Method Article

Mikroskop laserowego przechwytywania tkanki wątroby myszy utrwalonej paraformaldehydem do analizy RNA

DOI:

10.3791/69814

⸱

April 17th, 2026

 ,  ,  , 
1Biomedical Research Center, Southern Medical University, 2School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 3School of Pharmaceutical Science, Southern Medical University, 4Leica Microsystems (Shanghai) Trading Co., Ltd., 5The Seventh Affiliated Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje metodę izolowania RNA z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby myszy z unieruchomioną o Optymalnej Temperaturze Cięcia z zastosowaniem złożonego tkanki wątroby za pomocą mikrosekcji laserowej, umożliwiającej ukierunkowaną analizę ekspresji genów w dalszej fazie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrodyssekcja laserowego (LCM) zapewnia przestrzenny dostęp do określonych populacji komórek w złożonych tkankach poprzez wizualizację in situ i izolację. Aby umożliwić analizę transkryptomiczną histologicznie określonych obszarów w tkance stałej, przedstawiono szczegółowy protokół LCM do ekstrakcji RNA z paraformaldehydowych (PFA) sekcji wątroby osadzonych w związkach (OCT) z osadzonymi w tkance mysi. Protokół szczegółowo opisuje identyfikację i pobieranie próbek na mikroskalę (około 1 000 komórek) poprzez proces obejmujący utrwalanie tkanek, odwodnienie sacharozy, osadzanie OCT, kriosekcję, barwienie hematoksyliny oraz laserowe wychwytywanie wybranych obszarów histologicznych. Tą metodą uzyskano RNA o wysokiej czystości (A260/A 280: 1,9-2,1). Integralność RNA (RIN) wynosiła 6,7 ± 0,9, co odzwierciedla oczekiwaną fragmentację związaną z wiązaniem PFA. Jednak ilościowe PCR dla β-aktyny dało wartości Ct 17-19, a sekwencjonowanie RNA przeprowadzone przy użyciu preparatu bibliotecznego zoptymalizowanego fragmentacją dało odczyty wysokiej jakości, przy czym >90% zasad spełniało progi Q20 i Q30, potwierdzając, że RNA nadaje się do czułych analiz dalszych. Dlatego protokół ten umożliwia przestrzennie rozdzieloną, ukierunkowaną analizę ekspresji genów poprzez dostarczanie RNA o określonej czystości i integralności pochodzących z określonych histologicznych obszarów tkanki wątroby utrwalonej PFA.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładne pozyskiwanie przestrzennie rozdzielonych profili ekspresji genów jest kluczowe dla zrozumienia heterogeniczności tkanek w zdrowiu i chorobie. Sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek (scRNA-seq) oferuje wysoką rozdzielczość komórkową 1,2, ale traci natywny kontekst przestrzenny i może zmieniać profile transkrypcyjne podczas dysocjacji tkanek 3,4. W przypadku typów komórek, które nie mają publicznie zidentyfikowanych specyficznych markerów, uzyskanie populacji czystych za pomocą sortowania immunofluorescencyjnego lub izolacji immunomagnetycznej pozostaje trudne 5,6. Technologie transkryptomiki przestrzennej, takie jak Visium i GeoMx, pozwalają na przechwytywanie in situ danych o ekspresji genów o wysokiej przepustowości, jednak ich rozdzielczość przestrzenna jest ograniczona na poziomie pojedynczych lub subkomórkowych 7,8. Z kolei transkryptomika przestrzenna oparta na obrazowaniu może osiągnąć rozdzielczość na poziomie nanometrów, ale ma ograniczoną przepustowość wykrywania genów9. To podkreśla utrzymującą się lukę w analizie opartej na hipotezach konkretnych regionów morfologicznych.

Mikroskop przechwytywania laserowego (LCM) umożliwia selekcję i izolację określonych komórek pod kątem mikroskopu z przekrojów tkanek lub żywych hodowli komórek na podstawie obserwowalnego fenotypu. Takie podejście zachowuje strukturę komórkową i informacje przestrzenne10. Technika ta była szeroko stosowana w badaniach nad chorobami wątroby do analiz końcowych. Na przykład LCM był używany do pobierania komórek nabłonka żółciowego z biopsji wątroby w celu wyjaśnienia ich roli immunoregulacyjnej w pierwotnym zapaleniu żółciowego żółciowego11. Ponadto został wykorzystany do izolowania tkanki γ-transferazy glutamylowej (GGT) pozytywnej z modeli eksperymentalnych, aby potwierdzić specyficzną dla miejsca ekspresję genu Ggt1 12. Jednak te badania koncentrowały się głównie na świeżo zamrożonych tkankach, które często nie mają żadnych adnotacji klinicznych ani długoterminowej obserwacji13. Natomiast chemicznie utrwalone tkanki oferują zalety w diagnostyce histopatologicznej14. Chociaż sekwencjonowanie RNA oparte na LCM (RNA-Seq) zostało z powodzeniem zastosowane do archiwalnych, wielkoskalowych próbek wątroby utrwalonych formaliną i parafiną (FFPE).15. Brakuje jednak solidnego protokołu profilowania ekspresji genów opartego na LCM, specyficznego dla próbek mikroskopowych tkanek wątrobowych z tkanek osadzonych w związkach paraformaldehydowych (PFA) i Optimal Cutting Temperature (OCT).

