Wielostawowe synchroniczne śledzenie oparte na uczeniu głębokim do obiektywnej ilościowej kinematyki ruchowej kończyn tylnych u szczurów

Summary

Protokół ten ustanawia pipeline oceny kinematyki tylnej kończyny szczura za pomocą testu na bieżni bez markerów z automatycznym oznaczaniem trajektorii wielostawowych opartym na głębokim uczeniu, co umożliwia powtarzalną ilościową ilościową identyfikację ruchu.

Abstract

Dokładna i obiektywna ocena chodu szczura jest niezbędna dla badań neurobiologicznych i kinezjologii. Konwencjonalne systemy często polegają na obrazowaniu śladu do pośredniego wnioskowania chodu, co nie jest w stanie w pełni uchwycić kinematyki wielostawowej kończyn tylnych. Niniejsze badanie ustanawia system analizy chodu na bieżni oparty na bezmarkerach dla gryzoni, integrując niestandardowe algorytmy głębokiego uczenia z programowalną bieżnią wspierającą ciężar, umożliwiającą śledzenie w czasie rzeczywistym wielu stawów kończyn dolnych oraz wielowymiarową kinematyczną ilościowość. System automatycznie wyodrębnia parametry cyklu chodu, trajektorie stawów, wzorce rozkładu sił oraz płynność ruchu przy regulowanej prędkości (0-300 mm/s), nachyleniu (±30° gradientu) oraz w warunkach stopniowanego wsparcia ciężaru (0-500 g), zapewniając obiektywne narzędzie oceny badań nad zachowaniem nerwowo-mięśniowym. Korzystając z modeli urazów rdzenia kręgowego (SCI), wyniki pokazują wrażliwość systemu na wykrywanie wielowymiarowych różnic w zakresie ruchu stawów, ciągłości trajektorii, sile napędowej oraz płynności ruchu między zdrowymi a rannymi gryzoniami, potwierdzając jego zdolność do rozróżniania chorób i oceniania. W porównaniu z tradycyjnymi subiektywnymi wynikami czy metodami footprint, ta platforma eliminuje osobiste uprzedzenia i ograniczenia dotyczące danych o niskich wymiarach, łącząc architekturę opartą na głębokim uczeniu i przepustowość w zbieraniu danych. Jest stosowalny w badaniach dotyczących urazów nerwów centralnych lub obwodowych, chorób neurodegeneracyjnych, zaburzeń układu mięśniowo-szkieletowego oraz procesów starzenia. Dzięki synchronicznej integracji modułów neuroelektrofizjologii system dodatkowo umożliwia sprzężenie czasowe między chodem a sygnałami nerwowymi, ustanawiając ramy metodologiczne do analizy mechanizmów kontroli centralno-obwodowej oraz opracowywania strategii neuromodulacyjnych.

Introduction

We współczesnych badaniach neurobiologicznych i lokomotorycznych obiektywna ilościowa ilościowość chodu jest obecnie niezbędna do analizy funkcji nerwowo-mięśniowych, wyjaśniania mechanizmów chorobowych oraz oceny strategii rehabilitacji¹. Jego wysoka rozdzielczość czasoprzestrzenna umożliwia wychwycenie subtelnych różnic w synergiach między poleceniami nerwowymi, profilami aktywacji mięśni i mechaniką szkieletu, tworząc tym samym empiryczne podstawy do badania koordynacji szlaków nadrdzeniowych, sprzężenia zwrotnego obwodowego oraz kontekstów mechanicznych. Powtarzalne metryki kinematyczne zwiększają czułość wykrywania zmian, zmian zwyrodnieniowych oraz efektów terapeutycznych, przyspieszając proces rozwoju leków i urządzeń².

