Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł badawczy
* These authors contributed equally
To badanie identyfikuje sygnaturę związaną ze stresem oksydacyjnym opartą na 10-lncRNA w raku płaskonabłonkowym płuc (LUSC) na podstawie danych z The Cancer Genome Atlas. Chociaż walidacja wykazała ograniczoną wydajność predykcyjną kliniczną, sygnatura rozróżniała wzorce mikrośrodowiska immunologicznego, a in vitro testy potwierdziły LINC01615 jako kandydata związanego z migracją-inwazją do dalszego badania mechanistycznego.
Długotrwała niekodująca RNA (lncRNA) znacząco wpływa na wartość prognostyczną i infiltrację immunologiczną raka płaskonabłonkowego płuc (LUSC). Niniejsze badanie miało na celu wykazanie, w jaki sposób lncRNA związane ze stresem oksydacyjnym wpływają na rak płaskonabłonkowy (SCC). Zestaw danych The Cancer Genome Atlas (TCGA) zebrał informacje o transkryptomie i powiązane dane kliniczne dla LUSC. Aby zbudować model prognostyczny, zidentyfikowano 10 genów związanych z rokowaniem za pomocą serii analiz bioinformatycznych, które porównywały aberracyjną ekspresję genu OS w tkankach nowotworowych i zdrowych, a także jego związek ze złośliwością. Osoby badane zostały podzielone na grupy wysokiego i niskiego ryzyka na podstawie średniego wskaźnika ryzyka pochodzącego z 10-genowej sygnatury. Podczas gdy matematyczny model ryzyka wykazał ograniczoną niezależną wydajność predykcyjną w kohorcie walidacji (AUC ~ 0.5), ewaluacje funkcjonalne i immunologiczne ujawniły znaczące różnice w mikrośrodowisku nowotworowym (TME) między kategoriami ryzyka. Szczególnie, pacjenci z wysokim ryzykiem wykazywali odmienne profile infiltracji immunologicznej i zmienione wskaźniki immunologiczne w porównaniu ze swoimi odpowiednikami z niskiego ryzyka. Dlatego, zamiast służyć jako bezpośrednie narzędzie do przewidywania klinicznego, ta sygnatura lncRNA związana ze stresem oksydacyjnym dostarcza cennych biologicznych wglądów w krajobraz immunologiczny LUSC i wskazuje potencjalne cele terapeutyczne do dalszego badania mechanistycznego.
Rak płuc wykazuje najwyższą globalną częstość występowania i śmiertelność wśród nowotworów złośliwych1. Wśród histologicznych wariantów raka płuc niedrobnokomórkowego (NSCLC) rak płaskonabłonkowy płuc (LUSC) jest dominującym podtypem, często korelują ją niekorzystne wyniki kliniczne i brak wysoce efektywnych leczenia ukierunkowanego w porównaniu z rakiem płaskonabłonkowym płuc2. Podczas gdy podstawowe podejścia terapeutyczne obejmują interwencję chirurgiczną, radioterapię i chemioterapię, pacjenci z zaawansowanym LUSC często wykazują oporność na leczenie3. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania wytrzymałych biomarkerów molekularnych w celu poprawy prognostycznej stratyfikacji i wskazań do badań terapeutycznych dla LUSC4.
Stres oksydacyjny, charakteryzujący się patologicznym nagromadzeniem reaktywnych form tlenu (ROS), odgrywa krytyczną rolę w inicjacji, wzroście i przerzutach nowotworów. W przypadku braku skutecznych mechanizmów usuwania ROS, podwyższone poziomy ROS wywołują uszkodzenia DNA i genotoksyczność, co ostatecznie prowadzi do różnych zmian genomowych, które przyczyniają się do rozwoju raka. Należy zauważyć, że badania konsekwentnie wykazały wzrost poziomów ROS i stresu oksydacyjnego specyficznie w patogenezie raka płuc5,6. Ostatnie badania wskazały ponadto, że grupy genów związanych ze stresem oksydacyjnym mogą funkcjonować jako potencjalne biomarkery prognostyczne w nowotworach płuc7. Długie niekodujące RNA (lncRNA) stały się ważnymi regulatorami ekspresji genów i reprezentują obiecujące biomarkery prognostyczne w różnych nowotworach złośliwych. Podczas gdy wcześniejsze ważne badanie7 z powodzeniem ustanowiło model prognostyczny lncRNA związany ze stresem oksydacyjnym dla raka płaskonabłonkowego płuc (LUAD), szczególny krajobraz prognostyczny i implikacje immunologiczne takich lncRNA w LUSC pozostają w dużej mierze niezbadane.