Aby sprostać tej niezaspokojonej potrzebie, zoptymalizowano kompleksowy protokół z wykorzystaniem kriosekcji zafiksowanych PFA i osadzonych w OCT. Protokół ten odpowiada na ograniczenia workflow FFPE (np. długotrwałe przetwarzanie i agresywne chemikalia) dla wrażliwych aplikacji LCM-RNA16. Dla porównania, proces utrwalania i osadzania próbek z PFA i osadzonych w OCT jest stosunkowo prostszy i bardziej elastyczny, co umożliwia szybkie przygotowanie wysokiej jakości przekrojów, które zachowują integralność RNA oraz morfologię tkanek. Ponadto protokół ten realizowany jest za pomocą ultrafioletowego (UV) laserowego systemu LCM. W porównaniu z systemami podczerwieni, UV-LCM zapewnia dokładniejszą rozdzielczość cięcia i umożliwia bezpośredni, bezkontaktowy pobór próbek, minimalizując zanieczyszczenia i umożliwiając precyzyjną izolację obszarów mikroskali od złożonych architektur tkanek17,18. Dlatego wartość operacyjna tego protokołu polega na jego zdolności do przechwytywania mikroskalowych obszarów (~1000 komórek) z fragmentów wątroby utrwalonych PFA. Daje RNA odpowiednie do ukierunkowanej analizy ekspresji genów, umożliwiając bezpośrednią korelację między cechami histopatologicznymi a lokalnymi profilami transkryptomicznymi.

Tutaj opisujemy protokół do mikroskopijnego przechwytywania laserowego tkanki mikroskali (~1000 komórek) z mysich wątrobowych fragmentów myszy z PFA-fiksowanymi, osadzonych w OCT, następnie pobierany przez ekstrakcję RNA i dalszą analizę za pomocą ilościowej transkrypcji odwróconej sekwencjonowania PCR i RNA. Procedury te można zakończyć w ciągu pięciu dni.

Aby pomóc czytelnikom w ocenie zastosowania tego protokołu, poniżej podsumowano kluczowy zakres i ograniczenia. Protokół ten jest specjalnie zoptymalizowany do pobierania próbek określonych obszarów histologicznych opartych na hipotezie, morfologii z tkanek zafiksowanych PFA i osadzonych w OCT, z głównym zastosowaniem w wątrobie myszy. Jest odpowiedni dla badaczy, którzy muszą korelować przestrzennie rozdzielone dane transkryptomiczne z precyzyjnymi cechami histopatologicznymi zachowanymi w próbkach stałych. Workflow jest szczególnie cenny przy pracy z archiwalnymi lub klinicznie adnotowanymi tkankami stałymi, gdzie świeżo mrożone próbki są niedostępne. Jednak protokół ten nie jest idealny do badań wymagających wysokiej integralności, niefragmentowanego RNA (np. integralności RNA (RIN) > 8), ponieważ inherentna fragmentacja spowodowana wiązaniem chemicznym ogranicza jego zastosowanie w aplikacjach zależnych od pełnometrykalnych transkrypcji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące obsługi i opieki nad zwierzętami były wykonywane zgodnie z wytycznymi etycznymi i zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt na Southern Medical University. Opisana metoda wykorzystywała dorosłych samców myszy C57BL/6J i była utrzymywana na diecie wysokotłuszczowej, wysokocukrowej i ubogiej w cholinę, aby modelować związane z metabolicznym steato-wątrobą (MASH). Przed pobraniem tkanki wątroby zwierzęta były uśpione przez dekapitację.