Konwencjonalne platformy oceniające, takie jak CatWalk, DigiGait lub uproszczone analizy footprintów, pośrednio wnioskują kinematykę stawów na podstawie wzorców kontaktu podeszwowego. Te podejścia dają niskorozdzielcze i niespójne wskaźniki, które nie oddają złożoności kinematycznej wielostawowej kończyn tylnych ^3,4. Głównym celem naszej metody jest stworzenie systemu analizy chodu o wysokiej precyzji, bez markerów i opartego na ciężarze, zaprojektowanego specjalnie dla modeli gryzoni. Dlatego tworzymy nowatorskie ramy, które: (i) utrzymują gryzonie w pozycji pionowej pod kontrolowanym obciążeniem osiowym (0-100% masy ciała) podczas ciągłego obrazowania wielostawowego, (ii) bezpośrednio lokalizują anatomiczne punkty orientacyjne płaszczyzny strzałkowej z analizy widoku bocznego za pomocą głębokiego uczenia w celu generowania dwuwymiarowych trajektorii przestrzennych, (iii) eksportują kąty stawów rozdzielone w czasie oraz kinematykę segmentalną do modelowania statystycznego⁵. Zasadniczo ramy te opierają się na zastosowaniu głębokiego uczenia do zadań widzenia komputerowego, co umożliwia solidne wyodrębnianie cech wspólnych z danych wideo.

W porównaniu z obecnymi systemami, ta platforma oferuje cztery kluczowe zalety. Działanie bez markerów eliminuje odblaskowe lub implantowane tagi, jednocześnie znacząco zmniejszając złożoność proceduralną i artefakty ruchu⁶. Zintegrowany system zawieszenia z sprzężeniem zwrotnym umożliwia precyzyjne, stopniowe podparcie masy ciała (0-100%), co umożliwia kompleksową ocenę chodu na całym ciągłym przebiegu od załadunku do rozładunku, czego brakuje na bieżniach komercyjnych⁷. Architektura głębokiego uczenia pozwala na szybkie ponowne trenowanie dla nowych szczepów, wieku lub schorzeń patologicznych, przewyższając ręczne śledzenie w skalowalności⁸. A wysokoprecyzyjne współrzędne przestrzenne wielostawowe umożliwiają precyzyjną analizę kinematyki międzystawowej w połączeniu z ilościowym profilowaniem nietypowych wzorców chodu.

Ten protokół jest szeroko stosowalny. Umożliwia badanie kontroli nadrdzeniowej, pętli zwrotnych proprioceptywnych oraz synergii mięśni przy modulowanych wymaganiach mechanicznych⁹. Patofizologicznie dostarcza wrażliwych biomarkerów lokomotorycznych dla urazów rdzenia kręgowego (SCI), udaru, neurodegeneracji, neuropatii obwodowych oraz zaburzeń nerwowo-mięśniowych ^8,10. Terapeutycznie wspiera podłużną ocenę interwencji farmakologicznych lub opartych na urządzeniach, z większą mocą statystyczną dzięki kinematyce wysokiej rozdzielczości¹¹. Architektura modułowa umożliwia płynną integrację z komplementarnymi platformami, takimi jak elektromiogram (EMG) lub sygnały mózgowe, ułatwiając mechanistyczne dekodowanie korelatów nerwowych w ruchu kończyn dolnych.

Protocol

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytutu Badań nad Mózgiem w Pekinie i zgodne z Wytycznymi dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Nie zaobserwowano żadnych działań niepożądanych związanych z procedurą.

1. Przygotowanie sprzętu

1. Włącz zasilanie systemu bieżni i wybierz przycisk Speed Control na ekranie dotykowym.
2. Pozwól pasowi pracować z niską prędkością przez 30 sekund, aby obserwować, czy pas bieżni się nie zmienia.
3. Wybierz przycisk Kontrola Nachylenia , następnie ustaw nachylenie na 0°, kliknij Zero i potwierdź, że wyświetlana wartość pokrywa się z bąbelkiem poziomu.
4. Wejdź do interfejsu zawieszenia , zawiesz ciężarek 10 g i sprawdź, czy odczyt napięcia jest bliski 0,10 N.
5. Włącz Przemysłowy Komputer Osobisty (IPC) i włącz oprogramowanie do akwizycji i analizy wideo.
6. Stwórz katalog dziennego eksperymentu, zawierający informacje takie jak nazwa eksperymentu, identyfikacja zwierzęcia, grupa eksperymentalna, prędkość, nachylenie oraz procent redukcji masy ciała.
7. Montaż przemysłowego aparatu o wysokiej prędkości (UC70, rozdzielczość: 1280x1024, liczba klatek: 60 fps), wyposażonego w obiektyw manualny (f = 12 mm), na aluminiowym uchwytie profilowym. Ustaw obiektyw aparatu prostopadle do osi podłużnej bieżni, aby uzyskać ściśle boczny widok, zachowując poziomą odległość roboczą 15 cm od płaszczyzny pasa bieżni.
8. Umieść soczewkę poziomo za pomocą poziomicy i upewnij się, że tułów szczura zajmuje środkowe 2/3 kadru. Dostosuj ostrość i przysłonę, aż linie skali na linijce tylnej (siatka 1 cm) będą wyraźnie widoczne.
9. Kliknij Podgląd, aby potwierdzić, że nie ma śladów i jasność tła jest jednolita. Jeśli obraz jest zbyt ciemny, użyj diody LED podświetlenia, aby zwiększyć jasność; jeśli jest prześwietlona, zmniejsz wzmocnienie i odpowiednio zwęź przysłonę.
10. Kliknij Start nagrywania , aby przetestować jakość nagrania danych. Kliknij Zatrzymaj nagrywanie i ustaw ścieżkę przechowywania danych. Po ukończeniu powyższych testów sprzętu rozpocznij testy na zwierzętach.