W niniejszym badaniu autorzy systematycznie przeanalizowali zbiory danych TCGA w celu stworzenia nowego sygnału lncRNA związanego ze stresem oksydacyjnym specyficznie dostosowanego do LUSC. Co więcej, w odróżnieniu od czysto bioinformatycznych analiz, obecne badanie obejmuje in vitro walidację eksperymentalną w celu potwierdzenia biologicznej roli funkcjonalnej kluczowych zidentyfikowanych lncRNA (np. Linc01615). Badania te nie mają na celu natychmiastowego zastosowania klinicznego w decyzjach diagnostycznych i terapeutycznych, lecz głównie mają na celu zbadanie potencjalnych mechanizmów stresu oksydacyjnego w LUSC i jego korelację z mikrośrodowiskiem immunologicznym guza. Wyniki te mają na celu dostarczenie cennych biologicznych wniosków i wskazanie potencjalnych docelowych terapii dla przyszłych badań mechanistycznych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Zbieranie danych i przetwarzanie wstępne
Wszystkie dane przeanalizowane w niniejszym badaniu zostały uzyskane z publicznie dostępnej bazy danych TCGA wymienionej w Tabeli Materiałów. Niniejsze badanie ściśle przestrzegło Polityki Dotyczącej Udostępniania Danych Genomowych Narodowych Instytutów Zdrowia (NIH) oraz wytycznych publikacji dostarczonych przez TCGA. Ponieważ zbiory danych składają się z anonimizowanych, dostępnych publicznie danych klinicznych i wieloomowych, niniejsze badanie było zwolnione z dalszej aprobaty Instytucjonalnej Rady Etycznej (IRB). Dane transkryptomowe i odpowiadające im informacje kliniczne dotyczące LUSC zostały pobrane z bazy danych Cancer Genome Atlas (TCGA). Początkowo kohortę stanowiło 551 próbek (502 guzów i 49 normalnych). Aby zapewnić solidność tego modelu prognostycznego, pacjenci brakujący pełne dane dotyczące przeżycia ogólnego (OS), statusu przeżycia lub istotnych cech klinicznych zostali wykluczeni z dalszej analizy przeżycia. Po tej surowej filtracji kohorty, ustanowiono kohorty analitycznej 470 pacjentów z LUSC. Ci 470 pacjentów zostali następnie losowo podzieleni na zbiór treningowy (n = 235) i zbiór testowy (n = 235) w celu konstrukcji i walidacji modelu ryzyka. Łącznie zebrano 792 geny związane ze stresem oksydacyjnym za pośrednictwem bazy danych GeneCards, wymienionej w Tabeli Materiałów, z wykorzystaniem kryterium inkluzji wyniku trafności ≥ 7. Do przesiewania różnic w ekspresji genów związanych ze stresem oksydacyjnym zastosowano pakiet limma (wersja 3.66.0). Wykresy wulkaniczne stworzono za pomocą pakietu ggplot2 (wersja 4.0.2). Pomiędzy grupą treningową a grupą testową nie było zauważalnej różnicy w cechach klinicznych (p > 0.05). Zestaw treningowy został użyty do konstrukcji modelu, a zestaw testowy do wewnętrznej walidacji.
Konstrukcja i weryfikacja modelu ryzyka
Aby zidentyfikować lncRNA związane ze stresem oksydacyjnym, przeprowadzono analizę koekspresji Pearsona. Autorzy ocenili korelacje między profilami ekspresji zidentyfikowanych genów związanych ze stresem oksydacyjnym a wszystkimi zaanonsowanymi lncRNA w zbiorze TCGA-LUSC. Kryteria korelacji dla wyboru koekspresowanych lncRNA zostały ustawione na współczynniku korelacji |R| > 0.4 i wartości p < 0.001. Na podstawie tych progów wyprowadzono i wyodrębniono łącznie 6088 kandydatów lncRNA związanych ze stresem oksydacyjnym. Następnie te 6088 kandydatów lncRNA zostało ocenione za pomocą regresji LASSO i uzupełniających podejść analitycznych do konstrukcji prognostycznego modelu ryzyka. Wykorzystując przetworzone dane, uczestnicy pacjentów zostali sklasyfikowani na wysokie i niskie warstwy ryzyka.
Niezależne czynniki i krzywe ROC
Wykorzystano uniwariantne i multiwariantne modele regresji Coxa do zidentyfikowania niezależnych zmiennych prognostycznych. W szczególności, aby kontrolować rodzinne wskaźniki błędów podczas wielu uniwariantnych analiz regresji Coxa (n = 236 testów), zastosowano korekcję Bonferroniego, ustawiając surowy dostosowany próg istotności na p < 0.00021 (obliczony jako 0.05 / 236).
Analiza przeżycia i analiza głównych składowych
Pakiet survival (wersja 3.8-6) został użyty do obliczenia wskaźników przeżycia ogólnego (OS), a analiza głównych składowych (PCA) została zastosowana do oceny solidności modelu ryzyka.