1. Przygotowanie próbki z PFA

  1. Świeże próbki tkanki wątroby (pojedyncze płaty, o grubości 5 mm lub mniej) podłącz do 30 mL zimnej 4% PFA (świeżo przygotowanej) w temperaturze 4 °C przez 24 godziny.
    UWAGA: Zaleca się perfuzję wątroby roztworem soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS, 1×, zazwyczaj składającej się ze 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄ oraz 1,8 mM KH₂PO₄, pH 7,4) w stężeniu 1× przez 5 minut, a następnie utrwalanie perfuzji 4% PFA przez 5 minut. Alternatywnie, tkanka może być również utrwalona w roztworze 10% formaliny.
    UWAGA: Utrwalacz PFA jest toksyczny. Wszystkie odpady PFA muszą być zbierane w wyznaczonym, odpowiednio oznakowanym pojemniku na odpady chemiczne, zgodnie z przepisami instytucjonalnymi i lokalnymi.
  2. Przemyj ustalone próbki tkanek 3× razy przez 5 minut roztworem PBS bez RNazy 1×.
  3. Umieść ustaloną tkankę wątroby do probówki o pojemności 50 mL wypełnionej 50 mL sacharozy 30% (świeżo przygotowanej w sterylnym 1× PBS). Utrzymuj próbki w temperaturze 4 °C przez 10-12 godzin.
  4. Usuń próbki tkanek z roztworu sacharozy. Przycinaj próbki, aby uzyskać łatwe w obsłudze bloki (około 5 mm × 3 mm × 5 mm), a następnie umieść je w kryomoldzie (7 mm × 7 mm × 5 mm) zawierającym związek OCT.
    UWAGA: W razie potrzeby dostosuj orientację tkanek za pomocą kleszczy.
  5. Dodaj na wierzch związek OCT, aby całkowicie pokryć próbki tkanki, a następnie natychmiast umieść blok tkanki osadzony w OCT na ciekłym azocie lub suchym lodzie, aby szybko zamrozić związek OCT i utworzyć blok stały. To szybkie zamrożenie jest niezbędne do uzyskania wysokiej jakości kriosekcji.
    UWAGA: Noszcie rękawice odporne na kriogeniczność, aby chronić dłonie podczas obsługi materiałów kriogenicznych.
  6. Umieść bloki osadzone w OCT w temperaturze -80 °C do czasu kriosekcji.

2. Kriosekcja do mikrosekcji laserowej przechwytu

  1. Wystaw szkiełka z membrany naftalanu (PEN) na światło UV przez 30 minut, następnie pokryj szkiełka 0,1 mg/mL poli-L-lizyny, a następnie susz na powietrzu. Następnie uszczelnij krawędzie suwaka membranowego PEN neutralnym nośnikiem mocującym.
    UWAGA: Napromieniowanie UV i obróbka polimeryzyny na preparatach membranowych PEN mogą poprawić przyczepność próbek tkanek do szkiełek membranowych PEN. Uszczelnienie obwodu neutralnym nośnikiem montażowym zapobiega infiltracji wody lub powstawaniu pęcherzyków pod membraną, co jest kluczowe dla utrzymania efektywności LCM.
    UWAGA: Chroń skórę i oczy przed światłem UV. Noś okulary ochronne blokujące promieniowanie UV lub przyłbicę na twarz (przeznaczoną do ochrony przed promieniowaniem UV), a także fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe i długie rękawy zakrywające odsłoniętą skórę.
  2. Wytrzyj wszystkie dostępne powierzchnie kriostatu i wszystkie narzędzia środkiem dekontaminującym RNazę, a szczotkę wyczyść 75% etanolem.
    UWAGA: Utylizuj zużyte chusteczki i roztwórki etanolowe zgodnie z lokalnymi instytucjonalnymi protokołami zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego.
  3. Pozwól instrumentowi osiągnąć i ustabilizować się w temperaturze −20 °C.
  4. Pobierz próbki wątroby w temperaturze -80 °C i umieść je w kriostatie na minimum 15 minut.
  5. Nałóż cienką warstwę (2-3 mm) związku OCT na powierzchnię etapu próbki. Umieść etap próbki na półce do szybkiego zamrażania (lub w komorze kriostatu), aby wstępnie zastygła warstwa OCT.
  6. Nałóż niewielką ilość OCT na wstępnie zastygłą warstwę OCT na etapie próbki. Zdejmij blok wyrównanej tkanki (krok 2.4) i natychmiast umieść blok poziomo na tym OCT, utrzymując go na miejscu przez 10-15 sekund, aby umożliwić częściowe zamrożenie i zlepkanie. Po zabezpieczeniu zamontuj etap próbki (z dołączonym blokiem tkanki) na głowicy próbki kriostatu.
  7. Ostrożnie włóż ostrze między płytki zaciskowe a tylne płyty z jednej strony kriostatu, a następnie zaciskaj dźwignię zaciskową.
  8. Reguluj grubość kriostatu do 10 μm.
    UWAGA: Dostosowuj grubość plastów w zależności od potrzeb dla tkanki, ale utrzymuj grubość w zakresie 5-15 μm19.
  9. Wycinaj i montuj sekcje bezpośrednio na wstępnie impregnowanych szkiełkach membranowych PEN wewnątrz komory kriostatu utrzymywanej w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Każde szkiełko membranowe PEN może pomieścić 6-8 przekrojów tkanek. Zaleca się, aby cały proces cięcia był ukończony w ciągu 1 godziny. Ograniczenie czasu przecięcia minimalizuje narażenie tkanek na warunki otoczenia, a tym samym zmniejsza ryzyko degradacji RNA, odwodnienia tkanek oraz artefaktów morfologicznych, które są kluczowe dla zachowania jakości RNA i integralności histologicznej podczas analiz LCM i dalszych badań.