2. Przygotowanie zwierząt i przeprowadzenie testu

1. Przenieś szczura wraz z oryginalną klatką do pomieszczenia eksperymentalnego i pozwól mu odpocząć przez 10 minut. W tym okresie należy umożliwić swobodny dostęp do jedzenia i wody.
2. Rejestruj masę ciała za pomocą wagi elektronicznej (dokładnej do 0,1 g). Włącz szczury o dopasowanej masie ciała (±10 g), aby zminimalizować zakłócające skutki związane z rozmiarem ciała.
3. Jeśli kolor futra tylnych kończyn nie kontrastuje wystarczająco z tłem, użyj elektrycznej golarki, aby delikatnie usunąć 1 cm szeroki pasek futra po zewnętrznej stronie uda i z tyłu dolnej części nogi, aby poprawić dokładność rozpoznawania stawów. Podczas golenia szczur jest ręcznie unieruchamiany przez doświadczonego przewodnika bez sedacji, aby zminimalizować stres zwierzęcia. Obserwuj szczury pod kątem oznak stresu i zmęczenia, takich jak niechęć do poruszania się czy długotrwałe wypróżnianie.
4. Następnie użyj miękkiej taśmy, aby zmierzyć prostą odległość od biodra do kostki (mm), która posłuży jako podstawa do kolejnej normalizacji kroku.
5. Załóż rękawiczki, chwyć szczura i owiń elastyczny pasek na klatkę piersiową wokół przedniej pachy, mocując go do regulowanej szyny suwaka. Upewnij się, że pasek jest na tyle luźny, by włożyć jeden palec, nie wpływając na oddychanie zwierzęcia.
6. Powoli obracaj uchwyt ramienia zawieszenia, obserwując wartość napięcia na ekranie, stopniowo zwiększając ją do docelowego stosunku redukcji masy. Potwierdź, że tylne kończyny szczura nadal całkowicie dotykają ziemi.
7. Reguluj wysokość drążka chwytu. Poluzuj górne pokrętło i ustaw przednią drążek lekko poniżej czubka nosa szczura, gdy stoi wyprostowany, aby zwierzę mogło łatwo go chwycić bez nadmiernego odchylania głowy do tyłu czy pochylania się.
8. Na ekranie dotykowym ustaw prędkość na 150 mm/s, a nachylenie na 0°. Przeprowadź 10-minutową sesję aklimatyzacyjną, aby dostosować zwierzę do konkretnego poziomu wsparcia masy ciała. Obserwuj szczura pod kątem oznak stresu, np. zamarzania, wypróżniania się.
   1. Jeśli chód pozostaje nieregularny (definiowany jako [>3 przerwy/min]), przedłuż czas trwania o 2 minuty, maksymalnie do 20 minut. Jeśli szczur wykazuje uporczywe ciągnięcie łapą lub silne oznaki niepokoju, sesja aklimatyzacji zostaje natychmiast przerwana. Następnie zwierzę wraca do swojej domowej klatki i pozwala mu odpocząć co najmniej 24 godziny przed kolejną próbą. Dozwolone są maksymalnie 3 próby aklimatyzacji; zwierzęta, które nie powiodą się we wszystkich próbach, są wyłączone z formalnego eksperymentu.
9. Aklimatyzacja uznaje się za skuteczną, gdy szczur utrzymuje ciągły, równomierny krok przez co najmniej 60 sekund bez ciągnięcia łapą, a ogon zwisa naturalnie, bez sztywności. Wyklucz zwierzęta, które nie spełniają tych kryteriów po upływie maksymalnego okresu aklimatyzacji.
10. Wprowadź parametry wymagane do formalnego eksperymentu. Kolejno wpisz pożądaną prędkość (dowolną wartość od 0 do 300 mm/s) i nachylenie (−30° do +30°) na ekranie dotykowym, a następnie wybierz kierunek pasa bieżni.
11. Przeprowadz przygotowania przez pięć kolejnych dni przed formalnym eksperymentem: codziennie chodź przez 10 minut z prędkością 150 mm/s, 0° nachyleniem i zerową redukcją masy ciała, obserwując chod.
12. Po uruchomieniu bieżni obserwuj postawę szczura. Jeśli odchodzi od centralnej części 1/3, delikatnie stuknij kostką w prawą ścianę po stronie ciała. Większość zwierząt sama poprawi swoją pozycję. Jeśli dwie kolejne korekty są nieskuteczne, przesuń szczura i ponownie nagraj próbę. Daj zwierzęciu 3–5 minut przerwy na odpoczynek w neutralnym środowisku, jeśli konieczne jest przesunięcie pozycji i ponowne nagranie próby.
13. Po ustabilizowaniu kliknij Start Recording i nieprzerwanie rejestruj co najmniej pięć pełnych cykli chodu.
14. Po zakończeniu każdej próby natychmiast zmniejszyj prędkość do 0, odpiąć pasek na klatce piersiowej i odłóż szczura do odpowiedniej klatki.
15. Na koniec próby zwierzę jest ponownie umieszczane w klatce, gdzie woda jest dostarczana ad libitum za pomocą standardowej butelki.
16. Rejestruj co najmniej trzy próby w tych samych warunkach. Jeśli zwierzę biegnie nieprzerwanie przez ponad sześć prób, dodaj dodatkową 2-minutową przerwę, aby zapobiec kumulacyjnemu zmęczeniu.