Nomogramma
Wskaźnik dopasowania został oceniony za pomocą pakietu rms w R w celu oceny wiarygodności nomogramma. Obciążenie mutacyjne guza (TMB) zostało ocenione i wizualizowane za pomocą pakietu maftools (wersja 2.22.0). Algorytmy, w tym ssGSEA, zostały użyte do wykrycia infiltracji immunologicznej. Ponadto pakiet ggpubr (wersja 0.6.3) został użyty do porównania punktów kontrolnych odpowiedzi immunologicznej między grupami ryzyka. Algorytm ESTIMATE został użyty do charakteryzacji mikrośrodowiska guza (TME).
Analiza funkcjonalna
Pakiet clusterProfiler (wersja 4.14.6) w R został użyty do analizy wzbogacania. Aby dalej zbadać funkcjonalne ścieżki, przeprowadzono analizę GSEA. Za pomocą Cytoscape stworzono sieć koekspresji dla obserwacji.
Metody eksperymentalne
Warunki hodowli komórek i grupowanie
Ludzka linia komórek raka płaskonabłonkowego płuc NCI-H520 (RRID: CVCL_1566; wymieniona w Tabeli Materiałów) była hodowana w podłożu RPMI-1640 uzupełnionym o 10% (v/v) surowicy wołowej oraz 1% penicyliny-streptomycyny. Komórki w fazie logarytmicznej zostały posadzone w 6-dołkowych płytkach hodowlanych. Po pomyślnym przyczepianiu, komórki zostały losowo przydzielone do tr
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Identyfikacja genów o zróżnicowanej ekspresji dla stresu oksydacyjnego
Przepływ pracy przedstawiono na Rysunek 1. Charakterystyka kliniczna ostatecznej kohorty analitycznej obejmującej 470 pacjentów z LUSC jest szczegółowo opisana w Tabeli 1. Na podstawie określonego progu znaczenia wyniku ≥ 7 autorzy odnaleźli łącznie 792 geny związane ze stresem oksydacyjnym z bazy GeneCards (Plik dodatkowy 1). Między normalnymi...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Rak płasnokomórkowy płuc (LUSC) jest dominującym i wysoce agresywnym podtypem histologicznym raka płuca niedrobnokomórkowego, często charakteryzującym się ponurymi wskaźnikami przeżycia i odpornością na konwencjonalne metody terapeutyczne8,9. Pojawiające się dowody podkreślają stres oksydacyjny jako kluczowego czynnika napędzającego patogenezę i progresję różnych nowotworów. Patologiczna akumulacja reaktywnych form tlenu (ROS) oraz dysregulacja komórkowych układó...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Podczas przygotowywania rękopisu nie zastosowano żadnych narzędzi sztucznej inteligencji (AI) ani technologii wspomaganej AI; cały naukowy treść, analizy, dane surowe i wnioski zostały niezależnie wygenerowane, przejrzane i zatwierdzone przez autorów.
To dzieło zostało wspierane przez Narodowe Fundusze Naukowe Chin (Grant nr 8200430). Z głęboką wdzięcznością dziękujemy wszystkim współpracownikom i instytucjom zaangażowanym, w tym Hunan University of Traditional Chinese Medicine i Hunan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital, za ich zasoby i wsparcie. Wyrażamy również nasze uznanie dla wszystkich badaczy i uczestników, którzy przyczynili się do tego badania.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 4% Paraformaldehyd | Beyotime | P0099 | Używany do fiksacji komórek |
| Cytoscape | Cytoscape Consortium | https://cytoscape.org/ | Używany do tworzenia sieci współwystępowania |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099-141 | Ostateczne stężenie 10% (v/v) |
| Baza danych GeneCards | GeneCards Human Gene Database | https://www.genecards.org/ | Odkazywanie genów związanych ze stresem oksydacyjnym |
| Barwienie Giemsą | Sigma-Aldrich | GS500 | Używany do barwienia migrowanych/inwazyjnych komórek |
| ImageJ | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | Używany do ilościowego pomiaru szczelin ran |
| Lipo3000 Reagent do transfekcji | GLPBIO | GK20006 | Używany do transfekcji siRNA |
| Matrigel | Corning | 356234 | Rozcieńczony 1:8 w medium bez surowicy |
| NCI-H520 ludzki rak płaskonabłonkowy płuc | ATCC | HTB-182 | Używany do in vitro badań walidacji |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline) | Gibco | 10010-023 | Używany do mycia komórek |
| Penicylina-Streptomycyna (1%) | Gibco | 15140-122 | Dodatek antybiotyczny do kultury komórkowej |
| Oprogramowanie R (v4.1.2) | R Foundation | https://www.r-project.org/ | Analiza statystyczna i wizualizacja |
| Środowisko RPMI-1640 | Gibco | 11875-093 | Środowisko kultury komórkowej |
| The Cancer Genome Atlas (TCGA) | Genomic Data Commons | https://portal.gdc.cancer.gov/ | Źródło transkryptomu i danych klinicznych |
| Komory Transwell (8,0 μm) | Corning | 3422 | Używany do badań migracji i inwazji |