3. Barwienie hematoksylyny do mikrosekcji laserowej rejestracji

  1. Rozmroź szkiełki w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut przed użyciem.
  2. Przemyj preparaty bezRNazowym 1× PBS (3 razy, po 10 sekund każda).
  3. Zanurz szkiełka tkanek w filtrowanym roztworze hematoksyliny Mayera (składającym się z 1,0 g/L hematoksyliny, 0,2 g/L jodatu sodu, 50 g/l dwunastowodowego siarczanu glinu, 50 g/L hydratu chlorowego oraz 1,0 g/L kwasu cytrynowego) przez 5-10 sekund.
    UWAGA: Przed barwieniem przepuszcz roztwór roboczy hematoksyliny przez membranę strzykawkową o pojemności 0,22 μm.
  4. Płucz szkiełka wodą wolną od RNazy (3 razy, po 10 sekund każda), aby usunąć resztki roztworu hematoksyliny.
  5. Oceń jakość barwienia pod mikroskopem.
    UWAGA: Optymalnie barwione jądra powinny wyglądać na wyraźny niebiesko-fioletowy na tle przezroczystym. Niewystarczające barwienie powoduje słabe jądra, natomiast nadmierne barwienie zaciera szczegóły komórkowe. Tylko preparaty spełniające te optymalne kryteria barwienia powinny przejść do kolejnego etapu.
  6. Preparaty wysuszą za pomocą chłonnego papieru, a następnie całkowicie wyschnij na powietrzu (10-15 minut).
    UWAGA: Upewnij się, że preparaty są całkowicie wyschłe przed przystąpieniem do LCM. Następnie umieszcza szkiełka w rurkach wirówek 50 mL i tymczasowo przechowuje je na lodzie do czasu wykonania LCM.

4. Mikrorozcinanie laserowego przechwytu

UWAGA: Czas trwania eksperymentu LCM dla każdego slajdu powinien wynosić od 30 minut do 1 godziny. Zaleca się, aby cały eksperyment LCM został ukończony w ciągu 4 godzin. Limit ten jest ustawiony tak, aby zminimalizować degradację RNA w RT oraz zapobiec odparowaniu buforu zbiorczego w kapsle probówki, co jest kluczowe dla efektywnego pobierania próbek. W praktyce docelowy plon około 1 000 komórek z morfologicznie określonych regionów może być niezawodnie zebrany w ciągu 4 godzin.

  1. Przetrzyj powierzchnie stołu laboratoryjnego środkiem dekontaminującym RNazę.
  2. Włącz kontroler i pozwól mikroskopowi zakończyć proces inicjalizacji.
  3. Obróć klawisz zgodnie z ruchem wskazówek zegara z pozycji Wyłącz do pozycji Włącz, aby uruchomić system laserowy.
    UWAGA: System laserowy potrzebuje około 10 minut na rozgrzewkę.
  4. Włącz komputer i otwórz oprogramowanie LCM, a następnie poczekaj na zakończenie procesu inicjalizacji.
  5. Do urządzenia do pobierania włóż sterylną probówkę PCR o pojemności 0,2 mL.
  6. Dodaj 10 μL buforu trawienia proteinazy K (patrz Tabela Materiałów) do nasadki rurki PCR.
    UWAGA: Całkowita objętość buforu trawienia proteinazy K zostanie podniesiona do 150 μL w kolejnym kroku (patrz Krok 5.4.1) w ramach pełnej procedury lizy.
  7. Załaduj urządzenie do pobrania do uchwytu na próbkę mikroskopu.
  8. W oknie Change Collector Device najpierw wybierz przycisk Przenieś do punktu odniesienia . Następnie dostosuj ostrość aparatu, aby zapewnić wyraźny widok punktu odniesienia. Jeśli to konieczne, użyj strzałek w oknie, aby wycentrować punkt odniesienia w polu widzenia.
  9. Załaduj fragment tkanki do uchwytu na próbkę, upewniając się, że jest on ustawiony twarzą do dołu, a etykieta znajduje się po prawej stronie.
  10. Wybierz obiektyw 10×, zidentyfikuj i wyznacz obszary zainteresowania wykazujące specyficzne cechy patologiczne, takie jak mikropęcherzykowa steatoza (charakteryzująca się hepatocytami z licznymi małymi, przezroczystymi cytoplazmatycznymi wakuolami i centralnie położonymi jądrami). Następnie przejdź do menu Laser i kliknij przycisk Kalibruj . Potwierdź komunikat na ekranie, wybierając Tak i przejdź do kalibracji.
    UWAGA: Soczewka 10× obiektywu nie jest wyłączna do mikrosekcji; Inne soczewki powiększające (np. 20×) można wybrać na podstawie klarowności próbki i pożądanej rozdzielczości.
  11. W panelu sterowania laserem ustaw parametry cięcia na: Moc lasera = 50, Apertura (średnica wiązki laserowej) = 5 oraz Prędkość = 9.
    UWAGA: Powyższe wartości parametrów służą jako odniesienie dla systemu UV-LCM z próbkami tkanek używanymi w tym protokole. Użytkownicy innych systemów UV-LCM powinni rozważyć je jako punkt wyjścia i prawdopodobnie będą musieli empirycznie dostosować ustawienia. Optymalne ustawienia mogą się różnić w zależności od rodzaju tkanki, grubości przekroju i innych systemów LCM.
  12. Narysuj okrąg wokół docelowego obszaru za pomocą graficznego paska narzędzi. Wybierz Pojedynczy Kształt, kliknij przycisk Start Cut , aby wykonać LCM, a następnie ustaw urządzenie do zbierania, aby zebrać rozciętą tkankę.
    UWAGA: Pomyślne odłączenie oznacza oddzielenie wybranego obszaru, często widocznym ruchem szczeliny lub fragmentów. Dla spójności zbieraj z określonej liczby regionów o podobnej wielkości na próbkę. Jeśli docelowy obszar nie odłącza się automatycznie, kliknij przycisk Przesuń i Ciń, aby ręcznie przeciąć próbkę myszką. Aby uzyskać dokładniejsze oszacowanie liczby komórek, oprogramowanie LCM może automatycznie rejestrować całkowity obszar cięcia. Wartość tę można podzielić przez średni przekrój poprzeczny komórki docelowej, aby przybliżyć łączną liczbę przechwyconych komórek.
    UWAGA: Podczas procesu LCM nie patrz bezpośrednio na wiązkę lasera, aby uniknąć ekspozycji na promieniowanie laserowe.
  13. Opcjonalnie wykonaj obraz przed i po miejsca rozcięcia, wybierając polecenie Zapisz obraz jako w menu Plik. W oknie dialogowym wybierz lokalizację, nazwę pliku i zapisz w preferowanym formacie (np. .tif).
  14. Po zebraniu żądanej liczby komórek kliknij przycisk Unload , aby usunąć kolektora ze sceny. Przed zamknięciem rurki PCR sprawdź, czy objętość buforu trawienia K proteinazy K w kapsle pozostaje na poziomie 10 μL; uzupełnić bufor, jeśli podczas LCM nastąpiło parowanie (patrz Krok 4.6).
    UWAGA: Dodanie 10 μL buforu zapewnia pełne zwilżenie powierzchni kapsułki, co ułatwia efektywny transfer mikro-rozciętej granulki tkankowej podczas wirowania w kroku 4.16.
  15. Dokładnie przeszukaj probówki zbiorcze.
  16. Krótko obróć probówki zbiorcze i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.
    UWAGA: Powtórz kroki 4.5 do 4.16 dla następnej próbki. Protokół można wstrzymać do czasu ekstrakcji RNA.

