba klonów: NA (poliklonalna)
Przeciwciało przeciw IgG sprzężone z FITC przeciwko szczurom	Abcam (Wielka Brytania)	ab6840	Wykorzystywane do cytometrycznej ilościowej ilościowej wartości DSA-IgG Liczba klonów: Poliklonalna
System znieczulenia gazowego	Nanjing Calvin Biotechnology Co., Ltd.	KW-MZJ-4	Wyposażony w izofluran do znieczulenia ogólnego Liczba klonów: NA (poliklonalna)
Przeciwciało IgM sprzężone z PE przeciwko szczurom	Legenda biografii	408918	Używany do cytometrycznej ilościowej ilościowej wartości DSA-IgM Numer klonu: MRM-47
Stereotakstyczny mikroskop chirurgiczny	Beijing Zhongtian Guangzheng Technology Co., Ltd.	TS-39NK	Wykorzystywany do przeszczepu nerki szczura Numer klona: NA
Zaciski naczyniowe buldoga	ROBOZ SURGICAL INSTRUMENT CO.	RS-5481T	Stosowany do blokowania przepływu krwi podczas przeszczepu nerki Liczba klonów: NA