3. Ekstrakcja danych chodu

1. Najpierw wyodrębnić segmenty zawierające docelowy chód, zwykle około 10 sekund, które powinny zawierać co najmniej 10 analizowalnych stabilnych cykli chodu.
2. Zaimportuj plik .mov do oprogramowania analitycznego i zarejestruj indywidualne informacje szczurów, w tym numer identyfikacyjny, grupę oraz warunki eksperymentalne.
   UWAGA: System wykorzystuje architekturę YOLO-NAS Pose, nowoczesną sieć neuronową zoptymalizowaną do wysokowydajnego oszacowania pozycji.
   Budowa zbioru danych: Model został wytrenowany na solidnym zbiorze danych 6 000 klatek wideo. Ramki te były ręcznie oznaczone współrzędnymi pięciu kluczowych stawów kończyn tylnych (grzebień biodrowej, biodro, kolano, kostka i palec u nogi) za pomocą graficznego interfejsu użytkownika DeepLabCut, aby zapewnić dokładność w rzeczywistości.
   Szkolenie: Sieć przeszła transfer learning na GPU NVIDIA RTX 3080, aby dostosować wagi pozycji YOLO-NAS do specyficznych cech tylnej kończyny szczura.
   Inicjalizacja: W oprogramowaniu wybierz wstępnie wytrenowany model 'Rat_Hindlimb_YOLO_v1' i ustaw próg ufności na 0,8, aby wykluczyć kluczowe punkty o niskiej pewności.
   Podczas fazy analizy model YOLO-NAS Pose przetwarza strumień wideo klatka po klatce. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod widzenia komputerowego, które opierają się na odejmowaniu tła, ta architektura głębokiego uczenia bezpośrednio lokalizuje szczura i przewiduje współrzędne łączne w ramach ramki ograniczającej.
   Post-processing: Algorytm wyodrębnia współrzędne x i y z map prawdopodobieństwa. Aby zminimalizować drgania wysokich częstotliwości, do surowych trajektorii stosuje się filtr medianowy (rozmiar okna: 3 klatki).
   Wyjście: System skutecznie blokuje pięć docelowych stawów w ramce wideo, generując współrzędne przestrzenne o rozdzieleniu czasu dla całej sekwencji chodu. Dane te są automatycznie eksportowane jako .csv pliki do obliczeń kinematycznych. Używając linijki na tablicy (siatka 1 cm) rejestrowanej jednocześnie, system ustanawia relację konwersji, automatycznie oblicza współczynnik skalowania i grupowo konwertuje współrzędne pikseli na milimetry.
3. Eksportuj współrzędne położenia przestrzennego każdego stawu w czasie jako plik .csv do dalszych obliczeń indeksu.
   UWAGA: Oprogramowanie automatycznie oblicza długość kroku, częstotliwość kroków i wysokość stopy, a następnie eksportuje zmiany położenia przestrzennego i kątów pięciu stawów kończyn dolnych w czasie. Na podstawie wysokości palców oprogramowanie automatycznie dzieli każdy krok na fazę zamachu i fazę postawy oraz oblicza proporcje fazy zamachu i fazy postawy w każdym cyklu chodu.