5. Całkowita ekstrakcja RNA z mikro-rozczłonkowanych próbek

  1. Przetrzyj powierzchnie stołu laboratoryjnego środkiem dekontaminującym RNazę.
  2. Przenieś próbki LCM z zamrażarki o temperaturze -80 °C do kąpieli lodowej. Jeśli chcesz, połącz różne partie tych samych zebranych próbek.
  3. Inkubuj mikro-rozcięte probówki do góry nogami w 42 °C przez 30 minut.
    UWAGA: Ta inwersja zapewnia, że wszelkie tkanki pozostające na nakręcie po krótkim wirowaniu (Krok 4.16) zostaną uwolnione do buforu trawienia. Zapewnia to maksymalny transfer próbki do bufora przed regulacją objętości i wirowaniem wysokoprędkościowym w kroku 5.4.1.
  4. Izoluj całkowite RNA z próbek LCM za pomocą standardowego zestawu ekstrakcyjnego RNA zoptymalizowanego dla tkanek stałych (patrz Tabela materiałów).
    1. Dostosuj objętość w każdej probówce do końcowych 150 μL za pomocą buforu trawienia proteinazy K (patrz Tabela Materiałów). Skręć probówki przy 11 000 × g (1 min), a następnie przenieś próbki do sterylnej probówki o pojemności 1,5 mL.
    2. Dodaj 10 μL proteinazy K (20 mg/mL) do probówki, a następnie delikatnie mieszaj próbki poprzez powtarzane pipetowanie. Skutkuje to końcową objętością 160 μL oraz końcowym stężeniem białazy K około 1,25 mg/mL w reakcji trawienia na próbkę.
    3. Wykonaj dwustopniową inkubację próbki: najpierw w 56 °C przez 15 minut, następnie przez 15 minut w 80 °C. Podczas każdej inkubacji krótko wiruj rurki co 5 minut.
      UWAGA: Dla optymalnego przepływu pracy używaj dwóch podgrzewanych kąpieli wodnych. Jeśli stosujesz pojedynczą kąpiel, zatrzymaj się po inkubacji 56 °C: trzymaj próbki w stanie RT, podczas gdy kąpiel nagrzewa się do 80 °C, a następnie kontynuuj.
    4. Umieszczamy próbki na 3 minuty w lodzie, a następnie wiruję w 20 000 × g (15 minut).
    5. Aspiruj klarowany supernatant do nowej probówki 1,5 mL, uważając, by nie pojawić się w granulacji.
    6. Do każdej próbki dodaj 16 μL buforu inkubacyjnego DNazy oraz 10 μL enzymu DNazy I (2,73 jednostki/μL, patrz Tabela Materiałów). Następnie dokładnie wymieszaj zawartość, delikatnie odwracając rurki. Daje to końcową objętość 186 μL oraz końcowe stężenie DNazy I około 0,15 jednostki/μL w reakcji trawienia na próbkę.
    7. Wykonaj szybkie obrócenie, aby zebrać resztki płynu ze ścianek rur.
    8. Inkubuj probówki w RT przez 15 minut.
    9. Przelej 320 μL buforu wysokosolnego (patrz Tabela materiałów) do każdej próbki i dokładnie wymieszaj próbki. Daje to końcową objętość 506 μL na próbkę.
    10. Przelej 720 μL etanolu absolutnego do każdej probówki, wymieszaj próbki pipetowaniem (bez wirowania) i natychmiast przystąpi do działania. Daje to końcową objętość 1 226 μL na próbkę.
      UWAGA: Absolutny etanol jest wysoce łatwopalny. Zbieraj etanol z przechodami do wyznaczonego, niehalogenowanego pojemnika na odpady rozpuszczalnikowe organiczne, aby prawidłowo się utylizować.
    11. Przelej 700 μL mieszaniny próbki do kolumny oczyszczającej (umieszczonej w probówce 2 mL, patrz Tabela materiałów). Delikatnie zamknij pokrywkę i wiruj w wirówce przy 8 000 × g (15 s).
    12. Usuń przepływ probówki. Zachowaj kolumnę oczyszczającą.
    13. Powtórz kroki od 5.4.11 do 5.4.12.
    14. Do każdej probówki dodaj 500 μL buforu płukania na bazie etanolu (patrz Tabela materiałów). Delikatnie zamknij pokrywki i wiruj w wirze przy 8 000 × g (15 s). Następnie odrzuć przepływ rurki zbiorczej.
    15. Powtórz cały krok 5.4.14, z jedyną modyfikacją – zwiększając czas wirowania do 2 minut przy 8 000 × g.
    16. Przelej każdą kolumnę oczyszczającą do nowej probówki 2,0 mL. Wirówka w 14 000 × g (5 min) z otwartą nakręciłką, a następnie wyrzuć rurkę i resztki cieczy.
    17. Przelej każdą kolumnę oczyszczającą do nowej probówki 1,5 mL. Pipetą nałóż 16 μL wody wolnej od RNazy na błonę, zamknij pokrywkę i wiruj w wirowaniu przy 14 000 × g (5 min), aby ułatwić wypływ całego RNA.
      UWAGA: Wszystkie próbki eluowanego RNA trzymaj na lodzie podczas kroków 5.5 i 5.6, aby zapobiec degradacji.
  5. Ilościowo określ próbki RNA i sprawdź czystość (stosunek260/A 280 ) za pomocą spektrofotometrii.
    UWAGA: Pomiar stężenia i czystości (stosunek260/A 280 ) w tym etapie, wraz z oceną integralności w kroku 5.6, stanowi ostateczny ilościowy punkt kontrolny dla skutecznego odzyskania RNA. Oczekuje się wyraźnego wypłynięcia RNA.
  6. Wykonaj elektroforezę żelową agarozy z stężeniem żelu 1% i określ integralność RNA (RIN) za pomocą systemu bioanalizatora do oceny jakości RNA.
  7. Przechowuj próbki RNA w temperaturze -80 °C do czasu wykonania qRT-PCR lub RNA-Seq.

6. Analiza RNA

UWAGA: qRT-PCR opisane jest w krokach 6.1 i 6.2, a RNA-Seq w kroku 6.3.

  1. Przygotuj mieszaninę reakcji odwrotnej transkrypcji i dodaj 50 ng całkowitego RNA na reakcję na lodzie. Przejdź do reakcji transkrypcji odwrotnej za pomocą cyklera termicznego zgodnie z podanymi instrukcjami (patrz Tabela materiałów).
  2. Na lodzie przygotuj ilościowy master mix PCR dla β-aktyny zgodnie z instrukcjami producenta (zobacz Tabelę materiałów dla sekwencji primerów). Wykonaj amplifikację PCR w czasie rzeczywistym na ilościowym systemie PCR, stosując zalecany przez producenta protokół cykliczny z 10 ng cDNA na reakcję.
  3. Korzystając z niskowejściowego zestawu niwersowego (patrz Tabela materiałów), skonstruuj biblioteki RNA-Seq z 50 ng całkowitego RNA. Określ rozmiar i koncentrację biblioteki za pomocą systemu bioanalizatora (patrz Tabela materiałów), a następnie wykonaj sekwencjonowanie parowe na platformie o wysokiej przepustowości (patrz Tabela materiałów).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalny przepływ pracy, obejmujący wiązanie PFA, odwodnienie sacharozy w 30%, osadzanie i kriosekcję OCT, barwienie hematoksyliny, identyfikację i precyzyjne pobieranie docelowego obszaru (~1 000 komórek) za pomocą LCM, lizę komórek, izolację RNA, metryki kontroli jakości RNA oraz dwie kluczowe zastosowania analityczne, został przedstawiony na Rysunku 1. Przekrój wątroby zabarwiony hematoksyliną na preparatie PEN jest pokazany pod mikroskopem przed (Rysunek 2A