4. Porównania kinematyczne między grupami

1. Znormalizuj każdy cykl chodu w grupie od 0% (kontakt stopy) do 100% (ponownie ten sam kontakt stopy), aby zjednoczyć różne długości cykli, ułatwiając uśrednianie grupowe i porównywanie. Rodzaje obrazów, które można wygenerować do zilustrowania dynamiki chodu, przedstawiono w Pliku Uzupełniającym 1.

5. Analiza statystyczna

1. Wszystkie analizy statystyczne wykonuj za pomocą oprogramowania GraphPad Prism.
2. Zweryfikować normalność rozkładu danych za pomocą testu Shapiro-Wilka.
3. Do porównań walidacji kinematycznej i demonstracji wskaźnika masy ciała (BMI), przedstawiamy dane jako średnią ± SEM.
4. Oceń różnice między dwoma warunkami eksperymentalnymi za pomocą testu t niesparowanego ucznia.
5. Zdefiniuj progi istotności statystycznej jako *p < 0,05, **p < 0,01 oraz ***p < 0,005. Należy zauważyć, że w tym pilotażowym badaniu walidacyjnym uwzględniono łącznie n = 3 szczury.

6. Osadzenie modułu elektrofizjologicznego

UWAGA: Aby stworzyć model eksperymentalny, zwierzęta zostały znieczulone izofluranem (3% przy indukcji, 1,5%–2% przy podtrzymywaniu). Buprenorfina (0,05 mg/kg) została podana w celu zapewnienia okołooperacyjnego analgezji. Po standardowym przygotowaniu skóry i sterylnym zasłonięciu, naświetlano tkanki docelowe, aby zabezpieczyć elektrody rejestrujące w zależności od konkretnej metody: powierzchni czaszki do EEG, otworu międzykręgowego do rejestracji rdzenia kręgowego oraz docelowych mięśni kończyn tylnych do EMG. Zwierzęta były poddawane codziennemu monitoringowi pooperacyjnemu. Podawanie leków analgetycznych kontynuowano przez pierwsze trzy dni po operacji, aby zapewnić odpowiednie leczenie bólu. Zgodnie z identycznym protokołem znieczulającym opisanym powyżej, wykonano standardową laminektomię T10. Następnie wywołano kontuzję stłuczeniem za pomocą skalibrowanego urządzenia do zrzucania ciężaru przed zamknięciem rany. Wszystkie procedury ściśle przestrzegały wytycznych instytucjonalnej opieki nad zwierzętami.

1. Po zakończeniu modelowania zwierząt należy wszczepić urządzenie do rejestracji elektrofizjologicznej.
2. Do rejestracji nerwowej umieść elektrody na powierzchni czaszki, w przestrzeni zewnątrzoponowej lub korze mózgowej, aby rejestrować sygnały mózgowe.
3. Do rejestracji rdzenia kręgowego należy włożyć elektrody rejestrujące do przestrzeni zewnątrzoponowej otworu międzykręgowego.
4. Do rejestracji EMG zakopuj srebrne przewody dwubiegunowe w mięśniach, aby rejestrować aktywność elektryczną mięśni.
5. Po wszczepieniu pozwól zwierzęciu na 5-7 dni na regenerację, codziennie sprawdzając ranę i chód, aby upewnić się, że nie ma oznak infekcji lub bólu, zanim przystąpisz do eksperymentu na bieżni. Pozwól zwierzęciu przejść pełny, 5–7-dniowy okres rekonwalescencji w klatce domowej, aby monitorować powrót do normalnego chodu i zapewnić prawidłowe gojenie rany. W trakcie tego okresu rekonwalescencji nie przeprowadza się rejestrowania chodu ani testów na bieżni.
6. Wykonaj przygotowania sprzętu i zwierząt, jak opisano powyżej.
7. Zsynchronizuj zbieranie parametrów elektrofizjologicznych i filmów ruchowych, zapewniając, że dane elektrofizjologiczne i wideo mają ten sam znacznik czasu.
8. Po zebraniu danych dopasuj sygnały nerwowe do klatek wideo podczas analizy, aby intuicyjnie obserwować wzorce elektrofizjologiczne na różnych etapach cyklu chodu, dostarczając bezpośrednich dowodów na badanie mechanizmu sprzężenia centralno-peryferyjnego.

Results

Schemat i rzeczywiste zdjęcie struktury systemu bieżni pokazano odpowiednio na rysunku 1A, B. Urządzenie jest zdolne do uzyskania wysokokontrastowych obrazów bocznych bez użycia znaczników. Bieżnia umożliwia regulacje prędkości, nachylenia, kierunku i redukcji masy, a także jest wyposażona w panel sterowania numerycznego. Towarzyszący interfejs programowy obejmuje system monitorowania i akwizycji w czasie rzeczywistym, a także interfejs do analizy przesyłania wideo i ekstrak...

Discussion

Protokół ten określa system analizy chodu szczurów oparty na bieżni oraz jego procedury operacyjne, zapewniając wielowymiarowe i obiektywne narzędzie oceny dla badań behawioralnych nerwowo-mięśniowych. Jak pokazano w porównaniach parametrów chodu między SCI a zdrowymi szczurami w badaniu przykładowym, system pozyskuje surowe współrzędne ruchów przestrzennych kończyn dolnych uczestników dzięki ciągłej wideografii chodu o wysokiej liczbie klatek na sekundę oraz zautomatyzowanemu algorytmowi anotacji wielostawowych sterowan...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adnotacje i adnotacje Gait AI Oprogramowanie do pozyskiwania	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MouseAI	MouseAI to zintegrowane oprogramowanie analizujące dla bieżni MOVEMETRICS, łączące nagrywanie wideo, rejestrowanie metadanych oraz automatyczną analizę chodu w jeden sposób pracy.
Mechaniczne uderzenia	RWD Life Science, Shenzhen, Chiny
Wielokanałowy system rejestracji elektrofizjologicznej	Kedou (Suzhou) mózg – technologia komputerowa	KedouBC RHD128A	KedouBC RHD128A to kompaktowy, 128-kanałowy system pozyskiwania elektrofizjologii in vivo, zaprojektowany do wysokiej rozdzielczości rejestrowania neuronów u małych i dużych zwierząt laboratoryjnych. Integrując lekkie, plug-and-play główne sceny (≤ 1,3 g), 16-bitowe konwersje A/D oraz programowalne wzmacniacze, rejestruje sygnały EEG, ECoG, LFP, spikes, EMG i EKG od 0,1 Hz do 30 kHz z ≤ 2.4 & mikro; Szum systemu V oraz > 10 GΩ Impedancja wejściowa. RHD128A dostarcza solidne, skalowalne przez użytkownika dane neuronowe, przyspieszając badania nad interfejsami mózg-maszyna, < odrocznictwem i rehabilitacją neurodegeneracji br/>.
Bieżnia	Shanghai ClinAITrial Technology Co., Ltd.	MOVEMETRICS	MOVEMETRICS to bieżnia o wysokiej precyzji wyposażona w instrumenty do zaawansowanej analizy chodu gryzoni.