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siła LCM polega na precyzyjnym, in situ wychwytywaniu wybranych komórek lub obszarów tkanek, co ułatwia badanie konkretnych obszarów w tkance heterogenicznej. Jednak niska wydajność próbki, czasochłonny proces, wysokie koszty oraz potrzeba specjalistycznego sprzętu ograniczają szerokie zastosowanie tej techniki w laboratoriach23. W tym badaniu protokół LCM-RNA został opracowany, aby przezwyciężyć kluczowe ograniczenia historyczne. Protokół ten wprowadził szybki etap barwienia hematoksylin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były częściowo wspierane grantami od Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (82070589), Fundacji Nauk Przyrodniczych Guangdong (2022A1515010218) oraz Projektu Planu Nauki i Technologii Guangzhou (206077078001) dla prof. Yan Wanga. Jesteśmy wdzięczni Centrum Badań Biomedycznych na Southern Medical University za wsparcie techniczne oraz dostęp do systemu mikroprzecinania laserowego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
materiałowy
0,2 ml cienkościennych rurekAxygenPCR-02-CLampy do pobierania LCM
1,5 mL rurki wirówkiAxygen339653
4% paraformaldehyduLeageneDF0135
Rurka wirówkowa 50 mLThermoFisher Scientific339653
DEPC (dietylpirowęglan)SigmaD-5758
Zestaw trawienia DNazy IQiagen73504Komponent zestawu RNeasy FFPE zawiera roztwór zapasowy DNazy I oraz bufor wzmacniający DNazę
Etanol (100%)Thermo Fisher ScientificBP2818Oczyszczony dla biologii molekularnej
Bufor płukania na bazie etanoluQiagen73504Buforowe RPE (komponent zestawu RNeasy FFPE)
Bufor płukania o wysokiej zawartości soliQiagen73504Buforowe RBC (komponent zestawu RNeasy FFPE)
Niskoprofilowe łopatki mikrotomoweLeica Biosystems819
Mayer' S hematoksylynaLeageneDH0001
Złożenie OCTSakura4583
Ślizg pokryty membraną PEN.Leica11505188
Sól fizjologiczna buforowana fosforanemLeageneCC0010Wolne od DNazy/RNazy
Poli-L-lizynaMacklinP875131S
Bufor trawienia proteinazy KQiagen73504Bufor PKD (komponent zestawu RNeasy FFPE)
Kolumna oczyszczającaQiagen73504Kolumna spinowa RNeasy MinElute (komponent zestawu RNeasy FFPE)
Ilościowy miks PCR masterTakara BioRR820ATB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)
Zestaw do transkrypcji odwrotnejQiagen205411Zestaw do odwrotnej transkrypcji QuantiNova
Zestaw do ekstrakcji RNAQiagen73504Zestaw RNeasy FFPE
Zestaw do sekwencjonowania RNA (niskowejściowy, uwięziony)Takara Bio634412Zestaw SMARTer do całkowitego RNA-seq – pico input savca v2
Środek dekontaminacyjny RNazySolarbioSR0040Czyszczenie
SacharozaMacklinS818049
Zwierzęta i dieta
Mysz: C57BL/6JCentrum Zwierząt Laboratoryjnych prowincji Guangdong03
specjalna dieta i specjalna Woda pitna
Dieta wysokotłuszczowa, uboga w cholinę (dieta bazowa)TROPHIC Animal Feed High-Tech Co., Ltd.TP36310MMakroskładniki: białko, 14 kcal%; węglowodany, 26 kcal%; tłuszcz, 60 kcal%)
Woda pitna uzupełniana cukremMacklinN/A (przygotowane wewnętrznie)Do autoklawowanej wody pitnej dodano mieszaninę D-glukozy (Macklin, Cat# F87500) i D-fruktozy (Macklin, Cat# S818049) w końcowym stężeniu 42 g/L, z stosunkiem glukozy do fruktozy 55:45 (w/w)
Mouse Primers
β-actin (Forward: AGAGGGAAATCGTGCGTGAC )Sekwencjonowanie BGIDostosowaneHPLC oczyszczony
β-actin (Reverse: CAATAGTGATGACCTGGCCGT)Sekwencjonowanie BGIDostosowaneHPLC oczyszczony
Sprzęt
Mikrotom kriostatuLeica BiosystemsCM3050 S
System bioanalizatoraAgilentG2939BA
Platforma sekwencjonowania o wysokiej przepustowościIllumina; Inc.System NovaSeq 6000
System mikroskopii przechwytywania laserowegoLeica MicrosystemsLeica LMD6500
System ilościowy PCRBiosystemy stosowaneSystem PCR QuantStudio 5 w czasie rzeczywistym
SpektrofotometrThermoFisher ScientificNP80NanoDrop
Termiczny CyclerBioRadT100
Oprogramowanie
Adobe Illustrator CC 2019 (wersja 23.0.2)Adobehttps://www.adobe.com/products/illustrator.html
GraphPad Prism (wersja 8.3.0)Oprogramowanie GraphPadhttps://www.graphpad.com

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science. Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).
  2. Halpern, K. B., et al. Single-cell spatial reconstruction reveals global division of labour in the mammalian liver. Nature. 543 (7647), 352-356 (2017).
  3. Aizarani, N., et al. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  4. Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  5. Baron, C. S., et al. Cell Type Purification by Single-Cell Transcriptome-Trained Sorting. Cell. 179 (2), 527-542.e19 (2019).
  6. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  7. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  8. Chen, A., et al. Spatiotemporal transcriptomic atlas of mouse organogenesis using DNA nanoball-patterned arrays. Cell. 185 (10), 1777-1792.e21 (2022).
  9. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), 78-82 (2016).
  10. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  11. Baba, N., et al. Gene expression profiling in biliary epithelial cells of primary biliary cirrhosis using laser capture microdissection and cDNA microarray. Transl Res. 148 (3), 103-113 (2006).
  12. Mena, J. E. T., et al. Laser capture microdissection after γ-glutamyl transferase histochemistry: An optimization for gene expression analysis. Anal Biochem. 447, 126-132 (2014).
  13. Liu, Y., et al. Next-generation RNA Sequencing of Archival Formalin-fixed Paraffin-embedded Urothelial Bladder Cancer. Eur Urol. 66 (6), 982-986 (2014).
  14. Ludyga, N., et al. Nucleic acids from long-term preserved FFPE tissues are suitable for downstream analyses. Virchows Arch. 460 (2), 131-140 (2012).
  15. Mägel, L., Bartels, S., Lehmann, U. Next-Generation Sequencing Analysis of Laser-Microdissected Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue Specimens. Methods Mol Biol. 1723, 111-118 (2018).
  16. Von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA Quality from FFPE Samples. PLoS One. 2 (12), e1261(2007).
  17. Böhm, M., Wieland, I., Schütze, K., Rübben, H. Microbeam MOMeNT: non-contact laser microdissection of membrane-mounted native tissue. Am J Pathol. 151 (1), 63-67 (1997).
  18. Schütze, K., et al. Cut out or poke in--the key to the world of single genes: laser micromanipulation as a valuable tool on the look-out for the origin of disease. Genet Anal. 14 (1), 1-8 (1997).
  19. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histol Histopathol. 30 (11), 1255-1269 (2015).
  20. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. J Vis Exp. (45), e2565(2010).
  21. Ge, S. J., Gan, W. Q., Karlinsey, K., Zhou, B. Y., Pachter, J. S. Immuno-laser capture microdissection of perfusion-fixed mouse brain tissue coupled to RNA-seq. J Neurosci Methods. 423, 110548(2025).
  22. Takahashi, K., Beltran, W. A., Sudharsan, R. An optimized workflow for transcriptomic analysis from archival paraformaldehyde-fixed retinal tissues collected by laser capture microdissection. Exp Eye Res. 246, 109989(2024).
  23. Mahalingam, M. Laser Capture Microdissection: Insights into Methods and Applications. Methods Mol Biol. 1723, 1-17 (2018).
  24. Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy. Nano Converg. 4 (1), (2017).
  25. Erickson, H. S., et al. Quantitative RT-PCR gene expression analysis of laser microdissected tissue samples. Nat Protoc. 4 (6), 902-922 (2009).
  26. Pan, D. Y., et al. Laser Capture Microdissection-Based RNA Microsequencing Reveals Optic Nerve Crush-Related Early mRNA Alterations in Retinal Ganglion Cell Layer. Transl Vis Sci Technol. 9 (11), 30(2020).
  27. Civita, P., et al. Laser Capture Microdissection and RNA-Seq Analysis: High Sensitivity Approaches to Explain Histopathological Heterogeneity in Human Glioblastoma FFPE Archived Tissues. Front Oncol. 9, 482(2019).
  28. Phan, H. V., et al. High-throughput RNA sequencing of paraformaldehyde-fixed single cells. Nat Commun. 12 (1), 5636(2021).
  29. Thomsen, E. R., et al. Fixed single-cell transcriptomic characterization of human radial glial diversity. Nat Methods. 13 (1), 87-93 (2016).
  30. Lin, X. J., et al. A comparative analysis of RNA sequencing methods with ribosome RNA depletion for degraded and low-input total RNA from formalin-fixed and paraffin-embedded samples. Bmc Genomics. 20 (1), 831(2019).
  31. Luzzi, V., Mahadevappa, M., Raja, R., Warrington, J. A., Watson, M. A. Accurate and reproducible gene expression profiles from laser capture microdissection, transcript amplification, and high density oligonucleotide microarray analysis. J Mol Diagn. 5 (1), 9-14 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Laser Capture MicrodissectionParaformaldehyde Fixed TissueMouse Liver TissueRNA ExtractionCryosectioningHematoxylin StainingOCT EmbeddingRNA SequencingHepatocyte ProfilingReal Time PCR

Related Articles